CN109988730A - 一种桑树病害的生防菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种桑树病害的生防菌及其应用。本发明提供一种防治桑树枯萎病的铜绿假单胞菌菌株(Pseudomonas aeruginosa)，所述菌株于2019年3月19日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号是GDMCC No：60613。本发明首次得到了一株对桑枯萎病的多种病原具有良好的拮抗/防控效果的铜绿假单胞菌菌株。利用本发明提供的菌株或其发酵液对于桑树细菌性枯萎病进行生物手段防控，安全有效，能够避免化学农药带来的土壤环境恶化，病原的耐药性增强等各种问题，为桑树病害的生物防治奠定了基础，有很好的应用前景，值得大力推广。

Description

一种桑树病害的生防菌及其应用

技术领域

本发明涉及植物病害防控技术领域，更具体地，涉及一种桑树细菌性病害的生防菌及其应用。

背景技术

桑树病害是指由于病原微生物侵染而导致的生长发育不良、桑叶产量减低和品质变劣的现象。由于上述病害的存在，严重影响了桑叶的品质和产量，阻碍桑树种植业的发展。

桑树细菌性枯萎病(Mulberry bacterial wilt)又名桑枯萎病，与桑青枯病(Mulberry bacterial wilt)、桑疫病(Mulberry bacterial blight)为我国三大桑树细菌性病害。该病发病快、蔓延迅速，严重影响了桑的产量和质量，对浙江及华南各省(区)蚕桑生产造成了严重损失。目前尚无有效的化学农药及其他的防治方法。

该病病原菌具有多样化特征：浙江大学谢关林课题组明确指出引起浙江地区的桑树细菌性枯萎病的病原菌为肠杆菌属(Enterobacter)细菌，分别阿氏肠杆菌(E.sburiae)、阴沟肠杆菌(E.cloacae)和桑肠杆菌(E.mori.)。戴凡炜等从广东和广西的病样分离得到的桑树细菌性枯萎病的新病原菌为克雷伯氏杆菌属(K.lebsiella)的肺炎杆菌(K.pneumoniae)、克雷伯氏菌(K.variicola)、产酸克雷伯氏菌(K.oxytoca)和泛菌属(Pantoea)的菠萝泛菌(P.ananatis)。

桑青枯病是青枯病原细菌侵染桑根系木质部导管，影响水分运输，致使叶片失水、桑树死亡的一种维管束病害。该病来势猛、蔓延快，是一种对桑树具有毁灭性的土传植物检疫性病害,可引起新种桑或成林桑当年死亡。

大部分桑树病害为土传性病害，难以防治，目前主要采用化学药剂达到缓和病害的目的，化学农药具有见效快的优势，对病情可快速得到缓解，但大规模使用使土壤环境恶化，病原的耐药性增强，不能根本上解决问题，所以寻找一种更有效、长久、安全的防治方法迫在眉睫。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种桑树病害的生防菌及其应用。

本发明的第一个目的是提供一种防止桑树病害的铜绿假单胞菌菌株。

本发明的第二个目的是提供所述菌株和/或其发酵液在防控肠杆菌属细菌、克雷伯氏菌属细菌、泛菌属细菌和/或劳尔氏菌属细菌，和/或制备防控肠杆菌属细菌、克雷伯氏菌属细菌、泛菌属细菌和/或劳尔氏菌属细菌的制剂中的应用。

本发明的第三个目的是提供所述菌株和/或其发酵液在防控植物病害和/或制备防控植物病害的制品中的应用。

本发明的第四个目的是提供一种防控植物病害的制剂。

为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：

本发明从桑树根部组织中分离得到一株桑枯萎病和桑青枯病病原有不同程度的拮抗/防控作用的内生菌，并结合形态特征、生理生化特征及r RNA全长序列分析对其进行鉴定，确定其为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。

本发明要求保护一种防治桑树病害的铜绿假单胞菌菌株，所述菌株于2019年3月19日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼)，保藏号是GDMCC No：60613，其生物材料名为Pseudomonas aeruginosa YD-001，分类学命名为Pseudomonas aeruginosa(铜绿假单胞菌)。

进一步，本发明要求保护以下内容：

所述菌株和/或其发酵液在防控肠杆菌属细菌、克雷伯氏菌属细菌、泛菌属细菌和/或劳尔氏菌属细菌，和/或制备防控肠杆菌属细菌、克雷伯氏菌属细菌、泛菌属细菌和/或劳尔氏菌属细菌的制剂中的应用；

