CN109536401A - 一种复合微生物菌肥及其制备方法以及在促进水稻生长中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种复合微生物菌肥及其制备方法以及在促进水稻生长中的应用。所述的一种复合微生物菌肥，其含有三种水稻根际促生菌，所述的三种水稻根际促生菌分别命名为Bacillus aryabhattai LZP01、Bacillus pumilus LZP02以及Bacillus megaterium LZP03，保藏在中国典型培养物保藏中心，其菌种保藏编号分别为CCTCC NO：M 2018597、CCTCC NO：M 2018598以及CCTCC NO：M 2018599。田间试验证明，加入本发明所述复合微生物菌肥的水稻在秧盘中根系生长比较发达，最主要的是相互之间盘根能力较好，这将非常有利于水稻在田间的存活与生长。

Description

一种复合微生物菌肥及其制备方法以及在促进水稻生长中的 应用
技术领域
本发明涉及一种复合微生物菌肥及其制备方法，特别涉及一种具有促进水稻生长作用的复合微生物菌肥及其制备方法。本发明属于农业生产技术领域。
背景技术
水稻是世界上最重要的粮食作物，是中国种植面积最大和产量最高的粮食作 物。中国是世界水稻种植面积最大的国家，因此水稻种植对保障国家安全和社会稳 定具有重要的意义。1996年中国建立了国家超级稻育种项目，主要研究超级杂交稻 育种。自20世纪70年代后期以来，亚洲特别是中国的水稻用地面积迅速增加。在 中国，旱稻移栽的最受欢迎的苗被称为垫型苗，它们在苗箱中的土壤上生长。目前 中国水稻种植面积近5亿亩，大多采用育苗移栽的方式。水稻种植的关键步骤是水 稻育苗，其机械化水平直接影响到水稻的生产能力。目前国内育苗机械化程度仍 较低，存在劳动强度高、播种不均匀、品质低、生产力低、托盘数量大等缺点。因 此，提高水稻综合生产能力，必须发展新兴的水稻育苗基质。
近年来，随着中国城市化进程和产业结构调整的加快，迫切需要将水稻生产转 向机械化生产。机械化水稻移栽有三种方法：软盘苗方法，双层塑料苗方法和塑料 盘苗方法，这几种方法都有不同程度的应用，目前大多数水稻育苗方法以土壤或新 型基质为培养基。苗床土壤施肥是移栽水稻幼苗的关键措施之一，用于水稻育苗的 苗床土壤通常来自耕地表土，从而导致土壤结构恶化并降低作物产量。
微生物菌肥是以活性(可繁殖)微生物的生命活动导致作物得到所需养分(肥 料)的一种新型肥料生物制品，是农业生产中肥料的一种(也称第三代肥料)。土 壤微生物通过参与有机物的更新、养分循环和生物修复等过程来维持土壤功能。过 去几十年来，中国大量的使用化肥和农药，过量施肥并不总能转化为作物产量的增 加，相反，会造成土壤酸化、营养利用效率低下、富营养化以及温室气体排放等问 题。微生物不仅是微生物氮固定的介质，还是通过其代谢过程导致氮转化的驱动因 素。
21世纪，许多发展中国家面临的最大挑战是生产基本的生活必需品，特别是用 于人类基本生活的食物。根际中的植物-微生物间相互作用被认为是可以改善植物 生长的主要方式。在田间实验条件下观察到微生物菌肥具有潜在益处，所以过去几 年使用根际促生菌(PGPR)促进植物生长的研究显着增加。研究表明，肥料的种 类和数量是影响土壤微生物群落的重要因素，不同作物种类间土壤微生物群落不 同。环境因素如土壤湿度和温度也会影响微生物群落的组成。植物根际促生菌作为 生物肥料和生物防治生物被认为是减少农业中化学物质使用的替品。
在许多亚洲国家，植物根际促生菌已被认为是适应可持续发展农业的生物肥 料。一般认为，不同植物的根际微生物是由不同的植物根际促生菌群体定殖的，这 些微生物群落在遗传和生理上不同。PGPR作为综合管理系统的一个组成部分，可 作为降低农药使用率的生物防治剂。但是生物肥料生产中存在一些问题，这些制约 因素包括：菌株具有区域特异性；合适的载体的研发和保质期较短；基因型可能变 化。阻碍生物肥料生产的其他因素包括缺乏足够的装备、储存设施和运输系统不足、 生物肥料需求不足以及销售机会的有限。植物根际促生菌在植物生长促进和土壤病 原体生物防治中的作用已被深入研究。目前已有数种PGPR商品化，其作物生长促 进活性已在多种方面得到证明。
本发明对东北水稻根系微生物进行了研究，不仅从常规方面筛选鉴定了促生 菌，还在离子转换能力和分泌激素能力上进行了鉴定。用多种水稻育苗方式进行水 稻促生研究，更加科学和全面的验证菌株对是水稻的影响能力。在菌株水稻根系和 土壤吸附存活能力方面进行了深入的研究，将为菌株之间、菌株和水稻之间的联系 作用机理研究提供铺垫。最后将理论与实际结合，制成微生物菌剂应用到实际水稻 育苗，得到了很好的效果。将芽孢杆菌用于微生物菌肥的研发，既可以有效促进植 物生长，提高农作物产量；还可以减轻化肥农药对土壤的损伤，保护环境。本发明 的提出对水稻微生物肥料开发利用能够产生推动作用，在农业生产实践中产生了经 济效益、社会效益和生态效益。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能够促进水稻生长的复合微生物菌肥及其制备方法。
为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：
