CN107099474A - 一种具有广谱抗菌活性的绿针假单胞菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种具有广谱抗菌活性的绿针假单胞菌，以及该菌株在果树及大田作物病害防治中的应用，属于生物技术领域。一种具有广谱抗菌活性的绿针假单胞菌，分类命名为绿针假单胞菌（Pseudomonas chlororaphis），株号为YTBTa14，保藏编号为CCTCC NO:M 2016099，16S rDNA序列如序列表所示。本发明具有广谱抗菌活性的绿针假单胞菌，其菌体和发酵液均具有较强的广谱的果树真菌病害抗菌活性，且抗菌效果持久、稳定，具备从中开发出新型、高效、广谱生防杀菌剂的巨大潜力，为微生物应用于生物防治的开发提供了新的途径。

Description

一种具有广谱抗菌活性的绿针假单胞菌及其应用
技术领域
本发明涉及一种具有广谱抗菌活性的绿针假单胞菌，以及该菌株在果树及大田作物病害防治中的应用，属于生物技术领域。
背景技术
小麦、果树是世界上重要的经济作物，常年受到多种病害的危害，每年因病害造成的经济损失难以估计。目前农药是防控病虫害的最有效手段之一，但是因化学农药的广泛使用而引起的各种问题也随之而来，如农药残留、环境污染、病虫害抗药性的产生等，不利于农业的可持续发展。因此，禁止和限制大量高毒、高残留农药的使用，开发和使用生物源农药已成为保护环境和促进农业发展的重要研究课题。
生物防治是指利用生物及其代谢产物防治植物病虫害方法。它的实质就是利用生物种间关系、种内关系，调节有害生物种群密度，即生物群防治生物群。与传统的防治技术相比，生物防治技术具有不污染环境、对人和其他生物安全、产品无残留、易于同其他植物保护措施协调配合并能节约能源等优点，必将在有害生物综合防治中发挥着越来越重要的作用。到目前为止，真菌、细菌、放线菌、酵母菌都可用于生物防治。利用细菌防治有害微生物是开发和利用微生物资源的重要研究领域之一，亦是最具有潜力、应用前景最为广阔的有效途径之一。细菌防治优势主要有以下几点：一是繁殖速度快、培养成本低廉；二是对病原菌的作用方式较广，如细菌素、抗生素、胞外裂解酶、脂肽类等多种形式，三是有些细菌具有防病阻生的双重作用。
近年来，生物防治迅速发展，其中假单胞菌在植物病虫害防治中发挥了非常重要的作用。主要通过营养竞争、分泌降解微生物的酶及抗生作用等实现其生物防治作用。在我国，绿针假单胞菌主要用于多种蔬菜作物病原真菌、细菌引起的病害的有效防治，而针对果树及大田作物真菌病害的绿针假单胞菌未见报道。目前，研究者通过大量试验筛选到能够拮抗多种果树、病原真菌的绿针假单胞菌株，并初步取得显著成效。
发明内容
本发明的目的是针对果树及大田作物病害的生物防治，尤其是苹果轮纹病、樱桃疫病、葡萄炭疽病、葡萄白腐病、葡萄霜霉病、小麦纹枯病，提供了一种具有广谱抗菌活性的绿针假单胞菌及其应用，其菌体和发酵液对于多种果树病害及大田作物病害具有较好的防治效果。
一种具有广谱抗菌活性的绿针假单胞菌，分类命名为绿针假单胞 菌(Pseudomonas chlororaphis)，株号为YTBTa14，已于2016年3 月8日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称为CCTCC，地址为中国 武汉武汉大学)，保藏编号为CCTCC NO:M 2016099，16S rDNA序 列如序列表所示。
所述的绿针假单胞菌的形态特征为：菌体为杆状，0.3μm ～ 0.8μm×1.0μm ～1.1μm，革兰氏染色阴性，无芽孢，单极生鞭毛，能运动，在 KMB 培养基上培养 24h 后可形成1.2mm 菌落，菌落可产生橙色色素，圆形，表面凸起，光滑，较粘稠，易挑起，边缘整齐。
所述的绿针假单胞菌的生理生化特征为：能产生荧光色素，能水解精氨酸双水解酶、脂酶、氧化酶、过氧化氢酶、柠檬酸盐、明胶，不水解淀粉，也不产生 H2S，都不能利用聚β-羟基丁酸盐作碳源。最适培养温度为 28℃～ 30℃，最适生长 pH 值为 7.0 ～ 7.5，可产生橙色非荧光色素，能利用卵磷脂酶，可把蔗糖转化为果聚糖，不产生脓青素，也不进行反硝化作用。
