CN112592856B - 一种烟草赤星病拮抗放线菌菌株及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种烟草赤星病拮抗放线菌菌株及其应用，该菌株为所述的烟草赤星病拮抗放线菌为黄三素链霉菌Streptomyces flavotricini F706；保藏名称为所述的烟草赤星病拮抗放线菌为黄三素链霉菌F706；保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是湖北省武汉市武昌区珞珈山武汉大学；保藏日期：2020年11月18日；保藏编号：CCTCC No.M 2020755。本发明的烟草赤星病拮抗放线菌的基因序列为SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。

Description

一种烟草赤星病拮抗放线菌菌株及其应用
技术领域
本发明涉及微生物及植物病害生物防治领域，特别涉及一种烟草赤星病拮抗放线菌菌株及其应用。
背景技术
烟草赤星病是由链格孢属(Alternaria spp.)真菌侵染引起的烟草叶部病害，发生流行范围光，具有间歇性和爆发性的特点，对烟叶产量和品质影响巨大，是烟草生产上威胁最大的病害之一。放线菌是一类极具经济价值和广泛应用前景的微生物资源，因其抗生素、酶、抑制剂等代谢产物丰富多样，在农林生产、工业和临床医药领域具有重要的应用价值。挖掘有生物活性的放线菌资源，对于研发环境友好、高效生物农药一直以来都受到广泛关注。
目前，在烟草生产实践中，赤星病防治主要利用化学药剂菌核净、代森锰锌及生物农药多抗霉素等。由于化学药剂存在抗/耐药性和农药残留等问题，其不断降低的防治效果和对生态环境的不良影响限制了长期大量使用；研发新型高效生物农药用于植物病虫害防治，是农作物绿色可持续发展的必然方向。本发明从烟草根际土壤中分离得到的所述的烟草赤星病拮抗放线菌为黄三素链霉菌F706，作为烟草病害拮抗菌，抑制烟草赤星病、黑胫病、灰霉病、青枯病、野火病、空胫病病原菌的生长，暂未见报道。该菌株对烟草赤星病的防治效果明显优于生物农药多抗霉素，因此可利用所述的烟草赤星病拮抗放线菌为黄三素链霉菌F706研发新型生物制剂和生物农药，用于烟草赤星病及其他具抑制活性烟草病害的防治。
发明内容
本发明的目的是提供一种活性高、抗菌谱广的烟草赤星病拮抗放线菌菌株。
本发明的技术方案如下：本发明提供了如下技术方案：本发明的一种烟草赤星病拮抗放线菌菌株，所述的烟草赤星病拮抗放线菌为黄三素链霉菌Streptomycesflavotricini F706；保藏名称为黄三素链霉菌F706；保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是湖北省武汉市武昌区珞珈山武汉大学；保藏日期：2020年11月18日；保藏编号：CCTCC No.M 2020755。
进一步地，所述烟草赤星病拮抗放线菌的基因序列为SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。
进一步地，所述的烟草赤星病拮抗放线菌菌株F706在于28℃培养箱中培养6d后光镜观察，孢子丝钩状或螺旋状，孢子近椭圆形；扫描电镜观察，菌株F706的孢子形态和表面结构，孢子丝钩状或螺旋状。
本发明所述的烟草赤星病拮抗放线菌菌株制备的烟草赤星病拮抗放线菌菌剂。
进一步地，其活性成分为如下(a)(b)(c)中的至少一种：
(a)所述的烟草赤星病拮抗放线菌的发酵培养物；
(b)所述的烟草赤星病拮抗放线菌细胞的超声裂解上清；
(c)所述的烟草赤星病拮抗放线菌细胞的超声裂解沉淀。
本发明所述的烟草赤星病拮抗放线菌菌剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)烟草赤星病拮抗放线菌种子液制备：将菌种F706接种在培养基后，于28℃培养箱中培养36-48h后开始出现菌落，72-96h后开始产生孢子；
(2)发酵菌剂制备：将上述烟草赤星病拮抗放线菌种子液接种于发酵基础培养基中，调节发酵液中烟草赤星病拮抗放线菌的菌体浓度至1.0×106-107CFU/mL，获得烟草赤星病拮抗放线菌菌剂。
