CN114480226B - 一株阿氏肠杆菌及其在防治植物细菌性软腐病中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株阿氏肠杆菌及其在防治植物细菌性软腐病中的应用。本发明的阿氏肠杆菌L95，其保藏编号为GDMCCNO.62058，该菌株能够高效淬灭Dickeya属软腐菌产生的特有的VFM群体感应信号，显著减轻该属病原细菌引起的作物细菌性软腐病的发生，并且在盆栽试验中防治效果优良；而且该菌株能够稳定生存，安全无致病毒力。本发明为安全、有效地防治作物细菌性软腐病提供了一株新的生防菌，具有良好的应用前景。

Description

一株阿氏肠杆菌及其在防治植物细菌性软腐病中的应用

技术领域

本发明属于植物病害生防技术领域，具体涉及一株阿氏肠杆菌及其在防治植物细菌性软腐病中的应用。

背景技术

Dickeya属细菌是一种土壤传播的革兰氏阴性病原菌，在世界范围内引起多种植物发生细菌性软腐病，其中包括如水稻、马铃薯、香蕉和芋头等主要的农业经济作物和许多观赏植物，被列为世界十大最具破坏性的植物病原细菌之一。Dickeya属病原菌宿主范围广泛，菌株变异频繁，因此，针对其特有的群体感应信号系统，开发精准、高效且不易引起菌株耐药性产生的绿色环保的防控方法非常重要。

VFM群体感应信号是Dickeya属病原菌中特有且保守存在的一种信号类型。前期研究表明，VFM信号系统主要调控Dickeya软腐菌重要毒力因子——细胞壁降解酶的产生，但对细菌的生长没有作用，因此，以其为作用靶标筛选群体淬灭生防菌株，将对作物细菌性软腐病的安全、高效生物防控具有重大意义。

目前，由于VFM群体感应信号化学性质极不稳定，限制了其化学结构的鉴定，也成为Dickeya软腐菌群体淬灭技术发展的巨大瓶颈。

发明内容

本发明的目的是针对现有作物细菌性软腐病防治技术的不足，提供一株能够高效淬灭VFM群体感应信号的生防菌——阿氏肠杆菌L95，在防治VFM群体感应信号介导的作物软腐病方面有巨大的应用潜力，这为使用微生物代替化学合成杀菌剂提供新的开发资源，可作为生物农药进行开发利用。

本发明利用前期构建的VFM群体感应信号报告系统VR2(已公开于专利申请CN202110772560.9中)，在信号结构未知的情况下，从环境中筛选到一株阿氏肠杆菌L95，在不影响报告系统VR2生长的前提下，能通过淬灭VFM群体感应信号，显著降低多种作物软腐菌的致病力，高效防控作物细菌性软腐病。

本发明发现阿氏肠杆菌L95菌株具有高效淬灭Dickeya属的VFM群体感应信号的能力，能有效抑制香蕉细菌性软腐病菌D.zeae MS2、水稻细菌性基腐病菌D.oryzae EC1、马铃薯软腐病菌D.dadantii 3937和芋头软腐病菌D.fangzhongdai CL3对相应作物的侵染；并且阿氏肠杆菌L95菌株本身安全无致病毒力，在温室盆栽试验中没有影响香蕉、水稻、芋头和马铃薯的生长，说明本发明的阿氏肠杆菌L95菌株可被用于开发针对作物细菌性软腐病的生物农药。该菌株的发现，有利于减轻化学药剂滥用和残留的问题，也为利用群体淬灭技术防治作物细菌性软腐病提供新的菌种资源。

因此，本发明的第一个目的是提供一株阿氏肠杆菌L95，其保藏编号为GDMCCNO.62058。

本发明还提供阿氏肠杆菌L95在防治植物细菌性软腐病中的应用。

优选，所述的植物细菌性软腐病是由Dickeya属细菌引起的、依赖VFM群体感应信号分子介导致病的细菌性病害。本发明的阿氏肠杆菌L95对Dickeya属细菌产生的VFM群体感应信号具有淬灭作用。

