CN111621451A - 一种芽孢杆菌、利用该芽孢杆菌进行抗生素残留检测的方法及其应用 - Google Patents

一种芽孢杆菌、利用该芽孢杆菌进行抗生素残留检测的方法及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN111621451A
CN111621451A CN202010695141.5A CN202010695141A CN111621451A CN 111621451 A CN111621451 A CN 111621451A CN 202010695141 A CN202010695141 A CN 202010695141A CN 111621451 A CN111621451 A CN 111621451A
Authority
CN
China
Prior art keywords
sample
bacillus
gentamicin
kanamycin
streptomycin
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202010695141.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111621451B (zh
Inventor
李劼
王震
冶晓芳
周坤
张小千
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shihezi University
Original Assignee
Shihezi University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shihezi University filed Critical Shihezi University
Publication of CN111621451A publication Critical patent/CN111621451A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111621451B publication Critical patent/CN111621451B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/07—Bacillus
    • C12R2001/10—Bacillus licheniformis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/18—Testing for antimicrobial activity of a material

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明属于抗生素的微生物检测技术领域，尤其涉及一种芽孢杆菌、利用该芽孢杆菌进行抗生素残留检测的方法及其应用。该研究结果为TTC法的推广应用提供了一株方便易得的指示菌。该菌为革兰氏阳性菌，具体为地衣芽孢杆菌，该地衣芽孢杆菌可替代嗜热链球菌进行TTC法试验，取得与嗜热链球菌同样或更为准确的结果。在37℃，乳样中含菌量为0.1mg/mL时，培养0.5h，加TTC溶液继续培养30min后，每10min观察一次结果，至阴性对照变红。

Description

一种芽孢杆菌、利用该芽孢杆菌进行抗生素残留检测的方法 及其应用
技术领域
本发明属于抗生素的微生物检测技术领域，尤其涉及一种芽孢杆菌、利用该芽孢杆菌进行抗生素残留检测的方法及其应用。
背景技术
抗生素是一类由微生物和其他的生物在生命活动过程中合成的代谢产物或其衍生物，其在很低的浓度时就能够抑制或干扰病原菌、病毒等的生命活动，如青霉素、四环素、金霉素、链霉素、氯霉素、磺胺类药物等。在医学上，抗生素被广泛的应用于预防和治疗多种微生物感染性疾病以及某些癌症。在奶业的源头中，抗生素使用频率很高，特别是治疗牛乳房炎，常常大剂量反复使用。据统计，约有十多种抗生素以一种或多种联合的形式采用粉剂、涂擦剂、注射剂，以及乳导管注入等方式加以应用，导致抗生素残留相当严重，在奶牛饲料中，也含有抗生素添加剂。许多抗生素如青霉素、四环素、磺胺类药物及某些氨基糖苷类抗生素等均具有抗原性，能使部分易感人群发生过敏反应。轻者表现为荨麻疹、发热、关节肿痛及蜂窝组织炎等，严重时可出现喉头水肿、呼吸困难、过敏性休克，甚至危及生命；有些抗生素具有一定毒性，长期用药对服用者的肝肾功能具有一定损伤，甚至有致癌、致畸、致突变作用；并且可引起长期摄入者体内耐药菌增加，当有重大疾病需治疗时抗菌药物失效。牛奶中抗生素残留是当前原料奶中不容忽视的问题，控制残留的发生不仅需要对奶源进行有效管理，而且要建立先进的抗生素残留检测方法，从而加强奶源质量管理。
检测牛奶及其制品中抗生素残留有多种方法，如微生物检测法；理化检测法；免疫法等。微生物法是抗生素残留检测最早采用的方法，目前已有多种商品试剂盒，如Delvotest、CharmScien等，以及我国国标嗜热链球菌抑制法(又称TTC法)。
嗜热乳酸链球菌抑制法(TTC法)是GB/T 4789.27-2008中鲜乳中抗生素残留检验第一法，其中以嗜热链球菌作为指示菌，2，3，5-氯化三苯四氮唑(TTC)作为指示剂。其方法原理是：样品经过80℃杀菌后，添加嗜热链球菌液，36±1℃培养2h后，加入TTC溶液，若乳样中不含有抗生素或抗生素的浓度低于检测限，嗜热链球菌将继续增殖，将TTC还原成为红色物质。相反，如果乳样中含有高于检测限的抗生素，则嗜热链球菌受到抑制，因此TTC不被还原，保持原色。关于指示菌量，TTC法的描述是：取一接种环活化的嗜热链球菌液至9mL脱脂灭菌脱脂乳中，培养15h，按1∶1稀释后使用。
