CN105838627B - 一种防治烟草青枯病的青霉xfsf-8菌株及应用 - Google Patents

一种防治烟草青枯病的青霉xfsf-8菌株及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种青霉xfsf‑8菌株，以及其制备抗烟草青枯病菌剂方面的应用，本发明通过在恩施州健康烟田中取土样、筛选、分析、培养后得到一株生防青霉xfsf‑8，并通过田间实验验证：青霉xfsf‑8防治烟草青枯病效果好，针对性强，无污染，制成菌剂后可长期保存，方便于田间应用，进一步丰富了放线菌生防菌研究领域的成果，对烟草青枯病的防治具有指导意义。

Description

一种防治烟草青枯病的青霉xfsf-8菌株及应用
技术领域
本发明具体涉及一种青霉xfsf-8固体发酵条件优化，及其在烟草青枯病防治上的应用，属于农业微生物学技术及发酵工程领域。
背景技术
烟草青枯病是一种土传性细菌病害，由青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)引起。青枯病的主要病发特征是病株根部及侧根发黑腐烂，茎部可见黑色条斑，该病最典型的特征是叶片枯萎后仍是绿色，故称青枯病(周训军等2012)。该病在我国烟田中发病率和致死率高，对烟草的产量和质量影响很大，造成了巨大的经济损失。目前，仍然很难使用某种单一的方法彻底根除烟草青枯病，多种生物防治以及农业的措施结合可以减轻青枯病的危害。
目前，青枯病的生物防治以其无污染、效果好、不会产生抗药性等越来越受到人们的青睐。例如，印度Anuratha和Gnanamanickam进行了许多青枯病的防治试验，用荧光假单胞杆菌(Pseudomonasfluorescens)进行的试验取得了良好的防治效果(TrigaletA1990)。人们从烟草的根或根际土壤中分离并筛选芽孢杆菌，并进行了小区试验和盆栽试验，结果表明，多种芽孢杆菌对青枯病菌都具有较强抑制作用(陈程等2011)。El-Abyad等将3个青霉菌株—柠檬荧光青霉(Streptomycescitrecofluorescens)、极美青霉(S.pulcher)和灰白青霉(S.canescens)分别制成种衣剂，将种子进行处理后，在42～63d时间内成功的控制了青枯病(El-Abyad1993)。刘艳霞等将从健康烟草根际土壤中分离筛选到的短芽孢杆菌L-25(Brevibacillusbrevis)和娄彻氏青霉L-9(Streptomyces rochei)，与有机肥结合后制备成微生物肥料使用，对烟草的产量有显著提高，第一年和第二年施用生物有机肥处理移栽50天后烟草青枯病的生物防控率分别为82.2％和96.2％，105天后烟草青枯病的生物防控率分别达到75.2％和95.4％；生物有机肥处理第一年和第二年烟叶产量分别为2212.5kg/hm2、1475.5kg/hm2，是对照的2.4和2.6倍。(刘艳霞等2014)。
我国烟草青枯病发生严重，造成了巨大的经济损失，所以解决烟草青枯病问题至关重要。由于环境安全问题的日益突出以及抗药性的不断出现，化学农药的使用受到越来越多的限制，因而将研究重点逐渐转移到生物防治上。自然界微生物种类多，为青枯病的生物防治提供了丰富的微生物资源。
发明内容
本发明的目的是对青霉xfsf-8固体发酵培养条件进行优化，提高其固体发酵产孢量。将其施用于烟草根部，对烟草青枯病具有较好的防治效果。
本发明提供一种青霉xfsf-8菌株，其特征在于：所述青霉的分类命名为青霉Penicilliumsp.xfsf-8，保藏在中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号为CCTCCNO：M2016100；保藏日期2016年3月9日，保藏地址湖北省武汉市洪山区八一路武汉大学中国典型培养物保藏中心，邮政编码：430072；所述的链青霉xfsf-8菌株基因序列为：
