CN110683875A - 一种预防烤烟青枯病的生物菌肥、制备方法及应用 - Google Patents

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娄元菲
卢志伟
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Abstract

本发明涉及一种预防烤烟青枯病的生物菌肥、制备方法及应用，生物菌肥中的枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短短芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、康氏木霉对烤烟青枯病病原菌具有很好的拮抗与竞争作用，能够有效抑制烤烟青枯病病原菌的生命活动，同时诱导植物抗性抵御，提高烤烟抗青枯病的能力；米曲霉在发酵过程中能够分解米糠中的淀粉与蛋白质，供给烟株生长；酵素是现在比较流行的一种酶，所含菌种主要包括酵母菌、醋酸菌、乳酸菌等，可以发酵分解米糠中的淀粉、蛋白质等有机物，供给烟株生长。同时生物菌肥对环境安全，无公害，无残留，专一性强，活性高，对非靶标生物安全无副作用。

Description

一种预防烤烟青枯病的生物菌肥、制备方法及应用
技术领域
本发明属于生物菌肥技术领域，特别是指一种预防烤烟青枯病的生物菌肥、制备方法及应用。
背景技术
青枯病是由茄科劳尔氏菌引起的一种烤烟细菌性土传病害，其寄主范围广，适应能力极强，广泛分布于热带、亚热带及温带地区，在我国广东、广西、贵州及云南等各省市均有严重发生。我国烤烟种植面积大，长期的连作种植方式导致了我国主要烤烟产区青枯病发病率越来越高，给烟农们带来巨大的经济损失。
目前，国内外针对烤烟青枯病的防治措施主要有采用抗病品种、轮作、采用一些物理防治、化学防治以及生物防治等手段。华南农业大学邓音乐、宋施豪、尹文芳等的发明的应用单不动杆菌对青枯病进行防治；恩施州宣恩县烟叶分公司刘月华、孙玉晓、刘焰等研究不同种类生物有机肥对烤烟青枯病及烟叶生长的影响，提出采用有机肥(菜枯+碳化谷壳+烟草秸秆粉碎物)防治青枯病效果较明显。湖南农业大学杨友才等对烟草品种青枯病抗病性及抗性遗传研究，发现Ti448A、D101、G80等三个品种对青枯病表现高抗。
使用抗病品种虽然可以大幅度地减轻病害发生和流行，但烟叶作为特殊的经济作物，对其质量要求较高，很难找到一种既能高抗青枯病的同时又能达到质量要求的烤烟新品种；轮作换茬和休耕的种植方式虽然在一定程度上能够减轻烤烟病害的发生，但满足不了农户对经济利益的追求；农业生产上现主要采用化学农药、农业防治等传统防治方法防治烤烟青枯病，但是其效果都不尽理想，且对生态环境造成严重污染，增加农产品有毒化学物质的残留量；生物防治因其具有无污染、不杀伤天敌、病菌不易产生抗药性、有利于人畜安全及环境保护，因而符合现代有机农业发展的要求，受到人们广泛重视。
发明内容
本发明的目的是提供一种预防烤烟青枯病的生物菌肥、制备方法及应用，能够减少有效抑制烤烟大田生长发育过程中青枯病的发生，改良烟田土壤，促进烤烟前期的根系生长发育，提高烤烟的产质量。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种预防烤烟青枯病的生物菌肥，由生物菌肥种子菌发酵液和米糠组成；所述生物菌肥种子菌发酵液与米糠的质量比为1：3～8。
进一步的，所述生物菌肥种子菌发酵液与米糠的质量比为1：5。
所述生物菌肥种子菌发酵液中，按体积百分比，由以下组分组成：枯草芽孢杆菌5～20％、短小芽孢杆菌5～20％、侧孢芽孢杆菌5～20％、巨大芽孢杆菌5～20％、解淀粉芽孢杆菌5～15％、酵素5～10％、米曲霉5～10％、康氏木霉5～10％。
