CN110982743A - 促进玉米根系发育的阿氏芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及根际促生菌(PGPR)领域，具体涉及一株促进玉米根系发育的阿氏芽孢杆菌及其应用。菌株为阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)LAD，以保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地点为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC NO 18653，保藏日期为2019年10月10日，阿氏芽孢杆菌在促进玉米根系发育中的应用。本发明中阿氏芽孢杆菌Bacillus aryabhattai LAD能在土壤中稳定存在，具有固氮、产糖、解淀粉和产生植物激素等特性，并促进玉米幼苗生长及根系发育，且阿氏芽孢杆菌具有较强的抗逆性，因此，可用于作物生产中。

Description

促进玉米根系发育的阿氏芽孢杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及根际促生菌(PGPR)领域，具体涉及一株促进玉米根系发育的阿氏芽孢杆菌及其应用。

背景技术

阿氏芽孢杆菌发现于21世纪初，属于革兰氏阳性菌、芽孢杆菌属菌落光滑，大小为5-10mm。阿氏芽孢杆菌研究方向包括大分子降解、产物合成和促进植物生长等。阿氏芽孢杆菌在自然界中分布广泛，且抗逆性很强，在动物肠道、植物根际、深海以及高原均有发现。阿氏押宝杆菌不仅能降解或合成大分子化合物，包括脱色、污水降解、合成香料、合成生物絮凝剂和抗白血病特效药物；还能与植物共生并促进植物生长，包括合成激素、抗逆和增加作物产量。从2009发现并分离出第一株阿氏芽孢杆菌至今菌种资源仍较为匮乏，且由于阿氏芽孢杆菌存在广泛，有些种类并不适宜在农作物中应用，同时仅能体现单一的效果，且并未有从玉米中分离得到的阿氏芽孢杆菌的相关报道，同时不能实现多功能。

发明内容

本发明的目的在于针对现有研究的不足，提供一株能够促进根系发育的阿氏芽孢杆菌及其应用。

为实现本发明所述目的，所提供以下技术方案予以实现:

一株促生阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地点为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCCNO 18653，保藏日期为2019年10月10日。

本发明中阿氏芽孢杆菌Bacillus aryabhattai LAD的生物学特性为革兰氏染色阳性杆菌，具有固氮、产糖及促进玉米苗期苗长及根系发育等特性。Bacillus aryabhattaiLAD在培养至72h后，菌体浓度在 OD_600nm＝1.4～1.5时，稀释发酵液对玉米进行浸种24h后培养，在菌体浓度为10²时，水培使玉米地上部分苗长增加107％，最长根增加 197％，主根粗增加22，总根长增加97％，总根表面积增加96％，根体积增加76％；土培使玉米总根长增加48％，总根表面积增加43％，根体积增加46％。

本发明中阿氏芽孢杆菌的获取方法是：在棕壤长期定位试验站采集土壤，称取采集的新鲜土壤样品10g，放入盛有90mL无菌水并带有少量小玻璃珠的摇瓶中，放置在摇床上180r/min振荡培养30min，使土样均匀地分散在稀释液中制成10-1稀释液。吸取1mL 10^-1稀释液于装有9mL无菌水的玻璃试管中，振荡混匀制成10^-2稀释液。依次类推，连续稀释，直至稀释到10^-6。本研究选取10^-3、10^-4、10^-5三个稀释梯度的土壤稀释液，分别吸取0.1mL稀释液在分离用选择性培养基上均匀涂布，直至固体培养基表面变干，每个稀释度设置3次重复。将平板置于30℃恒温培养箱中培养5-7d。待平板上微生物菌落长出后，通过观察菌落的形态特征，挑取少许长势良好且表面湿润、光滑凸起、有粘液的不同细菌的单菌落，划线转接于分离用选择性培养基中，30℃培养5-7d。依此方法连续划线纯化培养3次以上，镜检其纯度，直至获得纯培养，划线于试管斜面，并置于4℃冰箱中保藏备用。

