CN103468605B

CN103468605B - 分离自冷浸田土壤的肠杆菌cj-22及其应用

Info

Publication number: CN103468605B
Application number: CN201310337134.8A
Authority: CN
Inventors: 谢晓梅; 廖敏; 陈娜; 张楠
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2013-08-05
Filing date: 2013-08-05
Publication date: 2015-04-22
Anticipated expiration: 2033-08-05
Also published as: CN103468605A

Abstract

本发明提供了一株分离自冷浸田土壤的肠杆菌（Enterobacter sp.）CJ-22，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，100101，保藏编号：CGMCC No.7392，保藏日期：2013年03月29日。本发明经筛选获得了一株用于含铜锌酸性矿山废水处理的阿氏肠杆菌CJ-22，为控制含铜锌酸性矿山废水排放对环境的影响提供了技术基础，应用前景广阔。

Description

分离自冷浸田土壤的肠杆菌CJ-22及其应用

（一）技术领域

本发明涉及一株分离自冷浸田土壤的肠杆菌（Enterobacter sp.）CJ-22，及其在含铜锌酸性矿山废水处理中的应用。

（二）背景技术

随着全球工业化的迅速发展，矿产资源的开发进一步加剧，由此而产生的酸性矿山废水已经成为许多国家水体污染的主要来源之一。据不完全统计，美国水体中的酸就有70%是来自酸性矿山废水。酸性矿山废水的形成与硫化矿物的开采、加工过程都有关系。一旦硫化矿石接触到水体，空气中氧气和细菌就会将其氧化并产生酸性矿山废水，同时，由于一些金属硫化物也会被氧化而释放出大量金属离子，使得酸性矿山废水具有低pH值、高酸度、高金属浓度以及含大量硫酸盐等特点。因此，酸性矿山废水具有很大的危害性，它会腐蚀金属设备，污染地表水和地下水，引起土壤酸化和盐渍化，废水中的重金属还会通过食物链进入人体，危害到人体健康。

目前，对于酸性矿山废水的处理主要有这几种方法：中和法、人工湿地法、硫化物沉淀法和微生物法。中和法就是向酸性矿山废水中投加石灰石或石灰来中和废水中的氢离子，该法的缺点是成本较高，反应生成的硫酸钙残渣较多，容易造成二次污染；人工湿地法主要是利用湿地系统中的植物、土壤等对酸性废水中的金属离子进行吸附、过滤，该法操作简单，易于管理，但是由于占地面积大，处理程度易受环境影响，而且处理后残余的H₂S会进人大气，从而造成大气污染等缺点使它的应用受到限制；硫化物沉淀法是利用金属硫化物的溶解度往往比氢氧化物的溶解度更低的原理，向废水中投加硫化物，对废水中的金属离子进行选择性的沉淀。但是该法中的pH值不好控制，成本也较高，而且如果这些硫化物的沉积污泥不在水下封存或排除氧化条件，其可能再氧化生成硫酸，重新造成环境问题；微生物法就是利用硫酸盐还原菌在厌氧条件下将酸性矿山废水中的硫酸盐还原为硫化物，生成的硫化物再与废水中的重金属发生反应生成难溶解的金属硫化物。国外研究发现微生物技术不但处理效果较好，而且成本也较低，无二次污染，因而微生物技术受到广泛关注，而相关技术研究我国较少。

（三）发明内容

本发明目的是提供一株能够用于含铜锌酸性废水处理的菌株——肠杆菌（Enterobacter sp.）CJ-22。

本发明采用的技术方案是：

一株分离自冷浸田土壤的肠杆菌（Enterobacter sp.）CJ-22，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，100101，保藏编号：CGMCCNo.7392，保藏日期：2013年03月29日。

该菌株的菌落特征如下：为杆菌，不产胞子且具有小的荚膜，革兰氏阴性，菌体大小为（0.8～1.6）μm×（0.5～0.8）μm，在固体培养基上，菌落呈圆形，表面凸起、光滑，边缘完整，呈白色，不透明。。