由于不同的菌种活力、不同的菌液量等都会对TTC的还原反应产生非常大的影响，因此，对于同一份样品，不同的实验人员或着同一位实验人员在不同时间、不同批次的实验中经常会得出不同的实验结果。比如，当加入菌量过多时，会使抗生素含量低的乳样管变红，出现假阴性结果；当加入菌量过少时，在方法规定观察时间内对照管颜色不发生可见改变，无法判断最终结果，或导致假阳性结果增加。
以上种种原因都极大地限制了TTC法的推广及应用。本领域中也已经有部分研究人员开始着手于对国标TTC法的改进和优化，但是目前为止，依然没有较为精准的、能够较大程度且较全面地使假阴性、假阳性以及实验操作过程、耗时等各方面问题都得以显著改善的实验方案被披露。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种芽孢杆菌、利用该芽孢杆菌进行抗生素残留检测的方法及其应用，该研究结果为TTC法试验的推广应用提供了一株方便易得的指示菌。
本发明是这样实现的，一种芽孢杆菌，其16S rDNA序列见SEQ ID NO:3，保藏编号为CGMCC No.18051，建议的分类命名为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)，已于2019年06月28日保藏至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
一种利用上述的芽孢杆菌进行抗生素残留检测的方法，包括以下步骤：
将待测样品于80℃灭菌10min后，冷却到40℃以下，备用；
取冷却后的待测样品与含权利要求1所述地衣芽孢杆菌的菌液混合得到反应体系，恒温培养；同时以不含抗生素的样品做阴性对照；
培养一定时间后，加入4％TTC指示剂；其中，待测样品与菌液及指示剂三者的体积比为4.5：0.5：0.15；
继续培养，以阴性对照变色时间为参照，对待测样品进行观察：若变为红色，则说明待测样品中不含青霉素钾、庆大霉素、卡那霉素及链霉素或其含量低于检出限，结果为阴性；若无色，则说明待测样品中青霉素钾、庆大霉素、卡那霉素及链霉素含量高于或等于检出限，结果为阳性；
4种抗生素的最低检出限分别为青霉素钾0.004IU/mL、庆大霉素0.4IU/mL、卡那霉素5IU/mL、链霉素0.5IU/mL；
其中，反应体系中芽孢杆菌湿菌体量为0.05mg/mL时：培养温度为37℃-40℃，乳样培养时间为0.5-1.5h；或温度为43℃，乳样培养时间为0.5h；
或，反应体系中芽孢杆菌湿菌体量为0.1mg/mL时：温度为37℃，乳样培养时间为0.5-1.5h；或温度为40℃、43℃，乳样培养时间为0.5h；
或，反应体系中芽孢杆菌湿菌体量为0.15mg/mL时：温度为37℃、40℃，乳样培养时间为0.5h；
或，反应体系中芽孢杆菌湿菌体量为0.2mg/mL时：温度为37℃、40℃，乳样培养时间为0.5h。
进一步地，加入指示剂培养30min后，每10min观察一次，并以阴性对照变色为参照。
如上述的地衣芽孢杆菌在抗生素检测中的应用。
进一步地，所述抗生素包括链霉素、青霉素钾、土霉素、阿莫西林、多西环素、卡那霉素、庆大霉素及替米考星中的至少一种。
如上述的地衣芽孢杆菌在代替嗜热链球菌参照GB/T 4789.27-2008进行抗生素检测中的应用。
进一步地，如上述的应用的方法，包括以下步骤：将待测样品于80℃灭菌10min后，冷却到40℃以下，备用；
取冷却后的待测样品与含权利要求1所述芽孢杆菌的菌液混合得到反应体系，反应体系中菌量为0.1mg/mL，37℃恒温培养；同时以不含抗生素的样品做阴性对照；
培养0.5h后，加入4％TTC指示剂；其中，待测样品与菌液及指示剂三者的体积比为4.5：0.5：0.15；
继续培养30min后观察结果，如阴性对照没有变色，则继续培养，每10min观察一次结果，至阴性对照变红。以阴性对照变色时间为参照，对待测样品进行观察：若变为红色，则说明待测样品中不含青霉素钾、庆大霉素、卡那霉素及链霉素或其含量低于检出限，结果为阴性；若无色，则说明待测样品中青霉素钾、庆大霉素、卡那霉素及链霉素含量高于或等于检出限，结果为阳性；
4种抗生素的最低检出限分别为青霉素钾0.004IU/mL、庆大霉素0.4IU/mL、卡那霉素5IU/mL、链霉素0.5IU/mL。
如上述的检测方法在抗生素检测中的应用。
嗜热链球菌可以从酸乳中分离得到，申请人参考相关文献，选择乳酸菌培养基I、45℃恒温培养，从酸乳中分离得到乳白色疑似嗜热链球菌菌落，用该细菌进行TTC法实验，得到了预期的结果。当时以为该菌就是嗜热链球菌，直到2018年由于科研项目的需要，对此细菌进行了染色镜检、生化及PCR鉴定，才发现是地衣芽孢杆菌。该菌容易从酸乳中分离得到，可以替代嗜热链球菌进行TTC法实验，有利于TTC法在基层的进一步推广应用，从而大大降低基层乳企筛查鲜乳中抗生素残留的费用。
综上所述，本发明的优点及积极效果为：本发明用乳酸菌培养基从酸奶中分离嗜热链球菌时，得到了一株革兰氏阳性大杆菌，而非链球菌；并且用该菌替代嗜热链球菌完成了TTC法试验。并对该革兰氏阳性大杆菌进行了分离纯化培养、PCR鉴定和生化鉴定，比较了2种细菌对TTC法检测结果的影响，为TTC法的应用提供了一株指示菌。