本发明发明人从黑龙江省二九零农场采集优质水稻根系黑土进行研究，通过不同选择性培养基—PKO无机培养基、亚历山大罗夫培养基、蒙金娜有机培养基，筛 选出具有溶磷功能、解钾功能、解磷功能的促生菌，并进行了菌落特征检测。将筛 选出来的菌株进行16SrDNA基因序列的分子鉴定，得到解磷菌有Bacillus pumilus (LZP02)、Bacillusaryabhattai(LZP08)、Bacillus ginsengisoli(LZP05)；溶磷菌有 Bacillus megaterium(LZP03)、Bacillus oryzaecorticis(LZP04)、Bacillus ginsengisoli (LZP07)；解钾菌有Bacillus aryabhattai(LZP01)、Bacillus subtilis(LZP06)、Bacillus licheniformis(LZP09)。用钼锑抗法和原子吸收法检测这些菌株对磷和钾转换能力， LZP02与LZP05菌株接力能力最好，LZP03和LZP07菌株溶磷能力最好，LZP06 和LZP01解钾能力最好。之后验证了菌株生理生化和功能多样性，得出这几种菌株 分别具有多种离子转换能力。在实验室盆栽育苗实验下，验证了筛选的菌株均具有 促进水稻生长的能力，尤其是LZP01、LZP02、LZP03这三种菌株，在水稻的株高、 茎粗、干鲜重和根系生长方面，都有较为明显的促进能力。将水稻种子用不同的菌 液浸泡，验证浸泡法对水稻的促进作用，可以发现能力较好的有Bacillus aryabhattai (LZP01)、Bacillus pumilus(LZP02)、Bacillus megaterium(LZP03)、Bacillus ginsengisoli (LZP05)、Bacillus subtilis(LZP06)、Bacillusginsengisoli(LZP07)，所以选择这几个 菌株进行进一步研究。
研究发现微生物也能够产生生长素、赤霉素、细胞分裂素、脱落酸和乙烯等 植物激素,它们对于植物的生长是必需的。对这几种水稻根际促生菌分泌植物促生 激素能力检测，根系促生菌普遍具有分泌IAA的能力，菌株Bacillus aryabhattai LZP01、Bacillusmegaterium LZP03和Bacillus ginsengisoli LZP07具有较高的IAA 分泌能力；对菌株进行测定赤霉素分泌量，赤霉素分泌量最高的为Bacillus subtilis LZP06，其分泌量为24.91mg·L-1；通过铁载体活性测定发现，Bacillus aryabhattai LZP01铁载体活性为39.2％，Bacillus pumilus LZP02铁载体活性为25.59％，Bacillus megaterium LZP03铁载体活性为47.22％。经过对筛选菌株进行离子转换能力、浸种 促生能力、盆栽促生能力和植物促生激素分泌能力的测定，挑选出对水稻促进效果 最好的三株菌Bacillusaryabhattai LZP01、Bacillus pumilus LZP02、Bacillus megaterium LZP03进行下一步研究。
水稻根际促生菌在植物根际土壤中的定殖能力是实现其促生能力的关键，土壤微生物定殖是一个复杂的过程，涉及到多种微生物性状与植物反应的相互作用，植 物和土壤细菌可以共同建立特异性的分子信号联系。因此，检测检测水稻根际促生 菌的定殖情况是根际促生菌研究领域的重点工作之一。通过MS培养基半固体实验， 排除其他微生物的干扰，可以证明LZP01、LZP02、LZP03这三种菌株确实具有较 好的促进水稻生长的能力。根据研究发现微生物肥料中含有活的微生物，并且在使 用中能获得特定肥料效应来增加植物产量或提高品质，在营养元素的转化、促进作 物生长、拮抗土传病害和生态系统的平衡等方面起着重要的作用。通过在黑龙江省 五常市和二九零农场进行Bacillus aryabhattaiLZP01、Bacillus pumilus LZP02、 Bacillus megaterium LZP03复合微生物菌肥的田间试验，可以发现对照秧盘水稻盘 根能力较差，加入复合微生物菌肥秧盘水稻盘根能力较好。可以发现加入复合微生 物菌肥的水稻幼苗在各项数据都有显著的促进作用，复合微生物菌肥对水稻根表面 积、根体积、根平均直径、根长具有促进作用。对照总根长为2.1cm，加入微生物 菌肥的水稻总根长为4.1cm，对照根表面积为2.98cm2，加入复合微生物菌肥的水稻根表面积为4.31cm2，对照根体积为0.039cm3，加入复合微生物菌肥的水稻根体 积为0.062cm3，对照根平均直径为0.34mm，加入复合微生物菌肥的水稻根平均直 径为0.39mm。
因此，在上述研究的基础上，本发明提出了一种复合微生物菌肥，其中含有三 种水稻根际促生菌，所述的三种水稻根际促生菌分别命名为Bacillus aryabhattai LZP01、Bacillus pumilus LZP02以及Bacillus megaterium LZP03，分类命名分别为 Bacillusaryabhattai LZP01、Bacillus pumilus LZP02以及Bacillus megaterium LZP03， 保藏在中国典型培养物保藏中心，地址在中国.武汉.武汉大学，其菌种保藏编号分 别为CCTCCNO：M 2018597、CCTCC NO：M 2018598以及CCTCC NO：M 2018599， 保藏时间为2018年9月6日。
其中，优选的，所述的复合微生物菌肥，其特征在于，按照以下方法制备得到：
将水稻根际促生菌Bacillus aryabhattai LZP01、Bacillus pumilus LZP02、Bacillus megaterium LZP03分别接种于LB液体培养基中，在28-30℃的摇床中100-150r·min-1振荡培养过夜作为种子液，将种子液分别接种于含有LB培养基发酵培养罐 中在28-30℃培养2-4d，制成微生物菌液，将发酵后的三种菌液混合，制成所述的 复合微生物菌肥。
其中，优选的，所述的复合微生物菌肥，其特征在于，按照以下方法制备得到：
将水稻根际促生菌Bacillus aryabhattai LZP01、Bacillus pumilus LZP02、Bacillus megaterium LZP03分别接种于LB液体培养基中，在30℃的摇床中140r·min-1振荡 培养过夜作为种子液，将种子液分别接种于含有LB培养基50L的发酵培养罐中在 30℃培养3d，制成微生物菌液，将发酵后的三种菌液按照等体积混合，制成所述 的复合微生物菌肥。
更进一步的，本发明还提出了所述的微生物菌肥在促进水稻生长中的应用。
相较于现有技术，本发明的有益效果是：
本发明将芽孢杆菌用于微生物菌肥的研发，既可以有效促进植物生长，提高农 作物产量；还可以减轻化肥农药对土壤的损伤，保护环境。本发明的提出必将对水 稻微生物肥料开发利用产生推动作用，在农业生产实践中产生经济效益、社会效益 和生态效益。
附图说明
