CN103834591B - 人参促生细菌fy4-2及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了从大量人参内生细菌中筛选到一株具有产生长素、固氮、解磷、解钾和产铁载体特性，并对宿主人参生长具有促进功能的细菌菌株FY4-2。经鉴定为阿氏肠杆菌（Enterobacter asburiae）。它产IAA能力强，可达到13.5μg/mL，无氮条件下长势良好，具有固氮潜能，定量测定其解磷含量，可达到130.6μg/mL，解钾可达到4.33μg/mL，有产生铁载体的能力，其活性达92%。能促进人参种子发芽生长，芽长增加81.97%；对人参根生长具有明显的促进作用，鲜重增加40.5%，干重增加43.97%；该菌株的发现为人参促生菌肥的开发及其利用奠定了良好的基础。
Description
技术领域
本发明属微生物领域，确切地说是人参促生细菌FY4-2及其应用。
背景技术
近二十年来，伴随化肥和农药的大量使用，在满足作物高产防病的同时，所带来的土壤恶化、环境污染等问题也越来越严重。此外，随着石油能源的日趋匮乏, 以石油为原料的化肥和农药生产成本日益提高，进而导致农业成本逐渐上升, 效益日益下降。这些问题都对人类的生产生活构成了极大的威胁。发展新型肥料，应用生物防治是现代农业和未来农业的必然趋势。近年来，微生物菌肥具有对人畜安全、不污染环境等优点已受到人们的重视，开展了一些相关研究和应用。而发展微生物菌肥的前提是获得具有高效生物活性功能的有益微生物，例如具有促进植物生长的微生物，简称植物促生菌。植物促生菌促进植物生长的机理不尽相同，其可合成某些对作物生长发育有直接作用的物质和（或）改变土壤中某些无效元素的形态，使之有效化而利于作物吸收，作用途径包括分泌有机酸溶解磷并使之有效化；自生固氮；通过嗜铁素增加植物铁营养；产生植物激素，调节植物乙烯等。植物促生菌还具有抑制或减轻某些植物病害对作物生长发育和产量的不良影响，其间接作用途径包括产生抗生素抑制植物病原微生物；清除植物根围可供病原菌利用的铁；诱导植物系统获得抗性；合成抗真菌代谢物；与病原微生物争夺根围生存空间等。
人参是我国最为重要的中药材之一，被称为“百草之王”。 2012年，人参（人工种植）被国家卫生部批准为新资源食品，消费量和市场需求量极具增加。人参种植对土壤和环境条件要求较高，在我国主要集中在吉林省长白山地区。吉林省人参产量占全国80%、世界70%，出口占世界60%，是吉林省主要出口创汇的农产品。在有限的土地资源条件下，提高人参产量和品质是满足市场需求的基础，保护种植区生态环境是人参产业可持续发展的必要条件，减少化肥农药不合理使用所造成的品质下降、农药残留超标等问题是人参产品顺利出口的重要保障。因此，分离筛选获得具有促进植物生长的微生物并研制成菌肥加以应用对于发展人参产业具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是为了减少化肥的使用，而提供一种对人参生长具有促进功能的人参内生菌株，人参促生细菌FY4-2。
阿氏肠杆菌株FY4-2，保藏编号为CCTCC NO：M2013630。
阿氏肠杆菌株FY4-2，它来源于人参体内，为人参内生菌。
阿氏肠杆菌株FY4-2在促进人参发芽及生长方面的应用。
一种生物菌肥，它是阿氏肠杆菌株FY4-2菌体的无菌水悬浮液；
所述的菌体的无菌水悬浮液浓度为108-109 cfu/mL。
本发明提供了从大量人参内生细菌中筛选到一株具有产生长素、固氮、解磷、解钾和产铁载体特性，并对宿主人参生长具有促进功能的细菌菌株FY4-2。经鉴定为阿氏肠杆菌（Enterobacter asburiae）。它产IAA能力强，可达到13.5μg/mL，无氮条件下长势良好，具有固氮潜能，定量测定其解磷含量，可达到130.6 μg/mL，解钾可达到4.33 μg/mL，有产生铁载体的能力，其活性达92%。能促进人参种子发芽生长，芽长增加81.97%；对人参根生长具有明显的促进作用，鲜重增加40.5%，干重增加43.97%；该菌株的发现为人参促生菌肥的开发及其利用奠定了良好的基础。
附图说明
图1 FY4-2菌株产生IAA图；
图2 FY4-2菌株促生功能分析图；其中，1：固氮潜能，2：解磷特性，3：解钾特性，4：产体载体能力；