本发明一种青霉xfsf-8菌株，其特征在于在制备抗烟草青枯病菌剂中的应用。
本发明一种青霉xfsf-8菌株，其特征在于青霉xfsf-8菌株的青枯病防治使用方法：将青霉xfsf-8固体发酵培养后，获得的发酵液，对烟草苗进行茎基部喷淋，单株烟草苗所喷淋的发酵液含有的青霉xfsf-8数量大于等于107CFU/ml。
本发明的有益效果：提供了一种青霉xfsf-8菌株以及其在防治烟草青枯病方面的应用，本发明通过在恩施州健康烟田中取土样、筛选、分析、培养后得到一株青霉xfsf-8，并通过田间实验验证：上述青霉使用时，防治烟草青枯病效果好，针对性强，无污染，方便于田间应用，对以后烟草青枯病的防治具有指导意义。
本发明一种青霉xfsf-8菌株与现有技术相比，本发明具有以下优点：从长势良好的健康烟草植株根际土壤中分离出多种真菌，并通过抗青枯雷尔氏菌的拮抗实验筛选到青霉xfsf-8，该菌株对青枯雷尔氏菌有较高抗菌活性。对青霉xfsf-8的固体发酵条件进行优化，通过单因素试验、PB实验、最陡爬坡实验、中心组合实验等得到最适发酵条件。发酵菌剂施用于烟田，结果表明青霉xfsf-8对烟草青枯病有较好的防治效果。
附图说明
图1为青霉xfsf-8对青枯雷尔氏菌的抗性平板实验；
图2为青霉xfsf-8固体发酵最适碳源和介质的筛选；
图3为青霉xfsf-8固体发酵最适氮源的筛选；
图4为青霉xfsf-8固体发酵最适无机盐的筛选；
图5为青霉xfsf-8固体发酵最适含水量的筛选；
图6为青霉xfsf-8固体发酵最适接种量的筛选；
图7为青霉xfsf-8固体发酵最适pH值的筛选；
图8为青霉xfsf-8固体发酵最适生长因子的筛选；
图9为青霉xfsf-8固体发酵最适培养周期的筛选；
图10为青霉xfsf-8固体发酵最适瓶装量的筛选；
图11为青霉xfsf-8固体发酵吐温-80最适含量的确定；
图12为酵母粉和含水量对青霉产孢量影响的等高线图；
图13为酵母粉和含水量对青霉产孢量影响的响应曲面图；
图14为酵母粉和吐温-80对青霉产孢量影响的等高线图；
图15为酵母粉和吐温-80对青霉产孢量影响的响应曲面图；
图16为含水量和吐温-80对青霉产孢量影响的等高线图；
图17为含水量和吐温-80对青霉产孢量影响的响应曲面图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但发明的实施方式不限于此。
本发明实施例所述技术方案，如未特别说明，均为常规技术，所用试剂如未特别说明，均来源于商业化渠道。
实施例1检测青霉xfsf-8对青枯雷尔氏菌的抗性
挑取从健康烟草植株根际土壤中分离纯化出的青霉xfsf-8接种于PDA液体培养基，于28℃，180rpm/min摇床培养5d，发酵液经过滤后在无菌操作台用直径0.22μm的过滤器过滤除菌。
从LB平板上挑取青枯雷尔氏菌单菌落接种于LB液体培养基中，于37℃，180rpm/min摇床培养24h，取适量菌液稀释至OD值0.2左右，涂布于LB平板。将已灭菌的滤纸置于平板中，用移液器取10μl无菌的青霉xfsf-8发酵液浸于滤纸片上，28℃恒温培养24h后观察抑菌圈。
结果显示：如图1，滤纸周围有明显的抑菌圈，青霉xfsf-8发酵液对青枯雷尔氏菌有明显的抑制作用。
实施例2青霉xfsf-8固体发酵条件的优化
(1)最适碳源和培养介质的优化
以玉米粉、小麦粉、麸皮、米糠作为碳源，以营养土、蛭石土作为培养基质，按1:1的比例将碳源和培养基质各称取7.5g混匀后置于培养皿中，121℃灭菌20min备用，共配置8种培养基。每种碳源设置3个重复。