进一步地，在步骤(1)中，放线菌的培养：将-80℃冰箱保存的F706放线菌菌种溶化后，用枪头反复吸取混匀，再吸取100μl涂布于ISP2固体培养基上，然后放入28℃培养箱中培养7d待用；病原真菌的培养：将活化的烟草赤星病菌接入AEA培养基上，放入28℃培养箱中培养5d待用；
种子液制备培养基：ISP2液体培养基，即酵母浸粉4g，葡萄糖4g，麦芽浸粉10g，蒸馏水1000ml；
在步骤(2)中，菌悬液的制备：挑取适量拮抗放线菌F706，加入装有无菌水的15ml离心管中，混匀制成菌悬液，待用；
所述的发酵基础培养基：P2培养基：即黄豆饼粉3％，玉米粉2％，葡萄糖2％，硫酸铵 0.4％，碳酸钙0.4％，磷酸氢二钾0.02％，pH 7.0-7.2；该实验的原始发酵培养基装样量为500 ml的三角瓶装发酵液80ml，即黄豆饼粉2.4g，玉米粉1.6g，葡萄糖1.6g，硫酸铵0.32g，碳酸钙0.32g，磷酸氢二钾0.016g，80ml蒸馏水，pH 7.0-7.2。
进一步地，在步骤(1)中，种子液的制备：装样量为250ml的三角瓶装ISP2液体培养基50ml，接菌量三块直径为5mm大小的F706菌块，恒温震荡培养(28℃，150r/min)2-3 d后备用；
在步骤(2)中，装样量为500ml的三角瓶装培养基80ml，接菌量为每瓶1％的F706菌悬液，即每瓶加入800μl菌悬液，恒温震荡培养(28℃，150r/min)4d后，将发酵液在室温9000rpm下离心10min，用0.2μm过滤器过滤上清液去除菌体，无菌发酵液于4℃冰箱保存备用。
本发明所述的烟草赤星病拮抗放线菌在生产用于植物病害防治产品中的应用。
本发明所述的烟草赤星病拮抗放线菌菌剂在生产用于烟草赤星病防治的产品中的应用。
有益效果：本发明的菌株体内活性高、成本低的特点。菌株F706对烟草主要病原菌均表现出显著的抑制作用，抑制效果表现稳定。本发明所述的烟草赤星病拮抗放线菌菌剂在生产用于烟草赤星病防治的产品中的应用。
附图说明
图1为本发明的抑菌活性测试图；图1A为本发明的烟草赤星病菌的抑菌活性测试图；图1B为本发明的黑胫病菌的抑菌活性测试图；图1C为本发明的灰霉病菌的抑菌活性测试图；图1D为本发明的烟草青枯病菌的抑菌活性测试图；图1E为本发明的野火病菌的抑菌活性测试图；图1F为本发明的空胫病菌的抑菌活性测试图。
图2A为本发明的光学显微镜下菌株F706的形态的示意图；图2B为本发明的菌株F706 扫描电镜观察的示意图；
图3为本发明的培养特征的示意图；
图4为本发明的放线菌F706的16S rDNA系统发育树的示意图；
图5为本发明的不同碳源对抑菌活性的影响图；
图6为本发明的不同有机氮源对抑菌活性的影响的示意图；
图7为本发明的不同无机氮源对抑菌活性的影响的示意图。
图8为本发明的葡萄糖浓度对抑菌活性的影响的示意图。
图9为本发明的牛肉浸粉的浓度对抑菌活性的影响的示意图。
图10为本发明的硝酸铵浓度对抑菌活性的影响的示意图。
图11为本发明的培养基均匀优化设计结果的示意图。
图12为本发明的优化后培养基与基础培养基发酵活性对比的示意图。
图13为本发明的接种量对抑菌活性的影响的示意图。
图14为本发明的牛肉浸粉的浓度对抑菌活性的影响的示意图。
图15为本发明的通气量对抑菌活性的影响的示意图。
图16为本发明的发酵温度对抑菌活性的影响的示意图。
图17为本发明的发酵时间对抑菌活性的影响的示意图。
图18为本发明的种龄对抑菌活性的影响的示意图。
具体实施方式
下面将通过附图和具体实施例对本发明做进一步的具体描述，但不能理解为是对本发明保护范围的限定。
实施例1
菌株分离
采集烟草根际土壤，过筛研磨后自然风干(20℃，3周)，称取自然风干土样5g，与CaCO3以10：1(w/w)的比例均匀混合，26℃下再风干7天后，用50mL磷酸缓冲液(10mmol/L，PH为7.0，含10％土壤浸汁)将CaCO3混合土样0.5g制成土壤悬液，30℃振荡2h后1500 rmp离心20min；梯度稀释后，取10-5稀释液0.15ml均匀涂布于高氏一号平板培养基，28℃恒温培养10天后，挑取不同形态、颜色的单菌落保存备测。