该菌株16S rDNA基因序列如SEQ ID NO.1所示：

TCGATCAAGTGGTAGCGCCCTCCCGAAGGTTAAGCTACCTACTTCTTTTGCAACCCACTCCCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGTAGCATTCTGATCTACGATTACTAGCGATTCCGACTTCATGGAGTCGAGTTGCAGACTCCAATCCGGACTACGACGTACTTTATGAGGTCCGCTTGCTCTCGCGAGGTCGCTTCTCTTTGTATGCGCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCTGGTCGTAAGGGCCATGATGACTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCAGTTTATCACTGGCAGTCTCCTTTGAGTTCCCGGCCGAACCGCTGGCAACAAAGGATAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATTTCACAACACGAGCTGACGACAGCCATGCAGCACCTGTCTCACAGTTCCCGAAGGCACCAAACCATCTCTGGAAAGTTCTGTGGATGTCAAGAGCAGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCATCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCATTTGAGTTTTAACCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGTCGATTTAACGCGTTAGCTCCGGAAGCCACGCCTCAAGGGCACAACCTCCAAGTCGACATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGCACCTGAGCGTCAGTCTTTGTCCAGGGGGCCGCCTTCGCCACCGGTATTCCTCCAGATCTCTACGCATTTCACCGCTACACCTGGAATTCTACCCCCCTCTACAAGACTCTAGCCTGCCAGTTTCGAATGCAGTTCCCAGGTTGAGCCCGGGGATTTCACATCCGACTTGACAGACCGCCTGCGTGCGCTTTACGCCCAGTAATTCCGATTAACGCTTGCACCCTCCGTATTACGCGGCTGCTGGCACGAGTAGCGTGCTCTCTGCGGTACGTCAATCGACGAGTTATTACTCATCACTTCCTCCCCGCTGA。

本发明菌株由采集江西省赣州市赣县田独镇的冷浸田水稻土中筛选获得，根据Sherlock MIS软件系统对菌株CJ-22定性和定量的分析生成的脂肪酸图谱，对比Library数据库，初步鉴定菌CJ-22为肠杆菌属（Enterobacter sp.）中的阿氏肠杆菌（Enterobacter asburiae），相似指数SI（similarity index）为0.943；用16S rDNA测序鉴定方法也证明该菌株为阿氏肠杆菌。

本发明还涉及所述的肠杆菌CJ-22在含铜锌酸性矿山废水处理中的应用。具体的，所述菌株用于去除含铜锌酸性矿山废水中的硫酸根离子、铜离子或锌离子。将本发明菌株接种至含铜锌酸性矿山废水中，在28～32℃、150～200r·min^-1的厌氧条件下进行培养3～10d，可有效去除废水中的硫酸根离子、铜离子和锌离子。

矿山废水是矿井内的天然溶滤水、选矿废水、选矿废渣堤堰的溢流水以及矿渣堆积场的浸出水等的总称。本发明所述的含铜锌酸性矿山废水，是指主要含硫酸根离子、铜离子和锌离子的矿山废水，其硫酸根浓度为500～3000mg·L^-1、锌离子浓度50～500mg·L^-1、铜离子浓度50～500mg·L^-1。

该菌株能用于含铜锌酸性废水处理，在厌氧条件下、pH4.0、温度（25～30）℃、OD_415nm0.2、硫酸根浓度1427mg·L^-1、锌离子浓度223mg·L^-1、铜离子浓度210mg·L^-1、转速180r·min^-1的条件下，培养3天，过滤，3种离子的去除率分别为98.1%、99.5%、99.7%，硫酸根、锌离子、铜离子残余处浓度分别为27.1mg·L^-1、1.13mg·L^-1、0.63mg·L^-1、处理后的废水经pH中和，可达到国家GB8978-1996污水综合排放标准限量标准排放。

本发明的有益效果主要体现在：本发明经筛选获得了一株用于含铜锌酸性矿山废水处理的阿氏肠杆菌CJ-22，为控制含铜锌酸性矿山废水排放对环境的影响提供了技术基础，应用前景广阔。

（四）附图说明

图1为阿氏肠杆菌CJ-22的电镜照片（放大50000倍）；

图2为16S rDNA PCR扩增结果（ZA：菌株CJ-22；Marke：DNA标准分子量）；

图3为基于16S rDNA序列的菌株CJ-22系统发育树；

（五）具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：降解菌株的筛选与鉴定

1材料与方法

1.1培养基和试剂

富集培养基：Na₂S₂O₃·5H₂O（10、15、25、30或50g）（逐步提高加入进行驯化富集），CaCl₂·6H₂O0.1g，MgCl₂0.25g，K₂HPO₄1.5g，NH₄Cl1g，蛋白胨9g，H₂O500mL，pH=4.0～4.2；