所述菌株和/或其发酵液在防控植物病害和/或制备防控植物病害的制品中的应用。

优选地，所述植物病害为肠杆菌属细菌、克雷伯氏菌属细菌、泛菌属细菌和/或劳尔氏菌属细菌中的一种或几种引起的。

优选地，所述植物病害为桑树病害。

优选地，所述植物病害为桑树枯萎病和/或桑树青枯病。

更优选地，所述桑树枯萎病为桑树细菌性枯萎病。

本发明还要求保护一种防控植物病害的制剂，含有所述的菌株和/或其发酵液。

优选地，所述植物病害为桑树枯萎病和/或桑树青枯病。

更优选地，所述桑树枯萎病为桑树细菌性枯萎病。

优选地，所述肠杆菌属细菌为阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)。

优选地，所述克雷伯氏菌属细菌为克雷伯氏菌(Klebsiella variicola)。

优选地，所述泛菌属细菌为菠萝泛菌(Pantoea ananatis)。

优选地，所述劳尔氏菌属细菌为青枯劳尔氏菌(Ralstonia solanacearum)。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明首次得到了一株对桑枯萎病的多种病原具有良好的拮抗/防控效果的铜绿假单胞菌菌株。利用本发明提供的菌株或其发酵液对于桑树细菌性枯萎病/青枯病进行生物手段防控，安全有效，能够避免化学农药带来的土壤环境恶化，病原的耐药性增强等各种问题，为桑树病害的生物防治奠定了基础，有很好的应用前景，值得大力推广。

附图说明

图1为YD-001对阴沟肠杆菌、克雷伯氏菌、泛菌和青枯劳尔氏菌的抑菌作用；A：阴沟肠杆菌；B：克雷伯氏菌；C：桑青枯劳尔氏菌；D：菠萝泛菌；a：YD-001菌株发酵液上清；b：5％的硫酸链霉素；c：无菌生理盐水。

图2为YD-001菌株在NA培养基的菌落形态特征图。

图3为YD-001菌株的革兰氏染色图。

图4为YD-001菌株电镜图片图。

图5为基于rRNA构建的YD-001菌株的系统进化树。

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

病株采集：于广东省丝绸集团英德蚕种场采集不发病桑树植株，低温保存带回实验室，4℃保存备用。桑树品种为桂桑优12。

供试菌株：阴沟肠杆菌、克雷伯氏菌、菠萝泛菌及桑青枯劳尔氏菌由本实验室分离保存。

主要试剂：PCR试剂、蛋白酶K等试剂购于生工生物工程(上海)股份有限公司。

主要培养基：马铃薯葡萄糖琼脂(广东环凯微生物科技有限公司)、LB肉汤(广东环凯微生物科技有限公司)、牛肉汁蛋白胨琼脂培养基(NA)

生理生化培养基均购于广东环凯微生物科技有限公司。

实施例1根部内生菌的分离纯化

一、实验方法

1、根部内生菌的分离纯化

取新采集的桑树根部组织用自来水冲洗干净后，剪成约3～4cm的根段置于带有开关的漏斗(漏口有滤网)内，然后在超净工作台上往漏斗内加入75％酒精，浸泡约15s后排干酒精，同样方法用升汞处理5min，再用无菌水冲洗3～4次，将根段取出置于工作台上风干后，用无菌镊子将根段的皮层撕下，露出木质部，然后用无菌解剖刀削刮下木质部纵条置于无菌的研钵内，加入约5mL无菌水后充分研磨，用移液枪取1mL的研磨液加入9mL的无菌水中，连续释5次，用接种环分别取一环第4和第5次的研磨稀释液在NA培养基平板上划线培养。待平板上长出菌落纯化后，将单菌落移至斜面上培养备用。

2、拮抗菌发酵产物的制备

挑取已纯化的单菌落在LB液体培养基中28℃、180r/min摇床振荡培养3d，8000r/min离心10min后取上清液用细菌过滤器(0.22μm微孔虑膜)过滤后做抑菌测试。

3、内生拮抗菌的筛选

采用滤纸片定量加液法测定内生菌的拮抗活性。3个直径5mm滤纸片等距离(15mm)放置在已均匀涂布供试菌株的培养皿中。用微量移液枪取40μL无菌滤液，少量多次加到滤纸片上。用0.5％的硫酸链霉素作对阳性对照，生理盐水做空白对照。每个平板各做3个重复。培养皿放置在28℃的恒温培养，48h后观察并测量抑菌圈大小。

二、实验结果

通过内生拮抗菌的筛选，发现了一株菌株对阴沟肠杆菌、克雷伯氏菌、桑青枯劳尔氏菌、菠萝泛菌均有拮抗作用，将其命名为YD-001，其拮抗作用见表1。

表1 YD-001菌株拮抗作用：

注：每组数据为三组重复的平均值及标准误差，不同字母表示组间显差异。

结果显示，拮抗菌的抗桑枯萎病病原能力分析表明，对桑细菌性枯萎病病原阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)、克雷伯氏菌(Klebsiella variicola)、菠萝泛菌(Pantoea ananatis)、青枯劳尔氏菌(Ralstonia solanacearum)均表现出不同程度的抑菌作用，并且抑菌效果均优于硫酸链霉素。具体结果如图1。

