CN112646906B - 含有特异性分子靶标的致泻大肠埃希氏菌标准参考菌株及其检测和应用 - Google Patents

含有特异性分子靶标的致泻大肠埃希氏菌标准参考菌株及其检测和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物工程领域，尤其涉及含有特异性分子靶标的致泻大肠埃希氏菌标准参考菌株及其检测和应用。本发明的致泻大肠埃希氏菌(菌株编号为：PY009‑2、3025B1)，具有标准的大肠埃希氏菌菌体显微形态和生理生化特征，可用于检验大肠埃希氏菌特征和验证显色平板的准确性。菌株携带毒力基因具有典型代表性，且具有特异性分子标记，遗传进化方面有特殊意义，能反映中国地区遗传背景，可作为参考菌株用于科学研究。

Description

含有特异性分子靶标的致泻大肠埃希氏菌标准参考菌株及其 检测和应用
技术领域
本发明涉及生物工程领域，尤其涉及含有特异性分子靶标的致泻大肠埃希氏菌标准参考菌株及其检测和应用。
背景技术
腹泻性疾病是世界范围内的一个重要公共卫生问题，每年因感染性腹泻死亡的人数超过200万，而在发展中国家，每年因腹泻性疾病死亡的人数高达1000万，给全球公共卫生行业造成了巨大经济损失，也给人民的生命健康构成了重要威胁。引起腹泻的各类病原中，致泻大肠埃希氏菌(Diarrhoeagenic Escherichiacoli，DEC)是重要的病原菌之一，广泛存在各类食品中，是我国常见重要的食源性致病菌，可引起不同程度腹泻疾病甚至死亡。根据其毒力和致病特点可分为五类，肠致病性大肠埃希氏菌(EPEC)，肠产毒大肠埃希氏菌(ETEC)，肠侵袭性大肠埃希氏菌(EIEC)，产志贺毒素大肠埃希氏菌(STEC)和肠集聚性大肠埃希氏菌(EAEC)。了解该菌的流行特征及遗传进化是有效防控该菌所致的食源性疾病的基础，而是否使用了合适的标准参考菌株决定了研究结果的可靠性。
2017年6月23日之前，我国食品中致泻大肠埃希氏菌检验主要执行GB/T4789.6—2003《食品卫生微生物学检验致泻大肠埃希氏菌检验》国家标准。致泻大肠埃希氏菌的鉴定主要采用传统血清分型方法。按照WHO1987年公布的O抗原类型，确定血清组和血清型。传统的血清学检测方法操作繁琐，交叉凝集现象普遍，容易产生假阳性结果。这些血清组包括了所有致泻大肠埃希氏菌，无法准确地区分各个致病类型菌株。为与国际接轨，我国新修订了食品中致泻大肠埃希氏菌检测国家标准GB4789.6-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验致泻大肠埃希氏菌检验》，以毒力基因作为不同致泻大肠埃希氏菌致病类型分类鉴定依据，并于2017年6月23日正式实施。新检测标准对各类致病菌株进行了明确区分。然而目前，我国仍缺乏代表性食品分离株作为标准对照菌株，现用标准菌株大部分为国外临床来源的菌株，并不能很好地反映该菌在食品中的传播特征。
此外，目前报道中所采用的保护剂基本用于定性储存大肠埃希氏菌，如薛蕾等人脱脂奶粉10％，海藻糖2％，蔗糖3％，谷氨酸钠1.5％，麦芽糊3％，抗坏血酸钠0.05％，其冻干存活率仅为53.19％。如中国专利CN107190046采用12％海藻糖，0.5％脱脂奶，仅能在-18℃条件下能保证菌含量在一定范围内。又如中国专利CN102140423B采用0.1-10质量份的水溶性糖、0.1～5质量份的脱脂奶粉、0.1-20质量份的明胶、0-10质量份的活性炭作为定量化保存的保护剂，该保护剂并没有提到冻干存活率的高低，且由于保护剂中含有一定浓度的明胶，在常温条件下或在冬天使用时其溶解度受到影响，溶解速度较慢；此外该保护剂中含有活性炭，活性炭不溶于水溶液，冻干后沉在瓶底，且复苏时，散落在平板表面，影响美观以及菌落的自动计数。因此，提供一种可长期保存定量化大肠埃希氏菌的冻干保护剂具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供两株致泻大肠埃希氏菌及其应用，本发明的两株致泻大肠埃希氏菌是中国地区的食品分离菌株，该菌株具有典型的致病性大肠埃希氏菌生理生化特性，携带特异性分子标记，能较好地反映该菌在中国地区的遗传背景。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