图1为部分菌株的形态及革兰氏染色照片；
图2为菌株进化树；
图3为菌株功能性测定；
其中：A和B表示可溶性磷含量变化，C表示不同处理钾离子含量；
图4为水稻幼苗对照；
图5为水稻生长指标测定；
其中：A表示菌株对水稻高度的影响，B表示菌株对水稻茎粗的影响，C表示 菌株对水稻地上干重的影响，D表示菌株对水稻地上湿重的影响；
图6为水稻根系指标测定；
其中：A表示菌株对水稻根表面积影响，B表示菌株对水稻根体积的影响；
图7为水稻对比照片；
图8为水稻指标测定；
图9为菌株分泌激素测定；
其中：A表示各菌株IAA最大释放量，B表示各菌株赤霉素最大释放量，C表 示各菌株铁载体活性；
图10为水稻幼苗照片；
其中：A表示水稻生长于MS培养基中，B表示水稻生长差异；
图11为水稻生长指标；
其中：A表示菌株对水稻茎粗的影响，B表示菌株对水稻株高的影响，C表示 菌株对水稻地上湿重的影响，D表示菌株对水稻地上干重的影响；
图12为菌对水稻根系影响；
其中：A表示菌株对水稻根表面积影响，B表示菌株对水稻根平均直径的影响， C表示菌株对水稻根体积的影响，D表示菌株对水稻根长的影响；
图13为水稻幼苗对比；
图14为田间试验照片；
其中：A、B表示育苗大棚照片，C表示对照水稻秧盘，D表示加入复合微生 物菌肥的水稻秧盘；
图15为水稻对比照片；
图16为水稻生长指标；
其中：A表示复合微生物菌肥对水稻地上干重的影响，B表示复合微生物菌肥 对水稻地下鲜重的影响，C表示复合微生物菌肥对水稻地上鲜重的影响，D表示复 合微生物菌肥对水稻株高的影响、E表示复合微生物菌肥对水稻地下干重的影响、F 表示复合微生物菌肥对水稻茎粗的影响；
图17为复合微生物菌肥对水稻根系影响。
A表示复合微生物菌肥对水稻根表面积影响，B表示复合微生物菌肥对水稻根 平均直径的影响，C表示复合微生物菌肥对水稻根体积的影响，D表示复合微生物 菌肥对水稻根长的影响。
菌种保藏信息：
1、菌种名称：Bacillus aryabhattai LZP01
分类命名：Bacillus aryabhattai LZP01
保藏机构：中国典型培养物保藏中心
保藏地址：中国.武汉.武汉大学
菌种保藏编号：CCTCC NO：M 2018597
保藏时间：2018年9月6日
2、菌种名称：Bacillus aryabhattai LZP02
分类命名：Bacillus pumilus LZP02
保藏机构：中国典型培养物保藏中心
保藏地址：中国.武汉.武汉大学
菌种保藏编号：CCTCC NO：M 2018598
保藏时间：2018年9月6日
3、菌种名称：Bacillus aryabhattai LZP03
分类命名：Bacillus megaterium LZP03
保藏机构：中国典型培养物保藏中心
保藏地址：中国.武汉.武汉大学
菌种保藏编号：CCTCC NO：M 2018599
保藏时间：2018年9月6日
具体实施方式
下面结合具体实例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域 技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的 细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1水稻根际促生菌的筛选与鉴定
1材料与方法
1.1水稻根际土壤采集
水稻根际土壤采集于黑龙江省二九零农场(47°35′23.85″N,131°56′24.01″E)，在农场水稻种植区选取一片土壤为黑土的水稻田，此稻田种植的品种为龙粳46。在 这片稻田1公顷范围内，随机选取10个种植点，每个点随机选取10株水稻，采用 抖土法收集根系表面1～2mm处的土壤，每个点收集土壤10g，共计100g土壤， 于4℃冷冻保存待用。
1.2培养基配方
LB培养基(1L)：琼脂20g，NaCl 8g，酵母5g，蛋白胨10g，pH 7.0，液体 培养基不加琼脂。
PKO无机培养基(1L)：葡萄糖10.0g，(NH4)2SO4 0.5g，NaCl 0.3g，Ca3(PO4)2 2.0g，MgSO4·7H2O 0.3g，KCl 0.3g，FeSO4·7H2O 0.036g，MnSO4·H2O 0.03g，琼 脂20g，液体培养基不加琼脂。
蒙金娜有机培养基(1L)：葡萄糖10.0g，MgSO4·7H2O 0.3g，(NH4)2SO4 0.5g，NaCl0.3g，KCl 0.3g，MnSO4·H2O 0.03g，FeSO4·7H2O 0.03g，卵磷脂0.2g，CaCO3 1.0g，酵母粉0.5g，琼脂20.0g，液体培养基不加琼脂。
亚历山大罗夫培养基(1L)：蔗糖5.0g，MgSO4·7H2O 0.5g，Na2HPO4 2.0g， CaCO30.1g，钾长石粉1.0g，FeCl3·6H2O 0.005g，琼脂20.0g，液体培养基不加 琼脂。
1.3试验主要仪器与材料
生物学显微镜、离心管、电热恒温干燥培养箱、电子分析天平、烧杯、摇床、 pH计、电热鼓风干燥箱、锥形瓶、高压灭菌锅、生化培养箱、紫外分光光度计、育 苗钵、高速离心机、超净工作台等。
盆栽育苗土壤采自齐齐哈尔市嫩江大坝，土壤养分含量为：有机质20.35g/kg、 碱解氮27.96mg/kg、速效钾79.00mg/kg，有效磷26.52mg/kg、土壤pH值6.49， EC值0.76mS/cm。供试水稻种子是由佳木斯水稻研究所提供的龙粳31。
1.4菌株的分离纯化
称取水稻根系土壤1g，在无菌条件下放入三角瓶中，加入无菌水配置成土壤 悬液，放于25℃温度、140r·min-1的条件下振荡培养30min得到土壤悬液。梯度稀 释为10-4、10-5、10-6浓度的悬液，分别吸取0.1mL悬液涂布到固体PKO无机培养 基(溶磷菌筛选)、亚历山大罗夫培养基(解钾菌筛选)、蒙金娜有机培养基(解磷 菌筛选)，分别平行为三组，将平板存放于30℃恒温箱中培养5d。分别挑取长势 良好并且透明圈明显的单菌落经过纯化并传代培养，每个菌株设置三个平行。将纯 化后的菌株分别接种于LB液体培养基中，在30℃温度、140r·min-1的培养箱中培 养过夜，分别吸取1mL菌液于2mL离心管中，在高速离心机中以4000r·min-1离 心10min，倒去上清保留底部沉淀，于-80℃冰箱中保藏备用。