一种具有广谱抗菌活性的绿针假单胞菌由蒲公英根中分离得到，具有广谱抗菌活性的绿针假单胞菌的获取方法，其特殊之处在于，该方法包括以下步骤：
⑴. 用自来水洗净表面并晾干，分别取其根、茎、叶进行表面消毒，加纯净水磨碎，静置10 min；
⑵. 取80 ul上清液，稀释涂布NA固体培养基上，置于28℃培养箱中培养3～7d，根据菌落形态特征挑取单菌落，纯化后保存，即得内生细菌菌饼；
⑶.将苹果轮纹病菌、樱桃疫霉病菌、葡萄炭疽病菌、葡萄白腐病菌、葡萄霜霉病菌、小麦纹枯病菌在专用培养基上培养，待病原菌长满平板后用打孔器在平板边缘打取菌块，放于另一个无菌平板中央；
⑷.在病原菌菌块的四周沿四个方向等距离2.5cm处放置相同直径的内生细菌菌饼，并置于25℃培养箱黑暗培养；
⑸.观察、记录，筛选出具有广谱抗菌活性的绿针假单胞菌。
一种具有广谱抗菌活性的绿针假单胞菌的发酵培养方法，其特殊之处在于，该方法包括以下步骤：
⑴.将绿针假单胞菌菌株接种于牛肉膏蛋白胨固体培养基中，在37℃培养温度下培养2~4天，得到种子液；
⑵.将步骤⑴制备的种子液接种到牛肉膏蛋白胨液体培养基中，在培养温度30℃下培养2~3天，得到发酵液；
⑶.离心提取沉淀，取上清液，经细菌过滤器过滤，获得具有广谱抗菌活性的无菌发酵液。
优选地，所述步骤⑵中种子液的接种量为1～2%。
所述具有广谱抗菌活性的绿针假单胞菌制成的菌剂。
所述具有广谱抗菌活性的绿针假单胞菌在苹果轮纹病、樱桃疫病、葡萄炭疽病、葡萄白腐病、葡萄霜霉病、小麦纹枯病方面的应用。
本发明具有广谱抗菌活性的绿针假单胞菌，其发酵液中的抗菌物质热稳定性良好，以20℃、40℃、60℃、80℃、100℃处理30min，121℃高压灭菌处理20 min，抗菌活性除121℃高温处理后有所下降外，其余温度下抗菌活性均保留85%以上。
本发明具有广谱抗菌活性的绿针假单胞菌，其菌体和发酵液均具有较强的广谱的果树真菌病害抗菌活性，且抗菌效果持久、稳定，具备从中开发出新型、高效、广谱生防杀菌剂的巨大潜力，为微生物应用于生物防治的开发提供了新的途径。
附图说明
绿针假单胞菌于2016年3月8日保藏于中国典型培养物保藏中 心(简称为CCTCC)；保藏编号为CCTCC NO:M 2016099。
图1：绿针假单胞菌YTBTa14的菌落形态图；
图2：绿针假单胞菌YTBTa14的 16S rDNA系统发育树；
图3：绿针假单胞菌YTBTa14对苹果轮纹病菌（a）、樱桃疫病菌（b）、葡萄炭疽病菌（c）、葡萄白腐病菌（d）的平板拮抗效果图；
图4：绿针假单胞菌YTBTa14对小麦纹枯病菌的平板拮抗效果图；
图5：绿针假单胞菌YTBTa14发酵液菌落生长速率法拮抗苹果轮纹病菌效果图；
图6：绿针假单胞菌YTBTa14发酵液菌落生长速率法拮抗樱桃疫病菌效果图；
图7：绿针假单胞菌YTBTa14发酵液菌落生长速率法拮抗葡萄炭疽病菌效果图；
图8：绿针假单胞菌YTBTa14发酵液菌落生长速率法拮抗葡萄白腐病菌效果图；
图9：绿针假单胞菌YTBTa14发酵液菌落生长速率法拮抗小麦纹枯病菌效果图；
图10：绿针假单胞菌YTBTa14叶盘法拮抗葡萄霜霉病菌效果图。
具体实施方式
以下结合附图，给出本发明的具体实施方式，用来对本发明进行进一步说明。
实施例1
绿针假单胞菌YTBTa14菌株的获得
首先，从田间采集健康的蒲公英植株，用自来水洗净表面并晾干，分别取其根、茎、叶进行表面消毒，加10 ml纯净水磨碎，静置10 min，取80ul上清液，稀释涂布在NA固体培养基上，置于28℃培养箱中培养3～7 d。根据菌落形态、颜色等特征挑取单菌落，纯化后在斜面培养基上保存。
再次，采用平板对峙培养法筛选拮抗多种果树及大田作物病害的绿针假单胞菌YTBTa14菌株。将苹果轮纹病菌、葡萄炭疽病菌、葡萄白腐病菌、樱桃疫霉病菌、小麦纹枯病菌在专用培养基上培养，待病原菌长满平板后用打孔器在平板边缘打取菌块，后放于另一个无菌平板中央，待病原菌长满平板后用打孔器在平板边缘打取菌块，放于另一个无菌平板中央，在病原菌菌块的四周沿四个方向等距离2.5cm处放置相同直径的经保存的绿针假单胞菌，并置于25℃培养箱中黑暗培养，每天观察并记录对病原菌有拮抗作用的菌株，初筛出具有拮抗作用的菌株，然后再用相同的方法进行复筛，挑选出抑菌带最宽的菌株，即为最终筛选出的具有广谱抗菌活性的绿针假单胞菌YTBTa14菌株。
