CN109136137A - 一种抗重金属的植物促生菌株及其应用 - Google Patents

一种抗重金属的植物促生菌株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于植物促生菌技术领域,具体涉及的是一种抗重金属的植物促生菌株及其应用。一种抗重金属的植物促生菌株,其分类学命名为单不动杆菌(Acinetobacter soli)BHG‑02,于2014年10月13日保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏号为CCTCC NO:M2014471。本发明抗重金属的促生植物菌株BHG‑02为首次从广西壮族自治区北海市的金湾红树林保护区的土壤中筛选分离得到的,能够分泌有机酸,溶解并利用培养基中的磷酸钙,同时具有ACC脱氨酶活性,生长激素IAA、脲酶活性等特性,溶解土壤中的重金属,解除植物的重金属胁迫,改良土壤养分状况,从而起到促进植物生长的作用。

Description

一种抗重金属的植物促生菌株及其应用
技术领域
本发明属于植物促生菌技术领域,具体涉及的是一种抗重金属的植物促生菌株及其应用。
背景技术
化肥在现代农业生产中发挥着巨大作用。但是随着化肥使用量的增加,其利用率逐年降低。农药和化肥的残留,向环境释放了大量的有害物质,污染了土壤、水源和食品,对人类健康及生存环境构成了极大威胁,要求保护生态环境和生产安全食品的呼声日益强烈。因此,开发利用替代化学肥料的新肥源,以适应发展绿色农业和绿色食品的需要已是当务之急。而微生物肥料可使土壤中无效营养有效化,预防和控制农作物病害,减少农药和化肥的使用,是解决土壤、水源和食品污染的根本途经,被普遍认为是一种环境友好、经济有效的提高作物产量的方法。
微生物肥料是一类含有微生物活体的特定制品,应用于农业生产中,能够获得特定的肥料效应。其中制品中活微生物起关键作用。目前,一般将微生物肥料制品分为两大类:一类是狭义的微生物肥料,指通过微生物的生命活动,增加了植物营养元素的供应量,包括土壤和生产环境中植物营养元素的供应总量,导致植物营养状况的改善,进而增加产量。这一类微生物肥料的代表是根瘤菌肥;另一类是广义的微生物肥料,指通过其中微生物的生命活动,不但能提高植物营养元素的供应量,还能产生植物生长激素,促进植物对营养元素的吸收利用或有拮抗某些病原微生物的致病作用,减轻农作物病虫害简介提高作物产量。与化学肥料相比,微生物肥料具有以下优点:不破坏土壤结构;保护生态、不污染环境,对人畜无毒无害;肥效持久;提高作物产量,改善作物品质;成本低廉,经济有效。
植物根际促生菌(Plant growth promoting rhizobacteria,PGPR)是一类能高密度定殖在植物根际的微生物,兼有抑制植物病原菌、根际有害微生物,以及促进植物生长并增加作物产量的作用。作为生物肥料和生物农药的重要资源库,PGPR的研究和应用已经起到了举足轻重的作用。从资源再生利用的角度来研究和开发微生物肥料则对资源综合利用和环境保护更具有现实意义。
公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解,而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
发明内容
本发明解决的问题在于提供一种抗重金属的植物促生菌株BHG02及其应用,该菌是一种新的植物根际促生菌,可应用于植物促生剂或微生物肥料的制备。
本发明的目的通过如下技术方案实现:
一种抗重金属的植物促生菌株,其分类学命名为单不动杆菌 (Acinetobactersoli)BHG-02,于2014年10月13日保藏于中国典型培养物保藏中心(地址:中国武汉武汉大学),保藏号为CCTCC NO:M2014471。
本发明还提供了所述的抗重金属的植物促生菌株在降解土壤重金属中的用途。
本发明还提供了所述的抗重金属的植物促生菌株在分泌有机酸中的用途。