更优选的，所述的植物细菌性软腐病为香蕉细菌性软腐病、水稻细菌性基腐病、马铃薯软腐病和芋头软腐病。

优选，所述的应用，包括将阿氏肠杆菌L95和/或包含阿氏肠杆菌L95的培养物接种至植物体的步骤。

优选，所述的接种采用伤根灌菌接种法。

优选，所述的接种采用注射接种法。

优选，所述的接种采用刺伤接种法。

本发明还提供一种植物细菌性软腐病的生防制剂，其含有阿氏肠杆菌L95和/或包含阿氏肠杆菌L95的培养物作为有效成分。

优选，所述的生防制剂为阿氏肠杆菌L95的菌悬液，浓度为OD₆₀₀1.0～1.5。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明结果表明，阿氏肠杆菌L95具有显著的高效淬灭Dickeya属细菌产生的VFM群体感应信号的能力；在接种试验中发现阿氏肠杆菌L95对香蕉、水稻、马铃薯和芋头均无致病力，但能有效抑制香蕉细菌性软腐病菌D.zeae MS2、水稻细菌性基腐病菌D.oryzaeEC1、马铃薯软腐病菌D.dadantii 3937和芋头软腐病菌D.fangzhongdai CL3对相应作物的侵染，降低作物细菌性软腐病的发病率。并且，阿氏肠杆菌L95本身安全无致病力，可用于开发针对作物细菌性软腐病的生物农药，为利用生物防治作物细菌性软腐病提供了新思路、新的菌株资源。

本发明首次公开了一株阿氏肠杆菌L95并证实其对作物细菌性软腐病菌产生的VFM群体感应信号具有很好的淬灭作用，显著减轻多种经济作物细菌性软腐病的发生，并且在盆栽试验中防治效果优良。同时，该菌株能够稳定生存，安全无致病毒力，为安全、有效地防治作物细菌性软腐病提供了一个新的生防制剂，具有良好的应用前景。

保藏说明：

本发明的Enterobacter asburiae L95(阿氏肠杆菌L95)于2021年11月12日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏编号：GDMCC NO.62058，保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省科学院微生物研究所。

附图说明

图1为菌株L95对香蕉细菌性软腐病菌Dickeya zeae MS2的拮抗效果。

图2为流式细胞仪测定菌株L95对VR2报告系统中VFM信号的淬灭效果。

图3为菌株L95基于16S rDNA基因序列的系统进化树。

图4为菌株L95基于gyrB和rpoD基因序列的联合系统进化树。

图5为菌株L95显著减轻香蕉和水稻上细菌性软腐病症状的发生。

图6为菌株L95显著减轻马铃薯和芋头上细菌性软腐病症状的发生。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1：菌株L95的分离和筛选

1、菌株分离

土样采集：2020年11月采集自湖北省孝感市水稻田的水稻根围土壤，取田间表层及以下5cm深的土壤进行装袋保存，带回实验室作为微生物源进行菌株分离。

菌株分离：采用稀释、平板涂布划线进行分离纯化。具体地，将采集到的田间土壤样本充分混匀后，称取5.0g置于装有15mL新鲜LB液体培养基的灭菌离心管内，于28℃、200rpm摇床震荡培养15min，静置至土壤颗粒沉于离心管底部，取上清液以无菌水梯度稀释，吸取100μL 10^-5、10^-6、10^-7稀释液涂布于LB平板，倒置于28℃恒温培养箱内培养24h后将不同菌落形态的单菌落划线纯化。挑取纯化后平板上的单菌落，标号，置于含1mL液体LB的2mL离心管中，于28℃、200rpm摇床过夜震荡培养，作为待筛菌液，备用。

2、菌株筛选：利用酶标仪高通量筛选。具体地，将VR2报告菌株(已公开于专利申请CN202110772560.9中，是通过基因工程手段改造香蕉细菌性软腐病菌Dickeya zeae MS2得到的VFM群体感应信号报告菌株)用LB+Kan固体培养基划线活化，挑取单菌落置于LB+Kan液体培养基中，于28℃、200rpm摇床震荡培养至菌液OD₆₀₀＝1.0，按1:100的比例(接种量)加入到LB液体培养基中，混合均匀后以每孔200μL加入到96孔培养板，以0.1％的接种量接入预先准备好的待筛菌液，每个样品处理重复三次，以无菌LB液体培养基做空白对照，以接入0.1％接种量的大肠杆菌DH5α做负对照。接种完成后贴上封膜，并盖上板盖，放入酶标仪内连续测24h，每隔三个小时测定一次OD₆₀₀和OD₄₈₅/OD₅₂₈。初步筛选对病原菌VFM群体感应信号具有淬灭作用的菌株。