本发明利用固氮及产糖性状分离出阿氏芽孢杆菌Bacillus aryabhattai LAD。提取Bacillus aryabhattai LAD的全基因序列，并通过16S rDNA扩增引物27F(SEQ ID NO：1)和1492R(SEQ ID NO： 2)扩增其16S rDNA序列。通过在NCBI比对发现，该序列与芽孢杆菌属(Bacillus sp.)的16S rDNA序列的同源性最高，为99％，系统发育树结果显示，Bacillusaryabhattai strain在同一分支上，亲缘关系较近，因此可以推断LAD菌为阿氏芽孢杆菌，命名为Bacillus aryabhattai LAD。

本发明的有益效果：

本发明中阿氏芽孢杆菌Bacillus aryabhattai LAD分离自棕壤长期定位试验站玉米种植土壤中，其能在土壤中稳定存在，具有固氮、产糖、解淀粉和产生植物激素等特性，并促进玉米幼苗生长及根系发育，且阿氏芽孢杆菌具有较强的抗逆性，因此，可用于作物生产中，不仅可以帮助化肥减施改善环境，并且对作物增产抗逆提供可行性。

附图说明

图1为本发明是实例提供的LAD菌16S rDNA PCR扩增产物电泳检测结果；其中M为5000bp DNA marker，1，2，3，4为LAD菌株的16S rDNA PCR扩增产物。

图2为本发明是实例提供的基于16S rDNA序列同源性的LAD 系统发育树。

图3为本发明是实例提供的Bacillus aryabhattai LAD的生长曲线。

图4为本发明是实例提供的LAD菌nif H基因PCR扩增产物电泳检测结果；其中M为5000bp DNA marker，1，2道为LAD菌nif H 基因PCR扩增产物。

图5为本发明是实例提供的LAD菌解淀粉阳性反应图像。

图6为本发明是实例提供的LAD菌处理后，水培14d和大田实验60d玉米幼苗根系分析仪测量图。

图7为本发明是实例提供的LAD菌处理后，大田实验60d玉米根系发育情况。

图8为本发明是实例提供的不同处理对土壤水稳定性团聚体的影响效果图。

具体实施方式

以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。

本试验从玉米长期定位试验田中，筛选出一株阿氏芽孢杆菌，探究其促生功能，并探究了其对玉米根系形态发育的影响。因此，筛选具有促生功能阿氏芽孢杆菌为相关研究提供菌种资源。

实施例1固氮阿氏芽孢杆菌的分离及初步鉴定

在棕壤长期定位试验站采集土壤，称取采集的新鲜土壤样品10 g，放入盛有90mL无菌水并带有少量小玻璃珠的摇瓶中，放置在摇床上180r/min振荡培养30min，使土样均匀地分散在稀释液中制成 10^-1稀释液。吸取1mL 10^-1稀释液于装有9mL无菌水的玻璃试管中，振荡混匀制成10^-2稀释液。依次类推，连续稀释，直至稀释到10^-6。本研究选取10^-3、10^-4、10^-5三个稀释梯度的土壤稀释液，分别吸取 0.1mL稀释液在分离用Ashby培养基上均匀涂布，直至固体培养基表面变干，每个稀释度设置3次重复。将平板置于30℃恒温培养箱中培养5-7d。待平板上微生物菌落长出后，通过观察菌落的形态特征，挑取少许长势良好且表面湿润、光滑凸起、有粘液的不同细菌的单菌落，划线转接于分离用选择性培养基中，30℃培养5-7d。依此方法连续划线纯化培养3次以上，镜检其纯度，直至获得纯培养，划线于试管斜面，并置于4℃冰箱中保藏备用。结果表明，从土壤中分离到1株革兰氏染色阳性、接触酶阳性的杆菌，命名为LAD，菌落整齐、表面湿润、有光泽、透明、有粘液等特征。初步鉴定其为芽孢杆菌，于4℃冰箱中保存。

实施例2阿氏芽孢杆菌的分子鉴定

1.总DNA的提取

挑取实施例1中单菌落接入液体牛肉膏培养基中，37℃，180rpm 培养24h，取培养好的菌液利用Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒进行DNA提取。

2.16S rDNA的PCR扩增

以16S rDNA扩增引物27F(SEQ ID NO：1)和1492R(SEQ ID NO：2)为上下游引物，LAD菌总DNA为模板进行PCR扩增。反应体系为：LAD菌总DNA 1.5μL；2×Taq MasterMix 12.5μL；上下游引物(10μmol/L)各0.5μL；无菌水10μL。反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性1min，60℃退火1min，72℃延伸90s，共35个循环；72℃延伸10min。PCR获得的产物于4℃保存备用。