抑菌活性检测
抑菌活性测试的烟草重要病害病原菌均为贵州省烟草科学研究院真菌实验室分离、鉴定和保存，包括青枯病菌、野火病菌、空胫病菌(细菌性病原)以及烟草赤星病菌、烟草黑胫病菌、烟草灰霉病菌(真菌性病原)。
细菌病原抑制活性测试：用NA培养基活化青枯病菌、野火病菌、空胫病菌，挑取单菌落接入NB液体培养基中，30℃，150rpm振荡培养24h后去0.1ml菌液均匀涂布与NA平板上，室温放置1h后，在平板中心位置接入待测放线菌，28℃恒温培养5天后，观察是否产生抑菌圈。
真菌病原抑制活性测试：用PDA平板培养基活化并培养赤星病菌、黑胫病菌、灰霉病菌，将培养好的赤病菌用打孔器打成直径5mm的菌饼，接种PDA培养基中心，在平板距病原2cm 四周点接待测放线菌，28℃恒温培养5天后，观察病原菌生长是否受到抑制。
菌株F706对待测病原菌均表现出显著的抑制作用，菌株连续传代5次后测试，抑制效果表现稳定，表明其具有广谱烟草病原菌抑制效果(下为抑菌活性测试图)。图1A为本发明的从左至右分别为A烟草赤星病菌、B黑胫病菌和C灰霉病菌；图1B为本发明的从左至右分别为D烟草青枯病菌、E野火病菌和F空胫病菌。
菌株鉴定
采用高氏一号、ISP2、ISP3、ISP4、ISP5琼脂培养基分别接种菌株F706，于28℃培养箱中培养7天，观察菌落培养特征并进行光学显微镜和扫面电镜观察；采用常规方法对菌株的生理生化特征进行测试；提取菌株基因组，利用细菌16S通用引物(27F/1492R)扩增菌株16S rDNA序列并测序，序列在Genbank中进行Blast比对，下载、收集链霉菌属相近种模式菌株的16S rDNA序列，采用MEGA 5.0软件，邻位连接法构建菌株F706与相关种的系统发育分析。
(1)F706形态特征
本发明的图2A为本发明的光学显微镜下菌株F706的形态图；图2B为菌株F706扫描电镜观察图；菌株F706在于28℃培养箱中培养6d后光镜观察，孢子丝钩状或螺旋状，孢子近椭圆形；扫描电镜观察，菌株F706的孢子形态和表面结构，孢子丝钩状或螺旋状。
(2)F706培养特征
将菌种F706接种在培养基后，于28℃培养箱中培养36-48h后开始出现菌落，72-96h 后开始产生孢子。培养特征(从左至右分别为高氏一号、ISP2、ISP3、ISP4、ISP5，28℃培养7d)；放线菌F706的培养特征如表1所示，菌株生理生化特征测定结果如表2所示。
表1
Figure BDA0002844997130000051
(3)F706生理生化特征
菌株F706生理生化特征测定结果如表2所示：
表2
Figure BDA0002844997130000061
注：“+”，阳性；“-”，阴性。
上述(1)、(2)、(3)结果符合链霉菌属特征
(4)F706分子生物学鉴定
将放线菌F70616S序列进行比对，与所述的烟草赤星病拮抗放线菌为黄三素链霉菌 Streptomycesflavotricini序列相似性极高。下载、收集相近种模式菌株的16S rDNA序列，采用MEGA 5.0软件，邻位连接法构建菌株F706与相关种的系统发育分析。
F706系统发育表明其与Streptomyces flavotricini NRRL B-5419T、Streptomyces amritsarensis 2AT、Streptomyces globosus LMG 19896T、Streptomycestoxytricini NBRC 12823T 等菌株相似性较高，从序列的同源性结合菌株的形态特征、生理生化特性等将菌株定为所述的烟草赤星病拮抗放线菌为黄三素链霉菌(Streptomycesflavotricini)。放线菌F706的16S rDNA系统发育树如图4所示。
试验例1
菌株F706发酵条件优化及赤星病抑制效果测试
(1)菌株发酵条件优化
以烟草赤星病菌为靶标，采用单因素和均匀设计方法对菌株发酵培养基组分进行了筛选，获得了优化的菌株发酵培养基；对菌株发酵接种量、种龄、通气量、时间、初始pH温度等发酵条件进行了测试，获得了最适发酵条件。
