CN112592859B

CN112592859B - 一株绿针假单胞菌及其应用

Info

Publication number: CN112592859B
Application number: CN202011516131.7A
Authority: CN
Inventors: 彭华正; 金群英; 朱汤军; 叶华琳; 张飞英
Original assignee: Zhejiang Academy of Forestry
Current assignee: Zhejiang Academy of Forestry
Priority date: 2020-12-21
Filing date: 2020-12-21
Publication date: 2021-08-13
Anticipated expiration: 2040-12-21
Also published as: CN112592859A

Abstract

一种绿针假单胞菌及其应用，属于生物技术领域。本发明提供了绿针假单胞菌在控制植物病害菌和抑制单子叶杂草生长的作用。本发明的绿针假单胞菌及其次生代谢产物源于自然归于自然，与环境友好兼容，对农林作物的杂草的抑制作用有较好的针对性，且在控制杂草生长的同时，具有抑制植物病虫害的作用，无污染无残留，可作为无公害新型微生物除草剂用于林地除草剂的无害化生产。

Description

一株绿针假单胞菌及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种绿针假单胞菌及其应用。

背景技术

化学除草剂为我国的粮食生产做出了重大贡献，但是长期大量重复使用化学除草剂也带来了环境污染、残留药害、杂草抗药性等负面影响。随着人类环保意识的不断提高，要求减少化学除草剂使用的呼声也日益强烈。这些因素促使人们开始致力于开发新型的环境友好型的生物除草剂；

微生物除草剂利用杂草病原菌活体或其代谢产物进行杂草防治，是将杂草病原菌活体或其代谢产物加工成一定的剂型，在适宜的防治时期使用来防治杂草，比如在杂草易感病时期使用。微生物除草剂根据其活性成分可以分为两大类：一类是利用微生物活体生产的活体微生物除草剂；一类是利用微生物代谢产物生产的微生物源除草剂。而狭义微生物除草剂通常是指活体微生物除草剂。由于微生物除草剂是利用植物病原菌来防治杂草，这些植物病原菌都是当地生态环境中自然存在的，因此，对环境的毒害作用相对较小。由于微生物除草剂的寄主专一性较强，所以对其他作物相对安全。与化学除草剂相比，微生物除草剂具有环境友好、无毒或低毒、无污染、易于生产等优点，而且在除草的同时往往具有调节土壤生态、抑制病虫害等多种作用，符合可持续农业发展需要；

目前投入市场的微生物除草剂大多为真菌除草剂(My-coherbicide),真菌除草剂已成为微生物除草剂(Microbial herbicide)的代名词。最近几年,人们逐渐将目标转向细菌，从杂草根系土壤的微生物菌群中筛选出具有抑制植物生长作用的细菌,以及通过培养获得使其宿主植物致病的细菌胞外植物毒素。如，最近几年在加拿大西部，已对草地土壤中分离出的1000多株根际细菌进行了抑制一年生杂草生长的筛选,证明了将抑制性根际细菌作为潜在生物控制因子的可行性。对能抑制雀麦生长的几株分离菌所在的寄主范围测试表明,根际细菌及其次生代谢产物对杂草的抑制作用是寄主专一性的；非目标作物的试验表明，根际细菌往往对根系和茎生长的抑制作用很小，甚至有益。由于细菌比真菌生长周期短、发酵工艺简单、生产流程易控制、对环境条件要求不严格、易被土壤降解，因此具有良好的应用开发前景，已成为微生物除草剂研究的一大热点。

发明内容

针对现有微生物除草剂的发展趋势，本发明的目的在于提供一种绿针假单胞菌及其应用的技术方案；

所述的一种绿针假单胞菌Pseudomonas chlororaphis菌株sj19，其保藏号为CGMCC No.19318；

所述的绿针假单胞菌作为抑菌剂的应用；

所述的绿针假单胞菌作为除草剂的应用；

本发明所述的绿针假单胞菌源于自然归于自然、与环境友好兼容、无污染无残留，既对植物病害有较强的抑制作用，又对单子叶草类有明显的选择性抑制作用，可用于林地除病害和杂草的无害化生产。