提供一株致泻大肠埃希氏菌，是致泻大肠埃希氏菌(DiarrhoeagenicEscherichiacoli)PY009-2，其分类命名为致泻大肠埃希氏菌(DiarrhoeagenicEscherichiacoli)，已于2019年10月27号保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC 60873。
提供一株致泻大肠埃希氏菌，是致泻大肠埃希氏菌(DiarrhoeagenicEscherichiacoli)3025B1，其分类命名为致泻大肠埃希氏菌(DiarrhoeagenicEscherichiacoli)，已于2019年10月27号保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC 60874。
本发明同时提供所述的致泻大肠埃希氏菌在检验大肠埃希氏菌显色平板准确性中的应用。
本发明还提供所述的致泻大肠埃希氏菌在作为致泻大肠埃希氏菌标准参考菌株的应用。
本发明还提供一种大肠埃希氏菌的冻干保护剂，并提供了冻干保护剂的具体实施例。
本发明提供的可长期定量保存大肠埃希氏菌的保护剂作用原理是：其中的多元醇和糖具有很强的亲水性,在冷冻或干燥过程中,可与菌体细胞膜磷脂中的磷酸基团或与菌体蛋白质极性基团形成氢键,保护细胞膜和蛋白质结构与功能的完整性，脱脂奶粉能够包裹在菌细胞外层保护菌体，而谷氨酸钠在冷冻干燥和贮藏过程中，能稳定菌悬液中的pH值并调整到活性物质的最稳定区域。抗坏血酸和L-半胱氨酸盐酸盐作为抗氧化剂，在冷冻干燥过程和长期储存中降低细胞氧化酶的活性，防止冻干品的氧化变质。
本发明的有益效果：
(1)本发明致泻大肠埃希氏菌(菌株编号为：PY009-2、3025B1)，具有标准的大肠埃希氏菌菌体显微形态和生理生化特征，可用于检验大肠埃希氏菌特征和验证显色平板的准确性。菌株携带毒力基因具有典型代表性，且具有特异性分子标记，遗传进化方面具有特殊意义，能反映中国地区遗传背景的菌株，可作为标准参考菌株用于科学研究。
(2)采用本发明所述的冻干保护剂制备的定量化的大肠埃希氏菌，具有以下优点：①成型好，外观漂亮且水溶性好，1-2秒内能够完全溶解。②冻干存活率能达到85％以上。③在2-8℃条件下可以保存至少一年以上，量值不发生变化，能够用于定量化质控菌株的长期保存。
附图说明
图1：致泻大肠埃希氏菌在麦康凯平板MAC上菌落形态图(3025B1)。
图2：致泻大肠埃希氏菌在显色平板上菌落形态图；其中A：3025B1；B：PY009-2。
图3：致泻大肠埃希氏革兰氏染色观察图；其中a：3025B1；b：PY009-2。
图4：致泻大肠埃希氏革兰氏电镜观察图，其中c：3025B1；d：PY009-2。
图5：致泻大肠埃希氏菌株的特有基因片段PCR扩增图。
具体实施方式
为更清楚地表述本发明的技术方案，下面结合具体实施例进一步说明，但不能用于限制本发明，此仅是本发明的部分实施例。
实施例1致泻大肠埃希氏菌菌株的分离、鉴定和培养
采集的食品样品，在无菌条件下将其彻底剪碎，称取样品25g加入到含有225mL营养肉汤，用拍击式均质器均质1min～2min，36℃±1℃培养6h。取10μL,接种于30mL肠道菌增菌肉汤管内,于42℃±1℃培养18h。将增菌液划线接种麦康凯平板MAC和大肠杆菌显色培养基，于36℃±1℃培养18h～24h，观察菌落特征。在MAC琼脂平板上，分解乳糖的典型菌落为砖红色至桃红色，不分解乳糖的菌落为无色或淡粉色；在大肠杆菌显色平板上，呈现圆形、半透明、表面光滑，直径2mm-3mm蓝绿色菌落(图2)。大肠杆菌O157在显色板上呈现紫红色菌落。将目标菌落从显色平板或MAC上转接到LB肉汤中，37℃过夜复苏。在无菌条件下将菌液加入终浓度为30％甘油管中，保存于-80℃冰箱，并进行冻干管保存。纯化后的菌落可进行形态特征、生理生化以及分子生物学等方面鉴定。
共分离得到两株致泻大肠埃希氏菌菌株(编号分别为：PY009-2、3025B1、)，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，地址为中国广州市先烈中路100号省微生物所实验楼八楼。
表1标准菌株基础信息表
Figure BDA0002871713140000041