绿针假单胞菌YTBTa14菌株的鉴定与保藏
对上述筛选出的绿针假单胞菌YTBTa14依据其菌落形态、个体形态学特征、生理生化特征、16S rDNA序列等均进行鉴定。
绿针假单胞菌YTBTa14个体形态与菌落特征如下：菌体为杆状，0.3μm ～ 0.8μm×1.0μm ～1.1μm，革兰氏染色阴性，无芽孢，单极生鞭毛，能运动，在 KMB 培养基上培养 24h后可形成1.2mm 菌落，菌落可产生橙色色素，圆形，表面凸起，光滑，较粘稠，易挑起，边缘整齐，如图1所示。
绿针假单胞菌YTBTa14生理生化特征为：能产生荧光色素，能水解精氨酸双水解酶、脂酶、氧化酶、过氧化氢酶、柠檬酸盐、明胶，不水解淀粉，也不产生 H2S，都不能利用聚β-羟基丁酸盐作碳源。最适培养温度为 28℃～ 30℃，最适生长 pH 值为 7.0 ～ 7.5，可产生橙色非荧光色素，能利用卵磷脂酶，可把蔗糖转化为果聚糖，不产生脓青素，也不进行反硝化作用。
通过16S rDNA同源性分析：以绿针假单胞菌YTBTa14菌株的基因组DNA为模板，利用细菌通用引物27-F/1492-R进行16S rDNA基因的PCR扩增。引物序列为：27-F: 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，1492-R: 5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'。PCR产物为单一条带，扩增产物回收纯化后送上海生工生物工程有限公司测序。该菌株的16S rDNA序列见序列表，其序列长度为1386 bp。同时将该菌株的16S rDNA序列与GenBank数据库收录的代表菌株的16S rDNA基因核苷酸序列进行同源性比对，结果与绿针假单胞菌菌株的同源性均高达100%。用软件分析得到系统发育树，结果见附图2：绿针假单胞菌YTBTa14菌株与Pseudomonas属的Pseudomonas chlororaphis细菌处于一个大的分支内，结合形态学和生理生化性状，同源性及系统发育分析，可确定筛选出的绿针假单胞菌YTBTa14菌株为绿针假单胞菌。
绿针假单胞菌YTBTa14菌株的培养和发酵条件
⑴.将绿针假单胞菌YTBTa14菌株接种于牛肉膏蛋白胨固体培养基中，在37℃培养温度下培养2~4天，得到种子液。
⑵.将步骤⑴制备的种子液以2%接种量接种到牛肉膏蛋白胨液体培养基中，在培养温度30℃下培养2~3天，得到发酵液。牛肉膏蛋白胨液体培养基以250 mL三角瓶盛装100ml液体量，转速150r/min。
⑶. 发酵液在转速5000r/min下离心10 min，取沉淀即为具有抗菌活性的菌体，取上清液，经细菌过滤器过滤，获得具有广谱抗菌活性的无菌发酵液。
其中，牛肉膏蛋白胨固体培养基配方为：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，琼脂粉15 g，水 1000 mL，pH 7.0-8.0。使用前在121℃温度，0.1 MPa压力下蒸汽灭菌20分钟。
牛肉膏蛋白胨液体培养基配方为：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，水 1000mL，pH 7.0-8.0。使用前在121℃温度，0.1 MPa压力下蒸汽灭菌20分钟。
绿针假单胞菌YTBTa14菌株及发酵液的广谱抗菌活性分析
取5个指示菌（苹果轮纹病菌、樱桃疫霉病菌、葡萄白腐病菌、葡萄炭疽病菌、小麦纹枯病菌）直径约为6 mm菌饼放置在土豆固体培养基平板中间，采用十字交叉法在四周接种拮抗菌绿针假单胞菌YTBTa14，见附图3、4。下表为绿针假单胞菌YTBTa14对不同作物病原真菌的抑菌带的大小。
表1 绿针假单胞菌YTBTa14对不同病原真菌的抑菌带的大小
取本发明的绿针假单胞菌YTBTa14的无菌发酵液，按照1:50比例加入到已灭菌的土豆固体培养基中，混匀后配制平板，冷却后向平板中央加入直径为6 mm的指示菌（葡萄白腐病菌、葡萄炭疽病菌、苹果轮纹病菌、樱桃疫霉病菌、小麦纹枯病菌）菌饼，采用菌落生长速率法，确定拮抗菌绿针假单胞菌YTBTa14对不同病原真菌的抑菌效果，结果见附图5-9。下表为绿针假单胞菌YTBTa14发酵液对不同果树及大田作物病原真菌的抑制效果：