3、菌株抑菌作用测定：抑菌圈实验。具体地，将利用酶标仪初步筛选得到的菌株挑取单菌落于含15mL LB培养液的50mL离心管里，于28℃、200rpm摇床震荡培养，待用。取已融化的15mL固体LB培养基在10×10cm的方形培养皿里倒板，吹干后，将15mL 1％琼脂糖(先冷却到50℃-60℃后加入150μL香蕉细菌性软腐病菌Dickeya zeae MS2菌液)倒在铺有LB的方形培养皿上，吹干。用直径为5mm的打孔器打孔，灭菌牙签挑去培养基后，向孔内注入20μL过夜培养的待测菌液，吹干，封口。把板正放在28℃培养箱里，培养16-18h，观察是否有透明的抑菌圈。获得一株对病原菌VFM群体感应信号具有淬灭作用但无抑菌效果的生防菌株，命名为菌株L95(图1)。

实施例2：流式细胞仪验证菌株L95对VFM的淬灭效果

将VR2报告菌株用LB+Kan固体培养基划线活化，挑取单菌落置于LB+Kan液体培养基中，于28℃、200rpm摇床震荡培养至菌液OD₆₀₀＝1.0，将报告菌株VR2和菌株L95(淬灭菌)等量接种混合培养，以只接入报告菌株VR2为对照，每隔四小时测定一次样品荧光强度MFI。从图2可知，在菌株培养4-8小时时，菌株L95可以显著淬灭VR2产生的VFM信号，而当菌株培养到12小时时，VR2自身的淬灭基因就可以降解系统中的VFM信号，这时候加和不加菌株L95，报告系统响应到的VFM信号值都与原来相比急剧降低。

实施例3：菌株L95的鉴定

1、形态鉴定

菌株L95为革兰氏阴性；在LB营养培养基上菌落呈现乳白色，半透明，圆形，凸起，表面光滑，易挑起，边缘整齐。

2、分子鉴定

为了明确实施例1获得的菌株L95的分类地位，我们采用多位点序列分析(Multilocus sequences analysis，MLSA)结合系统发育树分析(Phylogenetic analysis)的方法鉴定菌株L95。

16S rDNA序列分析是细菌鉴定的分子生物学鉴定手段，通过分析16S rDNA序列(核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)，结合保守看家基因gyrB(核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)和rpoD序列(核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示)，运用MEGA 6.0软件采用Neighbor-joining方法构建系统发育树，综合分析了菌株L95的进化关系。研究表明，菌株L95的16SrDNA序列与阿氏肠杆菌Enterobacter asburiae strain FDAARGOS 1432和CAV1043菌株的同源性达到最高的99.73％，进化系数与E.asburiae FDAARGOS 1432最为相近(图3)，通过分析gyrB和rpoD基因序列发现，L95与E.asburiae CAV1043和E.asburiae FDAARGOS 1056最为接近(图4)。

综上，结合多个看家基因的系统发育分析，将该生防菌鉴定为肠杆菌属的Enterobacter asburiae，命名为阿氏肠杆菌Enterobacter asburiae L95；并将该菌株于2021年11月12日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏编号：GDMCC NO.62058。

实施例4：菌株L95对细菌性软腐病的防效测定

在LB固体培养基上活化病原菌香蕉细菌性软腐病菌D.zeae MS2、水稻细菌性基腐病菌D.oryzae EC1、马铃薯软腐病菌D.dadantii 3937、芋头软腐病菌D.fangzhongdai CL3(以下分别简述为菌株MS2、EC1、3937、CL3)和(生防菌)菌株L95，倒置于28℃培养箱过夜培养待用。