进一步的，所述生物菌肥种子菌发酵液中，按体积百分比，由以下组分组成：枯草芽孢杆菌10～20％、短小芽孢杆菌10～20％、侧孢芽孢杆菌10～20％、巨大芽孢杆菌5～20％、解淀粉芽孢杆菌10～15％、酵素5％、米曲霉5～10％、康氏木霉5％。
进一步的，所述生物菌肥种子菌发酵液中，按体积百分比，由以下组分组成：枯草芽孢杆菌10～20％、短小芽孢杆菌10～20％、侧孢芽孢杆菌10～20％、巨大芽孢杆菌10～20％、解淀粉芽孢杆菌10～15％、酵素5％、米曲霉5％、康氏木霉5％。
一种制备上述任一项预防烤烟青枯病的生物菌肥的方法，包括以下步骤：
S1、分别将枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、酵素、米曲霉、康氏木霉的种子菌发酵液按照设定的比例配比，制成所需生物菌肥种子菌发酵液；
S2、将粉碎过的米糠过筛，干热灭菌第一设定时间后，得到完全灭菌的米糠；在无菌条件下，将生物菌肥种子菌发酵液和米糠，按照质量比1：3～8的比例进行均匀混合后转移到生化培养箱内进一步进行培养发酵第二设定时间；
S3、培养发酵完成后，将发酵物取出，置于38℃的鼓风干燥条件下风干，当含水率≤12％时，制得预防烤烟青枯病的生物菌肥。
所述种子菌发酵液有效菌含量均在3×108cfu/mL以上。
所述种子菌发酵液的制备方法，包括以下步骤：
1)培养基的制备
牛肉膏蛋白胨固体培养基的组成：牛肉浸膏、蛋白胨、葡萄糖、琼脂及蒸馏水；
营养肉汤培养基的组成：牛肉浸膏、蛋白胨、葡萄糖及蒸馏水；
肉汤培养基的组成：胰蛋白胨、酵母提取物及氯化钠；
马铃薯葡萄糖琼脂培养基的组成：去皮马铃薯、葡萄糖、琼脂及蒸馏水；
2)将枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌分别接入牛肉膏蛋白胨固体培养基中，置摇床上30℃，200r/min，培养72小时，将温度升高至36℃、200r/min，4-5h，使它们形成芽孢；
待培养基上长满菌丝再将其分别接种到肉汤培养基中，在28℃的恒温摇床，以110r/min中培养48小时，制成菌含量在3×108cfu/mL的菌悬液A；
将康氏木霉和米曲霉接入于马铃薯葡萄糖琼脂培养基中，30℃培养3天，滴加无菌水，振荡制备菌悬液，制成菌含量在3×108cfu/mL的菌悬液B；
3)将制成的菌悬液A和菌悬液B分别接入到营养肉汤培养基中，在30℃的恒温摇床，以200r/min中培养48小时，得到种子菌发酵液。
一种上述任一项预防烤烟青枯病的生物菌肥的应用，所述生物菌肥应用于植烟土壤。
进一步的，还包括有机肥，所述生物菌肥与所述有机肥的质量比为1：3～8。
本发明的有益效果是：
本发明的生物菌肥中的枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短短芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、康氏木霉对烤烟青枯病病原菌具有很好的拮抗与竞争作用，能够有效抑制烤烟青枯病病原菌的生命活动，同时诱导植物抗性抵御，提高烤烟抗青枯病的能力；米曲霉在发酵过程中能够分解米糠中的淀粉与蛋白质，供给烟株生长；酵素是现在比较流行的一种酶，所含菌种主要包括酵母菌、醋酸菌、乳酸菌等，可以发酵分解米糠中的淀粉、蛋白质等有机物，供给烟株生长。
同时本发明的生物菌肥对环境安全，无公害，无残留，专一性强，活性高，对非靶标生物安全无副作用。
具体实施方式
以下通过实施例来详细说明本发明的技术方案，以下的实施例仅是示例性的，仅能用来解释和说明本发明的技术方案，而不能解释为是对本发明技术方案的限制。
本申请各实施例菌种来源：