进一步地，嗜热链球菌常成片生长，不易分离，很少有单个菌落。而地衣芽孢杆菌有较多单菌落，后续也可以利用菌落计数法来确定TTC法的细菌量。
本申请中不仅对嗜热链球菌的TTC法进行了优化，同时用地衣芽孢杆菌代替嗜热链球菌对多种抗生素进行检测，能够得出相同的检测结果。
附图说明
图1是是嗜热链球菌的菌落形态；
图2是地衣芽孢杆菌的菌落形态；
图3是未知菌显微镜检测结果；
图4是未知菌PCR电泳图；
图5是未知菌的16S rDNA基因序列的进化树。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明，各实施例及试验例中所用的设备和试剂如无特殊说明，均可从商业途径得到。此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明披露了一种芽孢杆菌、利用该芽孢杆菌进行抗生素残留检测的方法及其应用，具体如下各实施例所示。本发明所用对照菌嗜热链球菌标准菌株(ACCC 10213)，购自中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)；TTC指示剂2，3，5-三苯基氯化四氮唑，购自上海蓝季生物；青霉素、链霉素、庆大霉素、卡那霉素对照品，购于中国兽医药品监察所；其他生化试剂均市售可得。
实施例1菌株的分离筛选及生化鉴定
据报道，嗜热链球菌可使用乳酸菌培养基从酸乳中分离得到，发明人按照常规方法用乳酸菌培养基从酸奶中分离嗜热链球菌时，并未分离出嗜热链球菌，但分离得到了一株未知芽孢杆菌，并进行以下性能鉴定。
嗜热链球菌很少有单个菌落，常成片存在，不易分离，如图1所示；而芽孢杆菌则有较多单个菌落，易分离得到，如图2所示。
1.未知菌的染色、镜检
将未知芽孢杆菌涂片、革兰氏染色、显微镜下观察该菌的形态特征，结果如图3所示。菌株经涂片、染色、镜检，结果为革兰氏阳性，细菌多呈杆状，成对、成链或单个存在，部分已形成芽孢。
2.未知菌的PCR鉴定
菌株培养条件：将未知菌接种到乳酸菌液体培养基中，46℃培养12h以上的菌液。
模板的制备：取1mL上述培养的细菌溶液置于EP管中，12000r离心10min，弃上清，然后用1mL无菌水悬浮沉淀，用手指均匀弹开底部沉淀物。在沸水浴中煮沸10min，在12000rpm离心10min，将上清液收集于PCR管中，并以3μL至5μL作为模板。-20℃保存备用。
16S rDNA引物的合成：由上海生工生物工程有限公司合成。正向引物：5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′，反向引物：5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′,分别见SEQ IDNO:1和SEQ ID NO:2。
PCR反应体系(30μL)：PCR Mix 15μL，ddH2O 10.2μL，正向引物0.9μL，反向引物0.9μL，模板3μL。PCR反应参数：94℃预变性5min，94℃变性40s，54.5℃退火30s，72℃延伸2min，进行35个循环，72℃终延伸10min，4℃保存。取PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。
未知菌序列的测定与比对：将扩增产物送上海生物工程技术有限公司纯化并测序，将未知菌序列提交Genbank数据库，进行同源性比对，序列使用MEGA5.0软件生成系统进化树。
结果如图4所示，未知菌的DNA通过PCR扩增获得具有500bp的靶片段，图4中A为2000super DNA mark，B为未知菌，C为乳酸菌培养基，D为阴性对照。使用NCBI中的BLAST功能比较上述未知细菌16S rDNA序列，见SEQ ID NO:3，对比发现未知菌与登录号MH424451.1、MG753545.1、KJ842640.1、MH373540.1、JX402428.1、EU257697.1、MH373542.1、KU877642.1、KJ842633.1、EU256501.1、KY401428.1的地衣芽孢杆菌的同源性在99.50-100％；从Nucleoticle数据库下载了16S rDNA的系统进化树，其是7种芽孢杆菌的标准菌株，参见图5。可初步判定未知菌可能是地衣芽孢杆菌。
3.未知菌与嗜热链球菌的生化鉴定
参考伯杰氏细菌鉴定手册中的芽孢杆菌和链球菌属的鉴定表，进行以下生化鉴定。
糖发酵试验：向糖发酵培养基中加入5％葡萄糖，麦芽糖和甘露醇，然后将它们分配到带有倒置管的小管中。在121℃下高压灭菌15min，通过无菌操作将S菌和Y菌接种到糖发酵培养基中。同时，做三个平行，并在培养箱中12h后观察结果。当接种的细菌分解培养基中的糖以产生酸时，培养基中的指示剂变成酸性，培养基的颜色变黄并呈阳性。如果液体介质中的倒置管中出现气泡，说明该细菌可产气，则为阳性；反之，则为阴性。
明胶液化试验：将明胶液化培养基置于水浴中并通过加热溶解。校准pH7.1，用纱布过滤，并分装在试管中。在115℃下高压灭菌15min，在将斜面冷却后，将S菌和Y菌分别接种在明胶培养基中于20℃接种5-7天。观察，如果没有凝固，则意味着明胶已经水解，则为阳性的。同时做三个平行。
甲基红(MR)试验：将S菌和Y菌接种于葡萄糖蛋白胨液体培养基中，同时做三个平行在35℃下培养2-3天，向每个8mL培养液中加入8-12滴0.04％甲基红醇溶液，并观察结果。红色为阳性，橙色为弱阳性，黄色为阴性。
V-P试验：将S菌和Y菌分别接种在葡萄糖蛋白胨液体培养基中，同时做三个平行，35℃培养48h后，每2.5mL培养液中加入5％a-萘酚0.6mL，再加入0.2mL KOH溶液，摇匀，观察结果。红色为阳性，不出现红色为阴性。