3.PCR产物的电泳检测

称取0.4g琼脂糖粉末，加入40mL 1×TAE缓冲液中，加热至琼脂糖完全溶解后加入2μL DNA染色液Goldview，混合均匀，趁热倒入制胶槽中，并插上梳板，室温静置20min以上，待完全凝固后垂直拔去梳板，将制备好的琼脂糖凝胶放入盛有1×TAE缓冲液的电泳槽中，缓冲液应没过胶面，吸取2μL与上样Buffer混匀的PCR产物加入琼脂糖凝胶的点样孔，在其中一个点样孔中加入DNA分子量标准(DNA marker)，接通电源在5V/cm条件下电泳30min，电泳结束后，取出琼脂糖凝胶，轻轻地置于紫外透射仪上成像，根据DNA 分子量标准(DNAmarker)判断扩增条带的浓度及大小。如图1所示，在1500bp处出现与预期一致的特异性条带，说明16S rDNA扩增成功。

阿氏芽孢杆菌Bacillus aryabhattai LAD的16S rDNA序列如下：

catgcagtcgagcgaactgattagaagcttgcttctatgacgttagcggcggacgggtga gtaacacgtgggcaacctgcctgtaagactgggataacttcgggaaaccgaagctaatac cggataggatcttctccttcatgggagatgattgaaagatggtttcggctatcacttaca gatgggcccgcggtgcattagctagttggtgaggtaacggctcaccaaggcaacgatgca tagccgacctgagagggtgatcggccacactgggactgagacacggcccagactcctacg ggaggcagcagtagggaatcttccgcaatggacgaaagtctgacggagcaacgccgcgtg agtgatgaaggctttcgggtcgtaaaactctgttgttagggaagaacaagtacgagagta actgctcgtaccttgacggtacctaaccagaaagccacggctaactacgtgccagcagcc gcggtaatacgtaggtggcaagcgttatccggaattattgggcgtaaagcgcgcgcaggc ggtttcttaagtctgatgtgaaagcccacggctcaaccgtggagggtcattggaaactgg ggaacttgagtgcagaagagaaaagcggaattccacgtgtagcggtgaaatgcgtagaga tgtggaggaacaccagtggcgaaggcggctttttggtctgtaactgacgctgaggcgcga aagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgagtgc taagtgttagagggtttccgccctttagtgctgcagctaacgcattaagcactccgcctg gggagtacggtcgcaagactgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtgg agcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatcctctgac aactctagagatagagcgttccccttcgggggacagagtgacaggtggtgcatggttgtc gtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttgatctta gttgccagcatttagttgggcactctaaggtgactgccggtgacaaaccggaggaaggtg gggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatggat ggtacaaagggctgcaagaccgcgaggtcaagccaatcccataaaaccattctcagttcg gattgtaggctgcaactcgcctacatgaagctggaatcgctagtaatcgcggatcagcat gccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccacgagagtttgt aacacccgaagtcggtggagtaaccgtaaggagctagccgcctaaggt

4.序列比对及系统发育树构建

将经电泳检测的16S rDNA PCR产物送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，并将测序结果在GenBank中进行比对。结果显示，通过在NCBI比对发现，该序列与芽孢杆菌属(Bacillus sp.)的 16S rDNA序列的同源性最高，为99％，系统发育树结果显示，Bacillus aryabhattai strain在同一分支上，亲缘关系较近，因此可以推断LAD 菌为阿氏芽孢杆菌，命名为Bacillus aryabhattai LAD。

实施例3阿氏芽孢杆菌Bacillus aryabhattai LAD生物学性质测定

1.LAD菌株活化

挑取保存的LAD菌株于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，37℃，180 r/min培养24h，使LAD菌株处于活跃状态。

2.生长曲线测定

将活化后的菌液按2wt％接种量接入50ml牛肉膏蛋白胨培养基中，180r/min，37℃条件下培养。每隔2h测定菌液OD₆₀₀值，直至 OD值趋于稳定，做三组平行，以空白培养基为对照，绘制生长曲线。如图所示，LAD菌株在接种0-4h内处于迟缓期，4h后进入对数期，此阶段菌株生长较快，12h开始生长缓慢，到32h趋于稳定。

