CN115074272A - 一种生物脱硫的阿氏芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

一种生物脱硫的阿氏芽孢杆菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于工业微生物技术领域，涉及一种生物脱硫的阿氏芽孢杆菌及其应用。一种生物脱硫的阿氏芽孢杆菌，其分类命名为阿氏芽孢杆菌(Bacillusaryabhattai)NM1‑A2，于2021年8月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo:23142。本发明所提供的阿氏芽孢杆菌具备高效的硫利用率和生物脱硫的功能，能够通过4S途径将有机硫污染物二苯并噻吩(DBT)脱硫生成2‑羟苯基(2‑HBP)。本发明提供了一种含硫污染物高效去除的微生物技术，为生物脱硫提供了新的方法，该技术生产工艺环保，操作简单，无二次污染，很适合工业化大规模生产。

Description

一种生物脱硫的阿氏芽孢杆菌及其应用
技术领域
本发明属于工业微生物技术领域，涉及一种生物脱硫的阿氏芽孢杆菌及其应用。
背景技术
硫元素作为常见的污染物，在地壳中分布很广，各种矿石燃料比如煤和石油中都含有一定量的硫，随着经济的发展，来自矿物燃烧、含硫矿石冶炼，和硫酸、磷肥生产等经济活动导致了，大气中大量的二氧化硫、三氧化硫及硫酸盐等污染。全世界二氧化硫的人为排放量每年约1.5亿公吨，其中矿物燃料燃烧占70％以上。传统的脱硫工艺一般有成本高，存在二次污染等特点。
在生物地球化学循环中，硫的氧化至关重要，硫氧化通常指元素硫或还原性硫化物被细菌氧化的过程。在中国亚热带北部湾海洋红树林湿地沉积物中天然富含硫还原菌(SRB)和硫氧化菌(SOB)。SRB可能氧化50％以上的海洋沉积物有机物，其中SRB在自然界中的功能通常是硫化氢(H2S)中的硫酸盐中合成硫化物，或在铁存在时沉淀为黑色硫化亚铁。一般认为，硫氧化细菌，如反硝化硫杆菌，在缺氧条件下可以利用硝酸盐作为氧化剂。
DBT作为石油工业中常见且难以去除的有机硫化物，目前在生物脱除有机硫中只有红球菌属(Rhodococcus)通过4S途径进行降解，但关于红球菌的分类学至今未完善和统一，无法完善利用是困扰石油工业的重大问题。
随着生物学和生物技术的发展，研究者希望寻找到可用能够进行生物脱硫的成本低，效率高，无二次污染的微生物脱硫菌，微生物菌种是研究此类问题的核心。因此，筛选脱硫性能优良的菌株成为解决上述问题的有效途径。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供一种生物脱硫的菌株，不仅可以在食品发酵消除污染物质，也可以提高含硫污染物的生物法去除效率，满足生物脱硫的大规模工业化应用。具体内容如下：
一种生物脱硫的阿氏芽孢杆菌，其分类命名为阿氏芽孢杆菌(Bacillusaryabhattai)NM1-A2，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏日期为2021年8月13日，保藏编号为CGMCC No:23142。
所述的阿氏芽孢杆菌在硫源利用方面的应用。所述的硫源包括有硫酸镁、硫粉、硫代硫酸钠、硫化钠和亚硫酸钠等。
所述的阿氏芽孢杆菌在生物脱硫方面的应用。
进一步的，所述在生物脱硫方面的应用，是在消除有机硫污染DBT中的硫基方面的应用。
进一步的，所述在生物脱硫方面的应用，是以所述的阿氏芽孢杆菌作为发酵菌种用于工业生物脱硫方面的应用。
所述的阿氏芽孢杆菌的培养方法，菌株培养pH范围为5.5～8.0，最适pH 为6.0、培养温度为25～50℃，最适温度为37℃、培养盐浓度为0～4％NaCl，最适盐浓度为4％。培养时间16-24小时，在Luria-Bertani肉汤培养基、SOB 肉汤培养基和1622E海洋肉汤培养基上具备良好的生长速率。
进一步的，培养过程中所使用的碳源培养基包括Luria-Bertani肉汤培养基、SOB肉汤培养基和1622E海洋肉汤培养基。
本发明所述菌株已具有高效利用无机硫和有机硫的功能，具备生物脱硫的生物学功能。
该菌株的阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)NM1-A2菌落形态呈乳白色不透明，圆形颗粒状，中间凸起，边缘整齐，表面光滑，湿润，有光泽，生长速度较快。经革兰氏染色反应鉴定，结果显示为革兰氏阳性菌。