基础培养基：NH₄NO₃1.00g，MgSO₄.7H₂O0.5g，(NH₄)₂SO₄0.5g，KH₂PO₄0.5g，NaCl0.5g，K₂HPO₄1.5g，H₂O1000mL，pH4.0；

基础培养基加入1.5%（w/v，每100mL加1.5g）琼脂和100g.L^-1的Na₂S₂O₃·5H₂O即配成相应的固体基础培养基；

pH4.0、硫酸根浓度1427mg·L^-1、锌离子浓度223mg·L^-1、铜离子浓度210mg·L^-1的酸性矿山废水。

1.2菌株对含铜锌酸性矿山废水处理效能的测定

将纯化后的单个菌株以菌量OD_415nm=0.2接种到100mL酸性矿山废水（pH4.0、硫酸根浓度1427mg·L^-1、锌离子浓度223mg·L^-1、铜离子浓度210mg·L^-1）250mL三角瓶中，以不接菌的培养液作对照，在30℃、180r·min^-1的恒温摇床上振荡厌氧培养3天。培养结束后，用0.45μm膜过滤，滤液用于相应离子的测定，其中硫酸根含量用离子色谱仪测定，锌离子和铜离子含量用原子吸收分光光度仪测定。

去除率（%）=（对照样品残留量-处理样品残留量）×100/对照样品残留量

1.3优势降解菌株选育

1.3.1菌株来源

采集江西省赣州市赣县田独镇的冷浸田水稻土。

1.3.2降解菌株的分离、纯化和筛选

从每份冷浸田土样中取10g，在无菌的条件下，分别加到100mL无菌液体富集培养基的250mL三角瓶中．在30℃下180r·min^-1摇床上培养7天后，按10%接种量转移到下一批富集培养基上（Na₂S₂O₃·5H₂O梯度依次为20、30、50、60或100g g·L^-1），同条件驯化培养7天。然后再按10%接种量转接到含100g·L^-1的Na₂S₂O₃·5H₂O无菌液体的基础培养基中，继续培养7天，连续转接2次后从Na₂S₂O₃·5H₂O浓度为100g·L^-1基础培养基中，取0.1mL基础培养基发酵液反复进行平板划线分离、纯化，直到筛选得到单个菌落，将纯菌落接种到斜面上，于4℃冰箱内保存。

1.3.3菌株鉴定

菌株鉴定采用美国MIDI公司的Sherlock microbial identity system（MIS）软件系统，该系统将基础培养基上纯化的单菌落按照MIDI公司的操作规范进行脂肪酸的提取和分析，定性（种类）和定量（含量）地分析微生物的脂肪酸成份并生成脂肪酸图谱，将生成的图谱和数据库（Library）进行比对，根据相似指数SI（similarity index）鉴定未知菌种，相似指数SI大于0.9就基本可确定是某种微生物。该系统是一相对快速和具有丰富菌库的微生物鉴定系统，已得到较广泛的应用（吴愉萍，徐建明，汪海珍等.SherlockMIS系统应用于土壤细菌鉴定的研究．土壤学报，2006，43(4):642-647）。

此外，同时用16S rDNA鉴定方法进行验证，与Sherlock microbialidentity system(MIS)进行比较。以CJ-22菌株总DNA为模板，用16S rDNA基因的通用引物进行PCR扩增，得到的扩增片段经回收、测序可明确其大小，再将测序结果用BLAST软件与GenBank中的序列进行同源性比较。

1.3.4菌株形态特征观察及生理生化特性测定

将菌株接种在固体培养基中，48h后电镜观察菌株形态特征；取纯化的菌株生长的对数期进行革兰氏、结晶紫简单荚膜等染色；生理生化特性测定参照《常见细菌系统鉴定手册》（东秀珠，蔡妙英）。

2.结果

2.1菌株的分离与筛选

经分离、纯化、筛选获得1株能有效处理含铜锌酸性矿山废水的细菌，命名为CJ-22，其它菌株降解力都不同程度地衰退，培养3天，发现它对硫酸根、锌离子及铜离子3种离子的去除率分别为98.1%、99.5%、99.7%。

2.2菌株的鉴定

2.2.1菌株CJ-22基本形态及生理生化特征

该菌为杆菌，不产胞子且具有小的荚膜，革兰氏阴性，菌体大小约为长（0.8～1.6）μm、宽（0.5～0.8）μm（如图1），在固体培养基上，菌落圆形，表面凸起、光滑，边缘完整，呈白色，不透明。乙酰甲基甲醇生成试验（v-p）反应阳性，吲哚实验阴性，不能液化明胶，其他生理生化特性见表1。