取培养好的青霉xfsf-8固体PDA平板，于无菌操作台下用无菌水将孢子洗下来制成孢子悬浮液，用血球计数板测定孢子含量，调整浓度为1.2×107个孢子/ml的孢子悬浮液。
无菌条件下，向培养皿中加入6ml上述孢子悬浮液，混匀后置于28℃恒温培养箱中培养观察计数，并于第五天开始统计各皿孢子含量。
孢子量测定：称取固体发酵培养基1g，加入内有19ml无菌水的三角瓶中，加入适量玻璃珠，放至摇床上180rpm/min振荡30min，获得孢子悬浮液，用血球计数板计量孢子数，每个处理3次重复。结果如表1、图2所示。
表1青霉xfsf-8固体培养生长状况及产孢情况
结果：如图2所示，在以玉米粉作为碳源，蛭石作为培养基质时，青霉xfsf-8固体发酵产生的孢子数最多，达到1.77×109个/g。因此，确定玉米粉为最适碳源，蛭石为最适的培养基质。
(2)最适氮源的筛选
以玉米粉作为碳源，蛭石作为培养基质，按1:1的比例将玉米粉和蛭石各称取7.5g混匀后置于培养皿中，121℃灭菌20min备用。共配制4组培养基，每组设置3个重复。
取培养好的青霉xfsf-8固体PDA平板，于无菌操作台下用无菌水将孢子洗脱下来制成孢子悬浮液，用血球计数板测定孢子含量，调整孢子浓度为1.2×107个孢子/ml，此孢子悬浮液用于接种。
分别以豆粕粉、尿素、硝酸钠、硝酸钾、硫酸铵作为氮源，以0.5％的含量将上述氮源分别溶于1.2×107/ml的孢子悬浮液中，向每组培养皿中加入6ml含有氮源的孢子悬浮液，混匀后置于28℃恒温培养箱中培养观察计数。结果如图3所示。
结果：如图3所示，在以玉米粉作为碳源，蛭石作为培养基质，硫酸铵作为氮源时，青霉xfsf-8固体发酵产生的孢子数最多，达到1.92×109个/g。
(3)最适无机盐的筛选
以玉米粉作为碳源，蛭石作为培养基质，硫酸铵作为氮源，按1:1的比例玉米粉和蛭石各称取7.5g混匀置于培养皿中，121℃灭菌20min备用，配制4组培养基，每组设置3个重复。
取培养好的青霉xfsf-8固体PDA平板，于无菌操作台下用无菌水将孢子洗脱下来制成孢子悬浮液，用血球计数板测定孢子含量，最终定量为1.2×107个孢子/ml的孢子悬浮液。
分别以氯化钾、硫酸铁、硫酸镁、硫酸镁作为无机盐，以0.5％含量的硫酸铵以及上述无机盐分别溶于1.2×107/ml的孢子悬浮液中，向每组培养皿中加入6ml孢子悬浮液，混匀后置于28℃恒温培养箱中培养观察计数。结果如图4所示。
结果：如图4所示，在以玉米粉作为碳源，蛭石作为培养基质，硫酸铵作为氮源，硫酸镁作为无机盐时，青霉xfsf-8固体发酵产生的孢子数最多，达到2.43×109个/g。
(4)最适含水量的筛选
以玉米粉作为碳源，蛭石作为培养基质，硫酸铵作为氮源，硫酸镁作为无机盐，按1:1的比例玉米粉和蛭石各称取7.5g混匀置于培养皿中，121℃灭菌20min备用，配制4组培养基，每组设置3个重复。
取培养好的青霉xfsf-8固体PDA平板，于无菌操作台下用无菌水将孢子洗脱下来制成孢子悬浮液，用血球计数板测定孢子含量，最终定量为1.2×107/ml的孢子悬浮液。
将0.5％含量的硫酸铵和0.5％的含量的硫酸镁分别溶于1.2×107/ml的孢子悬浮液中，按照40％、50％、60％、80％的含水量，向每组培养皿中分别加入6ml、7.5ml、9ml、12ml孢子悬浮液，混匀后置于28℃恒温培养箱中培养观察计数。结果如图5所示。
结果：如图5所示，在以玉米粉作为碳源，蛭石作为培养基质，硫酸铵作为氮源，硫酸镁作为无机盐，含水量为40％时，青霉xfsf-8固体发酵产生的孢子数最多，达到2.73×109个/g。