3.niLADH固氮基因测定

利用PCR扩增LAD菌Nif H基因，扩增引物 P1(TTATACTACAGGAGCTTCAG)和为上下游引物 P2(ATGACAGACGAAAACATTAG)，LAD菌总DNA为模板进行PCR 扩增。反应体系为：LAD菌总DNA 1.5μL；2×Taq MasterMix 12.5μL；上下游引物(10μmol/L)各0.5μL；无菌水10μL。反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性1min，60℃退火1min，72℃延伸90s，共35个循环；72℃延伸10min。PCR获得的产物于4℃保存备用。如图所示，Nif H扩增产物约为350b p。由此可见，本发明阿氏芽孢杆菌Bacillus aryabhattai LAD含有固氮基因，进而其具有相应特性。

4.解淀粉能力测定

采用淀粉培养基两点接种，在30℃条件下培养48h.，形成菌落后，在平板上滴加入少量碘液，并缓慢旋转培养皿，使碘液均匀铺满至整个平板。立即观察结果，若菌落周围出现透明圈说明淀粉已被水解，则为阳性反应，透明圈的大小能说明菌株水解淀粉能力的大小，也能说明产生胞外淀粉酶活力的高低。如图所示，LAD的菌落周围均出现了透明圈，为阳性反应。

5.促进玉米生长

将活化后的LAD培养72h，测得OD600nm为1.4-1.5，对培养得到的LAD菌悬液用蒸馏水经水以10倍浓度进行梯度稀释，分别得到稀释10、10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶的LAD菌悬液，在人工气候室中，模拟玉米生长条件，分别采用土培和水培方式对玉米进行促生实验。用得到的菌悬液对玉米种子进行水培，以水为空白对照。并将玉米种子分别用不同浓度LAD菌悬液和水浸种24h。取4kg过20目筛网土于盆栽盆中，将浸种后的玉米种子均匀种植在盆栽盆中。每组三个平行，培养14d后观察并记录玉米幼苗生长情况。

水培14d后，玉米生长情况如图所示，玉米幼苗数据如表1和图 6，从图表中可以明显看出，在稀释倍数为10²的条件下，玉米从根长、及苗长生长状况均较为良好，而针对主根粗，我们从数据中可以看出，实验组明显高于对照组，而实验组之间变化并不是特别明显。因此将10²确定为促进玉米幼苗生长发育的最适浓度。

表1水培玉米幼苗14d生长数据

选取稀释至菌体浓度为10²的LAD菌悬液对玉米种子进行浸种处理，常温浸种24h后，分别于实验室水培及大田中播种。培养后利用根系分析仪测定根部发育情况，分别对水培14d和大田实验60d 的玉米幼苗根际进行测定。将水培14d和大田播种60d的玉米幼苗根系处理后，经根系根系分析仪测定，在图中根据根系分析仪获得图像，可以明显看出，实验室内水培及大田实验播种培养后处理组根系均明显较对照组发达，其中图7中获得的玉米幼苗根系图像中，我们可以明显看出，处理组根系丰富度及粗细明显高于对照组。根据表2中，根系分析仪获得的根系数据同样证明以上两点。

表2根系分析仪根系分析数据

6.土壤团聚体：

土壤团聚体湿筛法测定土壤水稳定性大团聚体具体方法为：将 LAD菌株处理和对照组土壤分别转移至孔径为0.25mm的筛子中，慢慢加水使土壤浸润，再将筛子放入水中；保持筛子的上边缘保持高于水面，轻轻地上下移动浸在水中的筛子，保持一致的频率上下移动，直至筛子上的土壤颗粒在水面清晰可见且不再透过筛子。分别收集 >0.25mm和<0.25mm的土壤样品，然后烘干称重，计算各级团聚体的质量百分比(参见图8)。

图8表示供试菌株的不同处理对土壤水稳定性团聚体的影响可知，LAD菌株的不同处理对土壤水稳定性团聚体比例也存在不同的影响。与对照组相比，接含活菌体发酵液和不含菌体发酵液分别提高了1.87倍和1.23倍，差异显著(P<0.05)。