康氏木霉(Trichoderma neokoningii)，购于中国普通微生物菌种保藏管理中心，CGMCC.13254；巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)，购于中国普通微生物菌种保藏管理中心，CGMCC:1.9072；枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，购于中国普通微生物菌种保藏管理中心，CGMCC:1.15792；短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)，购于中国普通微生物菌种保藏管理中心，CGMCC:1.8817；解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，购于中国普通微生物菌种保藏管理中心，CGMCC:1.8719；短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)，购于中国普通微生物菌种保藏管理中心，CGMCC:1.8167米曲霉(Aspergillus oryzae)，购于中国普通微生物菌种保藏管理中心，CGMCC:3.13905；酵素来源于华南农业大学)。
生物菌肥中的枯草芽孢杆菌是一种嗜温性产芽孢的革兰氏阳性杆状细菌，它是目前发现的最强的生物表面活性剂，具有耐热、耐酸碱、抗紫外线、无毒害、所需营养物质简单、生长繁殖迅速、稳定性高等特点。其分泌的芬枯草菌素，可通过改变生物膜的结构或使通透性起到抗菌的作用且其能抑制许多致病菌的生长，能产生70多种具有抗菌效果的物质，是一种非常理想的生防制剂微生物。
解淀粉芽孢杆菌能够降解自然界中一些有毒物质，净化被污染的土壤和水源，其又是典型的植物促生菌，能够分泌抗菌蛋白、抗生素、酶或者多肽等活性物质，促进植物生长，防治病虫害。
侧孢芽孢杆菌能够促进植物根系生长，增强根系的吸收能力，从而提高作物产量；抑制植物体内外病原菌的繁殖，减轻病虫害，降低农药残留；能够疏松土壤，解决土壤板结问题，活化土壤，提高土壤利用率。有些芽孢杆菌还可产生一些具有活性的抗菌蛋白质，这些蛋白质的抑菌机理为破坏细胞壁造成菌丝的变形，使孢子发芽异常，抑制它的生长繁殖常见的芽孢杆菌，具有极快繁殖能力、较强的环境适应能力和代谢产物多样性，在生物防治研究中被广泛应用。
短小芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌定殖于植物根际，与烤烟青枯病病原菌茄科劳尔氏菌形成竞争关系，同时分泌代谢物抑制青枯病病原菌生长，并且诱导植物抗性抵御，提高烤烟青枯腐病能力。
米曲霉在发酵过程中能够分解米糠中的淀粉与蛋白质，供给烟株生长。
康氏木霉可以产生挥发性的抑制青枯病病原菌生长的抗生物质，抑制病原菌孢子发芽与菌丝生长，其细胞壁分解酵素能够抑制病原菌孢子发芽能力。
培养基的制备，在本申请的以下实施例中，均使用相同的培养基，本申请的培养基的制备方法均为现有技术，在此，仅提出培养基的组成，并不影响本申请技术方案的实现，根据需要，培养基的组成的用量可以进行变化。
牛肉膏蛋白胨固体培养基的组成(NA)：牛肉浸膏3g，蛋白胨5g，葡萄糖20g，琼脂18g，蒸馏水1000mL，PH7.0。
营养肉汤培养基的组成(NB)：牛肉浸膏3g，蛋白胨5g，葡萄糖20g，蒸馏水1000mL，PH7.0。
肉汤培养基的组成(LB)：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠(NaCl)10g/L，pH7.4。
马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)：马铃薯(去皮)200g，葡萄糖20g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，PH7.0。
在本申请的技术方案中，相应的种子菌发酵液为各单独的种子菌发酵液，本申请各实施例中，分别为枯草芽孢杆菌发酵液、巨大芽孢杆菌发酵液、短小芽孢杆菌发酵液、侧孢芽孢杆菌发酵液、解淀粉芽孢杆菌发酵液、酵素发酵液、米曲霉发酵液、康氏木霉发酵液。