Figure BDA0002871713140000051
本发明的菌株可培养于TBS和LB培养基中，培养方法如下：菌株在LB液体培养基中37℃培养18-24h，可用于其他研究。
实施例2致泻大肠埃希氏菌菌株的生理生化特征及血清型鉴定
染色镜检：将可疑菌落涂片，进行革兰氏染色，镜检观察形态。所有致泻大肠埃希氏菌为革兰氏阴性，呈短杆状、无芽孢，有鞭毛。
API20E鉴定：从大肠杆菌显色平板上刮取蓝绿色的单个菌落，用生理盐水制备成浊度适当的细胞悬浮液，使用API20E生化鉴定试剂条鉴定，鉴定结果如表2所示。
表2本发明2株致泻大肠埃希氏菌菌株生化鉴定结果
Figure BDA0002871713140000052
实施例3致泻大肠埃希氏菌株标准菌株的毒力因子携带特征
采用多重PCR的方法鉴定菌株携带的毒力基因。引物与扩增方法参考国家标准GB4789.6-2016。所使用的引物由上海生工生物有限公司合成(引物序列见表3)。PCR扩增体系(25μL)包含：2×Ferment PCRmix，12.5μL；0.4μM上下游引物；ddH2O，8.5μL和基因组DNA，2μL。8-10μL的PCR产物上样于2.0％琼脂糖凝胶进行电泳分离(120V，40min)，使用2000bpDNA Marker。
表3致泻大肠埃希氏菌鉴定所用引物序列及扩增片段
Figure BDA0002871713140000053
Figure BDA0002871713140000061
表4致泻大肠埃希氏菌携带毒力基因情况
Figure BDA0002871713140000062
实施例4致泻大肠埃希氏菌标准菌株的药敏特征
致泻大肠埃希氏菌株经营养琼脂平板活化后加入生理盐水稀释至终浓度为1×107cfu/mL涂布于MH平板上，待菌液干了之后将抗生素纸片贴在培养基表面，37℃培养24h。采用游标卡尺测定抑菌圈大小，精确至0.01mm。选用的抗生素如下：氨苄西林(AMP，10μg)、阿莫西林/克拉维酸(AMC，30μg)、头孢他啶(CAZ，30μg)、头孢噻肟(CTX，30μg)、头孢西丁(FOX，30μg)、头孢噻吩(KF，30μg)、环丙沙星(CIP，5μg)、奈定酮酸(NA，30μg)、诺氟沙星(NOR，10μg)、阿米卡星(AK，30μg)、庆大霉素(CN，10μg)、卡那霉素(K，30μg)、链霉素(S，25μg)、氯霉素(C，30μg)、复方新诺明(SXT，25μg)和四环素(TE，30μg)。Escherichia coli ATCC25922作为质控菌株。
表5本发明两株致泻大肠埃希氏菌菌株耐药谱
Figure BDA0002871713140000071
实施例5致泻大肠埃希氏菌标准菌株的多位点序列(MLST)分型分析用试剂盒法提取菌株DNA，采用Escherichia coli MLST数据库(http://mlst.warwick.ac.uk/mlst/dbs/Ecoli)的MLST分型方案，选择7个管家基因adk、fumC、gyrB、icd、mdh、purA、recA，进行PCR扩增。将PCR产物进行双向测序，测序结果使用Chromas及DNAStar软件进行修正后，提交Pasteur在线数据库进行处理，获得各管家基因的等位基因编码，形成各菌株序列型。
表6扩增引物及条件
Figure BDA0002871713140000072
Figure BDA0002871713140000081
表7标准参考菌株MLST分子分型
Figure BDA0002871713140000082
实施例6致泻大肠埃希氏菌标准菌株的特征序列分析
主要根据致泻大肠埃希氏菌的泛基因组分析结果获得菌株特有的非必需基因。共选取了696株代表性大肠埃希氏菌(PY009-2和3025B1)基因组序列来进行泛基因组分析。泛基因组采用原核生物泛基因组自动化分析软件(Pan-GenomicsAnalysisPipeline，PGAP)中的MP方法来分析，通过本地Perl脚本对分析结果进行处理，得到所有菌株的核心基因及非核心基因信息。
两株致泻大肠埃希氏菌(Diarrhoeagenic Escherichiacoli)：
致泻大肠埃希氏菌(Diarrhoeagenic Escherichiacoli)PY009-2，含有如SEQ IDNO:1所示的核苷酸序列；