本发明还提供了所述的抗重金属的植物促生菌株合成生长素IAA中的用途,所述的植物促生菌株可利用色氨酸合成生长素IAA。
本发明还提供了所述的抗重金属的植物促生菌株在促进植物生长中的用途。
本发明还提供了所述的抗重金属的植物促生菌株在溶解并利用培养基中的磷酸钙的用途。
本发明还提供了所述的抗重金属的植物促生菌株在ACC脱氨酶产量中的用途,所述的植物促生菌株可催化乙烯前体ACC,进而影响植物生长时乙烯的水平,促进合成和分泌IAA。
本发明还提供了所述的抗重金属的植物促生菌株在制备促进植物生长制剂中的用途,所述的促进植物生长制剂为微生物菌剂或微生物肥料。
与现有技术相比,本发明具有以下有益的技术效果:
1.本发明提供的单不动杆菌BHG-02为首次首次从广西壮族自治区北海市的金湾红树林保护区的土壤中筛选分离得到的,该菌株具有高盐浓度抗性,检测结果表明该菌是一种能够高效分解重金属的新的单不动杆菌,分类命名为BHG02(Acinetobacter soli)。
2.本发明提供的单不动杆菌BHG-02,由于其能够分泌有机酸,溶解并利用培养基中的磷酸钙,同时具有ACC脱氨酶活性,生长激素IAA等特性,能够高效分解重金属,通过分解土壤中的重金属,解除植物的重金属胁迫,促进植物的生长。其原因在于,重金属积累在植物之中,植物可利用具有重金属耐性的植物降低土壤中有毒金属的移动性,从而降低重金属进入食物链的可能性。在根际添加抗重金属微生物菌肥后,植物根系分泌物能改变土壤根际环境,可使多价态Cr、Hg、As的价态和形态发生改变,降低在植物根部的积累,主要通过减少根部累积、沉淀、转化重金属形态,或通过微生物吸附根表面的重金属。从而改良土壤营养成份和吸收状况,促进植物吸收更多的营养物质,促进植物生长。
3.本发明提供的单不动杆菌BHG-02可以色氨酸为前体合成植物生长激素吲哚乙酸(IAA),由于其吸附在种子和根系的表面,可直接被植物利用,同时也可能与植物本身内生的IAA共同作用刺激植物细胞的生长和增殖,从而促进植物根系的生长发育及有效吸收土壤中的水分和养分。同时可能参与植物体内其他生命活动的调节。
4.本发明提供的单不动杆菌BHG-02,对不同金属胁迫下最低抑菌浓度和玉米苗期的株高、生物量、根系和光合速率均具有显著的促进作用。
保藏信息说明
单不动杆菌(Acinetobacter soli)BHG-02,保藏编号为CCTCC NO:M2014471,保藏日期为2014年10月13日,保藏单位为中国典型培养物保藏中心 (CCTCC),保藏地址为中国武汉武汉大学。
附图说明
图1为本发明的单不动杆菌BHG-02在含CuSO4、NaCl、AlCl3的LA培养基中的菌落形态;
图2为BHG-02菌株对200μM的Al3+离子胁迫下水稻的促生作用;
图3为E.coil菌株发酵液有机酸的高效液相分析图,菌株在液体NBRIP 液体培养基,32℃、200rmp/min条件下,持续发酵5天后进行液相分析,进样量为0.02mL;
图4为BHG-02菌株发酵液有机酸的高效液相分析图,BHG02菌株在液体NBRIP液体培养基,32℃、200rmp/min条件下,持续发酵5天后进行液相分析,进样量为0.02mL;
图5为二硝基苯肼法测定a-酮丁酸浓度的标准曲线;
图6为BCA法测定蛋白浓度的标准曲线;
图7为重金属对BHG-02菌株的最低抑菌浓度;
图8为BHG-02菌株对盆栽玉米的促生作用,玉米在30℃的学校温室内培养24天;
图9为BHG-02菌株对玉米根系发育的影响,绿色标记为玉米的须根、红色标记为根毛、黑色标记为重叠或者较粗的根(上图为对照组,下图为实验组);
图10为BHG-02菌株对玉米的生物量产生的影响,依次为:地上部分株高、根系总长度、根系总表面积。
具体实施方式
下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明,所述是对本发明的解释而不是限定。
下述实施例中所用的材料和试剂,如无特殊说明,均可从商业途径得到。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。