图3 FY4-2菌株在NA培养基上的菌落形态；
图4 FY4-2菌株电镜下观察的菌体形态；
图5 FY4-2 菌株的分子鉴定聚类图谱；
图6 FY4-2菌株对人参种子发芽的促生作用图；
图7 FY4-2菌株对人参种子发芽的促生作用结果；
图8 FY4-2菌株对人参根的促生作用图；
图9 FY4-2菌株对人参根鲜重的促生作用结果；
图10 FY4-2菌株对人参根干重的促生作用结果。
具体实施方式
实施例一 菌株FY4-2促生特性的测定
从来自于吉林省健康人参植株体内，采用平板稀释法筛选获得了人参内生细菌FY4-2。
1. 产IAA能力的测定
将FY4-2接种到液体LB培养基中，30℃ 160rpm培养12h。测定吸光值后将菌液在工作台操作下稀释到吸光值0.8左右。取0.2ml接种到含100mg/L色氨酸培养基中，培养48h后10000rpm离心5min，取上清液2ml加入显色液4ml，暗处放置0. 5h 后在540nm 下测定吸光值。共得到6株产IAA能力较高的菌株，其中FY4-2产IAA能力最高，可达到13.5μg/mL（图1）。
2. 固氮能力的测定
将FY4-2划线接种于Ashby固体培养基上，30℃恒温培养2d，观察菌株长势，结果发现菌株FY4-2在无氮条件下长势良好，具有固氮潜能（图2）。
3. 人参内生解磷细菌的测定
采用PKO固体培养法，将分离于吉林省健康人参植株体内的内生细菌FY4-2接种在NA培养基上，培养12h后，打孔接种于PVK固体培养基，3d后观察解磷圈大小。然后将FY4-2菌株采用钼锑钪比色法进行解磷效果的检测，方法为将FY4-2菌株打菌碟接种于50mL LB液体培养基，160 r/min培养12h。取1 mL接种于装有50 mL PVK液体培养基的150 mL三角瓶中，3 d后取培养液5mL，8000 r/min离心5min后取上清，钼锑钪比色法测量可溶性磷含量。结果显示，在PVK平板上，FY4-2菌株具有清晰可见的解磷圈（图2）；定量测定其解磷含量，可达到130.6 μg/mL。
4. 解钾能力的测定
初筛采用硅酸盐固体培养基，将在NA培养基上培养好的FY4-2菌块接种于硅酸盐固体培养基上，30℃培养3d后观察解钾圈大小。复筛采用火焰光度法，将FY4-2接种到液体LB培养基上，30℃，160 rpm培养12h后测定吸光值。取2ml菌液接入50ml液体硅酸盐培养基中，30℃，160 rpm培养72h后，用火焰光度计定量测量解钾含量。结果显示，在硅酸盐平板上，FY4-2菌株具有明显的的解钾圈（图2）；定量测定其解钾含量，可达到4.33 μg/mL。
5. 产铁载体能力的测定
采用刃天青法定性和定量测定FY4-2产铁载体能力。定性检测是将在NA培养基上培养好的FY4-2菌块接种到刃天青平板，28℃培养3天后观察蓝色培养基上橙黄色晕圈的出现和大小。定量检测是用铂金丝接种环取一环新鲜菌苔于MKB液体培养基内，28℃摇床培养(150 r/min) 48h后，取菌液10 ml，8000 rpm离心10 min，取上清3 ml到试管，再加入3ml刃天青检测液混匀，1h后测量630nm下的吸光值（As），以双蒸水为对照调零。另外，取3ml未接菌的MKB液体培养基与3ml刃天青检测液混匀后做同样处理，其吸光值为（Ar）。根据公式：铁载体活性单位% =［(Ar－As) /Ar］×100 计算菌株产铁载体的量。结果FY4-2有产生铁载体的能力，其活性高达92%（图2）。
实施例二 菌株FY4-2的鉴定
将FY4-2菌株划线接种在NA培养基上，28℃培养12~24h后，观察记录单菌落形态。FY4-2在NA培养基上呈淡黄色不透明圆形小菌落，边缘整齐（图3）。
取在LB液体培养基中培养24h的FY4-2菌株菌液，离心用无菌水反复冲洗后，悬浮于适量无菌水中进行负染色制备样品，用镊子夹住带膜的铜网蘸取微量菌液，静置2 min，从边缘用滤纸吸干剩余液；然后再用镊子夹住带菌的铜网浸入盛有双蒸水的烧杯内漂洗，再用滤纸吸干液体，接着用2%磷钨酸负染色5 min，干燥后用透射电镜观察发现菌体呈杆状，具有周生鞭毛（图4）。