具体方法如下
放线菌培养基：ISP2固体培养基，即酵母浸粉4g，葡萄糖4g，麦芽浸粉10g，琼脂18g，蒸馏水1000ml。
赤星病菌培养基：AEA培养基，即酵母浸粉5g，甘油20ml，硫酸镁0.25g，硝酸钠6g，氯化钾0.5g，磷酸二氢钾1.5g，琼脂17.5g，pH约为6.0。
种子液制备培养基：ISP2液体培养基，即酵母浸粉4g，葡萄糖4g，麦芽浸粉10g，蒸馏水1000ml。
发酵基础培养基：P2培养基：即黄豆饼粉3％，玉米粉2％，葡萄糖2％，硫酸铵0.4％，碳酸钙0.4％，磷酸氢二钾0.02％，pH 7.0-7.2。该实验的原始发酵培养基装样量为500ml的三角瓶装发酵液80ml，即黄豆饼粉2.4g，玉米粉1.6g，葡萄糖1.6g，硫酸铵0.32g，碳酸钙0.32g，磷酸氢二钾0.016g，80ml蒸馏水，pH 7.0-7.2。
生物测定培养基：PDA培养基，即马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，蒸馏水1000ml。
实验准备
放线菌的培养：将-80℃冰箱保存的F706放线菌菌种溶化后，用枪头反复吸取混匀，再吸取100μl涂布于ISP2固体培养基上，然后放入28℃培养箱中培养7d待用。
病原真菌的培养：将活化的烟草赤星病菌接入AEA培养基上，放入28℃培养箱中培养 5d待用。
菌悬液的制备：挑取适量拮抗放线菌F706，加入装有无菌水的15ml离心管中，混匀制成菌悬液，待用。
种子液的制备：装样量为250ml的三角瓶装ISP2液体培养基50ml，接菌量三块直径为5mm大小的F706菌块，恒温震荡培养(28℃，150r/min)2-3d后备用。
发酵液的制备：装样量为500ml的三角瓶装培养基80ml，接菌量为每瓶1％的F706菌悬液，即每瓶加入800μl菌悬液，恒温震荡培养(28℃，150r/min)4d后，将发酵液在室温9000rpm下离心10min，用0.2μm过滤器过滤上清液去除菌体，无菌发酵液于4℃冰箱保存备用。
平板的制备：将发酵液：PDA培养基以1:9的比例加到PDA培养基中，混匀倒出制成平板。此次试验是将5ml的发酵液加入到45ml的PDA培养基中，均匀倒出三个平板。
抑菌活性的测定：采用十字交叉法测量菌块直径。在培养皿底端画两条垂直相交的直线，垂足为培养皿的中心，待平板晾干后，将直径为5mm的赤星病菌块菌丝朝下放于中心点， 28℃恒温培养3d和5d后，分别测量第三d和第五d的菌块直径，并计算发酵液对赤星病菌的抑制率。试验共3个重复。
Figure BDA0002844997130000081
烟草赤星病拮抗放线菌F706的发酵培养基主要成分的筛选
不同碳源对烟草赤星病菌生长的抑制情况:在基本培养基中其他成分保持不变的情况下，以蔗糖、糊精、麦芽糖、乳糖和可溶性淀粉等量替代基本培养基中的葡萄糖，以无菌混悬液的基本培养基为空白对照，测定发酵液对赤星病菌的抑菌率。
不同有机氮源对烟草赤星病菌生长的抑制情况：在基本培养基中其他成分保持不变的情况下，用大豆粉、尿素、蛋白胨、牛肉浸粉、花生粉等量替代基本培养基中的玉米粉，以无菌混悬液的基本培养基为空白对照，测定发酵液对赤星病菌的抑菌率。
不同无机氮源对烟草赤星病菌生长的抑制情况：在基本培养基中其他成分保持不变的情况下，用硝酸铵、氯化铵、硝酸钾、硝酸钠等量替代基本培养基中的硫酸铵，以无菌混悬液的基本培养基为空白对照，测定发酵液对赤星病菌的抑菌率。
发酵培养基的优化
单因素试验：在确定了培养基中最佳的碳源、有机氮源和无机氮源之后，对这三种最佳组分逐一进行考察试验，确定各组分的适宜浓度。考察其中某一组分时，其它组分按原配方比例进行加入，并保证培养条件相同。
均匀设计法优化发酵培养基：通过单因素试验确定了影响赤星真菌生长的主要营养组分及其各组分的浓度范围后，利用均匀设计试验优化赤星真菌的发酵培养基配方。最后将原始的P2培养基、ISP2培养基、均匀设计的培养基与均匀优化后的最佳培养基同时发酵，对比各个发酵液对赤星真菌的抑菌效果。
试验例1
不同发酵条件对放线菌抑菌活性的影响