实施例1:单不动杆菌(Acinetobacter soli)BHG-02的分离和鉴定
1.1单不动杆菌(Acinetobacter soli)BHG-02的分离
单不动杆菌(Acinetobacter soli)BHG-02的分离包括取样,富集和初筛,复筛3个步骤,具体如下:
1.1.1取样
从广西壮族自治区北海市的金湾红树林保护区的土壤中采样,装入干净的采样袋(瓶)中,做好标记,于4℃冰箱中保存备用。
1.1.2富集和初筛
将1g所采集的样品接种于100mL的[CuSO4]=3mM的LB培养基中,37℃, 200rpm,振荡培养24h。然后取上清1mL,采用十倍梯度稀释方法涂布于 [NaCl]=800mM的LB平板上,37℃,培养48h,观察有无菌落出现,将长出的菌落转接至新的含相应浓度铜离子的LB培养平板上纯化保存。
1.1.3复筛
将1.1.2得到的菌株在LB培养基中,37℃,200rpm,培养24h。而后对其发酵液进行IAA检查,取发酵液按梯度稀释涂于[CuSO4]=3mM的LB固体培养基中,37℃培养箱中倒置培养2天,挑选较大的菌株多次分离传代,分离得到了一株抗重金属能力较高的菌株。
1.2单不动杆菌(Acinetobacter soli)BHG-02的鉴定
对上述分离纯化得到的纯培养菌株进行一系列生理生化鉴定,并进行 DNA提取,16S rDNA的扩增和测序。
1.2.1如图1所示,该菌株在LB固态培养基上形成椭圆形或圆形菌落、淡黄色、凸起、表面光滑、边缘整齐的菌落。
镜检显示短杆状、无鞭毛、无芽孢的革兰氏阴性细菌,其他检测项目如表1所示。
表1 BHG-02菌株的生理生化特征
注:+表示阳性反应,存在或有,–表示阴性反应,不存在或没有。
1.2.2利用引物F27和R1492进行扩增16S rDNA,引物序列如下:
F27:5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′;
R1492:5′-TAGGGTTACCTTGTTACGACTT-3′。
PCR扩增条件为95℃5min,94℃30s、55℃30s、72℃90s,30个循环, 72℃10min。
对PCR扩增产物进行测序,测序结果如SEQ ID NO.1所示,BHG-02菌株的16SrDNA序列的扩增长度为1422kb。
经同源性比对,其与Acinetobacter soli strain B1(NCBI accession no. NR_044454.1)具有99%的高度相似性,结合BHG02菌株形态学和生理生化特性,鉴定该菌株为Acinetobacter soli菌属的一个菌株,命名为单不动杆菌 (Acinetobacter soli)BHG-02,将其保藏于中国典型培养物保藏中心 (CCTCC) (地址:中国武汉武汉大学),保藏号为CCTCC NO:M2014471。
实施例2:单不动杆菌(Acinetobacter soli)BHG-02铝胁迫下促生菌的促生作用
2.1供试菌株对植株种子水培促生试验
①将滤纸垫于培养皿中,尽量铺满皿底,121℃湿热灭菌20min,70℃烘干,待用。
②菌悬液的准备:将菌株接种于LB培养基中,37℃,200rpm,培养18h,离心收集菌体,用蒸馏水悬浮,加蒸馏水至OD600=0.9,此菌悬液约为109CFU/mL。
③种子表面消毒:挑出饱满的种子,无菌蒸馏水清洗三次,75%酒精洗两次,75%酒精浸泡2min,无菌蒸馏水洗三次,备用。将菌悬液分别进行梯度稀释,稀释浓度分别约为106CFU/mL、107CFU/mL、108CFU/mL、109CFU/mL,对已经消毒的种子进行浸种。处理组使用稀释过的菌液进行,对照组使用蒸馏水;浸种4小时后进行下一步实验。
④在培养皿中加入3mL 1/4Hoagland培养液(完全浸湿滤纸);盐胁迫组在上述条件下加入NaCl溶液,使其浓度保持在150mM;Al3+胁迫组加入AlCl3溶液,使其浓度保持在200μM;对照组加入同等的蒸馏水。置于32℃恒温培养箱,培养48h后,观察,测量根长及下胚轴长。