实施例1
一种预防烤烟青枯病的生物菌肥，该生物菌肥中的各组分按以下配比制成：
生物菌肥种子菌发酵液，(按体积百分比计：枯草芽孢杆菌20％、巨大芽孢杆菌20％、短小芽孢杆菌15％、侧孢芽孢杆菌15％、解淀粉芽孢杆菌15％、酵素5％、米曲霉5％、康氏木霉5％)，米糠；其中，生物菌肥种子菌发酵液与米糠的质量比为1：5。
预防烤烟青枯病的生物菌肥的制备方法，包括如下步骤：
S1、种子菌发酵液的制备，包括以下步骤：
A、将保存的枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌分别接入于牛肉膏蛋白胨固体培养基(NA)中，置于摇床上30℃，200r/min，培养72小时，将温度升高至36℃、200r/min，4-5h，使它们形成芽孢；
待培养基上长满菌丝再将其分别接种到LB(肉汤培养基)中，在28℃的恒温摇床，以110r/min中培养48小时，制成菌含量在3×108cfu/mL的相应菌悬液；
康氏木霉、米曲霉分别接入于马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)试管中，30℃培养3天，往试管中滴加5mL无菌水，振荡制备菌悬液；制成菌含量在3×108cfu/mL的相应菌悬液。
B、将制成的相应菌悬液按照5％的接种量分别接入到NB培养基中，在30℃的恒温摇床，以200r/min中培养48小时，得到相应种子菌发酵液；
C、将所得的不同种子菌发酵液，按体积百分比计，按照枯草芽孢杆菌20％、巨大芽孢杆菌20％、短小芽孢杆菌15％、侧孢芽孢杆菌15％、解淀粉芽孢杆菌15％、酵素5％、米曲霉5％、康氏木霉5％的比例配比，制成所需生物菌肥种子菌发酵液。
S2、将粉碎过的米糠过3mm的筛子，放进121℃高温干热灭菌箱内进行干热灭菌，灭菌3h后，得到完全灭菌的米糠；在无菌条件下，将生物菌肥种子菌发酵液和米糠，按照质量比1：5的比例进行均匀混合后转移到生化培养箱内进一步进行培养发酵设定时间。
S3、培养发酵完成后，将发酵物取出，置于38℃的鼓风干燥条件下风干，当含水率≤12％时，制得所述的预防烤烟青枯病与改良土壤的生物菌肥。
预防烤烟青枯病的生物菌肥的应用方法，应用于植烟土壤中，具体包括如下步骤：
(1)选择地块平整及排灌方便的试验田地。
(2)对所选植烟田块进行整地(翻耕、碎土、起垄)，做到垄沟平直，垄体饱满，垄面细碎。
(3)将所制得的生物菌肥与有机肥以按质量比1：5比例混合均匀，采取穴施的施肥方法。作基肥：将所混合的肥料放入按烟株行距和株距挖的坑内。生物菌肥最佳温度是25℃～37℃，因此，基肥施肥完成时，要及时起垄盖膜待栽。作追肥：在距离移栽后的烟株根部两三寸远的地方挖的小坑内。
烟田在施基肥阶段，以实施例1中的方法进行施肥，其余栽培措施按照生产标准(烤烟生产技术规程，DB51/T 1212-2011)进行，在移栽后60天、移栽后75天、移栽后90天调查青枯病发病率与病情指数，同时调查烤后烟叶的经济性状以及中上等烟比例，此为处理1。烟田在施基肥阶段，按照生产标准(烤烟生产技术规程，DB51/T 1212-2011)进行基肥施肥，其余栽培措施按照生产标准进行，在移栽后60天、移栽后75天、移栽后90天调查青枯病发病率与病情指数，同时调查烤后烟叶的经济性状以及中上等烟比例，此为处理2。试验在广西靖西、广东梅县进行，选择历年青枯病发病情况严重的田块作为试验田块，供试品种云烟87。
表1梅州梅县各处理青枯病发病情况
Figure BDA0002271867460000071
表2广西靖西各处理青枯病发病情况
Figure BDA0002271867460000072
Figure BDA0002271867460000081