(5)最适接种量的筛选
以玉米粉作为碳源，蛭石作为培养基质，硫酸铵作为氮源，硫酸镁作为无机盐，以40％的含水量，按1:1的比例玉米粉和蛭石各称取7.5g混匀置于培养皿中，121℃灭菌20min备用，共配制6组培养基，每组设置3个重复。
取培养好的青霉xfsf-8固体PDA平板，于无菌操作台下用无菌水将孢子洗脱下来制成孢子悬浮液，用血球计数板测定孢子含量，分别定量为1.2×106/ml、0.6×107/ml、1.2×107/ml、2.4×107/ml、4.8×107/ml、1.2×108/ml的孢子悬浮液。
将0.5％含量的硫酸铵和0.5％的含量的硫酸镁分别溶于上述不同含量的孢子悬浮液，按照40％的含水量分别加到每组培养皿中，混匀后置于28℃恒温培养箱中培养观察计数。结果如图6所示。
结果：如图6所示，在以玉米粉作为碳源，蛭石作为培养基质，硫酸铵作为氮源，硫酸镁作为无机盐，含水量为40％，接种量为1.2×107/ml时，青霉xfsf-8固体发酵产生的孢子数最多，达到2.01×109个/g。
(6)最适pH值的筛选
以玉米粉作为碳源，蛭石作为培养基质，硫酸铵作为氮源，硫酸镁作为无机盐，以40％的含水量，1.2×107/ml的接种量，按1:1的比例玉米粉和蛭石各称取7.5g混匀置于培养皿中，121℃灭菌20min备用。共配制5组培养基，每组设置3个重复。
取培养好的青霉xfsf-8固体PDA平板，于无菌操作台下用无菌水将孢子洗脱下来制成孢子悬浮液，用血球计数板测定孢子含量，定量为1.2×107/ml的孢子悬浮液。将孢子悬浮液分成五等份，用0.5MHCl调节孢子悬浮液pH值分别为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0。
将0.5％含量的硫酸铵和0.5％的含量的硫酸镁分别溶于上述的孢子悬浮液，按照40％的含水量分别加到每组培养皿中，混匀后置于28℃恒温培养箱中培养观察计数。结果如图7所示。
结果：如图7所示，在以玉米粉作为碳源，蛭石作为培养基质，硫酸铵作为氮源，硫酸镁作为无机盐，含水量为40％，接种量为1.2×107/ml，孢子悬浮液pH为4.0时，青霉xfsf-8固体发酵产生的孢子数最多，达到3.36×109个/g。
(7)最适生长因子的筛选
以玉米粉作为碳源，蛭石作为培养基质，硫酸铵作为氮源，硫酸镁作为无机盐，以40％的含水量，1.2×107/ml的接种量，按1:1的比例玉米粉和蛭石各称取7.5g混匀置于培养皿中，121℃灭菌20min备用。共配制2组培养基，每组设置3个重复。
取培养好的青霉xfsf-8固体PDA平板，于无菌操作台下用无菌水将孢子洗脱下来制成孢子悬浮液，用血球计数板测定孢子含量，定量为1.2×107/ml、pH4的孢子悬浮液。
以酵母粉、蛋白胨作为生长因子，分别按照0.5％含量添加至上述的孢子悬浮液，按照40％的含水量分别加到每组培养皿中，混匀后置于28℃恒温培养箱中培养观察计数。结果如图8所示。
结果：如图8所示，在以玉米粉作为碳源，蛭石作为培养基质，硫酸铵作为氮源，酵母粉作为生长因子，硫酸镁作为无机盐，含水量为40％，接种量为1.2×107/ml，孢子悬浮液pH为4时，青霉xfsf-8固体发酵产生的孢子数最多，达到4.27×109个/g。
(8)最适培养周期的确定
以玉米粉作为碳源，蛭石作为培养基质，硫酸铵作为氮源，硫酸镁作为无机盐，酵母粉作为生长因子，以40％的含水量，1.2×107/ml的接种量，按1:1的比例玉米粉和蛭石各称取7.5g混匀置于培养皿中，121℃灭菌20min备用。
取培养好的青霉xfsf-8固体PDA平板，于无菌操作台下用无菌水将孢子洗脱下来制成孢子悬浮液，用血球计数板测定孢子含量，定量为1.2×107/ml、pH4的孢子悬浮液。