将未知菌和购买的标准嗜热链球菌进行了6种生化培养鉴定，结果见下表。
表1未知菌与嗜热链球菌的生化鉴定结果
Figure BDA0002590750050000061
注：S菌为嗜热链球菌，Y菌为地衣芽孢杆菌。
分析表1生化鉴定结果与伯杰氏细菌鉴定手册一致，从而确认未知菌为地衣芽孢杆菌。
实施例2地衣芽孢杆菌、嗜热链球菌进行TTC法优化实验
分别将乳酸菌固体培养基上的嗜热链球菌和地衣芽孢杆菌的菌苔用无菌水洗入1.5mL EP管中，以5000r/min的转速离心10min，倾去上清液，称取重量记为m1，连续2次用1mL无菌水将沉淀在管底的细菌洗入小三角瓶，吸净EP管中的液体，再对空的EP管称重记为m2，m1-m2即为菌体湿重。在试管中将菌液分别稀释至浓度为0.5mg/mL、1.0mg/mL、1.50mg/mL、2mg/mL的细菌使用液，备用。
将于石河子大学动物科技学院试验站购回的无抗生鲜牛奶，等量分装到五个三角瓶中，其中一瓶作为阴性对照，不加入抗生素，另外四个按照最低检出限加入4种不同抗生素分别至含青霉素钾0.004IU/mL、庆大霉素0.4IU/mL、卡那霉素5IU/mL、链霉素0.5IU/mL，做为阳性对照。将五份牛奶分别装于试管，每管加入4.5mL并做好标记，放入恒温水浴锅中80℃灭菌10min后从水浴锅中取出，冷却到40℃以下，备用。
将所有的乳样均分成2份，其中一份分别加入0.5mL不同浓度的嗜热链球菌菌液(使得反应体系中的菌量被稀释至如表2-表5的表头中的数值)，另一份分别加入0.5mL不同浓度的地衣芽孢杆菌菌液，置于恒温培养箱，分别在37℃、40℃、43℃、46℃、49℃、52℃下培养，每个温度分别培养0.5h、1h、1.5h、2h后加入4％TTC指示剂0.15mL，避光培养，每10分钟观察一次结果，并记录，同时做平行试验。
结果如下表所示，地衣芽孢杆菌与嗜热链球菌进行TTC法试验，在温度、菌量、培养时间相同的情况下，可得到相同的结果。
表2菌量为0.05mg/mL时，培养温度与时间对TTC法检测影响的结果
Figure BDA0002590750050000071
Figure BDA0002590750050000081
注：表中“+”表示变红，“-”表示不变色；““±”表示可疑。下同。
由表2可知，在菌量为0.05mg/mL时：培养温度为37℃-40℃，乳样培养时间为0.5-1.5h；或温度为43℃，乳样培养时间为0.5h；在这些条件范围内，地衣芽孢杆菌可以很好地检出四种抗生素，尤其是能检出青霉素钾，而优于嗜热链球菌。
表3菌量为0.1mg/mL时，培养温度与时间对TTC法检测影响的结果
Figure BDA0002590750050000082
Figure BDA0002590750050000091
由表3可知，在菌量为0.1mg/mL时：温度为37℃，乳样培养时间为0.5-1.5h；或温度为40℃、43℃，乳样培养时间为0.5h；在这些条件范围内，地衣芽孢杆菌可以很好地检出四种抗生素，尤其是能检出青霉素钾，而优于嗜热链球菌。
表4菌量为0.15mg/mL时，培养温度与时间对TTC法检测影响的结果
Figure BDA0002590750050000092
Figure BDA0002590750050000101
由表4可知，在菌量为0.15mg/mL时：温度为37℃、40℃，乳样培养时间为0.5h；在这些条件范围内，地衣芽孢杆菌可以很好地检出四种抗生素，尤其是能检出青霉素钾，而优于嗜热链球菌。
表5菌量为0.2mg/mL时，培养温度与时间对TTC法检测影响的结果
Figure BDA0002590750050000102
Figure BDA0002590750050000111
由表5可知，在菌量为0.2mg/mL时，结果同表4。
由表2-表5可见，当培养温度为37℃-43℃时，嗜热链球菌阴性对照管变色时间比地衣芽孢杆菌的快10-20min，46℃-52℃时，变色时间基本相同；提示地衣芽孢杆菌在46℃以下生长速度比嗜热链球菌慢，46℃及以上两指示菌生长速度基本相同。同时对数据比较发现，在相同菌量、相同乳样培养时间条件下，温度越高，阴性对照变色所需时间越短；相同菌量相同温度条件下，乳样培养时间越长，阴性对照变色所需时间越短。
本申请从菌量、培养温度、培养时间、结果判定时间几方面对TTC法进行了系统研究，并综合考虑假阴性或假阳性的实验结果误差性，最终筛选出TTC法的精确性较高的检测条件为：样品中菌量为0.05-0.1mg/mL、37℃-40℃培养0.5h，或样品中菌量为0.15mg/mL、37℃培养0.5h，加TTC溶液培养30min后每10min观察一次结果，至阴性对照变红，此时，地衣芽孢杆菌的青霉素乳样管不变色，嗜热链球菌的青霉素钾乳样管为可疑，检验效果非常好。否则，将无法保证检出青霉素钾。
实施例3地衣芽孢杆菌与嗜热链球菌对多种常用抗生素最低检出限的比较
为了解两种指示菌检测抗生素的检出限，申请人参照GB/T 4789.27-2008第二法嗜热脂肪芽孢杆菌抑制法(高通量微生物法)进行了检出限的研究：
方法原理是：在含有pH指示剂(溴甲酚紫)的检测培养基中预先混合检测菌，加入样品并孵育后，若该样品中不含有抗生素或抗生素的浓度低于检测限，细菌芽胞将在培养基中生长并利用糖产酸，pH指示剂的紫色变为黄色。相反，如果样品中含有高于检测限的抗生素，则细菌芽胞不会生长，pH指示剂的颜色保持不变，仍为紫色。
一、材料与方法