由表1、2可知在使用实施例1的生物菌肥后，烤烟移栽后60天梅州梅县、靖西两地的发病率与不用生物菌肥相比，发病率分别下降了8.50％、12.44％，病情指数分别下降了1.77、1.96。在烤烟移栽后75天后，梅州梅县、云靖西两地的发病率与不用生物菌肥相比，发病率分别下降了13.01％、17.41％，病情指数分别下降了5.51、6.18。在烤烟移栽后90天后，梅州梅县、靖西两地的发病率与不用生物菌肥相比，发病率分别下降了26.12％、25.09％，病情指数分别下降了9.51、9.2。说明，在使用实施例1生物菌肥后能够显著降低烤烟青枯病的发病率、病情指数，可以有效减轻烤烟青枯病的发生，防止发病植株发病情况的进一步恶化。
表3梅州梅县不同处理烤后烟叶经济状况
Figure BDA0002271867460000082
表4广西靖西不同处理烤后烟叶经济状况
Figure BDA0002271867460000083
由表3、4可知在使用实施例1的生物菌肥后，梅州梅县的中上等烟比例上升了2.76％，产量提高了125.9kg〃hm-2，产值提高了3525.2元〃hm-2，靖西的中上等烟比例上述了3.86％，产量提高了338.9kg〃hm-2，产值提高了9517.2元〃hm-2，说明，在使用实施例1生物菌肥后能够显著提高烤后烟叶的中上等烟比例，提高烤烟的产量与产值，有效提高烟农的收入。
实施例2
一种预防烤烟青枯病的生物菌肥，该生物菌肥中的各组分按以下配比制成：
生物菌肥种子菌发酵液，(按体积百分比计：枯草芽孢杆菌20％、巨大芽孢杆菌20％、短小芽孢杆菌15％、侧孢芽孢杆菌15％、解淀粉芽孢杆菌15％、酵素5％、米曲霉5％、康氏木霉5％)，米糠；其中，生物菌肥种子菌发酵液与米糠的质量比为1：5。
预防烤烟青枯病的生物菌肥的制备方法，包括如下步骤：
S1、种子菌发酵液的制备，包括以下步骤：
A、将保存的枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌分别接入于牛肉膏蛋白胨固体培养基(NA)中，置于摇床上30℃，200r/min，培养72小时，将温度升高至36℃、200r/min，4-5h，使它们形成芽孢；
待培养基上长满菌丝再将其分别接种到LB(肉汤培养基)中，在28℃的恒温摇床，以110r/min中培养48小时，制成菌含量在3×108cfu/mL的相应菌悬液；
康氏木霉、米曲霉分别接入于马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)试管中，30℃培养3天，往试管中滴加5mL无菌水，振荡制备菌悬液；制成菌含量在3×108cfu/mL的相应菌悬液。
B、将制成的相应菌悬液按照5％的接种量分别接入到NB培养基中，在30℃的恒温摇床，以200r/min中培养48小时，得到相应种子菌发酵液；
C、将所得的不同种子菌发酵液，按体积百分比计，按照枯草芽孢杆菌20％、巨大芽孢杆菌20％、短小芽孢杆菌15％、侧孢芽孢杆菌15％、解淀粉芽孢杆菌15％、酵素5％、米曲霉5％、康氏木霉5％的比例配比，制成所需生物菌肥种子菌发酵液。
S2、将粉碎过的米糠过3mm的筛子，放进121℃高温干热灭菌箱内进行干热灭菌，灭菌3h后，得到完全灭菌的米糠；在无菌条件下，将生物菌肥种子菌发酵液和米糠，按照质量比1：5的比例进行均匀混合后转移到生化培养箱内进一步进行培养发酵设定时间。
S3、培养发酵完成后，将发酵物取出，置于38℃的鼓风干燥条件下风干，当含水率≤12％时，制得所述的预防烤烟青枯病与改良土壤的生物菌肥。
预防烤烟青枯病的生物菌肥的应用方法，应用于植烟土壤中，具体包括如下步骤：
(1)选择地块平整及排灌方便的试验田地。
(2)对所选植烟田块进行整地(翻耕、碎土、起垄)，做到垄沟平直，垄体饱满，垄面细碎。