将0.5％含量的硫酸铵、0.5％的含量的硫酸镁，0.5％的含量酵母粉溶于上述的孢子悬浮液，按照40％的含水量分别加到每组培养皿中，混匀后置于28℃恒温培养箱中培养观察计数。连续培养10d，从第6d开始测定培养基孢子含量。结果如图9所示。
结果：如图9所示，在以玉米粉作为碳源，蛭石作为培养基质，硫酸铵作为氮源，酵母粉作为生长因子，硫酸镁作为无机盐，含水量为40％，接种量为1.2×107/ml，孢子悬浮液pH为4，培养周期为8d时，青霉xfsf-8固体发酵产生的孢子数最多，达到4.90×109个/g。
(9)最适瓶装量的确定
以玉米粉作为碳源，蛭石作为培养基质，硫酸铵作为氮源，硫酸镁作为无机盐，酵母粉作为生长因子，以40％的含水量，1.2×107/ml的接种量，按1:1的比例玉米粉和蛭石各称取5g、7.5g、10g混匀后置于培养皿中，121℃灭菌20min备用。配制3组培养基，每组设置3个重复。
取培养好的青霉xfsf-8固体PDA平板，于无菌操作台下用无菌水将孢子洗脱下来制成孢子悬浮液，用血球计数板测定孢子含量，定量为1.2×107/ml、pH4的孢子悬浮液。
将0.5％含量的硫酸铵、0.5％的含量的硫酸镁0.5％的含量酵母粉溶于上述的孢子悬浮液，按照40％的含水量分别加到每组培养皿中，混匀后置于28℃恒温培养箱中培养8d后观察计数。
结果：如图10所示，在以玉米粉作为碳源，蛭石作为培养基质，硫酸铵作为氮源，酵母粉作为生长因子，硫酸镁作为无机盐，含水量为40％，接种量为1.2×107/ml，孢子悬浮液pH为4、培养周期为8d，瓶装量为10g时，青霉xfsf-8固体发酵产生的孢子数最多，达到1.43×1010个/g。
(10)吐温-80最适含量的确定
以玉米粉作为碳源，蛭石作为培养基质，硫酸铵作为氮源，硫酸镁作为无机盐，酵母粉作为生长因子，以40％的含水量，1.2×107/ml的接种量，按1:1的比例玉米粉和蛭石各称取5g混匀置于培养皿中，121℃灭菌20min备用。准备5组培养基，每组设置3个重复。
取培养好的青霉xfsf-8固体PDA平板，于无菌操作台下用无菌水将孢子洗脱下来制成孢子悬浮液，用血球计数板测定孢子含量，定量为1.2×107/ml、pH4的孢子悬浮液。
将0.25％、0.5％、0.75％、1.00％、1.25％的吐温-80分别于0.5％含量的硫酸铵、0.5％的含量的硫酸镁0.5％的含量酵母粉混合并溶于上述的孢子悬浮液，按照40％的含水量分别加到每组培养皿中，混匀后置于28℃恒温培养箱中培养8d后观察计数。
结果：如图11所示，在以玉米粉作为碳源，蛭石作为培养基质，硫酸铵作为氮源，酵母粉作为生长因子，硫酸镁作为无机盐，含水量为40％，接种量为1.2×107/ml，吐温-80含量为1.00％，孢子悬浮液pH为4，培养周期为8d，瓶装量为10g时，青霉xfsf-8固体发酵产生的孢子数最多，达到8.73×109个/g。
(11)Plackett-Burman实验
采用Plackett-Burman实验，选取碳源玉米粉，氮源硫酸铵，无机盐硫酸镁，生长因子酵母粉，含水量，pH，吐温-80，共7个因素进行实验，每个因素取高(+1)、低(-1)两个水平，利用Design-Expert8.05b软件进行实验设计和结果分析，实验设计表见表2，实验响应值见表3，各因素效应及显著性分析见表4。
表2Plackett-Burman实验因素高低水平设计
表3Plackett-Burman实验设计
表4Plackett-Burman实验结果
结果：上述Y为响应值，即孢子量。根据实验数据，拟合二元一次方程为：R1＝4.11+0.057A+0.35B+0.28C+0.74D-0.66E-0.35F+0.73G，此回归方程的F值是20.00，P值为0.484，