附图说明

图1为sj19菌的形态学和生物学特征；

图1中，a.在PDA培养基上生长； b.该菌形成菌落形态（1cm标尺）；c.该菌的显微形态（标尺为10μm）；

图2为sj19菌在LB培养基上的生长情况；左图为培养1天后的菌落生长情况，右图为培养4天后菌落生长情况；

图3为sj19菌在PDA培养基上的生长情况；左图为培养1天后的菌落生长情况，右图为培养4天后菌落生长情况；

图4为sj19菌促进拟南芥侧根生长对比图；右侧为拟南芥苗在sj19处理后的生长情况，左侧为对照；

图5为sj19菌抑制水稻苗生长对比图；左侧为水稻苗在sj19处理后的生长情况，右侧为对照；

图6为sj19菌抑制毛竹苗生长对比图；左则为毛竹苗在sj19处理后的生长情况，右侧为对照。

具体实施方式

以下结合实施例来进一步说明本发明。下述的实施例并不对本发明作限定作用。

实施例1：绿针假单胞菌sj19的分离

从一株龙鳞竹的竹鞭部取材，将新挖的竹鞭清洗干净，切成2cm左右小段，先经70%酒精表面消毒，再用50%安替福民（次氯酸钠溶液）消毒半小时，最后无菌水浸泡冲洗4-5次。将上述处理后的材料在超净台上切开，接种到PDA培养基（即固体土豆培养基）平板上，待有菌长出时，分别划线纯化，并分别提取DNA进行分子鉴定，从而获得并确认该菌株。菌株确认的具体步骤如下：

1）样品收集：从平板中刮取少量待测菌入200μL的PCR管里，加入无菌水100μL，短时高速离心，去除上清；

2）样品裂解：加入50μL直径为0.1mm-0.5mm的玻璃珠，和1mg/mL的proteinase K悬液100μL，56℃保温，同时500-1000rpm水平震荡培养1h；

3）核酸收集：加入5-10% chelex液50μL ，80-95℃保温10-30min，短时高速冷冻离心，取上清冷冻保存；

4）16s序列的PCR扩增：取步骤3）得到的微量核酸溶液为模板，以16s rRNA引物p357f：CTCCTACGGGAGGCAGCAG和p907r：CCGTCAATTCMTTTRAGTTT进行PCR扩增，PCR反应体积是60μL，10X Taq Buffer6μL, 2.5 mM 的dNTP mixture 5μL, Taq 3u, 10μM的引物各2.5μL，模板体积为6μL，剩余用纯水补足；PCR反应程序为：95°C 300s；94℃ 15s，52°C 45s，72°C45s，共35-40轮循环；72℃ 300s。其扩增产物约600bp，该产物以常规PCR产物切胶纯化方法纯化后，最后以p357f为测序引物，测得其16s rRNA序列为：

CCGTGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTCTTCGGATTGTAAAGCACTTTAAGTTGGGAGGAAGGGTACTTACCTAATACGTGAGTATTTTGACGTTACCGACAGAATAAGCACCGGCTAACTCTGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACAGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGTGGTTTGTTAAGTTGAATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATCCAAAACTGGCAAGCTAGAGTATGGTAGAGGGTGGTGGAATTTCCTGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATAGGAAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACCACCTGGACTGATACTGACACTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCAACTAGCCGTTGGGAGCCTTGAGCTCTTAGTGGCGCAGCTAACGCATTAAGTTGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTTGACGGA

经blast比对，与现有的Pseudomonas chlororaphis strain FFOM13菌株相似性为99%，可以认为是同一种菌的不同菌株，定名为sj19；

绿针假单胞菌（Pseudomonas chlororaphis）sj19于 2020 年01 月09 日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(保藏中心地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101)，其保藏编号是：CGMCC No.19318。