菌株NM1-A2在硫酸镁培养基中生长最快，其次是硫粉培养基。该菌株在硫化物、亚硫酸盐和硫代硫酸钠培养基中也可以生长。
阿氏芽孢杆菌NM1-A2能够在最适条件下，利用不同硫源进行生长，同时还可以对含硫化合物DBT进行生物降解。
所述阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)NM1-A2的16S rDNA基因序列特征：其16S rDNA具有如序列表1中所示的核苷酸序列，序列长度为1400 bp。所述NM1-A2根据其形态学特征和16S rDNA基因序列在GenBank中的 BLAST结果，和全基因组序列在NCBI-NR库中的注释结果，鉴定该菌为阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)。
本发明的有益效果：
(1)本发明所提供的阿氏芽孢杆菌具有高效利用无机硫和有机硫的功能，具备生物脱硫的生物学功能，对含硫化合物DBT进行生物降解。
(2)本发明所提供的阿氏芽孢杆菌菌株稳定，生长速度较快，安全，培养条件简单。
(3)本发明所提供的阿氏芽孢杆菌菌株已完成全基因组测序分析，为研究阿氏芽孢杆菌来源的生物脱硫原理奠定基础。
(4)本发明所提供的阿氏芽孢杆菌是首次报道的处理生物脱硫的阿氏芽孢杆菌菌株。
(5)本发明提供的阿氏芽孢杆菌为生物脱硫的工业应用奠定了基础。
(6)利用本发明菌种处理含含硫废水，生产工艺环保，操作简单，无二次污染，很适合工业大规模生产。
附图说明
图1为NM1-A2在固体培养基上的形态。
图2为NM1-A2在扫描电镜的形态。
图3为基于16S rDNA基因序列构建的系统发育进化树。
图4为NM1-A2全基因组测序圈图分析。
图5为盐浓度(NaCl)在0-16％区间的生长情况分析。
图6为NM1-A2在1622E培养基上生长的耐热范围。
图7为NM1-A2在不同pH浓度下的最适生长。
图8为在不同硫源下NM1-A2的生长曲线。
图9为NM1-A2最适培养条件下DBT的紫外—可见光谱。
图10为NM1-A2最适培养条件下DBT的降解情况检测。
图11为NM1-A2最适培养条件下2-HBP的生成情况检测。
图12为NM1-A2基因组中相关4S途径关键基因PCR克隆结果。
图13为DBT降解机制的4S途径的代谢途径说明。
具体实施方式
下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料和试剂，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施案例中的所有材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。同时为本领域技术人员所公知的方法和试剂。
本发明中，下述实施例中采用的培养基为Luria-Bertani肉汤培养基、SOB 培养基和1622E海洋肉汤培养基。
下述实施案例中的Luria-Bertani肉汤培养基溶剂为蒸馏水，溶质及浓度具体如下：10克蛋白胨、5克酵母提取物、5克氯化钠，加水到1升。固体培养基为1升体系当中添加15-20克琼脂粉。
下述实施案例中的SOB培养基溶剂为蒸馏水，溶质及浓度具体如下：0.2 克硝酸钙、1克硫代硫酸钠、0.5克氯化钡、2克磷酸二氢钾、2克碳酸氢钠、1克酵母提取物、1克硫磺粉、加水到1升。固体培养基为1升体系当中添加 15-20克琼脂粉。
下述实施案例中1622E肉汤培养基，购买自：青岛高科技工业园海博生物技术有限公司，溶剂为蒸馏水，溶质及浓度具体如下：蛋白胨5.0克，酵母浸粉1.0克，柠檬铁酸0.1克，氯化钠19.45克，氯化镁5.98克，硫酸钠3.24 克，氯化钙1.8克，氯化钾0.55克，碳酸钠0.16克，溴化钾0.08克，氯化锶 0.034克，硼酸0.022克，硅酸纳0.004克，氟化钠0.0024克，硝酸铵0.0016 克，磷酸二氢钠0.008克，加水到1升。固体培养基为1升体系当中添加15-20 克琼脂粉。
实施例1
菌株NM1-A2的分离和纯化。
菌株NM1-A2是从亚热带区域广西北部湾海洋红树林湿地所采土样中分离得到。具体步骤如下：称取1克土样和50毫升无菌蒸馏水制备成土壤稀释液。在超净工作台中逐级稀释，配成一系列相应梯度的土壤稀释液(100， 10-1，10-2)，然后从每个连续稀释的样品中，用移液枪取100微升到SOB固体培养基的平板上，用涂布器均匀涂抹，每个浓度重复三次。所有培养皿在恒温培养箱中培养3-4天，观察平板上菌落的生长，然后每个菌落进行6个重复的传代纯化，纯化后挑取单菌落，转移到SOB肉汤培养基中，从SOB培养基中取100微升，在LB肉汤培养基中制成种子液保存，单菌落如图1所示。使用扫描电子显微镜，影像如图2所示。