表1:阿氏肠杆菌的生理生化特性

测试项目	结果	生理生化测试	结果
				革兰氏染色	-	V-P实验	+
甲基红	-	吲哚实验	-
				脂酶	-	硫化氢	+
赖氨酸脱羧酸	-	苯丙氨酸脱氨酶	-
				鸟酸氨脱羧酶	+	氧化酶	-
柠檬酸盐	-	脲酶水解	-
				木糖	+	精氨酸双水解酶	-
葡萄糖产气	-	蔗糖产酸	-
				丙二酸	-	麦芽糖产酸	-
乳糖	+	卫矛醇产酸	-
				L-丙氨酸	+	反硝化	-
水杨酸	-	液化明胶	-

注：+阳性反应；-阴性反应

2.2.2菌株CJ-22鉴定

（1）Sherlock MIS系统对CJ-22的鉴定

根据Sherlock MIS软件系统对菌CJ-22脂肪酸定性和定量的分析生成的脂肪酸图谱，对比Library数据库，初步鉴定菌CJ-22为肠杆菌属（Enterobacter sp.）中的阿氏肠杆菌（Enterobacter asburiae），相似指数SI(similarity index)为0.943。

（2）16S rDNA鉴定方法对CJ-22的验证

I.DNA提取结果

以CJ-22菌株总DNA为模板，用16S rDNA基因的通用因为进行PCR扩增，得到1条约为1kb的片段（图1）。扩增片段经回收、测序明确其大小为1025bp（SEQ ID NO.1）。

II.16S rDNA基因PCR扩增和序列分析

将测序结果用BLAST软件与GenBank中的序列进行同源性比较发现，CJ-22菌株与阿氏肠杆菌(Enterobacter asburiae)具有较高的同源性，同源性达到98.7%，遗传距离也较近。

综合CJ-22的生理生化性质、Sherlock MIS（MIDI鉴定系统）及16SrDNA系统进化分析可以看出，该菌属于肠杆菌属（Enterobacter sp.）中的阿氏肠杆菌（Enterobacter asburiae）。

3结论

1）从江西省赣州市赣县田独镇的冷浸田水稻土中分离得到1株能够用于含铜锌酸性废水处理的高效菌CJ-22（CGMCC No.7392），经SherlockMIS系统鉴定为肠杆菌属（Enterobacter sp.）中的阿氏肠杆菌（Enterobacterasburiae）。

实施例2：菌株对含铜锌酸性矿山废水处理性能检测

1材料与方法

1.1培养基和试剂

1.2菌株对对含铜锌酸性矿山废水处理性能

将纯化后的单个菌株以菌量OD_415nm=0.2接种到100mL酸性矿山废水（pH4.0、硫酸根浓度1427mg·L^-1、锌离子浓度223mg·L^-1、铜离子浓度210mg·L^-1）250mL三角瓶中，以不接菌的培养液作对照，在30℃,180r·min^-1的恒温摇床上振荡厌氧培养3天。培养结束后，按照实施例1方法测定菌株CJ-22对硫酸根、锌离子和铜离子3种物质的去除率。

2.结果

菌株CJ-22在pH4.0、OD_415nm0.2、转速180r·min^-1及厌氧环境条件下，对硫酸根、锌离子和铜离子的去除率分别为98.1%、99.5%、99.7%。硫酸根、锌离子、铜离子残余处浓度分别为27.1mg·L^-1、1.13mg·L^-1、0.63mg·L^-1，处理后的废水经pH中和，可达到国家GB8978-1996污水综合排放标准限量标准排放，表明本研究分离、筛选的阿氏肠杆菌菌株CJ-22是一株可有效处理含铜锌酸性矿山废水的高效菌株，对控制含重金属离子的酸性矿山废水对环境的影响具有一定的应用潜力。

Claims

1.分离自冷浸田土壤的肠杆菌（Enterobacter sp.）CJ-22，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，100101，保藏编号：CGMCCNo.7392，保藏日期：2013年03月29日。

2.如权利要求1所述的肠杆菌CJ-22，其特征在于该菌株16S rDNA基因序列如SEQ ID NO.1所示。

3.权利要求1所述的肠杆菌CJ-22在含铜锌酸性矿山废水处理中的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述菌株用于去除含铜锌酸性矿山废水中的硫酸根离子、铜离子或锌离子。