实施例2：菌株的形态学和生物学特征

sj19菌株最初分离培养在PDA培养基上，该菌落呈现铜色的金属光泽（图1 a， b）。显微镜观察表明，菌体为短小杆状（图1.c）。进一步的研究表明，该绿针假单胞菌sj19的最适温度范围为25-34℃，在LB培养基上生长比在PDA培养基上生长得更好，（如图2所示）。相比之下，Sj19在PDA培养基上的生长比LB培养基上慢（如图3所示）。

实施例3：菌株的抑菌作用

挑取sj19单克隆于LB液体培养基中，28℃、150rpm培养72h后，4000rpm离心10min，上清液经孔径为0.22μm的无菌滤膜过滤，取其中0.2mL滤液均匀涂布于PDA平板培养基上，以等体积无菌水作为对照，在该滤液平板和对照平板中央分别接入0.5cm胶胞炭疽菌菌块（Colletotrichum gloeosporioides）、葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea）和串珠状赤霉菌（Gibberella moniliformis），28°C培养3d后测定菌丝的生长直径。每个处理重复3皿。霉菌菌落直径采用十字交叉法进行测量，并计算菌丝生长抑制率，其中抑制率 (％)=[(对照霉菌菌落直径-处理霉菌菌落直径)/(对照霉菌菌落直径-菌块直径)]×100。实验结果表明，sj19对胶孢炭疽菌、葡萄座腔菌和串珠状赤霉菌有较好的抑制效果，见表1；

表1.菌落最大直径的比较（3个重复性的统计结果）：

。

实施例4：菌株对双子叶植物小苗的生长影响不大

拟南芥为典型的双子叶植物，本实验利用双子叶模式植物拟南芥作为模型测试sj19菌株对该类植物的影响。具体过程如下：

1）种子消毒和接种：取拟南芥种子至1.5mL离心管中，加70-75%酒精200μL，静置约30s-1min后，立即加入800μL无菌水稀释，然后吸出酒精和水的混合物；将消毒后的种子用无菌水冲洗4－6次（第4、5次的时候要间隔5min左右）；用200μL的移液枪头在MS培养皿上逐个点种子，每皿大约点6-8颗种子；

2）光照培养：用封口膜把培养皿逐个封起来，并编号，22度2500lux左右12-16h光照培养；

3）同时准备sj19菌液：在15mL比色管中装入PDB培养基5mL，从平板上挑取sj19单克隆加入培养基中，振荡培养同时监测OD600的变化，培养至OD值为1.0时，取30μL菌液离心后，去上清，加入900μL 10mM MgSO4重悬混匀；

4）拟南芥种子培养4天后可看到小苗萌出，在距离小苗5cm处滴加菌液；

5）加入菌液后将培养皿封口，留少许透气孔，45度斜放于22℃培养箱继续培养，七天后，观察和拍照；

与对照相比，sj19菌液的存在对拟南芥小苗根上部分影响不大，对根部则是促进侧根生长（见图4）。

实施例5：菌株对单子叶草本植物小苗的生长有明显抑制作用

水稻是典型的单子叶植物，本实验利用单子叶模式植物水稻作为模型测试sj19菌株对该类植物的影响。具体过程如下：

1）倒培养基：从4度冰箱中取出备用的MS固体培养基250mL在电炉上慢慢加热化开，然后冷却至不烫手，在一次性培养皿上倒平板，超净台吹15min左右；

2）准备种子：从4度冰箱中取出水稻种子，进行剥壳处理；

3）种子消毒：先将种子加入到200mL 25%浓度的NaCLO₂溶液中，放入摇床振荡消毒30min后，用无菌水依次浸泡1、4、5、10min作清洗；

4）移接种子：将消毒清洗后的水稻种子浸泡移接至倒好的MS培养基中；

5）培养：将移接好的培养皿放在2500lux光照下、 16h光照、22-25度培养；

6）取sj19菌1mL放于离心管中，在5000rpm的情况下离心5min后，取出离心管，倾倒出上清液，再加入100μL MgSO₄配制并稀释菌液；

7）水稻种子培养生长一周后萌出，选取生长均一的水稻苗转移至培养皿盖子上，用侵染菌进行浸泡侵染，侵染结束后转移到拟南芥营养液配制的固体培养基上，放置于500mL组培瓶中，28度培养2周，观察和拍照；