表2 绿针假单胞菌YTBTa14发酵液对不同病原真菌的抑菌效果
取本发明的绿针假单胞菌YTBTa14的无菌发酵液稀释50倍后，浸泡健康葡萄叶片2 h后晾干，打成直径10 mm的叶碟，背面朝上保湿培养，滴上20 μL新鲜的葡萄霜霉病菌孢子悬浮液（镜检浓度达1 × 106个/mL），25 ℃温度下培养，7天后通过发病情况计算抑菌率，病情调查采用6级记载法，根据病斑面积占叶盘面积的百分率划分病级：0级，无病斑；1级，病斑面积占整个叶面积的5%以下；3级，病斑面积占整个叶面积的6%～25%；5级，病斑面积占整个叶面积的26%～50%；7级，病斑面积占整个叶面积的51%～75%；9级，病斑面积占整个叶面积的75%以上。根据以下公式计算病情指数，通过计算病情指数分析不同葡萄品种对霜霉病的抗感病情况。
确定绿针假单胞菌YTBTa14对葡萄霜霉病菌的抑菌效果，见附图10。处理后霜霉病发生病指为33.33，对照病指为73.33，抑菌率为54.55%。
从附图3-10可以看出，本发明的绿针假单胞菌YTBTa14对以上指示病菌均有抵抗或抑制作用。
绿针假单胞菌YTBTa14产生的广谱抗菌物质的稳定性分析
热稳定性分析：将绿针假单胞菌YTBTa14的无菌发酵液分别置于20℃、40℃、60℃、80℃、100℃温度下处理30 min，121℃、0.1 MPa下高温高压处理20 min，将上述处理后的无菌发酵液与PDA培养基以体积比为1:50的比例制成平板，再将直径为6 mm的病原菌菌块接于平板中央，以未处理的发酵液抑菌率作为对照。其中，以葡萄炭疽病菌、葡萄白腐病菌和苹果轮纹病菌作为指示菌，采用菌落生长速率法，于28℃温度下培养3~7 d后，测量菌落直径。并计算处理后的绿针假单胞菌YTBTa14发酵液对病原菌的抑制率，作为抑菌性能的衡量指标。
试验结果表明：20℃~100℃下对葡萄炭疽病菌、葡萄白腐病菌和苹果轮纹病菌的抑制作用无明显变化，说明随温度的升高，绿针假单胞菌YTBTa14的拮抗物质活性几乎没有变化，抗菌活性均保留85%以上；在121℃高温下处理20 min对葡萄炭疽病菌抑制活性明显下降，对苹果轮纹病菌和葡萄白腐病菌抑制活性则略有下降。该试验表明绿针假单胞菌YTBTa14的抗菌活性物质的热稳定性较好。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东省烟台市农业科学研究院
<120> 一种具有广谱抗菌活性的绿针假单胞菌及其应用
<160> 1
<210> M
<211> 1386
<212> DNA
<213> 绿针假单胞菌（Pseudomonas chlororaphis）
<400> M
tgcagtcgag cggtagagag aagcttgctt ctcttgagag cggcggacgg 50
gtgagtaatg cctaggaatc tgcctggtag tgggggataa cgtccggaaa 100
cggacgctaa taccgcatac gtcctacggg agaaagcagg ggaccttcgg 150
gccttgcgct atcagatgag cctaggtcgg attagctagt tggtgaggta 200
atggctcacc aaggcgacga tccgtaactg gtctgagagg atgatcagtc 250
acactggaac tgagacacgg tccagactcc tacgggaggc agcagtgggg 300
aatattggac aatgggcgaa agcctgatcc agccatgccg cgtgtgtgaa 350
gaaggtcttc ggattgtaaa gcactttaag ttgggaggaa gggtacttac 400
ctaatacgtg agtattttga cgttaccgac agaataagca ccggctaact 450
ctgtgccagc agccgcggta atacagaggg tgcaagcgtt aatcggaatt 500
actgggcgta aagcgcgcgt aggtggttcg ttaagttgga tgtgaaatcc 550