试验选择嗜热乳酸链球菌(Streptococcus thermophilus，S.T)、地衣芽孢杆菌(Bacillus Licheniformis，B.L)做检测菌，分别对链霉素、青霉素、土霉素、阿莫西林、多西环素、卡那霉素、庆大霉素、替米考星共8种兽医临床常用抗生素进行了检测。
检测培养基：选择两种菌都能较好生长的乳酸菌培养基I(LBM I)，在1000mL液体培养基中加2％溴甲酚紫乙醇溶液600μL，调pH至7.0，高压灭菌后备用。
1、最适检测菌量筛选
在最适检测培养基中加入各检测菌，使检测培养基中的含菌量为5mg/mL、4mg/mL、3mg/mL、2mg/mL、1mg/mL，备用。
在96孔板，依次加入250μL含有不同菌量的检测培养基加50μL灭菌水，每个处理做4孔。放入46℃恒温培养1h观察结果，之后每15min观察颜色变化，记录各孔颜色变黄时间，从2h-2.5h变色的孔中选出检测菌的最适菌量。
2、检测8种常用抗生素最低检出限
用优化的高通量法检测8种抗生素残留，每孔加250L含最适检测菌的检测培养基、50μL不同浓度抗生素标准液，空白对照加50μL无菌去离子水，每个处理做平行试验。在46℃培养1.5h开始观察结果，并每15min观察一次结果，至空白对照变黄为止，记录试验结果。对以上试验检测出的阳性抗生素进一步筛选最低检出限。
二、结果
1、最适检测菌量筛选结果
结果显示，S.T和B.L在2h-2.5h之间变色的培养基含菌量均为3.0mg/mL，为最适检测菌量。详见表6。
表6不同菌量的检测培养基变色时间
单位：min
Figure BDA0002590750050000121
2、检测8种常用抗生素最低检出限
表7对8种常用抗生素最低检出限
单位：IU
Figure BDA0002590750050000122
Figure BDA0002590750050000131
以上试验结果表明，嗜热链球菌和地衣芽孢杆菌检测8种抗生素最低检出限除多西环素和替米考星略有不同外，其余的都相同。对于青霉素钾、庆大霉素、卡那霉素及链霉素的检出限与国标TTC法中的有所不同。这主要是因为两种实验方法的原理不同，指示菌剂也不同，所使用的菌量相差较大，TTC法中菌量一般为0.05-0.2mg/mL，而高通量微生物法中所用为3mg/mL。高通量微生物法中若菌量较低，则实验时间需要很久，无法满足实验要求。本实施例中仅需证明两种菌在青霉素钾、庆大霉素、卡那霉素及链霉素方面的检出限是一致的即可。
发明人还在其他条件下比较了两株菌的最低检出限，发现二者之间基本没有差异。
于37℃、菌量0.1mg/mL、培养0.5h，加TTC培养30min后，每10min观察一次结果，记录变色时间。详见下表：
表8两种指示菌检测四种抗生素残留最低检出限结果
Figure BDA0002590750050000132
以上四种抗生素的嗜(地)最低检出限分别为：青霉素钾0.004(0.004)IU、卡那霉素5(5)IU、链霉素0.5(0.5)IU、庆大霉素0.4(0.4)IU，两株菌的检出限一致。
综上所述，地衣芽孢杆菌可完全替代嗜热链球菌进行TTC试验，取得与嗜热链球菌同样的结果。该研究结果为TTC法试验的推广应用提供了一株方便易得的指示菌。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 石河子大学
<120> 一种芽孢杆菌、利用该芽孢杆菌进行抗生素残留检测的方法及其应用
<150> 201910658826X
<151> 2019-07-19
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Forward primer)
<400> 1
agagtttgat cmtggctcag 20
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Reverse primer)
<400> 2
tacggttacc ttgttacgac tt 22
<210> 3
<211> 1455
<212> DNA
<213> 16S rDNA(16S rDNA)
<400> 3
cggactgagg cgtgcctata ctgcagtcga gcggaccgac gggagcttgc tcccttaggt 60
cagcggcgga cgggtgagta acacgtgggt aacctgcctg taagactggg ataactccgg 120
gaaaccgggg ctaataccgg atgcttgatt gaaccgcatg gttcaatcat aaaaggtggc 180
ttttagctac cacttacaga tggacccgcg gcgcattagc tagttggtga ggtaacggct 240
caccaaggcg acgatgcgta gccgacctga gagggtgatc ggccacactg ggactgagac 300
acggcccaga ctcctacggg aggcagcagt agggaatctt ccgcaatgga cgaaagtctg 360
acggagcaac gccgcgtgag tgatgaaggt tttcggatcg taaaactctg ttgttaggga 420
agaacaagta ccgttcgaat agggcggcac cttgacggta cctaaccaga aagccacggc 480
taactacgtg ccagcagccg cggtaatacg taggtggcaa gcgttgtccg gaattattgg 540