1.5菌株16SrDNA基因序列的分子鉴定
将分离纯化出的水稻根际促生菌进行16SrDNA测序，序列由上海美吉公司进 行测定。菌株测序结果于NCBI中Blast比对，使用MEGA5.0软件构建系统进化树。
1.6菌株养分转化能力测定
将2μg·mL-1的磷标准液分别加入到7个比色管中，用超纯水将比色管定容至25mL，分别得到含磷量为0.00μg·mL-1、0.04μg·mL-1、0.08μg·mL-1、0.24μg·mL-1、 0.40μg·mL-1、0.80μg·mL-1、1.20μg·mL-1的标准液。在室温条件下加入钼锑抗显色 剂，显色时间为20min，用紫外分光光度计测定其吸光值(OD＝700nm)并制作标 准曲线。测定标准曲线为y＝0.1733x-0.1166，相关系数R2＝0.9907。挑取少许保 藏的溶磷菌株沉淀，接种于LB液体培养基中，在30℃、140r·min-1条件下的培养 箱中振荡培养过夜，吸取1mL菌液于液体PKO培养基；挑取少许保藏的解磷菌株 沉淀，接种于LB液体培养基中，在30℃、140r·min-1条件下的培养箱中振荡培养 过夜，吸取1mL菌液于液体蒙金娜培养基。将两种培养基放于30℃、120r·min-1震荡培养箱内培养，每24h取5mL菌液于4000r·min-1条件下离心10min，将上清 加入到比色管中，用超纯水定容至25mL后加入显色剂，每组三个平行。显色20min，用紫外分光光度计测定其吸光值(OD＝700nm)并制作曲线。
挑取少许保藏的解钾菌株沉淀，接种于LB液体培养基中，在30℃、140r·min-1条件下的培养箱中振荡培养过夜，吸取1mL菌液于亚历山大罗夫液体培养基中， 将培养基放于30℃、120r·min-1震荡培养箱内培养，每24h取样离心后利用火焰原 子吸收光谱仪测定上清液中钾离子的浓度，每组三个平行。
1.7菌株生理生化及功能多样性分析
淀粉水解试验：在LB牛肉膏蛋白胨培养基平板中加入10g的可溶性淀粉，接 菌后于适温培养2d后滴加少量的碘液，均匀铺满整个平板。如菌落周边有无色透 明圈，则表示该菌株能够分解淀粉，为阳性，仍然为蓝黑色为阴性。
油脂水解试验：将菌落划线至固体油脂培养基中，28℃下倒置培养48h后观 察平板颜色，如出现红色斑点表明脂肪水解，为阳性。
葡萄糖发酵实验：将菌株用穿刺法接种于培养基，28℃培养5d，如指示剂颜 色变黄则产酸，为阳性。
乳糖发酵试验：将菌株用穿刺法接种于培养基，28℃培养5d，如指示剂颜色 变黄则产酸，为阳性。
硫化氢试验：穿刺接种于醋酸铅培养基中，置37℃恒温箱经24h培养后，若 出现黑色沉淀者为阳性。
吲哚试验：于培养48h后的蛋白胨水培养基内加入4滴乙醚，摇动数次，静置 1min，乙醚层浮于培养液的上面，此时沿管壁缓慢加入10滴吲哚试剂(加入吲哚 试剂后切勿摇动试管，以防破坏乙醚层影响结果观察)，如有吲哚存在，乙醚层呈 现玫瑰红色，此为吲哚试验阳性反应。
甲基红试验：将菌株接种于葡萄糖蛋白胨水培养基中，28℃培养2d后加入2 滴甲基红试剂，培养基变红则为阳性。
伏-普试验：将菌株接种于葡萄糖蛋白胨水培养基中28℃培养48h后，加入10 滴KOH与等量的α-萘酚溶液(5％)，用力震荡，水浴30min，如有红色出现则为 阳性反应。
柠檬酸试验：将菌株接种柠檬酸盐培养基斜面上，28℃下培养5d，如可在此 斜面生长并红色变深成玫瑰红色，则为阳性。
将筛选得到的根际促生菌分别划线至LB培养基中，在30℃的条件下培养24h 进行活化，将活化后的各菌株分别点殖于PKO培养基、蒙金娜培养基、亚历山大 罗夫培养基中，于30℃的培养箱中培养2d观察各菌株的生长情况，每组三个平 行。
1.8盆栽促生试验
采用盐水漂浮法挑选水稻种子，选种后用清水淘洗，清除谷壳外盐分，加入烧 杯中于30℃浸种催芽。使用LB培养基分别将筛选的水稻根际促生菌培养至浓度为 OD600＝0.5，待水稻胚根长至0.5cm左右时，分别播种到添加了30mL菌液的盆栽 育苗土营养钵(10cm×10cm，每钵装有223g土)中，每钵5株水稻，设置加入 30mL的无菌LB培养基的营养钵为对照，每个处理重复5次。试验期间浇无菌水， 把种好的营养钵放入智能人工气候箱内，白天12h设置温度为30℃，湿度为30％， 光照等级为3级；晚上12h设置温度为30℃，湿度为30％，光照等级为0。一叶 之后白天温度设置为25℃，晚上温度20℃，两叶之后白天温度设置为20℃，晚 上温度为15℃，这样可以保证水稻根的发育。水稻株高用卷尺测量，起点为茎基 部，终点到生长点。茎粗用游标卡尺测量，测量幼苗茎地上部分三分之一处。水稻 地上鲜重、地下鲜重用电子天平测量。水稻地上干重、地下干重测量，将幼苗置于 烘箱中，先105℃烘干30min，然后80℃烘干至恒重后，用电子天平测量。水稻 根系分析用扫描仪描取根系图片，将图片用托普根系分析软件分析，并记录数据。
1.9浸种促生试验
用LB培养基分别培养水稻根际促生菌至菌悬液OD600＝0.5，用0.1％的升汞将 水稻种子消毒5min，无菌水清洗水稻种子6次后，将水稻种子分别放于菌液内浸 种24h。将水稻种子转至事先湿热灭菌且铺有2层滤纸的9cm培养皿中，每个培养 皿放20粒水稻种子，以无菌的LB培养基浸种为对照，每个处理重复3次。在温度 25℃、湿度60％的气候箱中暗培养，种子萌发后，以18h/6h光暗周期进行培养， 试验期间每天向培养皿中加入5mL无菌水，7d后测量水稻种子相关指标。
2结果与分析
2.1菌株的筛选与纯化
将采集的土壤悬液涂布于不同功能的筛选培养基上，在30℃的培养箱中培养5 d，挑选透明圈明显的菌株进行纯化，将纯化后的菌株分别接种于LB液体培养基中， 在30℃温度、140r·min-1的培养箱中培养过夜，分别吸取1mL菌液于2mL离心管 中，在高速离心机中以4000r·min-1离心10min，倒去上清保留底部沉淀，于-80℃ 冰箱中保藏备用。最终得到9株纯化菌株，其中溶磷菌三株：LZP03、LZP04、LZP07； 解磷菌三株：LZP02、LZP05、LZP08；解钾菌三株：LZP01、LZP06、LZP09。菌 株的菌落特征如表1所示。部分菌株的形态及革兰氏染色照片如图1所示。