ccgggctcaa cctgggaact gcatccaaaa ctggcgagct agagtatggt 600
agagggtggt ggaatttcct gtgtagcggt gaaatgcgta gatataggaa 650
ggaacaccag tggcgaaggc gaccacctgg actgatactg acactgaggt 700
gcgaaagcgt ggggagcaaa caggattaga taccctggta gtccacgccg 750
taaacgatgt caactagccg ttgggagcct tgagctctta gtggcgcagc 800
taacgcatta agttgaccgc ctggggagta cggccgcaag gttaaaactc 850
aaatgaattg acgggggccc gcacaagcgg tggagcatgt ggtttaattc 900
gaagcaacgc gaagaacctt accaggcctt gacatccaat gaactttcca 950
gagatggatt ggtgccttcg ggaacattga gacaggtgct gcatggctgt 1000
cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttgggtta agtcccgtaa cgagcgcaac 1050
ccttgtcctt agttaccagc acgttatggt gggcactcta aggagactgc 1100
cggtgacaaa ccggaggaag gtggggatga cgtcaagtca tcatggccct 1150
tacggcctgg gctacacacg tgctacaatg gtcggtacag agggttgcca 1200
agccgcgagg tggagctaat cccataaaac cgatcgtagt ccggatcgca 1250
gtctgcaact cgactgcgtg aagtcggaat cgctagtaat cgcgaatcag 1300
aatgtcgcgg tgaatacgtt cccgggcctt gtacacaccg cccgtcacac 1350
catgggagtg ggttgcacca gaagtagcta gtctaa 1386

Claims (6)

1.一种具有广谱抗菌活性的绿针假单胞菌，其特征在于：分类命名为绿针假单胞菌（Pseudomonas chlororaphis）YTBTa14，保藏编号为CCTCC NO: M 2016099，16S rDNA序列如序列表所示。
2.一种如权利要求1所述具有广谱抗菌活性的绿针假单胞菌获取方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：
⑴. 用自来水洗净表面并晾干，分别取其根、茎、叶进行表面消毒，加纯净水磨碎，静置10 min；
⑵. 取80 ul上清液，稀释涂布NA固体培养基上，置于28℃培养箱中培养3～7d，根据菌落形态特征挑取单菌落，纯化后保存，即得内生细菌菌饼；
⑶.将苹果轮纹病菌、樱桃疫霉病菌、葡萄炭疽病菌、葡萄白腐病菌、葡萄霜霉病菌、小麦纹枯病菌在专用培养基上培养，待病原菌长满平板后用打孔器在平板边缘打取菌块，放于另一个无菌平板中央；
⑷.在病原菌菌块的四周沿四个方向等距离2.5cm处放置相同直径的内生细菌菌饼，并置于25℃培养箱黑暗培养；
⑸.观察、记录，筛选出具有广谱抗菌活性的绿针假单胞菌。
3.一种如权利要求1所述具有广谱抗菌活性的绿针假单胞菌的发酵培养方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：
⑴.将绿针假单胞菌菌株接种于牛肉膏蛋白胨固体培养基中，在37℃培养温度下培养2~4天，得到种子液；
⑵.将步骤⑴制备的种子液接种到牛肉膏蛋白胨液体培养基中，在培养温度30℃下培养2~3天，得到发酵液；
⑶.离心提取沉淀，取上清液，经细菌过滤器过滤，获得具有广谱抗菌活性的无菌发酵液。
4.如权利要求3所述具有广谱抗菌活性的绿针假单胞菌的发酵培养方法，其特征在于：所述步骤⑵中种子液的接种量为1～2%。
5.一种如权利要求1所述具有广谱抗菌活性的绿针假单胞菌制成的菌剂。
6.一种如权利要求1所述具有广谱抗菌活性的绿针假单胞菌在苹果轮纹病、樱桃疫病、葡萄炭疽病、葡萄白腐病、葡萄霜霉病、小麦纹枯病方面的应用。
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Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107893040A (zh) * 2017-11-30 2018-04-10 华南农业大学 一种微生物群体感应信号分子降解菌及其在病害防治中的应用
CN109258695A (zh) * 2018-10-18 2019-01-25 江苏师范大学 绿针假单胞菌在防治线虫中的应用
CN110317802A (zh) * 2019-06-01 2019-10-11 山东省农业科学院植物保护研究所 一种防治苹果轮纹病的微生物菌剂及其制备方法
CN111944728A (zh) * 2020-08-26 2020-11-17 河南大学 一株绿针假单孢菌及其应用
CN112175869A (zh) * 2020-09-29 2021-01-05 烟台市林业科学研究所 一种假单胞菌及其应用
CN112592859A (zh) * 2020-12-21 2021-04-02 浙江省林业科学研究院 一株绿针假单胞菌及其应用
CN112899205A (zh) * 2021-03-31 2021-06-04 慕恩（广州）生物科技有限公司 一株绿针假单胞菌mn225969及其应用
CN113631040A (zh) * 2018-10-30 2021-11-09 农业生物群落股份有限公司 控制植物害虫和改善植物健康的组合物和方法
CN113999798A (zh) * 2021-11-24 2022-02-01 山东省科学院生态研究所(山东省科学院中日友好生物技术研究中心) 一种绿针假单胞菌及其在土壤微生态调控上的应用
CN114480226A (zh) * 2022-04-02 2022-05-13 华南农业大学 一株阿氏肠杆菌及其在防治植物细菌性软腐病中的应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103333845A (zh) * 2013-07-19 2013-10-02 上海农乐生物制品股份有限公司 一种绿针假单胞菌及其发酵培养方法
CN103509740A (zh) * 2013-08-13 2014-01-15 浙江大学 一种用于防治作物镰刀菌病害的绿针假单胞菌及其应用
CN103602621A (zh) * 2013-12-02 2014-02-26 江苏省农业科学院 一种绿针假单胞菌及其应用
CN104017744A (zh) * 2013-11-07 2014-09-03 上海交通大学 抗病促生的绿针假单胞菌剂的制备方法与用途
CN106467922A (zh) * 2016-08-26 2017-03-01 上海交通大学 一种基于绿针假单胞菌的脂肽的合成方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103333845A (zh) * 2013-07-19 2013-10-02 上海农乐生物制品股份有限公司 一种绿针假单胞菌及其发酵培养方法
CN103509740A (zh) * 2013-08-13 2014-01-15 浙江大学 一种用于防治作物镰刀菌病害的绿针假单胞菌及其应用
CN104017744A (zh) * 2013-11-07 2014-09-03 上海交通大学 抗病促生的绿针假单胞菌剂的制备方法与用途
CN103602621A (zh) * 2013-12-02 2014-02-26 江苏省农业科学院 一种绿针假单胞菌及其应用
CN106467922A (zh) * 2016-08-26 2017-03-01 上海交通大学 一种基于绿针假单胞菌的脂肽的合成方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