gcgtaaagcg cgcgcaggcg gtttcttaag tctgatgtga aagcccccgg ctcaaccggg 600
gagggtcatt ggaaactggg gaacttgagt gcagaagagg agagtggaat tccacgtgta 660
gcggtgaaat gcgtagagat gtggaggaac accagtggcg aaggcgactc tctggtctgt 720
aactgacgct gaggcgcgaa agcgtgggga gcgaacagga ttagataccc tggtagtcca 780
cgccgtaaac gatgagtgct aagtgttaga gggtttccgc cctttagtgc tgcagcaaac 840
gcattaagca ctccgcctgg ggagtacggt cgcaagactg aaactcaaag gaattgacgg 900
gggcccgcac aagcggtgga gcatgtggtt taattcgaag caacgcgaag aaccttacca 960
ggtcttgaca tcctctgaca accctagaga tagggcttcc ccttcggggg cagagtgaca 1020
ggtggtgcat ggttgtcgtc agctcgtgtc gtgagatgtt gggttaagtc ccgcaacgag 1080
cgcaaccctt gatcttagtt gccagcattc agttgggcac tctaaggtga ctgccggtga 1140
caaaccggag gaaggtgggg atgacgtcaa atcatcatgc cccttatgac ctgggctaca 1200
cacgtgctac aatgggcaga acaaagggca gcgaagccgc gaggctaagc caatcccaca 1260
aatctgttct cagttcggat cgcagtctgc aactcgactg cgtgaagctg gaatcgctag 1320
taatcgcgga tcagcatgcc gcggtgaata cgttcccggg ccttgtacac accgcccgtc 1380
acaccacgag agtttgtaac acccgaagtc ggtgaggtaa cctttggagc cagccgccga 1440
aggtgacaga gattt 1455

Claims (8)

1.一种芽孢杆菌，其16S rDNA序列见SEQ ID NO:3，保藏编号为CGMCC NO.18051。
2.一种利用权利要求1所述的芽孢杆菌进行抗生素残留检测的方法，其特征在于，包括以下步骤：
将待测样品于80℃灭菌10min后，冷却到40℃以下，备用；
取冷却后的待测样品与含权利要求1所述地衣芽孢杆菌的菌液混合得到反应体系，恒温培养；同时以不含抗生素的样品做阴性对照；
培养一定时间后，加入4％TTC指示剂；其中，待测样品与菌液及指示剂三者的体积比为4.5：0.5：0.15；
继续培养，以阴性对照变色时间为参照，对待测样品进行观察：若变为红色，则说明待测样品中不含青霉素钾、庆大霉素、卡那霉素及链霉素或其含量低于检出限，结果为阴性；若无色，则说明待测样品中青霉素钾、庆大霉素、卡那霉素及链霉素含量高于或等于检出限，结果为阳性；
4种抗生素的最低检出限分别为青霉素钾0.004IU、庆大霉素0.4IU、卡那霉素5IU、链霉素0.5IU；
其中，反应体系中芽孢杆菌湿菌体量为0.05mg/mL时：培养温度为37℃-40℃，乳样培养时间为0.5-1.5h；或温度为43℃，乳样培养时间为0.5h；
或，反应体系中芽孢杆菌湿菌体量为0.1mg/mL时：温度为37℃，乳样培养时间为0.5-1.5h；或温度为40℃、43℃，乳样培养时间为0.5h；
或，反应体系中芽孢杆菌湿菌体量为0.15mg/mL时：温度为37℃、40℃，乳样培养时间为0.5h；
或，反应体系中芽孢杆菌湿菌体量为0.2mg/mL时：温度为37℃、40℃，乳样培养时间为0.5h。
3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于：加入指示剂培养30min后，每10min观察一次，并以阴性对照变色为参照。
4.如权利要求1所述的地衣芽孢杆菌在抗生素检测中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述抗生素包括链霉素、青霉素钾、土霉素、阿莫西林、多西环素、卡那霉素、庆大霉素及替米考星中的至少一种。
6.如权利要求1所述的地衣芽孢杆菌在代替嗜热链球菌参照GB/T 4789.27-2008进行抗生素检测中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：将待测样品于80℃灭菌10min后，冷却到40℃以下，备用；
取冷却后的待测样品与含权利要求1所述芽孢杆菌的菌液混合得到反应体系，反应体系中菌量为0.1mg/mL，37℃恒温培养；同时以不含抗生素的样品做阴性对照；
培养0.5h后，加入4％TTC指示剂；其中，待测样品与菌液及指示剂三者的体积比为4.5：0.5：0.15；
继续培养30min后观察结果，如阴性对照没有变色，则继续培养，每10min观察一次结果，至阴性对照变红。以阴性对照变色时间为参照，对待测样品进行观察：若变为红色，则说明待测样品中不含青霉素钾、庆大霉素、卡那霉素及链霉素或其含量低于检出限，结果为阴性；若无色，则说明待测样品中青霉素钾、庆大霉素、卡那霉素及链霉素含量高于或等于检出限，结果为阳性；