⑤在48小时发芽测量后,转入水培箱继续进行培育。每个水培箱加入 500mL 1/4Hoagland培养液,20粒种子,置于32℃恒温培养箱中培育10天;盐胁迫组将培养液盐浓度控制在150mM,Al3+胁迫组将培养液的Al3+浓度保持在200μM;每三天更换一次培养液。
将培养好的菌株经过离心后重悬于蒸馏水中,将菌液浓度控制108 CFU/mL,对水稻进行浸种4小时处理,对照组和胁迫组使用蒸馏水浸种4小时。平皿发芽后转入含500mL1/4Hoagland培养液的水培箱中32℃培养10 天,其中菌处理组和胁迫组的培养液内含有浓度为200μM的Al3+离子。10 天后测量其株高根长、鲜重干重等生物量指标,初步断定各个菌株对铝胁迫下水稻的促生作用。
如图2所示,本发明的供试菌株单不动杆菌(Acinetobacter soli)BHG-02 在铝胁迫下的水稻有促生作用。
实施例3:单不动杆菌(Acinetobacter soli)BHG-02产有机酸种类及量的测定
BHG-02菌株在液体NBRIP液体培养基,32℃、200rmp/min条件下,持续发酵5天,然后进行高效液相色谱分析发酵液中的有机酸。使用Aminex HPX–87H有机酸和醇分析柱(BIO-RAD),长度为250mm。条件:柱温为65℃,流动相为5mmol L-1的硫酸(超纯水配制,超声波脱气15min),流速为0.5mL min-1,示差折光检测器检测,进样量为0.02mL。
分析结果表明,BHG-02能有效利用培养液中的葡萄糖转化为柠檬酸,进而溶解培养液内的磷酸钙,将金属钙螯合物溶解,释放速效磷。
如图3-4所示,本发明的单不动杆菌(Acinetobacter soli)BHG-02产葡萄糖酸量最高,柠檬酸、乙酸次之。
实施例4:单不动杆菌(Acinetobacter soli)BHG-02合成生长激素IAA 含量的测定。
通过使用Salkowski法对BHG02菌株进行IAA产量检测,在色氨酸液体培养基50mL,37℃、200rmp条件下实验发现,3mM AlCl3和800mM NaCl 胁迫对菌株产IAA的能力并没有很大影响,IAA浓度与对照组相差不大,基本稳定在14.3μg/mL左右。菌株在50mL的培养基中,在培养30h左右,其IAA浓度已经趋于饱和,往后继续培养未见其含量上升。
如图5所示,本发明的单不动杆菌(Acinetobacter soli)BHG-02合成IAA 的量为14.3μg/mg FW;而且检测结果还表明阴沟肠杆菌NG-33能够利用色氨酸产生IAA。
实施例5:BHG-02菌株的ACC脱氨酶活性检测
通常是使用ACC为唯一氮源,如菌株有ACC脱氨酶活性,则将会分解 ACC成为氮和a-酮丁酸。使用2,4-二硝基苯肼法测定a-酮丁酸浓度,可以反应菌株的ACC脱氨酶活性。
如图6所示,BHG-02菌株具有ACC脱氨酶活性,其酶活达到121.34nmol a-ketobutyrate/mg·h。
实施例6:BHG-02对不同重金属的最低耐受浓度
取适量无菌试管,配制含重金属不同浓度系列的培养基,按1%接种量接入培养18h的菌液,37℃,200rpm,培养48h,以不接菌的含重金属的培养基为对照,测OD600值。
最低抑菌浓度(MIC)指具有抑菌的物质对目的菌株的产生抑制的最低浓度。本实验通过测定9种重金属对BHG02菌株的毒性。
如图7所示,Hg(0.5mM)>Co(3mM)>Pb(4mM)>Cd(5mM)>Ni (6mM)>Cu(8mM)>Al(10mM)>Fe(12mM)>Mn(20mM)>Zn(25mM)。
实施例7:BHG-02菌株对盆栽玉米的生物量影响
7.1玉米盆栽试验
(1)菌悬液:将BHG-02接种到LB培养基中,37℃,200rpm,培养10h,离心收集菌体,用无菌水悬浮菌体,OD600=0.9,其浓度约为109CFU/mL。
(2)种子表面消毒:选取较饱满,均匀的种子,用dd H2O洗三次,75%的乙醇洗两次,75%乙醇泡2min,dd H2O洗三次。
(3)将菌悬液稀释10倍浓度约为108CFU/mL,对已经消毒的种子进行浸种。处理组使用稀释过的菌液进行,对照组使用蒸馏水;浸种4小时后进行下一步实验。
(4)500mL的塑料钵中装入含校园菜地土壤400g,每钵播入经过表面消毒的种子3粒,生长一周后间苗,每钵留一株;整个实验在广西大学生命科学与技术学院温室进行,室温28℃左右。
(5)在培育至第14天时候,进行光合测定。
(6)经过24天培育后,分别液氮收集样本,运回实验进行植株生物量测定。
7.2植株生物量的测定
播种24天后收获,沿土面剪取植株地上部分,采集根际土后,将根系用去离子水清洗三次,再用去离子水冲洗,用根系分析仪测量玉米的根系长度,表面积等生物量指标,称量并记录玉米的鲜重。然后将植株地上和根系105℃杀青2h,70℃烤至恒重,用分析天平测量植株的生物量。
7.3根际土pH和氮磷钾含量的测定
2008年11月24日收获植株时,采集根际土:仔细地从土壤中移出根系, 收集根围1mm内的土壤,即根系上分离土壤团聚体作为根际土,取根际土5g, 溶于50mL蒸馏水中,200rpm,振荡4h,离心,取上清,用pH计测pH。
7.4BHG-02菌株在土壤中的存活情况调查
称取已收集好的根际土1g,溶于10mL蒸馏水中,振荡1h,进行梯度稀释,涂布于含5mM CuSO4的LB固体培养平板上,然后经过含有lMNaCl的 LB培养基复筛,平板计数法分析土壤中抗性细菌的数量。
如图8所示,BHG-02菌株在供试土壤中可以有效的促进植物的生长。
如图9所示,使用winRHIZO 2013根系分析软件对其根系图片进行分析,结果证明BHG-02菌株可以促进玉米根系的发育,极大的提高了玉米根系的分生数、根长、根表面积及根毛数量。
如图10所示,生物量测定表明,处理组比对照组的生物量显著增加 (P<0.01),地上部分株高增加47.75%、鲜重提高150.86%、干重提高132.50%;根系根长增加139.47%、根表面积增加226.81%、根系总根尖数提高238.38%、主根直径提高29.29%、鲜重提高217.25%、干重提高190.95%;光合效率提高17.96%。
综上所述,本发明的单不动杆菌(Acinetobacter soli)BHG-02由于其能够抗重金属(Cu、Hg、Co、Pb、Ni、Cd、Zn、Mn、Al、Fe),微生物吸附重金属和转移重金属,减少土壤中的重金属,可以促进植物的生长。其还能够高产葡萄糖酸,乙酸,溶解并利用培养基中的磷酸钙,高效溶解难溶磷,释放可溶磷,以增加土壤中速效磷含量,可以解除植物缺磷胁迫,促进植物生长。同时具有ACC脱氨酶活性,还能够合成吲哚乙酸,从而能够帮助植物提供吲哚乙酸,起到促植物生长的作用,其对土壤重金属的分解和促进速效磷含量的提高,可协助改良土壤。因此,由于上述作用所具有的促植物生长的共性,所以该菌可以作为广泛的促生菌应用于植物促生长当中。
本发明的单不动杆菌(Acinetobacter soli)BHG-02能够从多个方面促进植物的生长,本发明的单不动杆菌(Acinetobacter soli)BHG-02处理玉米的株高、地上及地下生物量均具有显著的促进作用,对土壤速效磷含量也有显著提高作用,可应用于玉米促生制剂或微生物肥料的制备。
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式,并且很显然,根据上述教导,可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用,从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。
序列表
<110> 广西大学
<120> 一种抗重金属的植物促生菌株及其应用
<130> ZYWS
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1420
<212> DNA
<213> 一种抗重金属的植物促生菌株及其应用(Acinetobacter soli)
<400> 1
cggtcgggcc accgtggtac cgccctcttt gcagttaggc tagctacttc tggtgcaaca 60
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cggtctactt atcgcgttag ctgcgccact aaagcctcaa aggccccaac ggctagtaga 660
catcgtttac ggcatggact accagggtat ctaatcctgt ttgctcccca tgctttcgca 720
cctcagcgtc agtgttaggc cagatggctg ccttcgccat cggtattcct ccagatctct 780
acgcatttca ccgctacacc tggaattcta ccatcctctc ccacactcta gccaaccagt 840
atcgaatgca attcccaagt taagctcggg gatttcacat ttgacttaat tggccgccta 900
cgcgcgcttt acgcccagta aatccgatta acgcttgcac cctctgtatt accgcggctg 960
ctggcacaga gttagccggt gcttattctg cgagtaacgt ccactcatct tgggtattaa 1020
ccaaaagagc ctcctcctcg cttaaagtgc tttacaacca taaggccttc ttcacacacg 1080
cggcatggct ggatcagggt tccccccatt gtccaatatt ccccactgct gcctcccgta 1140
ggagtctggg ccgtgtctca gtcccagtgt ggcggatcat cctctcagac ccgctacaga 1200
tcgtcgcctt ggtaggcctt taccccacca actagctaat ccgacttagg ctcatctatt 1260
agcgcaaggt cacaagtgat cccctgcttt ctcccgtagg acgtatgcgg tattagcatc 1320
cctttcgaga tgttgtcccc cactaatagg cagattccta agcattactc acccgtccgc 1380
cgctaagtga tagtgcaagc accatcactc cgctcgactt 1420

Claims (8)

1.一种抗重金属的植物促生菌株,其特征在于,其分类学命名为单不动杆菌(Acinetobacter soli)BHG-02,于2014年10月13日保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏号为CCTCC NO:M2014471。
2.根据权利要求1所述的抗重金属的植物促生菌株在降解土壤重金属中的用途。
3.根据权利要求1所述的抗重金属的植物促生菌株在分泌有机酸中的用途。
4.根据权利要求1所述的抗重金属的植物促生菌株合成生长素IAA中的用途,其特征在于,所述的植物促生菌株可利用色氨酸合成生长素IAA。
5.根据权利要求1所述的抗重金属的植物促生菌株在促进植物生长中的用途。
6.根据权利要求1所述的抗重金属的植物促生菌株在溶解并利用培养基中的磷酸钙的用途。
7.根据权利要求1所述的抗重金属的植物促生菌株在ACC脱氨酶产量中的用途,其特征在于,所述的植物促生菌株可催化乙烯前体ACC,进而影响植物生长时乙烯的水平,促进合成和分泌IAA。
8.根据权利要求1所述的抗重金属的植物促生菌株在制备促进植物生长制剂中的用途,其特征在于,所述的促进植物生长制剂为微生物菌剂或微生物肥料。
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