致泻大肠埃希氏菌(Diarrhoeagenic Escherichiacoli)3025B1，含有如SEQ IDNO:2所示的核苷酸序列；
特有基因在所测菌株及其它大肠埃希氏菌中通过PCR扩增检验其特异性，结果如图5所示。两株菌株携带的特异性基因，序列分别如SEQ ID No:1～SEQ ID No:2所示。
表8菌株的特异性基因
标准菌种 特异性基因序列
PY009-2 SEQ ID No:1
3025B1 SEQ ID No:2
提取致泻大肠埃希氏菌株特有的非核心基因蛋白序列，通过本地Blast分别将其比对回大肠埃希氏菌的蛋白总库及NCBI非冗余蛋白数据库(NR)。去除比对到已知的大肠埃希氏菌蛋白的序列，其余则为各类致泻大肠埃希氏菌菌株特有的基因。各菌株的特异性基因可通过表9中引物进行扩增检验。
表9特异性基因引物设计
Figure BDA0002871713140000091
实施例7菌株冻干保护剂
一种可长期保存的定量大肠埃希氏菌冻干保护剂，含有5质量份的山梨醇，6质量份的脱脂奶粉，2质量份的海藻糖，1质量份的谷氨酸钠和2质量份的抗坏血酸。
实施例8标准菌株定量保存的保质期
在实施例中，菌粉的制备方式如下：将菌种复苏后接入摇瓶中进行培养至对数后期至稳定期前期选取合适的菌量加入到保护剂中，混合均匀后分装至西林瓶中，并取样进行稀释计数，为冻干前含菌量A0。将分装好的西林瓶半加塞转入冻干机中进行预冻，预冻温度为-40℃，时间为3h，开启主干燥，时间20-25h，之后进入解析干燥阶段，时间为6-8h，结束干燥，在真空状态下压塞并移出冻干机，进行自动轧盖，保证样品的完全真空状态，并置于2-8℃低温保存。取冻干后的样品进行稀释计数，计数结果为冻干后含菌量A.冻干存活率为A与A0的百分比。
采用的菌种为PY009-2和3025B1。按照上述制备方法以及计数方法，实施例的冻干保护剂冻存率为95.10％(表10-11)。
表10冻干前后菌落数量比较
Figure BDA0002871713140000101
在2-8℃储存期间，其菌含量的变化如下，以10％脱脂奶粉作为对照。
表11菌量变化情况
Figure BDA0002871713140000102
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 广东省微生物研究所（广东省微生物分析检测中心）
广东环凯生物科技有限公司
<120> 含有特异性分子靶标的致泻大肠埃希氏菌标准参考菌株及其检测和应用
<130> 2020.12.28
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
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<213> 致泻大肠埃希氏菌
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Claims (2)

1.检测特异性分子靶标的引物在制备致泻大肠埃希氏菌检测试剂中的用途，其特征在于，所述特异性分子靶标为：
如SEQ ID NO:1~2所示的任意一种或两种核苷酸序列；
其中，检测SEQ ID NO:1所示的特异性分子靶标的引物用于制备致泻大肠埃希氏菌（Diarrhoeagenic Escherichiacoli）PY009-2，保藏编号为GDMCC 60873的检测试剂；
其中，检测SEQ ID NO:2所示的特异性分子靶标的引物用于制备致泻大肠埃希氏菌（Diarrhoeagenic Escherichiacoli）3025B1，保藏编号为GDMCC 60874的检测试剂。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，
针对检测如SEQ ID NO:1所示的特异性分子靶标的引物包括：如SEQ ID NO:3所示的上游引物和如SEQ ID NO:4所示的下游引物；
针对检测如SEQ ID NO:2所示的特异性分子靶标的引物包括：如SEQ ID NO:5所示的上游引物和如SEQ ID NO:6所示的下游引物。
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