4种抗生素的最低检出限分别为青霉素钾0.004IU/mL、庆大霉素0.4IU/mL、卡那霉素5IU/mL、链霉素0.5IU/mL。
8.如权利要求2或3所述的检测方法在抗生素检测中的应用。
CN202010695141.5A 2019-07-19 2020-07-19 一种芽孢杆菌、利用该芽孢杆菌进行抗生素残留检测的方法及其应用 Active CN111621451B (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910658826X 2019-07-19
CN201910658826.XA CN110241056A (zh) 2019-07-19 2019-07-19 一种芽孢杆菌、利用该芽孢杆菌进行抗生素残留检测的方法及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111621451A true CN111621451A (zh) 2020-09-04
CN111621451B CN111621451B (zh) 2022-04-19

Family

ID=67892981

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910658826.XA Pending CN110241056A (zh) 2019-07-19 2019-07-19 一种芽孢杆菌、利用该芽孢杆菌进行抗生素残留检测的方法及其应用
CN202010695141.5A Active CN111621451B (zh) 2019-07-19 2020-07-19 一种芽孢杆菌、利用该芽孢杆菌进行抗生素残留检测的方法及其应用

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910658826.XA Pending CN110241056A (zh) 2019-07-19 2019-07-19 一种芽孢杆菌、利用该芽孢杆菌进行抗生素残留检测的方法及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (2) CN110241056A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115181691A (zh) * 2022-06-21 2022-10-14 中国科学院烟台海岸带研究所 一种芽孢杆菌db-q3及其应用

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110241056A (zh) * 2019-07-19 2019-09-17 石河子大学 一种芽孢杆菌、利用该芽孢杆菌进行抗生素残留检测的方法及其应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AR018821A1 (es) * 1998-06-25 2001-12-12 Neogen Corp Procedimiento para la determinacion de antibioticos con nucleo beta-lactama en un liquido biologico
WO2005049809A1 (en) * 2003-11-18 2005-06-02 Charm Sciences, Inc. Inhibition assay method and device for detection of antibiotics
CN101724586A (zh) * 2009-10-28 2010-06-09 河南花花牛乳业有限公司 嗜热脂肪芽孢杆菌及抗生素残留检测方法
CN110241056A (zh) * 2019-07-19 2019-09-17 石河子大学 一种芽孢杆菌、利用该芽孢杆菌进行抗生素残留检测的方法及其应用

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103320353B (zh) * 2013-05-22 2015-04-01 福建省农业科学院土壤肥料研究所 一株指示菌株及其应用
CN106434430A (zh) * 2016-09-07 2017-02-22 中山市润泽生物科技有限公司 一种降解抗生素与农药残留的复合微生物菌剂及其制备与应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AR018821A1 (es) * 1998-06-25 2001-12-12 Neogen Corp Procedimiento para la determinacion de antibioticos con nucleo beta-lactama en un liquido biologico
WO2005049809A1 (en) * 2003-11-18 2005-06-02 Charm Sciences, Inc. Inhibition assay method and device for detection of antibiotics
CN101724586A (zh) * 2009-10-28 2010-06-09 河南花花牛乳业有限公司 嗜热脂肪芽孢杆菌及抗生素残留检测方法