1、用PBS溶液分别将菌株MS2平板和菌株L95平板上的菌体冲洗下来，并将MS2菌悬液和L95菌悬液OD₆₀₀调至0.5；取1mLMS2菌悬液和等量PBS溶液混合(MS2)作为正对照；取1mLL95菌悬液与等量的MS2菌悬液混合(MS2+L95)；取1mL L95菌悬液和等量PBS溶液混合(L95)作为负对照；取2mLPBS溶液(PBS)作为空白对照。

采用注射接种法接种香蕉。挑选12株长势相似的香蕉苗，用1mL注射器分别取200μL的MS2、MS2+L95、L95、PBS注射到香蕉的假茎，每处理3个重复，每天观察香蕉苗的生长状况，做好记录。

实验结果表明，接种7天后，菌株L95对香蕉细菌性软腐病的防控率达到100％(图5A)。

2、用PBS溶液分别将菌株EC1平板和菌株L95平板上的菌体冲洗下来，并将EC1菌悬液和L95菌悬液OD₆₀₀调至0.5；取10mL EC1菌悬液和等量PBS溶液混合(EC1)作为正对照；取10mL L95菌悬液与等量的EC1菌悬液混合(EC1+L95)；取10mL L95菌悬液和等量PBS溶液混合(L95)作为负对照；取20mL PBS溶液(PBS)作为空白对照。将所有菌液用PBS定容至100mL后，采用伤根灌菌法(刺伤处理水稻根部)接种到水稻盆栽土壤中，每盆12棵长势均等的水稻苗，每个处理3个重复，每天观察接种植物的生长状况，做好记录。

实验结果表明，接种两天后，菌株L95对水稻细菌性基腐病的防控率达到74.91％(图5B)。

3、分别挑取菌株3937、CL3和菌株L95单菌落于含有10mL LB的50mL离心管中，放在28℃、200rpm摇床过夜培养。取1mL OD₆₀₀约为1.0的3937或CL3菌液加入等量LB液体培养基混合分别作为正对照；取1mL OD₆₀₀约为1.0的3937或CL3菌液加入等量L95菌液混合；取1mLOD₆₀₀约为1.0的L95菌液加入等量LB液体培养基混合作为负对照，LB液体培养基作为负对照。

采用刺伤接种法分别接种马铃薯和芋头，每个处理3个重复。将马铃薯和芋头切片处理后，分别取2μL的3937菌液与LB混合液(3937)、3937菌液与L95菌液混合液(L95+3937)、L95菌液与LB混合液(L95)、LB液体培养基(LB)接种到已做刺伤处理的马铃薯切片上；分别取2μL的CL3菌液与LB混合液(CL3)、CL3菌液与L95菌液混合液(L95+CL3)、L95菌液与LB混合液(L95)、LB液体培养基(LB)接种到已做刺伤处理的芋头切片上，观察接种切片的发病状况，做好记录。

实验结果表明，接种24小时后，菌株L95可显著减轻马铃薯和芋头上细菌性软腐病的发病症状(图6)。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> 一株阿氏肠杆菌及其在防治植物细菌性软腐病中的应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1503

<212> DNA

<213> 阿氏肠杆菌L95(Enterobacter asburiae L95)

<400> 1

agagtttgat catggctcag attgaacgct ggcggcaggc ctaacacatg caagtcgagc 60

ggcagcggaa agtagcttgc tactttgccg gcgagcggcg gacgggtgag taatgtctgg 120

gaaactgcct gatggagggg gataactact ggaaacggta gctaataccg cataacgtcg 180

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ctagtaggtg gggtaatggc tcacctaggc gacgatccct agctggtctg agaggatgac 300

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tgcacaatgg gcgcaagcct gatgcagcca tgccgcgtgt atgaagaagg ccttcgggtt 420

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ggggtagaat tccaggtgta gcggtgaaat gcgtagagat ctggaggaat accggtggcg 720

aaggcggccc cctggacaaa gactgacgct caggtgcgaa agcgtgggga gcaaacagga 780

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ggttaagtcc cgcaacgagc gcaaccctta tcctttgttg ccagcggtcc ggccgggaac 1140