实施例2
菌株NM1-A2形态特征观察
将分离纯化得到菌株于SOB固体培养基中，37℃恒温培养48小时，观察其菌落形态呈乳白色不透明，圆形颗粒状，中间凸起，边缘整齐，表面光滑，湿润，有光泽，生长速度较快，如图1所示。图1为NM1-A2菌落在Luria-Bertani培养基上的生长情况检测。然后经微生物革兰氏染色反应鉴定，结果显示NM1-A2为革兰氏阳性菌。
将分离纯化得到的菌株与SOB液体培养基中，37℃恒温培养48小时， 8000转/分钟离心5分钟，丢弃上清液，收集适量菌体样本做涂片检查，用作扫描电子显微镜。扫描电压设置放大到10千伏，放大倍数设为10,000倍。如图2所示。图2为菌株NM1-A2的扫描电镜图。图2显示该菌体呈杆状，大小为1～6微米。符合杆菌的基本形态。
实施例3
阿氏芽孢杆菌NM1-A2生理生化特征鉴定
1)、制备种子液：挑取活化的单菌落于SOB液体培养基中，30℃，200 转/分钟培养12小时。
2)、不同温度条件培养：使用1622E培养基，分装在不同的瓶子中，在接种后放入不同温度范围(20℃、25℃、30℃、37℃、45℃、50℃)的摇床，转速200转/分钟，在培养12-15小时后，测量其OD600值，结果如图3所示，其中对照组为空白培养基，可以得到NM1-A2可以在25～50℃范围内生长，结果如图3所示。图3横坐标为不同的温度设置，纵坐标为培养后的菌液浓度检测情况，“Control”为对照组。从图3中可知其最适温度为：37℃左右。
3)、不同pH条件培养：以质量体积百分比的2％为接种量，使用1622E 培养基，分别使用HCl和NaOH调整其pH，将pH控制在：2-14范围内，接种后在摇床中进行培养，温度：37℃，转速200转/分钟，12-15小时后观察 OD值，结果如图4所示。图4横坐标为不同的pH设置，纵坐标为培养后的菌液浓度检测情况。从图4可知，NM1-A2可以pH 5.5～8.0生长良好，其最适生长pH为6.0。
4)、不同盐度条件培养：以盐度培养基质量体积百分比的2％为接种量，在1622E培养基中，分别加入不同量的NaCl，控制氯化钠浓度区间为0～16％，摇床设置为温度：37℃，转速200转/分钟，在培养12-15小时，到达对数期后测量其OD值，测量结果如图5所示。图5横坐标为不同的盐浓度设置，纵坐标为培养后的菌液浓度检测情况。“Control”为对照组。从图5中可知， NM1-A2可在0～5％条件下生长，最适生长盐度为：4％。
实施例4
菌株NM1-A2的16S rDNA基因鉴定
使用SOB肉汤培养基培养NM1-A2微生物细胞，然后提取菌株NM1-A2 的总DNA，采用引物27F和1492R进行PCR扩增，扩增得到NM1-A2的16S rDNA序列。采用的序列引物如下：
27F：5’-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’
1492R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’
PCR程序如下：预变性：95℃，5分钟；变性：95℃，45秒；56℃， 45秒；72℃，1分钟，30个循环；延伸：72℃，10分钟；完成并4℃保存。选取合适的PCR产物送往南宁普丰生物信息有限公司及逆行测序，将得到的 16S rDNA基因序列使用NCBI-blast与16S rDNA数据库进行比对，鉴定该菌种为阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)，然后使用MEGA程序绘制系统发育进化树进一步确定亲缘关系，系统进化树如图6所示。图6为菌株NM1-A2 的16SrDNA基因与近缘种的系统发育关系分析。从图6中可知，NM1-A2和阿氏芽孢杆菌(Bacillusaryabhattai)代表性菌株单独成簇，亲缘关系最近。
实施例5
阿氏芽孢杆菌NM1-A2全基因组测序
将上述分离纯化得到菌株送上海派森诺生物科技股份有限公司进行全基因组测序。
NM1-A2经过Illumina测序后的数据情况为：其测得的序列长度大，没有不确定碱基。经过生物信息学分析，基因组序列拼接后序列的总长度为5,257, 678bps，包含4条Contigs，GC百分含量为38.18％。通过Pokka基因结构注释，共预测到蛋白质编码区5265条，非编码RNA 173条，包括核糖体RNA42 条，转运RNA 130条，转运-信使RNA 1条，同时包含了7个重复区域，统计结果如表1所示。