综上所述，本发明LAD菌不单具有某一项促生特性，在固氮，产糖，解淀粉，溶磷等方面均有较好效果，同时其能明显增加玉米根系丰富度。LAD菌株分离自玉米长期定位土壤，重新接种回玉米种植土壤，最大程度降低了对土壤微生态的影响，同时，其具有多种促生特性，代替菌种单一功能的弊端。

序列表

<110> 沈阳农业大学

<120> 促进玉米根系发育的阿氏芽孢杆菌及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1428

<212> DNA

<213> 阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai LAD)

<400> 1

catgcagtcg agcgaactga ttagaagctt gcttctatga cgttagcggc ggacgggtga 60

gtaacacgtg ggcaacctgc ctgtaagact gggataactt cgggaaaccg aagctaatac 120

cggataggat cttctccttc atgggagatg attgaaagat ggtttcggct atcacttaca 180

gatgggcccg cggtgcatta gctagttggt gaggtaacgg ctcaccaagg caacgatgca 240

tagccgacct gagagggtga tcggccacac tgggactgag acacggccca gactcctacg 300

ggaggcagca gtagggaatc ttccgcaatg gacgaaagtc tgacggagca acgccgcgtg 360

agtgatgaag gctttcgggt cgtaaaactc tgttgttagg gaagaacaag tacgagagta 420

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ggtttcttaa gtctgatgtg aaagcccacg gctcaaccgt ggagggtcat tggaaactgg 600

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tgtggaggaa caccagtggc gaaggcggct ttttggtctg taactgacgc tgaggcgcga 720

aagcgtgggg agcaaacagg attagatacc ctggtagtcc acgccgtaaa cgatgagtgc 780

taagtgttag agggtttccg ccctttagtg ctgcagctaa cgcattaagc actccgcctg 840

gggagtacgg tcgcaagact gaaactcaaa ggaattgacg ggggcccgca caagcggtgg 900

agcatgtggt ttaattcgaa gcaacgcgaa gaaccttacc aggtcttgac atcctctgac 960

aactctagag atagagcgtt ccccttcggg ggacagagtg acaggtggtg catggttgtc 1020

gtcagctcgt gtcgtgagat gttgggttaa gtcccgcaac gagcgcaacc cttgatctta 1080

gttgccagca tttagttggg cactctaagg tgactgccgg tgacaaaccg gaggaaggtg 1140

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ggtacaaagg gctgcaagac cgcgaggtca agccaatccc ataaaaccat tctcagttcg 1260

gattgtaggc tgcaactcgc ctacatgaag ctggaatcgc tagtaatcgc ggatcagcat 1320

gccgcggtga atacgttccc gggccttgta cacaccgccc gtcacaccac gagagtttgt 1380

aacacccgaa gtcggtggag taaccgtaag gagctagccg cctaaggt 1428

Claims (8)

1.一种促进玉米根系发育的阿氏芽孢杆菌，其特征在于：菌株为阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)LAD，以保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地点为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC NO 18653，保藏日期为2019年10月10日。

2.一种权利要求1所述阿氏芽孢杆菌在促进玉米根系发育中的应用。

3.一种玉米促生长剂，其特征在于：玉米促生长剂含权利要求1所述阿氏芽孢杆菌LAD。

4.按权利要求3所述的玉米促生长剂，其特征在于，所述阿氏芽孢杆菌LAD为该菌株的培养物、培养浓缩物或培养菌悬液。

5.按权利要求4所述的玉米促生长剂，其特征在于，所述培养液中阿氏芽孢杆菌LAD活菌数不小于10⁵cfu/mL。

6.根据权利要求4所述玉米促生长剂，其特征在于，所述发酵液为将所述菌活化后，将活化后的菌液按2wt％接种量接入50ml牛肉膏蛋白胨培养基中，180r/min，37℃条件下振荡培养24h-72h，即得所述培养液；

所述培养浓缩物为将上述发酵液经过离心分离、阳离子交换树脂D101吸附、75％乙醇解吸附、乙酸乙酯萃取，即可得培养浓缩物。

7.一种权利要求3所述玉米促生长剂的应用，其特征在于，所述促生长剂在促进玉米根系发育中的应用。

8.一种土壤调理剂，其特征在于，土壤调理剂含权利要求1所述阿氏芽孢杆菌LAD。

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