(3)将所制得的生物菌肥与有机肥以按质量比1：5比例混合均匀，采取穴施的施肥方法。作基肥：将所混合的肥料放入按烟株行距和株距挖的坑内。生物菌肥最佳温度是25℃～37℃，因此，基肥施肥完成时，要及时起垄盖膜待栽。作追肥：在距离移栽后的烟株根部两三寸远的地方挖的小坑内。
烟田在施基肥阶段，以实施例2中的方法进行施肥，其余栽培措施按照生产标准(烤烟生产技术规程，DB51/T 1212-2011)进行，在移栽后60天、移栽后75天、移栽后90天调查青枯病发病率与病情指数，同时调查烤后烟叶的经济性状以及中上等烟比例，此为处理1。烟田在施基肥阶段，按照生产标准(烤烟生产技术规程，DB51/T 1212-2011)进行基肥施肥，其余栽培措施按照生产标准进行，在移栽后60天、移栽后75天、移栽后90天调查青枯病发病率与病情指数，同时调查烤后烟叶的经济性状以及中上等烟比例，此为处理2。试验在广西靖西、广东梅县进行，选择历年青枯病发病情况严重的田块作为试验田块，供试品种云烟87。
表5梅州梅县各处理青枯病发病情况
Figure BDA0002271867460000101
表6广西靖西各处理青枯病发病情况
由表5、6可知在使用实施例2的生物菌肥后，烤烟移栽后60天梅州梅县、靖西两地的发病率与不用生物菌肥相比，发病率分别下降了5.53％、7.93％，病情指数分别下降了1.59、2.01。在烤烟移栽后75天后，梅州梅县、云靖西两地的发病率与不用生物菌肥相比，发病率分别下降了13.15％、13.2％，病情指数分别下降了5.51、5.52。在烤烟移栽后90天后，梅州梅县、靖西两地的发病率与不用生物菌肥相比，发病率分别下降了22.89％、22.96％，病情指数分别下降了8.51、8.43。说明，在使用实施例2生物菌肥后能够显著降低烤烟青枯病的发病率、病情指数，可以有效减轻烤烟青枯病的发生，防止发病植株发病情况的进一步恶化。
表7梅州梅县不同处理烤后烟叶经济状况
Figure BDA0002271867460000112
表8广西靖西不同处理烤后烟叶经济状况
Figure BDA0002271867460000113
由表7、8可知在使用实施例1的生物菌肥后，梅州梅县的上等烟比例上升了1.43％，产量提高了240.2kg〃hm-2，产值提高了6725.6元〃hm-2，靖西的上等烟比例上述了2.09％，产量提高了242.2kg〃hm-2，产值提高了6781.6元〃hm-2，说明，在使用实施例2生物菌肥后能够显著提高烤后烟叶的中上等烟比例，提高烤烟的产量与产值，有效提高烟农的收入。
实施例3
一种预防烤烟青枯病的生物菌肥，该生物菌肥中的各组分按以下配比制成：
生物菌肥种子菌发酵液，(按体积百分比计：枯草芽孢杆菌20％、巨大芽孢杆菌20％、短小芽孢杆菌20％、侧孢芽孢杆菌10％、解淀粉芽孢杆菌15％、酵素5％、米曲霉5％、康氏木霉5％)，米糠；其中，生物菌肥种子菌发酵液与米糠的质量比为1：5。
预防烤烟青枯病的生物菌肥的制备方法，包括如下步骤：
S1、种子菌发酵液的制备，包括以下步骤：
A、将保存的枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌分别接入于牛肉膏蛋白胨固体培养基(NA)中，置于摇床上30℃，200r/min，培养72小时，将温度升高至36℃、200r/min，4-5h，使它们形成芽孢；
待培养基上长满菌丝再将其分别接种到LB(肉汤培养基)中，在28℃的恒温摇床，以110r/min中培养48小时，制成菌含量在3×108cfu/mL的相应菌悬液；
康氏木霉、米曲霉分别接入于马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)试管中，30℃培养3天，往试管中滴加5mL无菌水，振荡制备菌悬液；制成菌含量在3×108cfu/mL的相应菌悬液。
B、将制成的相应菌悬液按照5％的接种量分别接入到NB培养基中，在30℃的恒温摇床，以200r/min中培养48小时，得到相应种子菌发酵液；