经过基因组功能注释，包括常用数据库GO，KEGG，NR等，NM1-A2 在NR数据库中注释到基因5,233条，在GO数据库中共注释到基因3,499条，在KEGG数据库中共注释到基因2,921条。CAZy分析糖苷水解酶类的基因有 57条，糖基转移酶类的基因有57条，碳水化合物酯酶类的基因有21条，辅助活性酶类基因有13条，不含多糖裂解酶类基因，结果如图7所示。图7为阿氏芽孢杆菌NM1-A2的全基因组圈图分析所示。图7汇总了全基因组学层面有关阿氏芽孢杆菌NM1-A2所有的功能注释。NM1-A2的全基因组序列数据已经释放在NCBI-GenBanK数据库中，登录号分别为CP083269、CP083270、 CP083271和CP083272。
表1全基因组测序结果分析
Figure BDA0003689293480000091
实施例6
NM1-A2硫利用效率检测。
将1克硝酸钾(KNO3)、1克氯化铵(NH4Cl)、2克磷酸二氢钾(KH2PO4)、 2克碳酸氢钠(NaHCO3)、0.8克氯化镁(MgCl2)与5克硫代硫酸钠(Na2S2O3·5H2O)等硫源混合制备培养基。在此培养基条件下接种NM1-A2，在 120小时内连续观察OD600值，结果如图8所示。图8为菌株NM1-A2在不同硫源培养基(硫酸镁、硫粉、硫代硫酸钠、硫化钠、亚硫酸钠)中的生长曲线情况。横坐标为培养时间，纵坐标为OD600吸收检测值，“Control”为对照组。图8结果表明，NM1-A2在硫酸镁培养基中的生长速率最高，其次是在硫粉末培养基中。NM1-A2在硫化物、亚硫酸盐和硫代硫酸钠介质中可以生长，但是生长速率比较低。对照组在单独的含硫化物的情况下不能生长。
实施例7
NM1-A2的DBT去除率。
在Luria-Bertani肉汤培养基中培养NM1-A2，离心后，收集纯细胞。50毫升去离子水中加入2.7毫摩尔DBT，再加入200微升二甲基甲酰胺(DMF)和0.125克NM1-A2纯细胞。在37℃的培养箱中200转/分钟摇匀。之后用分液漏斗分离溶液的油相。用紫外可见分光光度计(日本岛津)在325纳米处观察油相中剩余的DBT，紫外结果如图9所示。图9为利用微生物细胞处理后的剩余DBT的含量检测。横坐标为DBT在不同波长下的吸收峰，其中在 325纳米处吸收峰值最大。横坐标为微生物细胞培养时间，纵坐标为吸收峰值。处理时间越长，吸收峰值越低。图9表明处理时间越长，生物降解DBT的效果越好。
DBT降解效果也如图10所示。图10直方图显示DBT降解的效果。横坐标为微生物细胞培养时间，纵坐标为检测体系中剩余的DBT和总的DBT的比值。剩余的DBT和总的DBT的比值越低，说明降解效果越好。图10表明处理时间越长，体系当中的DBT含量也随之降低得越充分。NM1-A2对脱硫 DBT(2.7毫摩尔)具有较强的生物降解活性，100小时后约有95％的DBT被生物降解。
实施例8
2-HBP的生成检测。
利用DBT作为唯一硫源，12000转/分钟离心5分钟制作2毫升样本。1 毫升的上层清液转移到干净的微量离心管中，使用NaOH将pH调制8.0。将 300微升上清液装入微量滴定板中，加入3微升吉布斯试剂(10毫克2，6 二氯醌-4-氯酰亚胺溶于10毫升乙醇)，30分钟，根据颜色确定2-HBP的含量。结果如图11所示。图11的横坐标表示利用微生物细胞处理时间。纵坐标表示2-HBP的生成含量。图11表明在37℃和pH 8.0时，利用NM1-A2 细胞处理后，不同时间间隔产生2-HBP的含量情况。处理时间越长，2-HBP 的生成量随之越高。
实施例9
4S途径关键基因的PCR检测。
根据NCBI-Genebank 4S途径的基因序列，使用NCBI-primer程序设计引物，提取NM1-A2微生物细胞的全基因组基因PCR扩增，通过琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR结果，结果如图12所示。图12为利用PCR技术克隆的各个4S 途径相关关键基因。检测显示DNA片段图像，从左至右分别为dszA基因(1.45kb)、dszC基因(1.25kb)、dszB基因(2.5kb)等。这些基因通过4S途径参与 DBT的生物脱硫。