J.Y.PARK ET AL.: ""Production of the antifungal compounds phenazine and pyrrolnitrin from Pseudomonas chlororaphis O6 is differentially regulated by glucose"", 《LETTERS IN APPLIED MICROBIOLOGY》 *
WEIQUN HU ET AL.: ""Potential of Pseudomonas chlororaphis subsp. aurantiaca Strain Pcho10 as a Biocontrol Agent Against Fusarium graminearum"", 《PHYTOPATHOLOGY》 *
YOU,H.: ""Pseudomonas chlororaphis subsp. aurantiaca strain HYR26 1 6S ribosomal RNA gene, partial sequence"，Accession Number：KX272965.1", 《GENBANK》 *
熊欣 等: ""生防绿针假单胞菌HT66中脂肽的鉴定与功能"", 《微生物学通报》 *

Cited By (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107893040A (zh) * 2017-11-30 2018-04-10 华南农业大学 一种微生物群体感应信号分子降解菌及其在病害防治中的应用
CN109258695A (zh) * 2018-10-18 2019-01-25 江苏师范大学 绿针假单胞菌在防治线虫中的应用
CN113631040A (zh) * 2018-10-30 2021-11-09 农业生物群落股份有限公司 控制植物害虫和改善植物健康的组合物和方法
CN113631040B (zh) * 2018-10-30 2023-07-07 农业生物群落股份有限公司 控制植物害虫和改善植物健康的组合物和方法
CN110317802A (zh) * 2019-06-01 2019-10-11 山东省农业科学院植物保护研究所 一种防治苹果轮纹病的微生物菌剂及其制备方法
CN111944728B (zh) * 2020-08-26 2022-02-22 河南大学 一株绿针假单孢菌及其应用
CN111944728A (zh) * 2020-08-26 2020-11-17 河南大学 一株绿针假单孢菌及其应用
CN112175869A (zh) * 2020-09-29 2021-01-05 烟台市林业科学研究所 一种假单胞菌及其应用
CN112592859A (zh) * 2020-12-21 2021-04-02 浙江省林业科学研究院 一株绿针假单胞菌及其应用
CN112592859B (zh) * 2020-12-21 2021-08-13 浙江省林业科学研究院 一株绿针假单胞菌及其应用
CN112899205A (zh) * 2021-03-31 2021-06-04 慕恩（广州）生物科技有限公司 一株绿针假单胞菌mn225969及其应用
CN112899205B (zh) * 2021-03-31 2022-05-31 慕恩（广州）生物科技有限公司 一株绿针假单胞菌mn225969及其应用
CN113999798A (zh) * 2021-11-24 2022-02-01 山东省科学院生态研究所(山东省科学院中日友好生物技术研究中心) 一种绿针假单胞菌及其在土壤微生态调控上的应用
CN114480226A (zh) * 2022-04-02 2022-05-13 华南农业大学 一株阿氏肠杆菌及其在防治植物细菌性软腐病中的应用
CN114480226B (zh) * 2022-04-02 2023-06-02 华南农业大学 一株阿氏肠杆菌及其在防治植物细菌性软腐病中的应用

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