接种量对烟草赤星病菌生长的抑制情况：培养基主要充分筛选后，将同一批放线菌F706 的种子液接入到发酵培养基中，接种比例为1％，3％，5％，7％，9％，11％，13％。在28℃， 150r/min的条件下恒温震荡培养4d后，测量各处理对赤星病菌的抑菌率，确定最佳接种量。
初始pH对烟草赤星病菌生长的抑制情况：接种量确定后，将培养基的初始pH分别调至 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，将同一批放线菌F706的种子液以最佳接种量接种，在28℃， 150r/min的条件下恒温震荡培养4d后，测量各处理对赤星病菌的抑菌率，确定最佳初始pH。
通气量对烟草赤星病菌生长的抑制情况：确定初始pH后，将培养基调至最佳初始pH，用500ml三角瓶进行装样，装样量分别为20、40、60、80、100、120、140ml，将同一批放线菌F706的种子液以最佳接种量接种，在28℃，150r/min的条件下恒温震荡培养4d后，测量各处理对赤星病菌的抑菌率，确定最佳通气量。
发酵温度对烟草赤星病菌生长的抑制情况：确定通气量后，将培养基调至最佳初始pH，按照最佳装样量装入到500ml三角瓶中，将同一批放线菌F706的种子液以最佳接种量接种，在28℃，150r/min的条件下恒温震荡培养4d后，测量各处理对赤星病菌的抑菌率，确定最佳发酵温度。
发酵时间对烟草赤星病菌生长的抑制情况：确定发酵温度后，将培养基调至最佳初始pH，按照最佳装样量装入到500ml三角瓶中，将同一批放线菌F706的种子液以最佳接种量接种，在28℃，150r/min的条件下恒温震荡分别培养2、3、4、5、6d后，测量各处理对赤星病菌的抑菌率，确定最佳发酵时间。
种龄对烟草赤星病菌生长的抑制情况：确定发酵温度后，将在斜面分别培养4、5、6、7、 8d的放线菌F706菌株，分别制成菌悬液，按照前期试验已确定的各种最佳条件进行发酵后，测量各处理对赤星病菌的抑菌率，确定最佳F706种龄。
实验结果
烟草赤星病拮抗放线菌F706的发酵培养基主要营养成分的筛选
不同碳源对抑菌活性的影响：
通过改变培养基中碳源的种类，对碳源进行单因素筛选，结果如图5所示，当培养基中的碳源选用葡萄糖时，发酵液对赤星病菌的抑菌活性最高；当选用糊精作为碳源时，抑菌活性最不理想。不同碳源对抑菌活性的影响如图5所示。
不同有机氮源对抑菌活性的影响
通过改变培养基中有机氮源的种类，对有机氮源进行单因素筛选，结果如图6所示，当培养基中的有机氮源选用牛肉浸粉时，发酵液对赤星病菌的抑制活性最高；当选用大豆粉作为有机氮源时，抑菌活性最不理想。不同有机氮源对抑菌活性的影响如图6所示。
不同无机氮源对抑菌活性的影响
通过改变培养基中无机氮源的种类，对无机氮源进行单因素筛选，结果如图7所示，当培养基中的无机氮源选用硝酸铵时，发酵液对赤星病菌的抑制活性最高；当选用硫酸铵作为无机氮源时，抑菌活性最不理想。不同无机氮源对抑菌活性的影响如图7所示。
试验例2
发酵培养基的优化
单因素试验
葡萄糖浓度对抑菌活性的影响
通过图8可知：当葡萄糖浓度为1％时，发酵液对赤星真菌的抑菌活性最高；当葡萄糖浓度高至3％时，发酵液对赤星真菌的抑菌活性最不理想。葡萄糖浓度对抑菌活性的影响如图8 所示。
牛肉浸粉的浓度对抑菌活性的影响
通过图9可知：当牛肉浸粉浓度为3％时，发酵液对赤星真菌的抑菌活性最高；当牛肉浸粉浓度低至1％时，发酵液对赤星真菌的抑菌活性最不理想。牛肉浸粉的浓度对抑菌活性的影响如图9所示。
硝酸铵浓度对抑菌活性的影响
通过图10可知：当硝酸铵浓度为0.2％时，发酵液对赤星真菌的抑菌活性最高；当硝酸铵浓度为0.6％时，发酵液对赤星真菌的抑菌活性最不理想。硝酸铵浓度对抑菌活性的影响如图10所示。
均匀设计法优化培养基
通过单因素试验确定影响放线菌F706生长的主要营养组分及浓度范围后，采用均匀设计试验对放线菌F706的发酵培养基配方进行逐步优化。培养基试验因素及水平如表3所示。
表3
Figure BDA0002844997130000101
Figure BDA0002844997130000111