PCR结果显示NM1-A2拥有可以将DBT进行生物降解的完整的4S代谢途径，代谢途径如图13所示。图13表明，所有NM1-A2的DszD家族基因均参与了DBT途径的酶催化反应，DszC基因与两个DBT氧化反应并转化为 DBTO(亚砜-DBT)，然后转化为DBTO2(砜-DBT)。此外，在DszA酶作用下， DBTO2中C-S键被裂解，产生HBPS。DszB参与了HBPS向2-HBP和亚硫酸盐的最终转化。所有参与DBT氧化还原为2-HBP的DszD基因均以FMNH2作为还原剂。
由上可知，本发明的阿氏芽孢杆菌NM1-A2可以有效的降低环境中的硫化物含量，可以用其有效治理污水，不产生后续污染，速度快，环保可持续，具有显著经济效益。
最后，应当指出，以上实施例仅是本发明较有代表性的例子。显然，本发明的技术方案并不限于上述实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
序列表
<110> 广西科学院
<120> 一种生物脱硫的阿氏芽孢杆菌及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1400
<212> DNA
<213> 阿氏芽孢杆菌NM1-A2()
<400> 1
tagctcctta cggttactcc accgacttcg ggtgttacaa actctcgtgg tgtgacgggc 60
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gtggaattcc gcttttctct tctgcactca agttccccag tttccaatga ccctccacgg 840
ttgagccgtg ggctttcaca tcagacttaa gaaaccgcct gcgcgcgctt tacgcccaat 900
aattccggat aacgcttgcc acctacgtat taccgcggct gctggcacgt agttagccgt 960
ggctttctgg ttaggtaccg tcaaggtacg agcagttact ctcgtacttg ttcttcccta 1020
acaacagagt tttacgaccc gaaagccttc atcactcacg cggcgttgct ccgtcagact 1080
ttcgtccatt gcggaagatt ccctactgct gcctcccgta ggagtctggg ccgtgtctca 1140
gtcccagtgt ggccgatcac cctctcaggt cggctatgca tcgttgcctt ggtgagccgt 1200
tacctcacca actagctaat gcaccgcggg cccatctgta agtgatagcc gaaaccatct 1260
ttcaatcatc tcccatgaag gagaagatcc tatccggtat tagcttcggt ttcccgaagt 1320
tatcccagtc ttacaggcag gttgcccacg tgttactcac ccgtccgccg ctaacgtcat 1380
agaagcaagc ttctaatcag 1400

Claims (7)

1.一种生物脱硫的阿氏芽孢杆菌，其特征在于，其分类命名为阿氏芽孢杆菌(Bacillusaryabhattai)NM1-A2，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No:23142。
2.权利要求1所述的阿氏芽孢杆菌在硫源利用方面的应用。
3.权利要求1所述的阿氏芽孢杆菌在生物脱硫方面的应用。
4.根据权利要求3所述的阿氏芽孢杆菌在脱硫方面的应用，其特征在于，所述在生物脱硫方面的应用，是以所述的阿氏芽孢杆菌作为发酵菌种用于工业生物脱硫方面的应用。
5.根据权利要求3所述的阿氏芽孢杆菌在生物脱硫方面的应用，其特征在于，所述在生物脱硫方面的应用，是生物降解含硫化合物DBT方面的应用。
6.权利要求1所述的阿氏芽孢杆菌的培养方法，其特征在于，菌株培养pH为5.5～8.0、温度为25～50℃、盐浓度为0～4％NaCl。
7.根据权利要求6所述的阿氏芽孢杆菌的培养方法，其特征在于，培养过程中所使用的碳源培养基包括Luria-Bertani肉汤培养基、SOB肉汤培养基和1622E海洋肉汤培养基。
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