表明这个模型是显著性的，模型中P值小于0.05则表明此因子是显著性的，即D-酵母粉、E含水量、G-吐温-80为显著性影响因素，且酵母粉和吐温-80是正效应，含水量为负效应。
(12)最陡爬坡实验
根据部分因子实验设计结果确定显著影响因子后，针对酵母粉、吐温-80和含水量的质量浓度进行最陡爬坡实验，以拟合的回归方程模型的系数符号和大小设定显著影响因素的步长及变化方向，使响应值快速逼近最大相应区域。
设酵母粉的规范变量基本步长ΔX1＝0.2，则含水量规范变量基本步长ΔX2＝0.66/(0.74/ΔX1)＝0.18，吐温-80规范变量基本步长ΔX3＝0.73/(0.74/ΔX1)。酵母粉的实际步长Δξ1＝0.2*0.5％＝0.1％，含水量实际步长Δξ2＝0.18*4＝0.72，吐温-80实际步长Δξ3＝0.2*0.75＝0.15％。最陡爬坡实验设计及结果见表5。
表5最陡爬坡实验设计及结果
步长 酵母粉 水 吐温-80 Y
Δ 0.1％ 0.72ml 0.15％
0 0.5％ 4ml 0.75％ 3.09
1+Δ 0.6％ 3.28ml 0.9％ 4.06
2+Δ 0.7％ 2.56ml 1.05％ 1.67
3+Δ 0.8％ 1.84ml 1.2％ 0.97
4+Δ 0.9％ 1.12ml 1.35％ 0
结果：由表5可知，青霉xfsf-8固体发酵产孢量在1+Δ(酵母粉0.6％，水3.28ml，吐温-80 0.9％)是产量最高，达到4.06×109个/g。
(13)响应面实验设计
以青霉xfsf-8固体发酵产孢量为主要目标，根据最陡爬坡实验确定响应面实验中心点，利用Design-Expert8.05b软件进行响应面Box-Behnken设计BBD实验，实验设计及结果见表6和表7。
表6中心组合实验及结果
RUN A B C R1
1 1 -1 0 1.72
2 -1 1 0 3.86
3 0 1 1 4.39
4 0 -1 1 2.38
5 1 0 1 4.77
6 0 0 0 4.75
7 -1 0 1 3.58
8 -1 -1 0 1.64
9 0 0 0 4.30
10 -1 0 -1 4.24
11 1 0 -1 4.17
12 1 1 0 4.32
13 0 -1 -1 1.96
表7 ANOVAanalysisfor regressionequation
由方差分析可知，模型P值小于0.0001，表明模型是高度显著的，同时模型中的参数A、B、AC、A^2、B^2是显著的(P＜0.05)。模型失拟向项的P值为0.5，表明模型失拟不显著。同时软件分析得到的模型F值为65.998，多员相关系数R2为0.9884，说明模型拟合良好。变异系数(C.V.)为4.80，说明模型方程能很好地反应真实的实验值。
响应面分析及最佳培养基成分：确定通过回归方程绘制分析图，考察拟合的响应曲面形状，响应面立体分析图和响应面等高线图见图12-17。运用pert8.05b软件对回归方程进行分析，得到酵母粉0.6％，水3.28ml，吐温-80 0.9％时青霉xfsf-8固体发酵产孢量最大达到4.74×109个/g。
(14)验证实验
为确定建立的模型与实验结果是否符合，通过进一步的实验对模型的可靠性进行验证。在初始条件(仅有碳源和培养介质)和优化条件下分别进行3批次的固体发酵实验，测定青霉xfsf-8固体发酵产孢量，测得初始条件下得孢子产量为达到1.12×109个/g，优化条件下的孢子产量达到6.86×109个/g，结果表明青霉xfsf-8固体发酵条件优化后的培养基产孢量较初始条件有显著提高。
试验例
