CN115340961B - 拮抗水稻细菌性条斑病菌的沙阿霉素链霉菌及其应用 - Google Patents

拮抗水稻细菌性条斑病菌的沙阿霉素链霉菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于微生物防治领域，涉及拮抗水稻细菌性条斑病菌的沙阿霉素链霉菌(Streptomyces zaomyceticus)Sz‑11菌株及其在植物病害防治中的应用。本发明公开了一种沙阿霉素链霉菌Sz‑11，其保藏编号为：CCTCC NO:M 20211630。沙阿霉素链霉菌Sz‑11能抑制水稻细菌性条斑病(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola)，并能促进水稻种子萌发和幼苗生长。

Description

拮抗水稻细菌性条斑病菌的沙阿霉素链霉菌及其应用
技术领域
本发明属于微生物防治领域，涉及拮抗水稻细菌性条斑病菌的沙阿霉素链霉菌(Streptomyces zaomyceticus)Sz-11菌株及其在植物病害防治中的应用。
背景技术
水稻细菌性条斑病(Rice bacterial leaf streak)是水稻最严重的细菌性病害之一，会导致水稻严重减产。我国早已将此病害列入了禁止进境的检疫性有害生物名单中。其病原物为稻生黄单胞杆菌稻细条斑致病变种(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola，Xooc)，主要侵染水稻、陆稻、野生稻等植物，近年来在农业生产上造成的损失已超过白叶枯病。
水稻细菌性条斑病是一种重要的检疫性水稻病害，其发生具有流行性、暴发性和毁灭性等特点，该病是我国南方稻区生产的重要病害，病原物主要在病稻草和染病的稻谷上越冬，寄生在种子上随种子外调而远距离传播。在大田期病菌主要从植株的伤口和气孔侵入，在气孔下繁殖扩展到薄壁组织细胞间隙并纵向扩展，形成条斑。田间病株上溢出的菌脓，通过灌溉水、风雨和农事操作传播，接触稻幼嫩的叶片进行再侵染，引起病害扩展蔓延，并且在水稻的移栽期，分蘖末期到抽穗期等生育期，均会发生。当气候条件适宜时，在感病品种上能引起15％～25％损失，严重时达40％～60％，对水稻的高产稳产造成了严重威胁。
水稻细菌性条斑病是由稻生黄单胞杆菌稻细条斑致病变种(Xanthomonas oryzaepv.oryzicola,Xooc)引起的，危害部位主要集中在叶部，病斑呈暗绿色水浸状小斑，后发展为黄褐色细条斑。病害处常溢出串珠状黄色菌脓，因外部空气流通、温度等作用转变为干燥的胶状小粒。病害流行时，叶片呈卷曲状，形成鲜艳的黄色发病中心，稻株有早期死亡或无法抽穗的情况，部分稻株可正常抽穗，但其籽粒缺乏足够的饱满性，品质显著下降。水稻细菌性条斑病发病后较难治好，目前还未选育出对细菌性条斑病有抗性的水稻品种，仍主要使用以噻唑类化学药剂为主的化学防治方法。因此，长期使用容易造成病原菌抗药性突变体的比例上升，产生抗药性，并且其抗药性能够稳定遗传。在缺乏有效化学药剂和抗病品种的前提下，利用生防菌防治水稻细菌性条斑病是一种值得探索的防治途径，而且拮抗菌在防治植物病害中被认为是一类具有发展潜力的生防因子。
放线菌是一类广泛用于农业生产的重要生防微生物。高嫚妮等(2019年)从银杏树林土壤中分离放线菌，并用生长速率法测得其对苹果腐烂病菌和苹果斑点落叶病菌的抑制率达到了98％以上，对苹果褐斑病菌、小麦赤霉病菌、稻瘟病等其它病原菌的抑制率均大于60％。张艳军等(2014年)从不同环境中分离纯化得到的88株菌株中，筛选得到了对水稻白叶枯病菌具有明显拮抗作用的12号菌株，其抑菌圈直径为60.9mm，将其作为微生物农药具有一定的应用价值和开发前景。近年来，众多学者已陆续筛选获得不同种类的拮抗放线菌，用于防治不同植物病害的报道不胜枚举。