通过表4和图11可知，在N6处理下，即当葡萄糖浓度为0.4％，牛肉粉浓度为0.5％，硝酸铵浓度为0.45％时，赤星真菌的直径相较于其他处理是最短的，也就说明该条件下发酵液对赤星真菌的抑菌活性最显著。培养基均匀优化设计如表4所示。
表4
Figure BDA0002844997130000112
培养基均匀优化设计结果
数据经DPS统计软件处理，进行多因子及平方项逐步回归得出培养基配方中三种主要成分的最佳含量为：葡萄糖0.27％，牛肉浸粉1.17％，硝酸铵0.5％。据此可得出最优的培养基配方是黄豆饼粉3％，牛肉粉1.17％，葡萄糖0.27％，硝酸铵0.5％，碳酸钙0.4％，磷酸氢二钾0.02％，pH 7.0-7.2。
优化培养基与基础培养基发酵活性对比
通过图12可知，优化后的培养基所培养的赤星真菌的直径小于基础培养基培养的赤星真菌的直径，说明经过优化后的培养基所发酵的发酵液的抑菌活性有了明显提高，并大于基础培养基所发酵的发酵液的抑菌活性。优化后培养基与基础培养基发酵活性对比如图12所示。注：P1为基础培养基，P2为优化后的培养基。
试验例3
发酵条件对放线菌抑菌活性的影响
接种量对抑菌活性的影响
通过图13可知，保持其他条件不变，当接种量比率为13％时，赤星真菌的直径最小，说明发酵液的抑菌活性最好；而当接种量比率为7％时，赤星真菌的直径最大，说明发酵液的抑菌活性最不理想。接种量对抑菌活性的影响如图13所示。
初始pH对抑菌活性的影响
通过图14可知，保持其它条件不变，当初始pH为6时，发酵液对赤星真菌的抑菌活性最好。初始pH对抑菌活性的影响如图14所示。
通气量对抑菌活性的影响
通过图15可知，保持其它条件不变，当装样量为500ml三角瓶装20ml培养基时，发酵液对赤星真菌的抑菌活性是最好的。通气量对抑菌活性的影响如图15所示。
发酵温度对抑菌活性的影响
通过图16可知，保持其它条件不变，当发酵温度为32℃时，发酵液对赤星真菌的抑菌活性最好；当发酵温度为28℃时，发酵液对赤星真菌的抑菌活性最不理想。发酵温度对抑菌活性的影响如图16所示。
发酵时间对抑菌活性的影响
发酵时间对抑菌活性的影响如图17所示。通过图17可知，保持其它条件不变，发酵时间为3d时，发酵液对赤星真菌的抑菌活性最好；当发酵时间为2d时，发酵液对赤星真菌的抑菌活性最不理想。
种龄对抑菌活性的影响
通过图18可知，保持其它条件不变，当种龄为4d时，发酵液对赤星真菌的抑菌活性最好；当种龄为6d时，发酵液的抑菌活性最不理想。种龄对抑菌活性的影响如图18所示。
菌株发酵液防效测试
采用前述优化的发酵培养基和发酵条件对菌株进行发酵，0.22μm滤膜过滤去除菌体，获得无菌体发酵滤液；按常规方法制备烟草赤星病菌孢子液(2×104/ml)。
烤烟按常规方式进行漂浮育苗，烟苗长至5-6片叶时，移栽入装有900g土的花钵中，常规肥水管理至烟苗长出9-10片叶时进行试验处理，分别取等量菌株发酵稀释液(100倍稀释)、 3％多抗霉素500倍液、80％多菌灵1000倍液和不接菌的发酵培养液均匀喷雾于盆栽烟株叶片，两小时后，将等量赤星病菌孢子液喷雾接种于烟株叶片，每处理三个重复，每重复5盆；处理后烟株在温室内随机排列摆放，10天后按GB/T23222-2008《烟草病虫害分级及调查方法》调查、计算病情指数和防效。
表5
处理 病指 发病率(％) 防效(％)
对照 42.96 88.90 /
F706 5.43 35.56 60.00
多抗霉素 9.14 44.44 50.01
多菌灵 4.94 31.11 65.01
如表5所示，本发明从平板活性测试和温室防效将结果来看，F706对其他烟草主要病害应该都具备较好的抑制效果。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，本发明要求保护范围由所附的权利要求书、说明书及其等效物界定。
序列表
<110> 贵州省烟草科学研究院
<120> 一种烟草赤星病拮抗放线菌菌株及其应用
<130> 2020
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1383
<212> DNA