结果表明，在sj19的处理下，水稻苗生长明显受到了抑制，基本停止发育，直至最后死亡，（如图5所示）。

实施例6：菌株对单子叶植物毛竹小苗的生长抑制

竹子也是禾本科单子叶植物，sj19菌种来源于生长受抑制的毛竹变种龙鳞竹，这里利用毛竹种子育出的小苗进行测试，具体步骤如下：

1）先将毛竹种子用 70％的酒精浸泡消毒 60s；再用次氯酸钠溶液 (以下均指有效氯质量分数 )浸泡消毒，消毒强度为4％、30min。消毒后蒸馏水冲洗5次，准备接种；

2）将毛竹种子切除大部分胚乳或一半胚乳，在无菌条件下接种于成苗培养基内培养。每皿接种lO粒；

作为优选，成苗培养基成分为N6大量元素、B5微量元素及有机成分、MS铁盐、蔗糖30g／L，pH5.8；

作为优选，毛竹种子的发芽条件为 8h黑暗、16h光照、温度25℃；

3）取sj19菌1mL于离心管中，在5000rpm的情况下离心5min后，取出离心管，倾倒出上清液，离心管中再加入100μL MgSO₄配制并稀释菌液；

4）毛竹种子培养生长一周后萌出，竹子小苗用侵染菌进行浸泡侵染，侵染结束后转移到蛭石培养基，用营养液浇灌培养；

作为优选，营养液为拟南芥营养液；

3）移苗两周后，拔出竹苗进行对照比较；

上述试验采用种子消毒试验中效果较好的方法对种子进行消毒；

作为优选，以种子的胚根等于或大于种子长度的一半时为发芽标准；

对照比较结果表明，毛竹苗生长明显受到了抑制，发育缓慢，无法正常生长（如图6所示）。

序列表

<110> 浙江省林业科学研究院

<120> 一株绿针假单胞菌及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 534

<212> DNA

<213> 绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)

<400> 1

ccgtgccgcg tgtgtgaaga aggtcttcgg attgtaaagc actttaagtt gggaggaagg 60

gtacttacct aatacgtgag tattttgacg ttaccgacag aataagcacc ggctaactct 120

gtgccagcag ccgcggtaat acagagggtg caagcgttaa tcggaattac tgggcgtaaa 180

gcgcgcgtag gtggtttgtt aagttgaatg tgaaatcccc gggctcaacc tgggaactgc 240

atccaaaact ggcaagctag agtatggtag agggtggtgg aatttcctgt gtagcggtga 300

aatgcgtaga tataggaagg aacaccagtg gcgaaggcga ccacctggac tgatactgac 360

actgaggtgc gaaagcgtgg ggagcaaaca ggattagata ccctggtagt ccacgccgta 420

aacgatgtca actagccgtt gggagccttg agctcttagt ggcgcagcta acgcattaag 480

ttgaccgcct ggggagtacg gccgcaaggt taaaactcaa atgaatttga cgga 534

Claims

1.一种绿针假单胞菌（Pseudomonas chlororaphis）菌株sj19，其保藏号为CGMCCNo.19318。

2.如权利要求1所述的绿针假单胞菌菌株sj19在制备植物病害抑菌剂中的应用，所述抑菌剂为引起植物病害的胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）、葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea）和串珠状赤霉（Gibberella moniliformis）的抑菌剂。

3.如权利要求1所述的绿针假单胞菌菌株sj19作为选择性抑制单子叶植物的微生物除草剂的应用。