参照《常见细菌系统鉴定手册》和《伯杰系统鉴定手册》中推荐的部分培养基（表1）和方法测定FY4-2菌株的生理生化特性发现，菌株FY4-2为革兰氏染色阴性菌；接触酶、氧化酶、V-P反应为阳性；能利用柠檬酸、丙二酸，使硝酸盐还原；但不能使淀粉和油脂水解，可使明胶液化；石蕊牛奶试验产酸，对NaCl 的耐受性为7%；可以利用葡萄糖、甘露醇、半乳糖和果糖。
表1 菌株FY4-2的生理生化特性
| 鉴定项目 | 鉴定结果 | 鉴定项目 | 鉴定结果 | 鉴定项目 | 鉴定结果 |
| 革兰氏染色 | 明胶液化 | + | 甲基红试验 | ||
| 氧化酶 | + | 石蕊牛奶 | 产酸 | 最高耐盐性 | 7% |
| 接触酶 | + | 脲酶 | 葡萄糖利用 | + | |
| V-P | + | 硝酸盐还原 | + | 甘露醇利用+ | + |
| 吲哚 | 柠檬酸盐利用 | + | 乳糖利用 | ||
| 淀粉水解 | 丙二酸利用 | + | D-半乳糖利用 | + | |
| 油脂水解 | 精氨酸双水解 | + | D-果糖利用 | + |
注：“+”表示阳性，“-”表示阴性。
获得菌株16S rDNA序列与GenBank数据库中序列进行BLAST分析比对，登录号为KF928970，构建系统进化树（图5）。FY4-2与Enterobacter asburiae聚于同一分支中，其相似性达到99%。通过形态特征、培养特征、生理生化特征和分子生物学鉴定结果，FY4-2菌株为阿氏肠杆菌（Enterobacter asburiae）。阿氏肠杆菌（Enterobacter asburiae）FY4-2菌株,已于2013年12月4日送中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO：M2013630。保藏中心地址：中国武汉市武汉大学，邮编：430072。
实施例三 菌株FY4-2对人参生长的影响
1. 种子发芽试验
菌株FY4-2接种LB培养液摇床过夜培养后，8000 rpm离心5 min收集菌体。用无菌水洗涤2次后重悬浮于无菌水中，血球计数板测定浓度并将其稀释成浓度为109 cfu/mL的细菌悬浮液。选择将已后熟的人参种子浸泡在菌悬液中3h，取出晾干表面液体后，置于装有无菌湿润沙子的培养皿中，每皿15粒种子，即为1次重复，6次重复，于暗处18~23℃放置催芽10~15d，以无菌水处理的种子为对照。结果显示（表2，图6，图7），FY4-2菌株处理的人参种子芽长平均值为22.2 mm，大于清水对照处理（12.2 mm），芽长增加81.97%，表明FY4-2菌株对人参种子发芽生长具有显著地促进作用。
2. 对人参根的促生效果
试验于2012年10月20日将大小均匀的2年生人参苗种植于土壤肥力一致的人参床中，种植深度5cm。2013年6月5日，人参出苗完全展叶后用108 cfu/mL的FY4-2菌悬液进行灌根处理，每重复10株人参苗，浇灌200mL菌悬液，对照浇灌相同体积的水，4次重复，每10天浇灌1次，共3次。2013年10月25日人参地上部茎叶脱落后，挖出人参根，10株为单位测定根鲜重和干重。
表2 FY4-2菌株对人参种子发芽和根生长的促生效果
| 处理 | 平均芽长（mm） | 根平均鲜重（g/10株） | 根平均干重（g/10株） |
| FY4-2处理 | 22.2 | 78.40 | 22.69 |
| 清水对照 | 12.2 | 55.80 | 15.76 |
检测结果表明，FY4-2菌株对人参根生长具有明显的促进作用，经FY4-2菌株处理的人参与对照相比，鲜重增加40.5%，干重增加43.97%，统计结果详见表2，图8，图9，图10。
Claims (5)
1.阿氏肠杆菌株FY4-2（Enterobacter asburiae），保藏编号为CCTCC NO：M2013630。
2.权利要求1所述的阿氏肠杆菌株FY4-2，它来源于人参体内，为人参内生菌。
3.权利要求1所述的阿氏肠杆菌株FY4-2在促进人参发芽及生长方面的应用。
4.一种生物菌肥，它是权利要求1所述的阿氏肠杆菌株FY4-2菌体的无菌水悬浮液。
5.根椐权利要求4所述的一种生物菌肥，其特征在于：所述的菌体的无菌水悬浮液浓度为108-109 cfu/mL。
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