<213> 人工序列(烟草赤星病拮抗放线菌的基因序列)
<400> 1
tgcagtcgaa cgatgaagcc cttcggggtg gattagtggc gaacgggtga gtaacacgtg 60
ggcaatctgc ccttcactct gggacaagcc ctggaaacgg ggtctaatac cggatacgac 120
tgcggaaggc atcttctgtg gtggaaagct ccggcggtga aggatgagcc cgcggcctat 180
cagcttgttg gtggggtaat ggcctaccaa ggcgacgacg ggtagccggc ctgagagggc 240
gaccggccac actgggactg agacacggcc cagactccta cgggaggcag cagtggggaa 300
tattgcacaa tgggcgaaag cctgatgcag cgacgccgcg tgagggatga cggccttcgg 360
gttgtaaacc tctttcagca gggaagaagc gaaagtgacg gtacctgcag aagaagcgcc 420
ggctaactac gtgccagcag ccgcggtaat acgtagggcg caagcgttgt ccggaattat 480
tgggcgtaaa gagctcgtag gcggcttgtc acgtcggatg tgaaagcccg aggcttaacc 540
tcgggtctgc attcgatacg ggctagctag agtgtggtag gggagatcgg aattcctggt 600
gtagcggtga aatgcgcaga tatcaggagg aacaccggtg gcgaaggcgg atctctgggc 660
cattactgac gctgaggagc gaaagcgtgg ggagcgaaca ggattagata ccctggtagt 720
ccacgccgta aacgttggga actaggtgtt ggcgacattc cacgtcgtcg gtgccgcagc 780
taacgcatta agttccccgc ctggggagta cggccgcaag gctaaaactc aaaggaattg 840
acgggggccc gcacaagcgg cggagcatgt ggcttaattc gacgcaacgc gaagaacctt 900
accaaggctt gacatatacc ggaaagcatt agagatagtg ccccccttgt ggtcggtata 960
caggtggtgc atggctgtcg tcagctcgtg tcgtgagatg ttgggttaag tcccgcaacg 1020
agcgcaaccc ttgtcctgtg ttgccagcat gcccttcggg gtgatgggga ctcacaggag 1080
accgccgggg tcaactcgga ggaaggtggg gacgacgtca agtcatcatg ccccttatgt 1140
cttgggctgc acacgtgcta caatggccgg tacaatgagc tgcgataccg tgaggtggag 1200
cgaatctcaa aaagccggtc tcagttcgga ttggggtctg caactcgacc ccatgaagtc 1260
ggagtcgcta gtaatcgcag atcagcattg ctgcggtgaa tacgttcccg ggccttgtac 1320
acaccgcccg tcacgtcacg aaagtcggta acacccgaag ccggtggccc aacccttgtg 1380
gag 1383

Claims (7)