CN108004183A的发明涉及一株处理大豆种子后具诱导大豆产生对大豆胞囊线虫抗性的沙阿霉素链霉菌(Streptomyces zaomyceticus)Snea182的培养方法及其应用。沙阿霉素链霉菌Snea182代谢物处理大豆种子后可以诱导大豆对苗期第一代胞囊线虫产生明显的抗性，对大豆胞囊线虫胞囊的形成有明显的抑制作用，是很有潜力的生防菌，为防治大豆胞囊线虫病开辟了新思路。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种对水稻细菌性条斑病菌具有高拮抗作用的沙阿霉素链霉菌(Streptomyces zaomyceticus)Sz-11菌株及其应用----在水稻细菌性条斑病害防治及促进水稻种子萌发中的应用。
为解决上述技术问题，本发明提供一种沙阿霉素链霉菌(Streptomyceszaomyceticus)Sz-11，其保藏编号为：CCTCC NO:M 20211630。
作为本发明的沙阿霉素链霉菌(Streptomyces zaomyceticus)Sz-11的改进：16SrDNA序列如SEQ ID NO:1所述。
本发明还同时提供了沙阿霉素链霉菌(Streptomyces zaomyceticus)Sz-11的用途：防治水稻细菌性条斑病害。
作为本发明用途的改进：促进水稻种子萌发和幼苗生长。
作为本发明用途的进一步改进：抑制水稻细菌性条斑病(Xanthomonas oryzaepv.oryzicola)，并能促进水稻种子萌发和幼苗生长。
本发明针对水稻细菌性条斑病的农药防治日益暴露出来的问题，以利用微生物及其次级代谢产物进行水稻细菌性条斑病的生物防治成为研究方向。
本发明所述沙阿霉素链霉菌(Streptomyces zaomyceticus)Sz-11菌株，保藏名称沙阿霉素链霉菌Sz-11(Streptomyces zaomyceticusSz-11)，保藏编号为：CCTCC NO:M20211630，保藏地址：中国武汉武汉大学；保藏日期为2021年12月15日。
本发明从不同生境土壤样品中分离到165株放线菌菌株(图1)，经筛选得到1株拮抗水稻细菌性条斑病菌效果较好的菌株，编号为Sz-11，该菌株分离自柏树(Cupressusfunebris)根际土壤。依据形态特征、生理生化特征和16S rDNA序列分析，鉴定为沙阿霉素链霉菌(Streptomyces zaomyceticus)。以期为水稻细菌性条斑病的生物防治提供新的拮抗放线菌资源。
沙阿霉素链霉菌(Streptomyces zaomyceticus)Sz-11菌株发酵滤液对水稻细菌性条斑病菌有显著抑制作用，可以用来防治水稻细菌性条斑病等。Sz-11菌株在高氏1号液体培养液中发酵7d(温度为28℃)，0.22μm滤膜过滤得到发酵滤液，取200μL牛津杯法测定其对水稻细菌性条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola,Xooc)的抑制作用，抑菌圈直径可达54.52±2.02mm(图5)。抗菌谱试验结果表明：链霉菌Sz-11菌株发酵滤液还对植物病原细菌水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)具有较强的抑制作用(表3)。盆栽防效试验表明：Sz-11菌株发酵滤液对水稻细菌性条斑病的相对防效可达84.38％以上，病斑抑制率可达88.92％(图8)。链霉菌Sz-11菌株可为微生物源农药开发提供优良的菌株，在水稻、大豆、菜豆等作物病害生物防治上有较好的应用前景。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1为部分代表性放线菌纯菌株的菌落形态(高氏1号培养基，7d)；
图2为链霉菌Sz-11菌株的菌落和显微形态特征(高氏1号培养基，7d)；
图2中：A为Sz-11菌株菌落正面图；B为Sz-11菌株菌落背面图；C为Sz-11菌株单菌落图；D～F为菌株菌丝光学显微形态图；G～H为Sz-11菌株扫描电子显微镜下菌丝形态图；
图3为链霉菌Sz-11菌株生理生化部分实验结果；
图4为基于16S rDNA序列构建的链霉菌Sz-11菌株进化树；
图5为链霉菌Sz-11菌株发酵滤液对水稻细菌性条斑病菌Xooc生长的抑制作用；
图6为链霉菌Sz-11菌株发酵滤液对水稻细菌性条斑病菌Xooc细胞影响的扫描电子显微镜照片；
图6中：A：磷酸缓冲液处理(CK)；B：链霉菌Sz-11菌株发酵滤液处理；
图7为链霉菌Sz-11菌株的抗菌谱；
图8为Sz-11菌株发酵液不同处理后不同水稻品种的病斑抑制率；
图9链霉菌Sz-11发酵滤液对水稻细菌性条斑病的防效实验结果；
图9中：
CK1：清水阴性对照；CK2：Xooc阳性对照；
T1：发酵液治理组；T2：发酵液预防组；
T3：4倍稀释发酵液治理组；T4：4倍稀释发酵液预防组；
图10为链霉菌Sz-11发酵滤液对水稻种子萌发的影响。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1、拮抗水稻细菌性条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola)放线菌的筛选和鉴定
1菌株
(1)放线菌菌株：春、秋两季从浙江省仙居县南峰山、神仙居，浙江省金华市双龙洞、尖峰山，浙江省杭州市天目山等地植被茂密处(柏树、樟树、马尾松、茶树、红豆杉等植物根际)，铲除表土，取5～10cm深处的土壤分离纯化收集得到168株放线菌菌株。
(2)水稻细菌性条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola，Xooc，以下均缩写为Xooc)强致病力菌株RS105由本实验室提供保藏。
2培养基
(1)高氏1号固体培养基：可溶性淀粉20g、KNO3 1g、K2HPO4 0.5g、MgSO4·7H2O0.5g、NaCl 0.5g、FeSO4·7H2O 0.01g、琼脂20g，水1000mL，pH 7.4。用于放线菌菌株的分离纯化和鉴定。
(2)高氏1号液体培养基：不加琼脂，其余配方同(1)，用于放线菌菌株的液体发酵培养。
(3)NA培养基：牛肉浸膏3g、蛋白胨5g、蔗糖10g、酵母浸出粉1g、琼脂20g、水1000mL、pH 7.0-7.2。用于Xooc病菌的培养。
(4)NA液体培养基：不加琼脂，其余配方同(3)，用于Xooc的活化和发酵培养。
3实验方法
3.1放线菌菌株的分离纯化和保藏
用土壤梯度稀释涂布法分离。取5g土样加入到45mL无菌水中，摇床(180r/min)振荡30min后，静置10min取上清液，用无菌水进行浓度梯度稀释(10-2～10-5)，取每个梯度土壤稀释液200μL涂布于含0.01％重铬酸钾的高氏1号固体培养基平板上，于培养箱中28℃培养5～7d。挑取具有典型放线菌菌落特征的单菌落，经3次划线得到纯菌株，编号后，用25％甘油保藏于-80℃冰箱备用。
3.2拮抗Xooc放线菌菌株的筛选
3.2.1共培养法初筛
将采集到的菌株分别划线接种于高氏1号培养基平板上，28℃恒温培养活化待用；将Xooc接种于NA液体培养基中，摇床活化培养(160r/min、28℃)至OD600＝0.6时，吸取1mL的Xooc菌液加入到99mL融化的NA培养基中混匀倒板，待凝固后，用无菌打孔器(6mm)从接有菌落生长旺盛的放线菌纯菌株平板中取出菌饼置于平板中央，以空白高氏1号固体培养基菌饼为对照，28℃恒温培养3d，用十字交叉法测量抑菌圈大小，每组实验设置3个重复。根据抑菌圈有无和大小初步筛选有拮抗作用的放线菌菌株。
3.2.2牛津杯法复筛
(1)放线菌菌株的发酵培养：将有拮抗作用的放线菌接种到高氏1号培养基平板中，28℃培养3d，用直径6mm的无菌打孔器在放线菌平板上打孔取菌块，接种至装有50mL高氏1号液体培养液的250mL三角瓶中，于160r/min、28℃摇床培养7d后，将50mL发酵液12000r/min离心10min后，过0.22μm滤膜，获得发酵滤液备用。
(2)Xooc的培养：将Xooc接种于NA液体培养基中，摇床活化培养(160r/min、28℃)，当菌密度达到OD600＝0.6时，取1mL的Xooc菌液加入到99mL融化的NA培养基中混匀倒板，待凝固后，将灭菌的牛津杯放置于平板中央，加入200μL发酵滤液，以空白高氏1号液体培养基为对照，28℃恒温培养3d，用十字交叉法测量抑菌圈大小，每组实验设置3个重复。根据抑菌圈大小选择出拮抗作用较强的放线菌菌株。
3.2.3目标菌株发酵滤液处理后Xooc细胞形态变化的扫描电镜观察
(1)Xooc的培养：将Xooc接种于NA液体培养基中，摇床活化培养(160r/min、28℃)至菌密度为OD600＝0.6。
(2)放线菌菌株的发酵培养：用3.2.2(1)的方法获得有拮抗作用放线菌的发酵滤液。
(3)扫描电镜观察：将1mL发酵滤液与9mL Xooc菌液共同摇床培养4h(160r/min、28℃)，以加磷酸缓冲液(pH7.4的PBS缓冲液)处理的Xooc菌液为对照组，4h后12000r/min离心10min收集菌体。磷酸缓冲液(PBS)洗涤3次，加入2.5％戊二醛于4℃冰箱中固定过夜；离心弃去固定液加入PBS洗涤3次，依次加入30％、50％、70％、90％和无水乙醇进行梯度脱水，每次20min；叔丁醇置换酒精浸泡3次，每次30min，最后一次留少许叔丁醇，将样品放在-40℃下冷冻30min，置于真空冷冻干燥机中干燥过夜；将少量处理后的样品粘在导电胶上，喷金后在电镜下观察Xooc细胞形态变化。
3.3拮抗Xooc链霉菌目标菌株的鉴定
3.3.1形态特征观察
将目标菌株划线接种在高氏1号培养基平板上，28℃培养7d，观察菌落大小、形态、质地、表面、色泽等特征。用插片法和埋片法培养Sz-11菌株，光学显微镜下观察目标菌株的基内菌丝、气生菌丝和孢子丝等形态特征，并拍照。用扫描电镜观察菌体形态，制样方法同3.2.3。
3.3.2生理生化特征实验
对目标菌株进行淀粉水解、纤维素水解、明胶液化、H2S产生、碳源氮源利用等生理生化试验。
3.3.3 16S rDNA序列分析
提取目标菌株的基因组DNA，扩增16S rDNA序列，送上海生物工程公司测序。将测序得到的16S rDNA序列提交至GenBank并利用BLAST比对后进行分析，采用MEGA-X软件中Neighbor-Joining法构建系统发育树，确定所属的放线菌种类。
4实验结果
4.1放线菌纯菌株的获得
通过分离纯化从不同生境土壤样品中分离纯化共获165株放线菌纯菌株，32株代表性放线菌纯菌株的在高氏1号培养基培养7d的菌落如图1所示。
4.2拮抗Xooc放线菌菌株的筛选
利用共培养法和牛津杯法对165株放线菌菌株进行Xooc抑制效果的初筛和复筛，不同放线菌菌株抑制Xooc作用存在较大差异。经筛选获得1株拮抗作用较强的放线菌菌株，编号为Sz-11菌株，牛津杯法测定的抑菌圈直径达54.52±2.02mm(图5)，Sz-11菌株分离于浙江省台州市仙居县的柏树(Cupressus funebris)根际土壤。
4.3 Sz-11菌株发酵滤液处理后Xooc细胞形态的变化
扫描电镜观察结果表明：链霉菌Sz-11菌株发酵滤液处理Xooc细胞后，Xooc细胞内含物外漏，菌体被溶解，进一步表明链霉菌Sz-11菌株发酵滤液对Xooc细胞有强烈的致死作用(图6)。
4.4 Sz-11菌株的鉴定结果
Sz-11菌株形态特征：Sz-11菌株在高氏1号固体培养基上呈现出明显放射状菌落。菌落初期为透明肉色，培养3d后基内菌丝颜色加深呈现浅褐色，出现少量稀疏孢子，形态呈圆形放射状；菌落中心呈折皱状，菌丝生长于固体培养基内，周边呈放射状，基内菌丝致密，气生菌丝粗壮且长；培养7d后菌落表面覆盖白色孢子，中心孢子较少，气生菌丝呈绒粉状且干燥，无同心环；显微镜观察，基内菌丝致密交织，无隔膜，不断裂；气生菌丝粗壮且密，呈树状，多分支，直径为1.0～1.4μm；气生菌丝分支发育成熟分化为孢子丝，呈长直链状，孢子呈长圆形。在电子显微镜观察下，孢子外壁粗糙。(图2)。
生理生化试验结果表明：Sz-11菌株能产生淀粉酶、脂肪酶、过氧化氢酶、脲酶、明胶酶等多种酶类产物及H2S、有机酸等代谢产物(表1、图3)；可利用多种碳源，利用效果较佳的是葡萄糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖等(表2)；可利用多种氮源，较佳氮源是蛋白胨、组氨酸；适宜酸碱度是pH 7.3，最适转速为160r/min，适宜培养温度是28℃。
表1链霉菌Sz-11菌株生理生化试验结果
Figure BDA0003615288740000071
注：+++表示能力强，++表示能力中，+表示能力较弱，-表示无。
表2链霉菌Sz-11菌株碳源、氮源利用试验结果
Figure BDA0003615288740000072
注：+++表示生长旺盛，++表示生长良好，+表示生长一般，-表示不生长。
16S rDNA序列如SEQ ID NO:1所述。
与沙阿霉素链霉菌(Streptomyces zaomyceticus)的进化距离最近(图4)。根据Sz-11菌株的形态特征、生理生化试验结果和16S rDNA序列分析，结合链霉菌属(Streptomyces)分种检索表和进化树分析，将Sz-11菌株鉴定为沙阿霉素链霉菌(Streptomyces zaomyceticus)。
本发明的沙阿霉素链霉菌(Streptomyces zaomyceticus)Sz-11菌株，保藏名称沙阿霉素链霉菌Sz-11(Streptomyces zaomyceticusSz-11)，保藏编号为：CCTCC NO:M20211630，保藏地址：中国武汉武汉大学；保藏日期为2021年12月15日。
实施例2、沙阿霉素链霉菌(Streptomyces zaomyceticus)Sz-11菌株抗菌谱测定
1菌株
(1)沙阿霉素链霉菌(Streptomyces zaomyceticus)Sz-11菌株。
(2)4种代表性植物病原细菌：如水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzaepv.oryzae)、菜豆细菌性疫病菌(Xanthomonas axonopodis pv.phaseoli)、番茄细菌性叶斑病菌(Pseudomonas syringae pv.tomato)、大豆细菌性斑疹病菌(Xanthomonasaxonopodis pv.glycines)4种代表性植物病原细菌(见表3)，用于Sz-11菌株发酵滤液抗细菌谱测定。
2培养基
同实施例1。
3实验方法
3.1 Sz-11菌株的培养和发酵滤液的制备
用打孔器取Sz-11菌株1菌饼(直径6mm)，接种于高氏1号培养液中，装液量50/250mL、初始pH 7.3，160r/min，28℃恒温摇床培养72h，作为种子液。按照8％接种量将种子液接种于发酵培养液(即，高氏1号液体培养基)中，摇床发酵培养7d。将发酵液置于50mL离心管中12000r/min离心10min，上清液用0.22μm滤膜过滤，除去残余孢子，得到发酵滤液，备用。
3.2植物病原细菌的活化
将保藏于4℃的4种病原细菌分别接种于NA培养基中，于28℃活化培养2d。然后转接于新的NA培养基上于28℃培养2d，用于细菌抗菌谱测定。
3.3 Sz-11菌株抗细菌谱的测定
将已经活化培养的4种植物病原细菌分别接种于NA培养液中，摇床培养(160r/min、28℃)，当菌密度达到OD600＝0.6时，分别取1mL的病原菌菌液加入到99mL融化的NA培养基中混匀倒板，待凝固后，将灭菌的牛津杯放置于平板中央，加入200μL发酵滤液(步骤3.1所得)，以空白高氏1号液体培养基为对照，28℃恒温培养3d，用十字交叉法测量抑菌圈大小，每组实验设置3个重复。
4实验结果
对4种代表性植物病原细菌抗菌谱测定结果表明：链霉菌Sz-11菌株发酵滤液对水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)有较强的抑制作用(见表3，图7)；对菜豆细菌性疫病菌(Xanthomonas axonopodis pv.phaseoli)、番茄细菌性叶斑病菌(Pseudomonas syringae pv.tomato)、大豆细菌性斑疹病菌(Xanthomonas axonopodispv.glycines抑制作用较弱。
表3链霉菌Sz-11菌株发酵滤液对4种代表性植物病原细菌的抑制效果
Figure BDA0003615288740000091
注：不同小写字母代表处理间差异显著(P<0.05)
实施例3、链霉菌Sz-11菌株发酵液对水稻细菌性条斑病的防效研究
1病菌和水稻品种
(1)用于防效的放线菌：沙阿霉素链霉菌(Streptomyces zaomyceticus)Sz-11菌株。
(2)病原菌：水稻细菌性条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola，Xooc)
(3)水稻品种：选用对水稻细菌性条斑病易感的湘两优900、甬优15、嘉丰优2号、甬优1540 4个品种。
2培养基
同实施例1。
3实验方法
3.1水稻的培育
将大小均一饱满的水稻种子于75％酒精中表面消毒5min，无菌水冲洗5次以上，将种子放在湿润的滤纸上，置于37℃培养箱中直到种子发芽，将发芽的种子播种到土壤中，置于培养箱培养至水稻叶片长度超过20cm，备用。培养条件：光照16h、温度30℃，黑暗8h、温度26℃，湿度65％，两天浇一次水，一周喷营养液一次。
3.2 Xooc病菌的培养
将保藏于4℃的Xooc病菌接种于NA培养基平板上，于28℃活化培养3d；挑取单菌落接入装有3mL NA液体培养基的10mL试管中，活化至OD600＝0.6；取1mL菌液加入至100mL NA液体培养基中培养至OD600＝0.6；取Xooc病菌NA培养液，12000r/min离心5min，去上清加入无菌水，配制成OD600＝0.6的Xooc病菌清水悬液，用于防效试验。
3.3 Sz-11菌株发酵液的制备
用打孔器取Sz-11菌株1菌饼(直径6mm)，接种于高氏1号培养液中，装液量50/250mL、初始pH 7.3，160r/min，28℃恒温摇床培养72h，作为种子液。按照8％接种量将种子液接种于发酵培养液中，摇床发酵培养7d，得到发酵滤液，备用。
3.4盆栽防效初步研究
(1)无菌水空白对照组(CK1)：无菌剪刀蘸取无菌水45°剪叶，并套袋保持接种处湿润(24h)；
(2)Xooc处理对照(CK2)：无菌剪刀蘸取Xooc水悬液(OD600＝0.6)45°剪叶，并套袋保持接种部位湿润(24h)；
(3)处理1(T1)：先用喷壶将目标菌株发酵液(步骤3.3所得)均匀的喷洒在叶片正反两面(剂量：100μL/cm2)，并套袋保持接种部位湿润；喷洒3h后，按照CK2的处理方法接种Xooc病菌，并套袋保持接种部位湿润(24h)；
(4)处理2(T2)，按照CK2组的处理方法接种Xooc病菌，并套袋保持接种部位湿润；接种3h后按照T1中的方法喷洒目标菌株发酵滤液,并套袋保持接种部位湿润(24h)；
(5)处理3(T3)，处理方法同T1，区别在于喷洒的发酵液为4倍稀释液；
(6)处理4(T4)：处理方法同T2，区别在于喷洒的发酵液为4倍稀释液。
以上各组处理，每个处理15株，每株5片叶(同位叶)。
待病情发展趋于稳定后，记录并统计发病情况。以叶片为单位调查病情，水稻细菌性条斑病病情分0～9级标准如下：
0级：剪口处无病斑；
1级：病斑面积为叶面积10％以下；
3级：病斑面积为叶面积11％～25％；
5级：病斑面积为叶面积26％～45％；
7级：病斑面积为叶面积46％～65％；
9级：病斑面积为叶面积65％以上。
根据病害严重程度，按以下公式计算病情指数及防治效果：
病情指数＝∑(各级病株数×相对应病级数)/(调查总株数×最高级代表值)×100；
相对防治效果(％)＝(CK2-TK)/CK2×100％；
4实验结果
实验结果如(图8、9)所示：Sz-11发酵液对甬优15等4个水稻品种的病斑抑制率可达76.88％～88.92％。实验结果还表明Sz-11菌株发酵滤液对水稻细菌性条斑病的防治效果，预防效果优于治疗效果。
实施例4、链霉菌Sz-11菌株发酵液浸种对水稻种子萌发的影响
1水稻品种：甬优15。
2培养基
同实施例1。
3实验方法
3.1 Sz-11菌株发酵液的制备
用打孔器取Sz-11菌株1菌饼(直径6mm)，接种于高氏1号培养液中，装液量50/250mL、初始pH 7.3，160r/min，28℃恒温摇床培养72h，作为种子液。按照8％接种量将种子液接种于发酵培养液中，摇床发酵培养7d。
3.2浸种促生实验
试验设4个处理，分别为蒸馏水(CK1)、高氏1号培养基(CK2)、Sz-11菌株发酵液(T1)和Sz-11菌株发酵液灭活菌剂(T2)(经121℃高温高压灭菌30min)作为浸种液。选取均匀饱满的水稻种子，用70％的乙醇处理3min，无菌水冲洗5次后，分别用上述4种处理液浸种24h后，将种子置于湿润滤纸的培养皿中在37℃下萌发，每个处理3皿，每皿100粒种子，8d后测定种子发芽率。统计发芽种子芽长、根长，试验重复3次。
种子发芽率＝发芽种子数/总种子数×100％。
4实验结果
链霉菌Sz-11菌株发酵滤液对水稻种子萌发率的影响实验结果如表4(图10)所示，对水稻种子的萌发具有显著的促进作用。
表4链霉菌Sz-11菌株发酵滤液对水稻种子萌发率的影响
Figure BDA0003615288740000121
注：不同小写字母代表处理间差异显著(P<0.05)。
说明：沙阿霉素链霉菌(Streptomyces zaomyceticus)Sz-11的发酵液按照上述方法处理水稻种子，发酵液T1和灭活发酵液T2处理之后的水稻种子萌发率显著上升，同CK1和CK2存在显著差异。而，沙阿霉素链霉菌(Streptomyces zaomyceticus)Snea182的发酵液对水稻种子萌发无促进效果。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
序列表
<110> 浙江师范大学
<120> 拮抗水稻细菌性条斑病菌的沙阿霉素链霉菌及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1332
<212> DNA
<213> 沙阿霉素链霉菌(Streptomyces zaomyceticus)
<400> 1
gtggattagt ggcgaacggg tgagtaacac gtgggcaatc tgcccttcac tctgggacaa 60
gccctggaaa cggggtctaa taccggataa caccggcttc cgcatgggag ctggttgaaa 120
gctccggcgg tgaaggatga gcccgcggcc tatcagcttg ttggtggggt aatggcctac 180
caaggcgacg acgggtagcc ggcctgagag ggcgaccggc cacactggga ctgagacacg 240
gcccagactc ctacgggagg cagcagtggg gaatattgca caatgggcga aagcctgatg 300
cagcgacgcc gcgtgaggga tgacggcctt cgggttgtaa acctctttca gcagggaaga 360
agcgaaagtg acggtacctg cagaagaagc gccggctaac tacgtgccag cagccgcggt 420
aatacgtagg gcgcaagcgt tgtccggaat tattgggcgt aaagagctcg taggcggctt 480
gtcacgtcgg gtgtgaaagc ccggggctta accccgggtc tgcatccgat acgggcaggc 540
tagagtgtgg taggggagat cggaattcct ggtgtagcgg tgaaatgcgc agatatcagg 600
aggaacaccg gtggcgaagg cggatctctg ggccattact gacgctgagg agcgaaagcg 660
tggggagcga acaggattag ataccctggt agtccacgcc gtaaacgttg ggaactaggt 720
gttggcgaca ttccacgtcg tcggtgccgc agctaacgca ttaagttccc cgcctgggga 780
gtacggccgc aaggctaaaa ctcaaaggaa ttgacggggg cccgcacaag cagcggagca 840
tgtggcttaa ttcgacgcaa cgcgaagaac cttaccaagg cttgacatat accggaaagc 900
attagagata gtgcccccct tgtggtcggt atacaggtgg tgcatggctg tcgtcagctc 960
gtgtcgtgag atgttgggtt aagtcccgca acgagcgcaa cccttgtcct gtgttgccag 1020
catgcccttc ggggtgatgg ggactcacag gagaccgccg gggtcaactc ggaggaaggt 1080
ggggacgacg tcaagtcatc atgcccctta tgtcttgggc tgcacacgtg ctacaatggc 1140
cggtacaaag agctgcgatg ccgcgaggcg gagcgaatct caaaaagccg gtctcagttc 1200
ggattggggt ctgcaactcg accccatgaa gtcggagttg ctagtaatcg cagatcagca 1260
ttgctgcggt gaatacgttc ccgggccttg tacacaccgc ccgtcacgtc acgaaagtcg 1320
gtaacacccg aa 1332

Claims (4)

1.沙阿霉素链霉菌（Streptomyces zaomyceticus）Sz-11，其特征在于保藏编号为：CCTCC NO: M 20211630。
2.如权利要求1所述的沙阿霉素链霉菌Sz-11的用途，其特征在于：防治水稻细菌性条斑病害。
3.如权利要求1所述的沙阿霉素链霉菌Sz-11的用途，其特征在于：促进水稻种子萌发和幼苗生长。
4.根据权利要求2或3的用途，其特征在于：抑制稻生黄单胞杆菌稻细条斑致病变种（Xanthomonas oryzae pv. oryzicola），并促进水稻种子萌发和幼苗生长。
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