C、将所得的不同种子菌发酵液，按体积百分比计，按照枯草芽孢杆菌20％、巨大芽孢杆菌20％、短小芽孢杆菌20％、侧孢芽孢杆菌10％、解淀粉芽孢杆菌15％、酵素5％、米曲霉5％、康氏木霉5％的比例配比，制成所需生物菌肥种子菌发酵液。
S2、将粉碎过的米糠过3mm的筛子，放进121℃高温干热灭菌箱内进行干热灭菌，灭菌3h后，得到完全灭菌的米糠；在无菌条件下，将生物菌肥种子菌发酵液和米糠，按照质量比1：5的比例进行均匀混合后转移到生化培养箱内进一步进行培养发酵设定时间。
S3、培养发酵完成后，将发酵物取出，置于38℃的鼓风干燥条件下风干，当含水率≤12％时，制得所述的预防烤烟青枯病与改良土壤的生物菌肥。
预防烤烟青枯病的生物菌肥的应用方法，应用于植烟土壤中，具体包括如下步骤：
(1)选择地块平整及排灌方便的试验田地。
(2)对所选植烟田块进行整地(翻耕、碎土、起垄)，做到垄沟平直，垄体饱满，垄面细碎。
(3)将所制得的生物菌肥与有机肥以按质量比1：5比例混合均匀，采取穴施的施肥方法。作基肥：将所混合的肥料放入按烟株行距和株距挖的坑内。生物菌肥最佳温度是25℃～37℃，因此，基肥施肥完成时，要及时起垄盖膜待栽。作追肥：在距离移栽后的烟株根部两三寸远的地方挖的小坑内。
烟田在施基肥阶段，以实施例3中的方法进行施肥，其余栽培措施按照生产标准(烤烟生产技术规程，DB51/T 1212-2011)进行，在移栽后60天、移栽后75天、移栽后90天调查青枯病发病率与病情指数，同时调查烤后烟叶的经济性状以及中上等烟比例，此为处理1。烟田在施基肥阶段，按照生产标准(烤烟生产技术规程，DB51/T 1212-2011)进行基肥施肥，其余栽培措施按照生产标准进行，在移栽后60天、移栽后75天、移栽后90天调查青枯病发病率与病情指数，同时调查烤后烟叶的经济性状以及中上等烟比例，此为处理2。试验在广西靖西、广东梅县进行，选择历年青枯病发病情况严重的田块作为试验田块，供试品种云烟87。
表9梅州梅县各处理青枯病发病情况
Figure BDA0002271867460000141
表10广西靖西各处理青枯病发病情况
由表9、10可知在使用实施例3的生物菌肥后，烤烟移栽后60天梅州梅县、靖西两地的发病率与不用生物菌肥相比，发病率分别下降了6.41％、6.77％，病情指数分别下降了1.66、1.84。在烤烟移栽后75天后，梅州梅县、云靖西两地的发病率与不用生物菌肥相比，发病率分别下降了10.04％、11.3％，病情指数分别下降了4.74、4.90。在烤烟移栽后90天后，梅州梅县、靖西两地的发病率与不用生物菌肥相比，发病率分别下降了21.8％、23.98％，病情指数分别下降了8.66、8.89。说明，在使用实施例3生物菌肥后能够显著降低烤烟青枯病的发病率、病情指数，可以有效减轻烤烟青枯病的发生，防止发病植株发病情况的进一步恶化。
表11梅州梅县不同处理烤后烟叶经济状况
Figure BDA0002271867460000143
表12广西靖西不同处理烤后烟叶经济状况
Figure BDA0002271867460000151
由表11、12可知在使用实施例1的生物菌肥后，梅州梅县的中上等烟比例上升了2.66％，产量提高了79.5kg〃hm-2，产值提高了2226元〃hm-2，靖西的中上等烟比例上述了3.11％，产量提高了216.9kg〃hm-2，产值提高了6073.2元〃hm-2，说明，在使用实施例3生物菌肥后能够显著提高烤后烟叶的中上等烟比例，提高烤烟的产量与产值，有效提高烟农的收入。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变形，本发明的范围由所附权利要求极其等同限定。

Claims (10)

1.一种预防烤烟青枯病的生物菌肥，其特征在于，由生物菌肥种子菌发酵液和米糠组成；所述生物菌肥种子菌发酵液与米糠的质量比为1：3～8。
2.根据权利要求1所述的预防烤烟青枯病的生物菌肥，其特征在于，所述生物菌肥种子菌发酵液与米糠的质量比为1：5。
3.根据权利要求1或2所述的预防烤烟青枯病的生物菌肥，其特征在于，所述生物菌肥种子菌发酵液中，按体积百分比，由以下组分组成：枯草芽孢杆菌5～20％、短小芽孢杆菌5～20％、侧孢芽孢杆菌5～20％、巨大芽孢杆菌5～20％、解淀粉芽孢杆菌5～15％、酵素5～10％、米曲霉5～10％、康氏木霉5～10％。
4.根据权利要求3所述的预防烤烟青枯病的生物菌肥，其特征在于，所述生物菌肥种子菌发酵液中，按体积百分比，由以下组分组成：枯草芽孢杆菌10～20％、短小芽孢杆菌10～20％、侧孢芽孢杆菌10～20％、巨大芽孢杆菌5～20％、解淀粉芽孢杆菌10～15％、酵素5％、米曲霉5～10％、康氏木霉5％。
5.根据权利要求3所述的预防烤烟青枯病的生物菌肥，其特征在于，所述生物菌肥种子菌发酵液中，按体积百分比，由以下组分组成：枯草芽孢杆菌10～20％、短小芽孢杆菌10～20％、侧孢芽孢杆菌10～20％、巨大芽孢杆菌10～20％、解淀粉芽孢杆菌10～15％、酵素5％、米曲霉5％、康氏木霉5％。
6.上述权利要求1至5中任一项预防烤烟青枯病的生物菌肥的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、分别将枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、酵素、米曲霉、康氏木霉的种子菌发酵液按照设定的比例配比，制成所需生物菌肥种子菌发酵液；
S2、将粉碎过的米糠过筛，干热灭菌第一设定时间后，得到完全灭菌的米糠；在无菌条件下，将生物菌肥种子菌发酵液和米糠，按照质量比1：3～8的比例进行均匀混合后转移到生化培养箱内进一步进行培养发酵第二设定时间；
S3、培养发酵完成后，将发酵物取出，置于38℃的鼓风干燥条件下风干，当含水率≤12％时，制得预防烤烟青枯病的生物菌肥。
7.根据权利要求6所述的预防烤烟青枯病的生物菌肥的制备方法，其特征在于，所述种子菌发酵液有效菌含量均在3×108cfu/mL以上。
8.根据权利要求6所述的预防烤烟青枯病的生物菌肥的制备方法，其特征在于，所述种子菌发酵液的制备方法，包括以下步骤：
1)培养基的制备
牛肉膏蛋白胨固体培养基的组成：牛肉浸膏、蛋白胨、葡萄糖、琼脂及蒸馏水；
营养肉汤培养基的组成：牛肉浸膏、蛋白胨、葡萄糖及蒸馏水；
肉汤培养基的组成：胰蛋白胨、酵母提取物及氯化钠；
马铃薯葡萄糖琼脂培养基的组成：去皮马铃薯、葡萄糖、琼脂及蒸馏水；
2)将枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌分别接入牛肉膏蛋白胨固体培养基中，置摇床上30℃，200r/min，培养72小时，将温度升高至36℃、200r/min，4-5h，使它们形成芽孢；
待培养基上长满菌丝再将其分别接种到肉汤培养基中，在28℃的恒温摇床，以110r/min中培养48小时，制成菌含量在3×108cfu/mL的菌悬液A；
将康氏木霉和米曲霉接入于马铃薯葡萄糖琼脂培养基中，30℃培养3天，滴加无菌水，振荡制备菌悬液，制成菌含量在3×108cfu/mL的菌悬液B；
3)将制成的菌悬液A和菌悬液B分别接入到营养肉汤培养基中，在30℃的恒温摇床，以200r/min中培养48小时，得到种子菌发酵液。
9.上述权利要求1至5中任一项预防烤烟青枯病的生物菌肥的应用，其特征在于，所述生物菌肥应用于植烟土壤。
10.根据权利要求9所述的预防烤烟青枯病的生物菌肥的应用，其特征在于，还包括有机肥，所述生物菌肥与所述有机肥的质量比为1：3～8。
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