1.一种烟草赤星病拮抗放线菌菌株，其特征在于：该菌株为所述的烟草赤星病拮抗放线菌为黄三素链霉菌Streptomyces flavotriciniF706；保藏名称为黄三素链霉菌F706；保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址是湖北省武汉市武昌区珞珈山武汉大学；保藏日期：2020年11月18 日；保藏编号： CCTCC No. M 2020755。
2.权利要求1所述的烟草赤星病拮抗放线菌菌株制备的烟草赤星病拮抗放线菌菌剂。
3.根据权利要求2所述的烟草赤星病拮抗放线菌菌剂，其活性成分为权利要求1所述的烟草赤星病拮抗放线菌菌株的发酵培养物。
4.权利要求1所述的烟草赤星病拮抗放线菌菌剂的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）烟草赤星病拮抗放线菌种子液制备： 将菌种F706接种在培养基后，于 28℃培养箱中培养36-48h后开始出现菌落，72-96h后开始产生孢子；
（2）发酵菌剂制备：将上述烟草赤星病拮抗放线菌种子液接种于发酵基础培养基中，调节发酵液中烟草赤星病拮抗放线菌的菌体浓度为1.0×106- 107CFU/mL，获得烟草赤星病拮抗放线菌菌剂。
5.根据权利要求4所述的烟草赤星病拮抗放线菌菌剂的制备方法，其特征在于：在步骤（1）中，放线菌的培养：将-80 ℃冰箱保存的F706放线菌菌种溶化后，用枪头反复吸取混匀，再吸取100 μl涂布于ISP2固体培养基上，然后放入28 ℃培养箱中培养7 d待用；病原真菌的培养：将活化的烟草赤星病菌接入AEA培养基上，放入28 ℃培养箱中培养5 d待用；
种子液制备培养基：ISP2液体培养基，即酵母浸粉4 g，葡萄糖4 g，麦芽浸粉10 g，蒸馏水1000 ml；
在步骤（2）中，菌悬液的制备：挑取适量拮抗放线菌F706，加入装有无菌水的15 ml离心管中，混匀制成菌悬液，待用；
所述的发酵基础培养基：P2培养基：即黄豆饼粉3%，玉米粉2%，葡萄糖2%，硫酸铵0.4%，碳酸钙 0.4%，磷酸氢二钾 0.02%，pH 7.0-7.2；装样量为500 ml的三角瓶装发酵基础培养基80 ml，即黄豆饼粉2.4 g，玉米粉1.6 g，葡萄糖1.6 g，硫酸铵0.32 g，碳酸钙0.32 g，磷酸氢二钾 0.016 g，80 ml蒸馏水，pH 7.0-7.2。
6.根据权利要求5所述的烟草赤星病拮抗放线菌菌剂的制备方法，其特征在于：在步骤（1）中，种子液的制备：装样量为250 ml的三角瓶装ISP2液体培养基50 ml，接菌量三块直径为5 mm大小的F706菌块，28 ℃，150 r/min恒温震荡培养，2-3 d后备用；
在步骤（2）中，装样量为500 ml的三角瓶装培养基80 ml，接菌量为每瓶1%的F706菌悬液，即每瓶加入800 μl菌悬液，28 ℃，150 r/min恒温震荡培养4 d后，将发酵液在室温9000rpm下离心10 min，用0.2 μm过滤器过滤上清液去除菌体，无菌发酵液于4 ℃冰箱保存备用。
7.权利要求1所述的烟草赤星病拮抗放线菌菌株或权利要求2所述的烟草赤星病拮抗放线菌菌剂在生产用于烟草赤星病防治的产品中的应用。
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CN113930372B (zh) * 2021-11-25 2023-06-13 山东省科学院生态研究所(山东省科学院中日友好生物技术研究中心) 阿姆利则链霉菌s1-12及其预防和控制土传病害的应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
生防链霉菌配施棉秆炭对连作棉田土壤微生物区系的影响;马云艳等;《中国生态农业学报》;20170331(第03期);第96-105页 *
藤黄轮丝链霉菌T0907-107抑菌活性研究;肖顺等;《农业生物技术学报》;20141231(第11期);第15-22页 *
谷瘟病菌拮抗放线菌的筛选、鉴定及抑菌活性;牛倩云等;《山西农业科学》;20170920(第09期);第133-137页 *

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