2015年在湖北省恩施州宣恩县晓关镇烟田进行。该试验地历年种植烟草，青枯病发生严重，土壤属黄棕壤，肥力中等，地势平坦，光照条件较好。供试品种为云烟87。试验共设置3个处理，即：处理1：72％硫酸链霉素稀释1000倍(河北三农农用化工有限公司)；处理2：青霉xfsf-8菌剂(华中农业大学)；处理3：CK(灌清水)；以上处理在烟苗移栽后10天、移栽后30天和50天进行根部灌淋，每株灌根200ml，共3次。
在移栽后60天，调查各处理青枯病的发病情况，并计算发病率、病情指数、相对防效。结果见表8。
表8不同药剂对烟草青枯病的防效
处理 发病率(％) 病情指数 防效(％)
CK 51.15 24.51 -
硫酸链霉素 38.78 23.13 5.63
青霉xfsf-8菌剂 6.63 3.15 87.15
烟草青枯病及其他病害的调查标准均参照中华人民共和国国家标准GB/T3222—2008。烟草青枯病病情分级标准(以株为单位)：
0级：全株无病；
1级：茎部偶有褪绿斑，或病侧二分之一以下叶片凋萎；
3级：茎部有黑色条斑，但不超过二分之一，或病侧二分之一至三分之二叶片凋萎；
5级：茎部黑色条斑超过二分之一，但未到达茎顶部，或病侧三分之二以上叶片凋萎；
7级：茎部黑色条斑到达茎顶部，或病株叶片全部凋萎：
9级：病株基本枯死。
防效计算：
病情指数＝[(各级病株数×该病级指数)/(调查总株数×最高级指数)]×100
防效＝(空白对照区病指-处理区病)/空白对照区病指×100％
从表8可以看出，青霉xfsf-8菌剂对青枯病的防效效果显著，防效为87.15％，显著降低了烟草青枯病的发病率和病情指数，其效果优于硫酸链霉素。
SEQUENCE LISTING
<110> 湖北省烟草公司恩施州公司
<120> 一种防治烟草青枯病的青霉xfsf-8菌株及应用
<130> 2016
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 424
<212> DNA
<213> 青霉xfsf-8
<400> 1
ccggtccgtc tcttcagcac gtttccatca ccgtaccaca tatagtcgta catacagggg 60
atagtcgggg gcgtcagtat tcagctgtca gaggtgaaat tcttggattt gctgaagact 120
aactactgcg aaagcattcg ccaaggatgt tttcattaat cagggaacga aagttagggg 180
atcgaagacg atcagatacc gtcgtagtct taaccataaa ctatgccgac tagggatcgg 240
gcggggtttc tatgatgacc cgctcggcac cttacgagaa atcaaagttt ttgggttctg 300
gggggagtat ggtcgcaagg ctgaaactta aagaaattga cggaagggca ccacaaggcg 360
tggagcctgc ggcttaattt gactcaacac ggggaaactc accagggtcc agaaaaccca 420
aaaa 424

Claims (1)

1.一种青霉xfsf- 8菌株在制备抗烟草青枯病菌剂中的应用， 其特征在于：所述青霉的分类命名为青霉Penicillium sp. xfsf-8，保藏在中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号为CCTCC NO：M2016100。
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