实施例2拮抗菌的鉴定

菌落平板的培养特征、革兰氏染色以及各项生理生化指标测试是确定细菌菌株分类地位的重要依据。rRNA基因序列因其具有高度保守性，可作为进化分析的重要参考标准。

一、实验方法

将筛选得到的拮抗菌株(YD-001)接种于牛肉膏蛋白胨培养基，28℃培养2d，观察记录菌落形态、生长状况、可溶性色素产生情况等。革兰氏染色、形态观察及接触酶、好氧性等相关理化参数的测定参照《常见细菌系统鉴定手册》和《伯杰细菌鉴定手册》。

对拮抗菌(YD001)进行全基因组测序，将得到的rRNA全长与从NCBI上下载目标物种近缘物种的rRNA全序列采用MUSCLE v.3.8.31(http://www.drive5.com/muscle/)软件进行多序列比对，再用比对后的序列通过Mega6软件、，最大似然法(ML法：MaximumLikelihood method))构建系统发育树，Bootstrap值设置为1000。

二、实验结果

YD-001菌株在NA培养基上生长良好，平均直径2mm～3mm，菌落大小不一，扁平，边缘较整齐，流动性较弱(图2)。理化性状测定结果显示：YD-001菌株呈革兰阴性杆菌，无芽孢(图3)，电镜表现为铜绿假单胞菌为杆状菌，或直或弯，两端钝圆，大小500nm～1200nm×20nm～23nm，1～3根极端鞭毛，表面粗糙。(图4)好氧，接触酶反应阳性，具有运动性等，见表2。依据《伯杰细菌鉴定手册》，将YD-001菌株初步鉴定为铜绿假单胞菌，并将其保藏于广东省微生物菌种保藏中心(地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼)，其生物材料名为Pseudomonas aeruginosa YD-001，分类学命名为Pseudomonas aeruginosa，保藏编号为GDMCC No：60613，保藏日期为2019年3月19日。

表2 YD-001的生理生化特征:

注:“+”表示阳性反应；“-”表示阴性反应。铜绿假单胞菌为阳性对照组。

以YD001菌株的rRNA全长构建系统发育树(图5)，结果显示YD001与铜绿假单胞菌的遗传进化距离最近。可确定菌株YD001属于铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa。

根据培养特征，革兰氏染色，各项生理生化指标测试以及基于r RNA全长序列进化树分析可将YD-1鉴定为铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa。

实施例3拮抗菌YD-001的盆栽防治

一、实验方法

盆栽试验所用土壤为腐殖质土，桑树种子品种选用感病品种“桂桑12”。桑树枯萎病病原为本实验分离保存的包括阴沟肠杆菌、泛菌、桑青枯劳尔氏菌、克雷伯氏菌。桑苗为50d实生苗。实验组，供试桑苗用10⁶cfu/mL拮抗菌YD-001菌株悬液浸根处理1min，以后隔1周淋1次菌悬液，共淋2次，20d后采用伤根灌根法接种10⁸cfu/mL病原菌菌悬液10ml。空白对照组，只接种病原菌。每个处理30株桑苗。20d后，调查记录桑树植株发病情况，计算发病率、病情指数、及防效。

发病率：发病株数/试验总株数×100

桑枯萎病严重度分级标准：

0级：无病斑；

1级：病斑占叶面积≤1/4；

2级：1/4＜病斑占叶面积，≤1/2；

3级：1/2＜病斑占叶面积，≤3/4；

4级：病斑占叶面积＞3/4。

病情指数＝[∑(病级叶片数×该病级数)/(调查总叶片数×最高病级值)]×100；

防效/％＝[(对照组病情指数－处理组病情指数)/对照组病情指数]×100。

二、实验结果

拮抗菌YD-001对桑树盆栽的防治效果如表3所示。

表3拮抗菌对桑树盆栽的防治效果：

注：不同字母表示组间显差异

结果显示：拮抗菌YD-001对桑树盆栽感染的与桑树枯萎病相关的阴沟肠杆菌、克雷伯氏菌、泛菌和青枯劳尔氏菌均有很好的防控效果。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> 一种桑树病害的生防菌及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 5156

<212> DNA

<213> 铜绿假单胞菌菌株(Pseudomonas aeruginosa)

<400> 1

gaactgaaga gtttgatcat ggctcagatt gaacgctggc ggcaggccta acacatgcaa 60

gtcgagcgga tgaagggagc ttgctcctgg attcagcggc ggacgggtga gtaatgccta 120

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ccaaagttgt ggttaagtgg taaacgatgt gggaaggctt agacagctag gaggttggct 3060

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gcgtagtcga tgggaaacag gttaatattc ctgtacttct ggttactgcg atggagggac 3420

ggagaaggct aggccagctt ggcgttggtt gtccaagttt aaggtggtag gctgaaatct 3480

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gtggttgatg ccatgcttcc aagaaaagct tctaagcttc aggtaaccag gaaccgtacc 3600

ccaaaccgac acaggtggtc gggtagagaa taccaaggcg cttgagagaa ctcgggtgaa 3660

ggaactaggc aaaatggcac cgtaacttcg ggagaaggtg cgccggctag ggtgaaggat 3720

ttactccgta agctctggct ggtcgaagat accaggccgc tgcgactgtt tattaaaaac 3780

acagcactct gcaaacacga aagtggacgt atagggtgtg acgcctgccc ggtgccggaa 3840

ggttaattga tggggttagc gcaagcgaag ctcttgatcg aagccccggt aaacggcggc 3900

cgtaactata acggtcctaa ggtagcgaaa ttccttgtcg ggtaagttcc gacctgcacg 3960

aatggcgtaa cgatggcggc gctgtctcca cccgagactc agtgaaattg aaatcgctgt 4020

gaagatgcag tgtatccgcg gctagacgga aagaccccgt gaacctttac tgtagctttg 4080

cactggactt tgagcctgct tgtgtaggat aggtgggagg ctttgaagcg tggacgccag 4140

ttcgcgtgga gccatccttg aaataccacc ctggcatgct tgaggttcta actctggtcc 4200

gtaatccgga tcgaggacag tgtatggtgg gcagtttgac tggggcggtc tcctcctaaa 4260

gagtaacgga ggagtacgaa ggtgcgctca gaccggtcgg aaatcggtcg cagagtataa 4320

aggcaaaagc gcgcttgact gcgagacaga cacgtcgagc aggtacgaaa gtaggtctta 4380

gtgatccggt ggttctgtat ggaagggcca tcgctcaacg gataaaaggt actccgggga 4440

taacaggctg ataccgccca agagttcata tcgacggcgg tgtttggcac ctcgatgtcg 4500

gctcatcaca tcctggggct gaagccggtc ccaagggtat ggctgttcgc catttaaagt 4560

ggtacgcgag ctgggtttag aacgtcgtga gacagttcgg tccctatctg ccgtggacgt 4620

ttgagatttg agaggggctg ctcctagtac gagaggaccg gagtggacga acctctggtg 4680

ttccggttgt cacgccagtg gcattgccgg gtagctatgt tcggaaaaga taaccgctga 4740

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aagggccgtc gaagactacg acgttgatag gctgggtgtg taagcgttgt gaggcgttga 4860

gctaaccagt actaattgcc cgtgaggctt gaccatataa cacccaaaca atctgacgat 4920

tgtgtgttgt aaggtgaagt cgacgaaccg aaagttcgca tgaaccgcaa aacaccttga 4980

aatcacatac ctgaatccgg atagacgtaa gcccaagcga acggatatcc aaccgaattg 5040

cttgacgatc atagagcgtt ggaaccacct gatcccttcc cgaactcaga agtgaaacga 5100

cgcatcgccg atggtagtgt ggggtctccc catgtgagag taggtcatcg tcaagc 5156

Claims (9)

1.一种防治桑树病害的铜绿假单胞菌菌株，其特征在于，所述菌株于2019年3月19日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号是GDMCC No：60613。

2.权利要求1所述菌株和/或其发酵液在防控肠杆菌属细菌、克雷伯氏菌属细菌、泛菌属细菌和/或劳尔氏菌属细菌，和/或制备防控肠杆菌属细菌、克雷伯氏菌属细菌、泛菌属细菌和/或劳尔氏菌属细菌的制剂中的应用。

3.权利要求1所述菌株和/或其发酵液在防控植物病害，和/或制备防控植物病害的制品中的应用。

4.根据权利要求3所述应用，其特征在于，所述植物病害为由肠杆菌属细菌、克雷伯氏菌属细菌、泛菌属细菌和/或劳尔氏菌属细菌中的一种或几种引起的。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述植物病害为桑树枯萎病和/或桑树青枯病。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述桑树枯萎病为桑树细菌性枯萎病。

7.一种防控植物病害的制剂，其特征在于，含有权利要求1所述的菌株和/或其发酵液。

8.根据权利要求7所述的制剂，其特征在于，所述植物病害为桑树枯萎病和/或桑树青枯病。

9.根据权利要求8所述的制剂，其特征在于，所述桑树枯萎病为桑树细菌性枯萎病。