表1菌株的菌落特征
2.2菌株16SrDNA基因序列的分子鉴定
提取筛选得到的9种菌株的DNA，进行16SrDNA基因测序，菌株序列由上海 美吉公司进行测定，并将测序结果在NCBI数据库中进行Blast比对，结果如图2 和表2所示。结果表明，解磷菌有Bacillus pumilus(LZP02)、Bacillus aryabhattai (LZP08)、Bacillusginsengisoli(LZP05)；溶磷菌有Bacillus megaterium(LZP03)、 Bacillusoryzaecorticis(LZP04)、Bacillus ginsengisoli(LZP07)；解钾菌有Bacillusaryabhattai(LZP01)、Bacillus subtilis(LZP06)、Bacillus licheniformis(LZP09)。
表2菌株鉴定
2.3菌株养分转化能力测定
如图3可知，LZP08菌株培养24h时培养基磷含量达最高值，此时磷含量31.48 mg·L-1。LZP02与LZP05菌株在72h时培养基磷含量达最高值，此时磷含量分别为 32.68mg·L-1和35.57mg·L-1。三株溶磷菌均在168h时达到最大溶磷量，LZP03菌 株最大溶磷量为311.1mg·L-1，LZP07菌株最大溶磷量为293.39mg·L-1，LZP04菌株 最大溶磷量为286.42mg·L-1。LZP06菌株钾离子含量为1.13mg·L-1，LZP01菌株钾 离子含量为1.02mg·L-1，LZP09菌株钾离子含量为0.89mg·L-1，三株菌都具有较好 的解钾能力。
对三株溶磷菌、三株解磷菌进行透明圈测定，如表3所示，比较D/d值大小可 知LZP03溶磷效果较好，LZP02解磷效果较高。
表3透明圈测定
2.2.4菌株生理生化及功能多样性分析
对筛选菌株生理生化特性进行测定，数据详见表4。
表4菌株生理生化测定
对各水稻根际促生菌进行功能多样性检测，确定各菌株的溶磷能力、解磷能力、解钾能力的功能多样性大小。将各菌株分别点殖于不同的筛选培养基(PKO无机培 养基、蒙金娜有机培养基、亚历山大罗夫培养基)上培养观察菌株长势。如表5所 示，各菌株在溶磷筛选培养基的长势为(LZP01、LZP03、LZP04、LZP09)>(LZP02、 LZP05、LZP06、LZP07、LZP08)；各菌株在解磷筛选培养基上的长势(LZP02、 LZP08)>(LZP01、LZP03、LZP05、LZP09)>(LZP04、LZP06、LZP07)；各菌 株在解钾筛选培养基中(LZP01、LZP08、LZP09)>(LZP06)>(LZP02、LZP03、 LZP04、LZP05、LZP07)。
表5菌株功能多样性测定
+长势一般；++长势较好；+++长势很好
2.5盆栽促生试验
营养钵育苗20d后测量水稻的生理指标，图4为水稻生长对比照片。如图5可 知，对水稻高度促进效果最好的三株菌为LZP01(40.0cm)、LZP02(41.0cm)、LZP03 (37.7cm)；对水稻茎粗促进效果最好的三株菌为LZP01(2.24mm)、LZP02(2.46 mm)、LZP03(2.17mm)；对水稻地上干重促进效果最好的三株菌为LZP01(0.067 g)、LZP02(0.068g)、LZP06(0.062g)；对水稻地上湿重促进效果最好的三株菌 为LZP01(0.47g)、LZP02(0.43g)、LZP06(0.45g)。加入促生菌的土壤相比对 照土壤生长出来的水稻，在各项指标都有所提高，说明菌株具有促生效果。
如图.6可知，对水稻根表面积促进效果最好的三株菌为LZP01(2.878cm2)、 LZP02(2.709cm2)、LZP03(2.797cm2)；对水稻根体积促进效果最好的三株菌为 LZP01(0.0293cm3)、LZP02(0.0357cm3)、LZP03(0.039cm3)。加入促生菌的土 壤相比对照土壤的水稻，在根系各项指标都有所提高，说明菌株具有促生效果。
2.6浸种促生试验
浸种促生7d后观察水稻形态如图7，测定水稻的相关指标如图8，对照组的根 长为3.025cm，9种菌株根长相比对照都有促生，其中较好的有LZP02(7.9cm)、 LZP03(7.8cm)、LZP06(6.4cm)；鲜重方面，9种菌相比对照也都具有很大的提 高，对照鲜重为0.0338g，提高最为明显的有LZP02、LZP03、LZP06，重量分别为 0.0406g、0.0407g、0.0401g；株高方面，相比对照都有所提高，对照株高为3.19cm， 其中促生较好的有LZP01、LZP02、LZP03，分别为4.54cm、4.72cm、4.57cm。 经过菌株浸种实验，筛选得到的根系促生菌都可以很好的促进水稻幼苗根、茎生长。
实施例2根际促生菌促生能力分析
1材料与方法
1.1供试菌株
供试菌株为水稻根际土壤中筛选并验证能力较好的PGPR，包括溶磷菌Bacillusmegaterium(LZP03)、Bacillus ginsengisoli(LZP07)；解磷菌Bacillus pumilus(LZP02)、Bacillus ginsengisoli(LZP05)；解钾菌Bacillus aryabhattai(LZP01)、Bacillussubtilis (LZP06)，于-80℃冰箱中保藏备用。
1.2培养基配方
LB培养基(1L)：琼脂20g，NaCl 8g，酵母5g，蛋白胨10g，pH 7.0，液体 培养基不加琼脂。
PKO无机培养基(1L)：葡萄糖10.0g，(NH4)2SO4 0.5g，NaCl 0.3g，Ca3(PO4)2 2.0g，MgSO4·7H2O 0.3g，KCl 0.3g，FeSO4·7H2O 0.036g，MnSO4·H2O 0.03g，琼 脂20g，液体培养基不加琼脂。
蒙金娜有机培养基(1L)：葡萄糖10.0g，MgSO4·7H2O 0.3g，(NH4)2SO4 0.5g， NaCl0.3g，KCl 0.3g，MnSO4·H2O 0.03g，FeSO4·7H2O 0.03g，卵磷脂0.2g，CaCO3 1.0g，酵母粉0.5g，琼脂20.0g，液体培养基不加琼脂。
亚历山大罗夫培养基(1L)：蔗糖5.0g，MgSO4·7H2O 0.5g，Na2HPO4 2.0g， CaCO30.1g，钾长石粉1.0g，FeCl3·6H2O 0.005g，琼脂20.0g，液体培养基不加 琼脂。
MKB培养基(1L)：酪蛋白氨基酸5.0g，甘油15.0mL，MgSO4·7H2O 0.2g， K2HPO42.5g，琼脂20.0g，pH 7.0，液体培养基不加琼脂。
DF盐培养基(1L)：KH2PO4 4.0g，Na2HPO4 6.0g，MgSO4·7H2O 0.2g，葡萄 糖2.0g，葡萄糖酸2.0g，柠檬酸2.0g，(NH4)2SO4 2.0g，pH 7.2，用于ACC 脱氨酶菌株筛选培养。
ADF培养基：ACC溶于灭菌的超纯水后，用0.22μm一次性无菌过滤器过滤 除菌，加到不含有(NH4)2SO4的DF盐培养基中，使其终浓度为3.0mmol/L，用于 ACC脱氨酶菌株筛选培养。
酪素培养基(1L)：酪蛋白10.0g，牛肉浸粉3.0g，NaCl 5.0g，K2HPO4 2.0g， 琼脂15.0g，溴百里香酚兰0.05g，pH 7.4±0.1。
富集培养基(1L)：NaNO3 1.5g，NH4H2PO4 4g，KCl 0.5g，K2HPO4 1g， FeSO4·7H2O0.01g，MgSO4·7H2O 0.5g，茯苓粉30g。
MS培养基半固体(1L)：大量元素100.0mL，微量元素10.0mL，铁盐10.0ml， 有机物10.0ml，蔗糖30.0g，琼脂9.5g，pH 5.4。
大量元素(1L)：KNO3 19g，NH4NO3 16.5g，KH2PO4 1.7g，MgSO4·7H2O 3.7g，CaCl2·2H2O 4.4g。
微量元素(1L)：H3BO3 0.62g，KI 0.083g，ZnSO4·7H2O 0.86g，MnSO4·7H2O 1.6 g，Na2MoO4·2H2O 0.025g，CuSO4·5H2O 0.0025g，CoCl2·6H2O 0.0025g。
铁盐(1L)：Na2·EDTA3.725g，FeSO4·7H2O 2.785g。
有机物(500ml)：盐酸硫胺素0.01g，甘氨酸0.05g，烟酸0.0125g，盐酸吡哆 醇0.0125g，肌醇2.5g。
1.3试验主要仪器与材料
紫外分光光度计、离心管、电热恒温干燥培养箱、电子分析天平、烧杯、摇床、 pH计、电热鼓风干燥箱、锥形瓶、高压灭菌锅、培养皿、生化培养箱、高速离心机、 超净工作台等。
供试水稻种子是由佳木斯水稻研究所提供的龙粳31。
1.4菌株的植物促生激素测定
IAA分泌量测定，首先进行标准曲线测定，采用分析纯IAA进行制备，将200 μg·mL-1的IAA标准液(乙醇溶解后用水定容)梯度稀释为0μg·mL-1、25μg·mL-1、 50μg·mL-1、75μg·mL-1、100μg·mL-1、125μg·mL-1、150μg·mL-1浓度，采用Salkowski 显色法测定吸光值(OD530)，每组重复5次，得到标准曲线为y＝0.0132x+0.0111， 相关系数R2＝0.999。挑取少许保存的菌株沉淀接菌于LB液体培养基中，在30℃ 的培养箱中120r·min-1震荡培养24h制作种子液，按1％的接种量分别将种子液分 别接入含有200mg·L-1色氨酸的液体PKO无机培养基(溶磷菌)、蒙金娜有机培养 基(解磷菌)、亚历山大罗夫培养基(解钾菌)中，于30℃温度下120r·min-1震荡 培养，每24h采用Salkowski显色法测量IAA分泌量，每组三个平行。
对菌株进行铁载体活性测定，将保存的水稻根际促生菌挑取少许沉淀接种于LB液体培养基中，在30℃的摇床中140r·min-1振荡培养过夜，使菌液吸光值OD600＝1， 吸取1mL菌液于MKB液体培养基中，在30℃的摇床中120r·min-1震荡培养48h， 4000r·min-1离心10min，取3mL上清液。将上清液与CAS检测液各3mL充分混 合，反应时间1h，于630nm处测定吸光值(As)，每组三个平行。对照组为不接 菌MKB液体培养基，测定方法同上，测定值为(Ar)。铁载体含量测定根据公式： 铁载体活性单位(％)＝[(Ar–As)/Ar]×100进行计算铁载体产量。
赤霉素分泌量测定，首先将分析纯赤霉素溶于体积分数为70％的乙醇中，配置 成100μg·mL-1的赤霉素标准液，之后梯度稀释为0μg·mL-1、10μg·mL-1、20μg·mL-1、30μg·mL-1、40μg·mL-1、50μg·mL-1、60μg·mL-1浓度，取各浓度的赤霉素溶液0.5mL 与4.5mL 98％硫酸混匀，,用水定容至20mL后测定吸光值(412nm)，制作标准曲 线，经测定得到赤霉素标准曲线方程y＝0.0219+0.0002，R2＝0.999。将保存的水稻 根际促生菌挑取少许沉淀接种于LB培养基中，30℃摇床中120r·min-1震荡培养24 h制作种子液，按1％的接种量将种子液分别转接液体PKO无机培养基(溶磷菌)、 蒙金娜有机培养基(解磷菌)、亚历山大罗夫培养基(解钾菌)中，30℃温度下震 荡培养，每24h进行4000r·min-1离心10min，取0.5mL上清加入98％硫酸，用水 定容至200mL并测定412nm处的吸光值，以确定各菌株最大赤霉素分泌量，每组 三个平行。
1.5菌株产酶能力测定
菌株ACC脱氨酶活性测定，首先将冰箱中保藏的菌株用LB培养基活化，将活 化后的菌株分别接种到8mL的LB培养液中，28℃、160r/min-1震荡培养12h。 取0.2mL菌悬液转接入8mL的DF盐培养基中，28℃、160r/min-1震荡培养12h。 然后取0.2mL的菌液转接入8mL的ADF培养液中，以不含ACC的ADF培养基 作为对照，培养48h，测定其在600nm处的吸光值，每个处理3个重复。
将保存的水稻根际促生菌挑取少许沉淀接种于LB液体培养基中，在30℃的 摇床中140r·min-1振荡培养过夜，分别吸取1mL菌液涂布于酪素培养基，30℃培 养24h测定透明圈大小，以进行蛋白酶活性测定。将保存的水稻根际促生菌挑取少 许沉淀接种于LB液体培养基中，在30℃的摇床中140r·min-1振荡培养过夜，分别 吸取1mL菌液涂布于富集培养基，30℃培养24h测定透明圈大小，以进行β-1.3 葡聚糖酶活性测定。
1.6优势菌株MS培养基育苗试验
首先进行水稻种子杀菌，将水稻种子于蒸馏水中室温浸泡24h，之后在45℃ 温水中浸泡5min，在54℃温水中浸泡10min，然后在70％乙醇中浸泡5min，1％ 氯化汞浸泡10min，最后用无菌水冲洗8次水稻种子，整个过程在无菌条件下进行。 将消毒后的水稻种子置于高压灭菌的100mL锥形瓶中，每瓶20粒种子，用封口膜 密封，置于25℃暗处萌发培养6d，前两天加入足量的无菌水，以后每天换一次无 菌水。将挑选的优势水稻根际促生菌分别接种在LB培养基中培养至OD600为0.5。 挑选长势一致的萌发种子4个，播种于含无菌MS半固体培养基的培养皿中，每个 种子间隔2cm，在水稻根尖3cm处，加入25ml的根际促生菌。用封口膜密封， 垂直放置培养箱内。培养时间为6d(28℃/光照12h，25℃/黑暗12h，湿度为60％)， 得到水稻幼苗，每组试验三个重复。水稻株高用卷尺测量，起点为茎基部，终点到生长点。茎粗用游标卡尺测量，测量幼苗茎地上部分三分之一处。水稻地上鲜重、 地下鲜重用电子天平测量。水稻地上干重、地下干重测量，将幼苗置于烘箱中，先 105℃烘干30min，然后80℃烘干至恒重后，用电子天平测量。水稻根系分析用 扫描仪描取根系图片，将图片用托普根系分析软件分析，并记录数据。
2结果与分析
2.1菌株分泌植物激素能力测定
对挑选的水稻根际促生菌进行分泌植物促生激素测定，如图9可知，根系促生 菌普遍具有分泌IAA的能力，其中Bacillus subtilis LZP06分泌量最高为92.26 mg·L-1，菌株Bacillus aryabhattai LZP01、Bacillus megaterium LZP03和Bacillus ginsengisoliLZP07也具有较高的IAA分泌能力，分泌量分别为77.87mg·L-1、55.71 mg·L-1和53.31mg·L-1，并且菌株经过多次传代后产IAA的特性稳定。将菌株接种 于筛选培养基后测定赤霉素分泌量，赤霉素分泌量最高的为Bacillus subtilis LZP06， 其分泌量为24.91mg·L-1，其余菌株分泌量在10.75～17.46mg·L-1之间，也具有较好 的赤霉素分泌能力。通过铁载体活性测定发现，Bacillus aryabhattai LZP01铁载体活 性为39.2％，Bacillus pumilusLZP02铁载体活性为25.59％，Bacillus megaterium LZP03铁载体活性为47.22％，Bacillus ginsengisoli LZP05铁载体活性为64.44％， Bacillus subtilis LZP06铁载体活性为51.75％，Bacillus ginsengisoli LZP07铁载体活 性为50.91％。其中铁载体活性最高的菌株为Bacillus ginsengisoli LZP05。
2.2菌株产酶能力测定
通过测定菌株产酶能力可以发现(表6)，挑选的6株水稻根际促生菌均可产生 蛋白酶，产生能力最好的有Bacillus pumilus LZP02、Bacillus ginsengisoli LZP07，较 好的有Bacillus megaterium LZP03，其他3株菌产酶能力一般。挑选的6株水稻根 际促生菌均可产生β1-3葡聚糖酶蛋白酶，产生能力较好的有Bacillus aryabhattai LZP01、Bacillus pumilus LZP02、Bacillus ginsengisoli LZP07。产ACC脱氨酶能力测 定，Bacillus pumilus LZP02、Bacillus megaterium LZP03、Bacillus ginsengisoli LZP05、Bacillus ginsengisoli LZP07均可产生ACC脱氨酶，产酶能力较好的有Bacillusginsengisoli LZP07。
表6菌株产酶能力
－不产酶；+产酶一般；++产酶较好；+++产酶很好
2.3优势菌株MS培养基育苗试验
经过对筛选菌株进行离子转换能力、浸种促生能力、盆栽促生能力和植物促生 激素分泌能力的测定，挑选出对水稻促进效果最好的三株菌Bacillus aryabhattai LZP01、Bacillus pumilus LZP02、Bacillus megaterium LZP03进行下一步研究。
MS半固体培养基育苗6d后测量水稻的相关生理指标，图10A为水稻在MS 培养基中对比照片，图10B为水稻单株对比照片，从照片上可以发现加入促生菌的 水稻幼苗在根系和株高等方面，都显著优于对照。如图11，在数据方面对水稻生长 指标进行对比，可以发现三株菌均对水稻茎粗、株高、地上干重、地上湿重具有促 进作用。其中茎粗促进最好的为LZP01(1.04mm)，株高促进效果最好的为LZP03 (12.37cm)，地上湿重促进效果最好的为LZP03(0.031g)，地上干重促进效果最 好的为LZP02(0.0053g)。
如图12可知，三株菌均对水稻根表面积、根体积、根平均直径、根长具有促 进作用。对照总根长为2.77cm，促进效果最好的Bacillus megaterium LZP03总根长 为10.69cm，对照根表面积为0.26cm2，促进效果最好的Bacillus megaterium LZP03 根表面积为0.8cm2，对照根体积为0.0022cm3，促进效果最好的Bacillus megaterium LZP03根体积为0.01cm3，对照根平均直径为0.44mm，促进效果最好的Bacillus aryabhattai LZP01根平均直径为0.5mm。加入促生菌的土壤相比对照土壤的水稻， 在根系各项指标都有所提高，说明菌株具有促生效果。
实施例3复合微生物菌肥的田间应用试验
1材料与方法
1.1供试菌株
供试菌株为筛选的优质水稻根际促生菌，包括溶磷菌Bacillus megateriumLZP03；解磷菌Bacillus pumilus LZP02；解钾菌Bacillus aryabhattai LZP01，于-80℃冰箱中保藏备用。
1.2培养基配方
LB培养基(1L)：琼脂20g，NaCl 8g，蛋白胨10g，酵母5g，pH 7.0，液体 培养基不加琼脂。
1.3试验主要仪器与材料
紫外分光光度计、电子分析天平、烧杯、摇床、pH计、锥形瓶、高压灭菌锅、 高速离心机、超净工作台、发酵罐等。
1.4菌肥制备
将挑选的优势水稻根际促生菌Bacillus aryabhattai LZP01、Bacillus pumilusLZP02、Bacillus megaterium LZP03分别接种于LB液体培养基中，在30℃的摇床 中140r·min-1振荡培养过夜作为种子液，将种子液分别接种于含有LB培养基50L 的发酵培养罐中30℃下培养3d，制成微生物菌液，将发酵后的三种菌液按照等体 积比混合制成复合微生物菌肥备用。
1.5哈尔滨田间试验
育苗试验地为哈尔滨五常市。先将水稻种子室温浸泡7d进行催芽，然后将水 稻种子置于27cm×58cm的水稻秧盘中，秧盘事先培好育苗土，加完水稻种子后在 伏上一层育苗土。将处理好的秧盘置于7m×35m的塑料大棚内，处理组使用按照 育苗土质量10％加入复合微生物菌肥的水稻秧盘，对照组使用按照育苗土质量10％ 加入水的水稻秧盘，培养20d后测量相关数据。
1.6二九零农场田间试验
育苗试验地为黑龙江省二九零农场(47°35′23.85″N,131°56′24.01″E)，试验水稻品种为龙粳31。先将水稻种子室温浸泡7d进行催芽，然后将水稻种子置于27cm ×58cm的水稻秧盘中，秧盘事先培好育苗土，加完水稻种子后再伏上一层育苗土。 将处理好的秧盘置于7m×35m的塑料大棚内，处理组使用按照育苗土质量10％加 入复合微生物菌肥的水稻秧盘，对照组使用按照育苗土质量比10％加入水的水稻秧 盘，培养20d后测量相关数据。水稻株高用卷尺测量，起点为茎基部，终点到生长 点。茎粗用游标卡尺测量，测量幼苗茎地上部分三分之一处。水稻地上鲜重、地下 鲜重用电子天平测量。水稻地上干重、地下干重测量，将幼苗置于烘箱中，先105℃ 烘干30min，然后80℃烘干至恒重后，用电子天平测量。水稻根系分析用扫描仪 描取根系图片，将图片用托普根系分析软件分析，并记录数据。
2结果与分析
2.1哈尔滨田间试验
图13为水稻生长对比，从图中我们可以发现，加入了复合微生物菌肥的水稻 幼苗，较对照株高有明显的提高，在根系方面，加入微生物菌剂的水稻幼苗根系比 较发达。最主要的是相互之间盘根能力较好，这非常有利于水稻在实际田间的存活 与生长。
2.2二九零农场田间试验
于黑龙江省二九零农场进行Bacillus aryabhattai LZP01、Bacillus pumilusLZP02、Bacillus megaterium LZP03复合微生物菌肥的田间试验，图14A、B表示育 苗大棚照片，图14C表示20d后的对照秧盘，可以发现水稻盘根能力较差，图14D 表示20d后的加入复合微生物菌肥秧盘，可以发现水稻盘根能力较好。
图15表示菌株田间试验单株水稻对比，左侧三株为复合微生物菌肥水稻幼苗， 右侧为三株对照水稻幼苗，从照片中可以发现加入复合微生物菌肥的水稻幼苗在根 系和植株上比对照都有显著的提高。
如图16，在数据方面对水稻生长指标进行对比，可以发现加入复合微生物菌肥 的水稻幼苗在各项数据都有显著的促进作用，对照组地上部干重、地上部鲜重、地 下部干重、地下部鲜重、茎粗、株高分别为0.0097g、0.062g、0.0066g、0.036g、 1.39mm、6.57cm，加入复合微生物菌肥地上部干重、地上部鲜重、地下部干重、 地下部鲜重、茎粗、株高分别为0.136g、0.087g、0.0084g、0.053g、1.75mm、9.48 cm。
如图17可知，复合微生物菌肥对水稻根表面积、根体积、根平均直径、根长 具有促进作用。对照总根长为2.1cm，加入复合微生物菌肥的水稻总根长为4.1cm， 对照根表面积为2.98cm2，加入复合微生物菌肥的水稻根表面积为4.31cm2，对照 根体积为0.039cm3，加入复合微生物菌肥的水稻根体积为0.062cm3，对照根平均 直径为0.34mm，加入复合微生物菌肥的水稻根平均直径为0.39mm。加入促生菌 的土壤相比对照土壤的水稻，在根系各项指标都有所提高，说明菌株具有促生效果。

Claims (4)

1.一种复合微生物菌肥，其特征在于，含有三种水稻根际促生菌，所述的三种水稻根际促生菌分别命名为Bacillus aryabhattai LZP01、Bacillus pumilus LZP02以及Bacillusmegaterium LZP03，保藏在中国典型培养物保藏中心，其菌种保藏编号分别为CCTCC NO：M2018597、CCTCC NO：M 2018598以及CCTCC NO：M 2018599。
2.如权利要求1所述的复合微生物菌肥，其特征在于，按照以下方法制备得到：
将水稻根际促生菌Bacillus aryabhattai LZP01、Bacillus pumilus LZP02、Bacillus megaterium LZP03分别接种于LB液体培养基中，在28-30℃的摇床中100-150r·min-1振荡培养过夜作为种子液，将种子液分别接种于含有LB培养基发酵培养罐中在28-30℃培养2-4d，制成微生物菌液，将发酵后的三种菌液混合，制成所述的复合微生物菌肥。
3.如权利要求2所述的复合微生物菌肥，其特征在于，将水稻根际促生菌Bacillusaryabhattai LZP01、Bacillus pumilus LZP02、Bacillus megaterium LZP03分别接种于LB液体培养基中，在30℃的摇床中140r·min-1振荡培养过夜作为种子液，将种子液分别接种于含有LB培养基50L的发酵培养罐中在30℃培养3d，制成微生物菌液，将发酵后的三种菌液按照等体积混合，制成所述的复合微生物菌肥。
4.权利要求1-3任一项所述的微生物菌肥在促进水稻生长中的应用。
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