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acc 1503

<210> 2

<211> 2412

<212> DNA

<213> 阿氏肠杆菌L95(Enterobacter asburiae L95)

<400> 2

atgtcgaatt cttatgactc ctccagtatc aaagtcctga aagggctgga tgcggtgcgt 60

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aagcaggaac agtacattaa agacgacgaa gcgatggatc agtaccaaat cgcgatcgcg 1680

cttgatggtg cgaccctgca cgcgaactct cacgcccctg cactggccgg tgagccgctg 1740

gagcgtctgg tgtccgagtt caatgccacg cagaaaatga tcacgcgtat ggaacgccgt 1800

tatccgaaaa cgctgctgaa ggagctggtt tatcagccaa ccctgaccga agccgatctg 1860

agcgacgagc agaccgtgac ccgctgggtg aacgctctgg tgaccgatct gaacgagaaa 1920

gagcagcacg gcagcatgtg gaaatgcgat atccagcaga acgccgataa gcagttcgag 1980

cctattattc gcgtgcgtac ccacggcgtt gataccgact acccgctgga acacgagttt 2040

gtgaccggtc cggaataccg ccgtatctgc tcgctcggcg agacgctgcg cgggctgatc 2100

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gcgctggact ggctggtgaa agagtcccgt cgtggcctcg cgatccagcg ctataaaggt 2220

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atcgatattt aa 2412

<210> 3

<211> 1197

<212> DNA

<213> 阿氏肠杆菌L95(Enterobacter asburiae L95)

<400> 3

atgacggaac acgacaaatc ctccgccgtg gttgaagaga ccagggagac tgtggagacg 60

acgccacagc cagagacgac tgagaaaacc gctgagaaga aaaacggcag caacaaaacg 120

agcctcgcgc tgagcgcgat tgccattgcc attgcgctgg cagcaggggt tggcctgtac 180

ggcctggtga agcaacaggg tgctaaccag acgtccacca gcgatgcgct ggtgaatcag 240

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agccttatca ccgcgcgtcg cgcgattacc gaggacatcg ccagcctctc cgccgtctcg 600

caggtggatt acgacggcat tatccttaag gtgaaccagc tgtcgaatca gattgataac 660

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tccagctccc tgagcgaatg gcgcataaac ctgcagaaaa gctggcaaaa ctttatggac 780

agcttcatca ctatccgccg tcgcgacgaa accgccgtgc cgctgctggc gccgaaccag 840

gatatctatc tgcgcgagaa cattcgttcc cgcctgctgg tggcggctca ggccgtgccg 900

cgtcatcagg aagagacata caaacaggcg ctggataacg tctcgacgtg ggtacgcgcc 960

tactacaaca ccgatgatgc gacgaccacc gccttcctcg aagacattga taagctgagc 1020

cagcagaaca tcaccatgaa cgtgccggat aagctggcca gccagccgat tctggagaaa 1080

ctgatgcaga cgcgcgtacg taacctgctg gcgcagccgg gcgtaccggc agagccgacg 1140

gacggagcgg cacctgctcc ggctccggcg cctgaaagcg caccacaagg agagtaa 1197

Claims (8)

1.一株阿氏肠杆菌L95，其特征在于，其保藏编号为GDMCCNO.62058。

2.权利要求1所述的阿氏肠杆菌L95在防治植物细菌性软腐病中的应用，所述的植物细菌性软腐病是由Dickeya属细菌引起的、依赖VFM群体感应信号分子介导致病的香蕉细菌性软腐病、水稻细菌性基腐病、马铃薯软腐病和芋头软腐病。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，包括将阿氏肠杆菌L95和/或包含阿氏肠杆菌L95的菌液接种至植物体的步骤。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的接种采用伤根灌菌接种法。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的接种采用注射接种法。

6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的接种采用刺伤接种法。

7.一种植物细菌性软腐病的生防制剂，其特征在于，含有权利要求1所述的阿氏肠杆菌L95和/或包含权利要求1所述的阿氏肠杆菌L95的菌液作为有效成分。

8.根据权利要求7所述的生防制剂，其特征在于，所述的生防制剂为阿氏肠杆菌L95的菌悬液，浓度为OD₆₀₀1.0～1.5。

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