CN110241056A (zh) * 2019-07-19 2019-09-17 石河子大学 一种芽孢杆菌、利用该芽孢杆菌进行抗生素残留检测的方法及其应用

Non-Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
宁佳囡等: "抗生素残留受体分析法的研究进展", 《中国兽医学报》 *
寇玲等: "紫外诱变筛选磺胺敏感性菌株及在牛奶磺胺抗生素检测中的应用", 《现代食品科技》 *
李劼等: "TTC法中指示菌量与提高方法准确性初探", 《新疆畜牧业》 *
欧阳子程等: "纸片法筛选抗生素敏感菌株及其敏感性研究", 《食 品安全质量检测学报》 *
沈力等: "乳制品中抗生素残留检测方法", 《畜牧兽医杂志》 *
王 珂等: "提高微生物纸片法检出限的探讨", 《现代畜牧兽医》 *
王珂: "两种微生物抑制法检测抗生素残留优化与改良的研究", 《中国优秀博硕士学位论文全文数据库(硕士)农业科技辑》 *
马群飞等: "食品卫生微生物学检验 鲜乳中抗生素残留检验", 《中华人民共和国国家标准》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115181691A (zh) * 2022-06-21 2022-10-14 中国科学院烟台海岸带研究所 一种芽孢杆菌db-q3及其应用
CN115181691B (zh) * 2022-06-21 2024-04-19 中国科学院烟台海岸带研究所 一种芽孢杆菌db-q3及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN111621451B (zh) 2022-04-19
CN110241056A (zh) 2019-09-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108676757B (zh) 一株链霉菌属菌株及其产星孢菌素的应用
EP2245179B1 (en) Method and medium for detecting the presence or absence of staphylococcus aureus in a test sample
CN111621451B (zh) 一种芽孢杆菌、利用该芽孢杆菌进行抗生素残留检测的方法及其应用
Akbulut et al. Development and application of real-time PCR assays to detect fragments of the Clostridium botulinum types A, B, and E neurotoxin genes for investigation of human foodborne and infant botulism
JPH0355104B2 (zh)
CN112961804B (zh) 一种鼠伤寒沙门菌及其应用
CN102286606A (zh) 克罗诺杆菌肉汤培养基及检测方法
CN112961805B (zh) 一种喹诺酮类药物耐药基因gyrA和parE同时发生突变的鼠伤寒沙门菌及其应用
Kerr et al. Evaluation of the Mast ID and API 50CH systems for identification of Listeria spp
CN114717150B (zh) 一种植物乳杆菌crs33及其应用
CN113621539B (zh) 一株具有呕吐毒素脱毒功能的产酶抑菌型枯草芽孢杆菌的筛选及应用
CN113061550B (zh) 一株乳杆菌新菌株z6及其在食品中的应用
CN111979142B (zh) 一种同时携带耐药基因cfr和lsa(E)的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌及其检测方法
WO2022141939A1 (zh) 含有特异性分子靶标的副溶血性弧菌标准菌株及其检测和应用
CN111020040B (zh) 乳制品中致病菌多重荧光定量pcr检测引物组、试剂盒及其应用
CN109971670B (zh) 粪肠球菌、其培养基及牛奶中抗生素残留的检测方法及应用
CN112877448A (zh) 含有特异性分子靶标的蜡样芽胞杆菌标准菌株及其检测和应用
CN112575100A (zh) 含有特异性分子靶标的银白色葡萄球菌标准参考菌株及其检测和应用
Gupta et al. Identification of Brucella isolated from goats using Pst I site polymorphism at Omp2 gene loci
CN106167771B (zh) 一种巨大芽孢杆菌d122及其菌剂和菌剂制备方法
CN117286080B (zh) 一种改善精子活力的益生菌及应用
CN113913318B (zh) 一种同时携带四个喹诺酮类药物耐药突变位点的鼠伤寒沙门菌及其应用
CN112646906B (zh) 含有特异性分子靶标的致泻大肠埃希氏菌标准参考菌株及其检测和应用
CN115322939B (zh) 一株产脂肪酶的耐盐德巴克葡萄球菌及其应用
CN114196768B (zh) 用于鉴别铜绿假单胞菌血清群的特异性分子靶标及其快速检测方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant