CN115181691B - 一种芽孢杆菌db-q3及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种芽孢杆菌DB‑Q3及其应用，所述芽孢杆菌DB‑Q3于2022年1月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.24379，分类学命名为Bacillus sp.。本发明提供的这种芽孢杆菌DB‑Q3具有对青霉素的高浓度抗性，能以青霉素G钾为唯一碳源生长，高效降解青霉素G钾，降解率达87.5‑100％，有助于青霉素类抗生素的高效降解，为生物工程处理环境中青霉素类污染物提供降解基因资源，在β‑内酰胺酶类抗生素污染环境修复、发酵生产β‑内酰胺酶类抗生素过程中产生的菌渣的绿色生物降解等青霉素类污染物处理中有极强的应用前景。

Description

一种芽孢杆菌DB-Q3及其应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种芽孢杆菌DB-Q3及其应用。
背景技术
芽孢杆菌属为革兰氏染色阳性菌，需氧或兼性厌氧，大多数有动力，无荚膜，通常过氧化氢酶阳性的微生物。其基因组DNA中的G+C％含量为 32～62％。该属细菌的重要特性是能够产生对不利条件具有特殊抵抗力的芽孢。芽孢杆菌属菌株广泛分布于各种自然环境，如土壤和水中。
青霉素G钾是青霉素G的钾盐，由青霉素发酵液经多级萃取后，加入成盐剂，共煮沸蒸馏得到。青霉素G钾是青霉素类药物的其中一种，属于β-内酰胺类药物，其药理作用是干扰细菌细胞壁的合成，青霉素的结构与细胞壁的成分粘肽结构中的D-丙氨酰-D-丙氨酸近似，可与后者竞争转肽酶，阻碍粘肽的形成，造成细胞壁的缺损，使细菌失去细胞壁的渗透屏障，对细菌起到杀灭作用。
青霉素G钾一般利用产黄青霉菌发酵生产，在发酵过程会产生大量的发酵菌渣，其主要成分包括菌丝体、培养基中淀粉和黄豆粉等，菌渣中残留青霉素量达0.2-0.4％。由于菌渣中残留抗生素，对生态环境存在着潜在的危害性，会造成环境中细菌的耐药性，其存放受到严格管控，被禁止用作动物饲料或饲料添加剂以及直接用于农用肥生产等。
目前青霉素菌渣的处理方式主要是高温焚烧，由于菌丝体中主要成分是蛋白，其燃烧值低，且燃烧过程中会产生含氮、硫等有毒危害气体，尾气处理过程也非常复杂。因此，针对菌渣，开发绿色、无害化处理和资源化利用技术是菌渣处理面临的技术难点，而开发青霉素降解菌，有效降解菌渣中的青霉素是菌渣实现绿色处理的关键。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术中青霉素G钾菌渣无害化处理过程困难的问题。
为此，本发明提供了一种芽孢杆菌DB-Q3，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院 3号，保藏编号为CGMCCNo.24379，分类学命名为Bacillus sp.。
对芽孢杆菌DB-Q3进行16S rRNA基因测序，其序列如SEQ ID NO.1 所示。
SEQ ID NO.1：
CTAATACATGCAAGTCGAGCGAATGGATTAAGAGCTTGCTCTTAT GAAGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCATAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATAACATTTT GAACTGCATGGTTCGAAATTGAAAGGCGGCTTCGGCTGTCACTTATGGATGGACCCGCGTCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAA GGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGA CTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGA AGGCTTTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCTAGTTGAATAAGCTGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGC TAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGTGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGGAG ACTTGAGTGCAGAAGAGGAAAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATATGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTTTCTGGT CTGTAACTGACACTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGAG GGTTTCCGCCCTTTAGTGCTGAAGTTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAA CCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGAAAACCCTAGAGATAGGGCTTCTCCTTCGGGAGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGT GTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCATCATTAAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAA ACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACGGTACAAAGAGCTGCAAGACC GCGAGGTGGAGCTAATCTCATAAAACCGTTCTCAGTTCGGATTGTAGG CTGCAACTCGCCTACATGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCAC ACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGGGGTAACCTTTTGGAGCCAGCCGCCTAAGGTGGACAGAA
芽孢杆菌DB-Q3对青霉素G钾的降解效率高，在青霉素的菌渣处理、环境中青霉素的生物降解等青霉素类污染物处理中有很大的应用潜力。
本发明还提供了一种降解青霉素G钾的方法，包括以下步骤：将青霉素G钾加入到不含碳源的培养基中，随后将上述芽孢杆菌DB-Q3接种至培养基中，培养至青霉素G钾被完全降解。
具体的，上述培养基为LB培养基或MM培养基。
具体的，以培养基体积计，上述芽孢杆菌DB-Q3的接种量为每100毫升培养基，接种1毫升芽孢杆菌DB-Q3种子液，所述种子液浓度为108cfu /ml。
具体的，上述芽孢杆菌DB-Q3接种至培养基后，在30-37℃下摇床培养。
与现有技术相比，本发明具有以下优点和有益效果：
本发明提供的这种芽孢杆菌DB-Q3具有对青霉素的高浓度抗性，能以青霉素G钾为唯一碳源生长，高效降解青霉素G钾，其降解率达87.5-100％。该菌有助于环境中青霉素类抗生素的高效降解，亦能为生物工程处理环境中青霉素类污染物提供降解基因资源，在β-内酰胺酶类抗生素污染环境修复、发酵生产β-内酰胺酶类抗生素过程中产生的菌渣的绿色生物降解等青霉素类污染物处理中有极强的应用前景。
以下将结合附图对本发明做进一步详细说明。
附图说明
图1是本发明实施例中2中芽孢杆菌DB-Q3在LB培养基中对青霉素 G钾的降解结果图；a为对照组1，b为实验组1。
图2是本发明实施例2中芽孢杆菌DB-Q3在MM培养基中对青霉素G 钾的降解结果图；a为对照组2，b为实验组2。
图3是本发明提供的芽孢杆菌DB-Q3在MM培养基中生长状况示意图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。尽管已经详细描述了本发明的代表性实施例，但是本发明所属技术领域的普通技术人员将理解，在不脱离本发明范围的情况下可以对本发明进行各种修改和改变。因此，本发明的范围不应局限于实施方案，而应由所附权利要求及其等同物来限定。
下面通过具体实施例对本发明的芽孢杆菌DB-Q3及其应用进行研究。
实施例1：
从黄河三角洲滨海湿地采集土壤样品，称取1g样品于生理盐水中，定容至10mL，震荡混匀后进行10倍生理盐水梯度稀释，每个稀释梯度样品分别取100μL涂布于牛肉膏蛋白胨培养基，28℃倒置培养，挑取不同菌落进行反复划线直至纯化，将纯化后的菌株分别接种至青霉素G钾浓度为50 mg/L、75mg/L、100mg/L、125mg/L、150mg/L和200mg/L的牛肉膏蛋白胨培养基进行抗性筛选。
选取能够在各浓度青霉素G钾抗性平板上生长，具有高青霉素G钾抗性的菌株，提取DNA并进行16S rRNA基因测序，其序列如SEQ ID NO.1 所示。
SEQ ID NO.1：
CTAATACATGCAAGTCGAGCGAATGGATTAAGAGCTTGCTCTTAT GAAGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCATAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATAACATTTTGAACTGCATGGTTCGAAATTGAAAGGCGGCTTCGGCTGTCACTTATGG ATGGACCCGCGTCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGA CTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGA AGGCTTTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCTAGTTGAATAAGCTGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGC TAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATC CGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGTGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGGAG ACTTGAGTGCAGAAGAGGAAAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATATGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTTTCTGGT CTGTAACTGACACTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTA GATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGAGGGTTTCCGCCCTTTAGTGCTGAAGTTAACGCATTAAGCACTCCGCCTG GGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAA CCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGAAAACCCTAGAGATAGGGCTTCTCCTTCGGGAGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGT GTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCATCATTAAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAA ACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACGGTACAAAGAGCTGCAAGACC GCGAGGTGGAGCTAATCTCATAAAACCGTTCTCAGTTCGGATTGTAGG CTGCAACTCGCCTACATGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAG CATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGGGGTAACCTTTTGGAGCCAGCCGCCTAAGGTGGACAGAA
将16S rRNA基因序列在GenBank中比对，分析得出，该菌株与Bacilluswiedmannii FSL W8-0169T的一致度最高，达99％。因此，该菌株是芽孢杆菌属的菌株，将其命名为芽孢杆菌DB-Q3。由于16S rRNA基因序列的保守性，确定其是否新种需要进一步进行基因组分析。
提取芽孢杆菌DB-Q3的基因组DNA，利用Illumina Hiseq平台，测定其全基因组序列，利用Abyss软件拼接全基因组序列，利用OrthoANI软件计算菌株DB-Q3与Bacillus属的近源物种的平均核苷酸一致度(ANI)，得出其与Bacillus wiedmannii FSL W8-0169T的ANI值最高为93.4，低于细菌种的黄金标准94-95％，其为潜在新物种；进一步将菌株DB-Q3的序列与 Bacillus wiedmannii FSL W8-0169T的全基因组序列进行模拟杂交值分析 (DDH)得出，二者间的DDH为54.1％，低于物种分类值70％标准。因此菌株DB-Q3为芽孢杆菌属的一个新物种。
将芽孢杆菌DB-Q3保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.24379，保藏日期为2022年1月27日，分类学命名为 Bacillus sp.。
实施例2：
将芽孢杆菌DB-Q3培养至对数期(OD600＝0.8)后，取100μL作为种子液添加至含2g/L青霉素G钾的200mL LB培养基中，32℃摇床培养，培养24h即达到菌株培养的对数生长期后期(OD600＝1.0)，将培养基样品过滤除菌，培养基上清液作为实验组1进行高效液相色谱测定，分析其降解率，同时以未接种芽孢杆菌DB-Q3的LB培养基作为对照组1进行高效液相色谱测定，结果如图1所示，实验组1中青霉素G钾已被完全降解，其降解率达100％。
将芽孢杆菌DB-Q3培养至对数期(OD600＝0.8)后，取100μL作为种子液添加至以2g/L青霉素G钾作为唯一碳源的MM培养基中，32℃摇床培养，待菌液浓度至OD600＝0.5时，将培养基样品滤除菌后作为实验组2进行高效液相色谱测定，分析其降解率，同时以未接种芽孢杆菌DB-Q3的 MM培养基作为对照组2进行高效液相色谱测定，结果如图2所示，实验组2中青霉素G钾的浓度已降为0.25g/L，计算得出其对青霉素G钾的降解率为87.5％。
由上述实验可知，本发明提供的这种芽孢杆菌DB-Q3具有对青霉素的高浓度抗性，能以青霉素G钾为唯一碳源生长，高效降解青霉素G钾，其降解率达87.5-100％。该菌有助于环境中青霉素类抗生素的高效降解，亦能为生物工程处理环境中青霉素类污染物提供降解基因资源，在β-内酰胺酶类抗生素污染环境修复、发酵生产β-内酰胺酶类抗生素过程中产生的菌渣的绿色生物降解等青霉素类污染物处理中有极强的应用前景。
以上例举仅仅是对本发明的举例说明，并不构成对本发明的保护范围的限制，凡是与本发明相同或相似的设计均属于本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 中国科学院烟台海岸带研究所、烟台大学、石家庄学院、中科海洋微生物产业技术研究院（山东）有限公司
<120> 一种芽孢杆菌DB-Q3及其应用
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1442
<212> DNA
<213> 芽孢杆菌DB-Q3（Bacillus sp.）
<400> 1
ctaatacatg caagtcgagc gaatggatta agagcttgct cttatgaagt tagcggcgga 60
cgggtgagta acacgtgggt aacctgccca taagactggg ataactccgg gaaaccgggg 120
ctaataccgg ataacatttt gaactgcatg gttcgaaatt gaaaggcggc ttcggctgtc 180
acttatggat ggacccgcgt cgcattagct agttggtgag gtaacggctc accaaggcaa 240
cgatgcgtag ccgacctgag agggtgatcg gccacactgg gactgagaca cggcccagac 300
tcctacggga ggcagcagta gggaatcttc cgcaatggac gaaagtctga cggagcaacg 360
ccgcgtgagt gatgaaggct ttcgggtcgt aaaactctgt tgttagggaa gaacaagtgc 420
tagttgaata agctggcacc ttgacggtac ctaaccagaa agccacggct aactacgtgc 480
cagcagccgc ggtaatacgt aggtggcaag cgttatccgg aattattggg cgtaaagcgc 540
gcgcaggtgg tttcttaagt ctgatgtgaa agcccacggc tcaaccgtgg agggtcattg 600
gaaactggga gacttgagtg cagaagagga aagtggaatt ccatgtgtag cggtgaaatg 660
cgtagagata tggaggaaca ccagtggcga aggcgacttt ctggtctgta actgacactg 720
aggcgcgaaa gcgtggggag caaacaggat tagataccct ggtagtccac gccgtaaacg 780
atgagtgcta agtgttagag ggtttccgcc ctttagtgct gaagttaacg cattaagcac 840
tccgcctggg gagtacggcc gcaaggctga aactcaaagg aattgacggg ggcccgcaca 900
agcggtggag catgtggttt aattcgaagc aacgcgaaga accttaccag gtcttgacat 960
cctctgaaaa ccctagagat agggcttctc cttcgggagc agagtgacag gtggtgcatg 1020
gttgtcgtca gctcgtgtcg tgagatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc gcaacccttg 1080
atcttagttg ccatcattaa gttgggcact ctaaggtgac tgccggtgac aaaccggagg 1140
aaggtgggga tgacgtcaaa tcatcatgcc ccttatgacc tgggctacac acgtgctaca 1200
atggacggta caaagagctg caagaccgcg aggtggagct aatctcataa aaccgttctc 1260
agttcggatt gtaggctgca actcgcctac atgaagctgg aatcgctagt aatcgcggat 1320
cagcatgccg cggtgaatac gttcccgggc cttgtacaca ccgcccgtca caccacgaga 1380
gtttgtaaca cccgaagtcg gtggggtaac cttttggagc cagccgccta aggtggacag 1440
aa 1442

Claims (6)

1.一种芽孢杆菌DB-Q3，其特征在于：所述芽孢杆菌DB-Q3保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.24379，分类学命名为Bacillus sp.。
2.如权利要求1所述芽孢杆菌DB-Q3在降解青霉素类污染物中的应用，其特征在于：以青霉素G钾为唯一碳源生长，降解青霉素G钾。
3.一种降解青霉素G钾的方法，其特征在于，包括以下步骤：将青霉素G钾加入到不含碳源的培养基中，随后将如权利要求1所述的芽孢杆菌DB-Q3接种至培养基中，培养至青霉素G钾被完全降解。
4.如权利要求3所述的降解青霉素G钾的方法，其特征在于：所述培养基为LB培养基或MM培养基。
5.如权利要求3所述的降解青霉素G钾的方法，其特征在于：以培养基体积计，所述芽孢杆菌DB-Q3的接种量为每100毫升培养基，接种1毫升芽孢杆菌DB-Q3种子液，所述种子液浓度为108cfu/ml。
6.如权利要求3所述的降解青霉素G钾的方法，其特征在于：所述芽孢杆菌DB-Q3接种至培养基后，在30-37℃下摇床培养。
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