CN112538544B - 具有特异性分子靶标的食源性致病菌标准菌株活菌的检测方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了用于检测食源性致病菌的特异性分子靶标，所述特异性分子靶标的核苷酸序列如SEQ ID NO:1～31所示。本发明还提供了一种食源性致病菌活菌的检测方法，包括以下步骤：步骤1：在待测样品加入PMA染料溶液；步骤2：提取待测样品中的菌体DNA；步骤3：以步骤2中的菌体DNA为模板，进行实时荧光定量PCR检测；步骤4：待反应结束后，将获得的荧光定量PCR扩增的曲线和Ct值与建立的标准曲线计算样品中食源性致病菌活菌的数量。本发明的检测方法具有检测时间短，无须经过传统的培养增菌过程，不受样品中食源性致病菌标准菌株死菌干扰，准确检测并定量样品中食源性致病菌标准菌株的具体含菌数量。

Description

具有特异性分子靶标的食源性致病菌标准菌株活菌的检测方 法及应用

技术领域

本发明属于微生物检测技术领域，具体涉及一种食源性致病菌标准菌株活菌的检测方法及其特异性分子靶标的引物。

背景技术

食源性致病菌是其引起的食物疾病的主要原因。食源性致病菌主要包括：致泻大肠埃希氏菌(DiarrhoeagenicEscherichiacoli)、单核细胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes)、副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、克罗诺杆菌(Cronobacterspp.)、蜡样芽胞杆菌(Bacilluscereus)、沙门氏菌(Salmonella spp.)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersiniaenterocolitica)和空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)。目前对于标准菌株主要来源于国际或国内菌种保藏中心保藏的，遗传学特性得到确认和保证并可追溯，如美国微生物菌株保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)、我国医学微生物菌种中心(CMCC)等。本发明所选的食源性致病菌标准菌株均为污染中国地区食品样品中具有典型生化特征的优势分离株，能够较好地反映食源性致病菌在中国地区食品源分离株的遗传背景。建立针对食源性致病菌标准菌株的活细胞定量检测方法可以实现对标准菌株保藏性能的评估，为标准菌株的生产和应用提供重要保证。

在对实际样品检测中致病菌检测和菌种保藏质量评估方面，目前普遍采用基于传统培养的平板计数法。该方法需要通过梯度稀释、选择性培养基培养等一系列繁琐步骤。目前已开发多种基于特异性核酸序列的快速检测方法如聚合酶链式反应(Polymerase chainreaction,PCR)已被视为检测食品中食源性致病菌的可靠方法，实时荧光定量PCR(qPCR)由于其特异性和灵敏性，可以克服常规生物学方法的这些缺点，并被广泛应用于食源性病原菌快速检测，其扩增的核酸序列基本采用菌株所在属种常见毒力基因进行扩增鉴定。

叠氮溴化丙啶(Propidium monoazide,PMA)是一种对核酸具有高度亲和力的光敏反应染料，其能穿透死细胞和受损细胞的细胞膜，在强光下与DNA形成共价键，从而抑制死细胞中DNA的扩增，而活细胞的DNA未被结合，可在qPCR反应中被扩增和检测，以达到区分死、活菌检测的目的。近年来，利用PMA结合DNA扩增的技术被广泛应用于多种食源性致病菌的活菌检测，被认为是目前最为有效的新型活菌检测技术。

目前，针对样品中菌株活细胞定量仍然普遍采用国标规定的传统培养方法后进行平板计数的方法，该方法结果较为准确，检测时间较长(一周左右)、操作复杂(预增菌、选择性培养、显色培养、生化鉴定)、成本高，且灵敏度较低，特异性较差。目前已开发多种基于特异性核酸序列的快速检测方法如聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)已被视为检测乳或其他食品中食源性致病菌的可靠方法，实时荧光定量PCR(qPCR)由于其特异性和灵敏性，则可以克服常规生物学方法的这些缺点。然而，使用qPCR难以区分活细胞和死细胞，这导致了活细胞数量可能会被高估，存在假阴性和假阳性的问题。

此外，平板培养法和常规引物的核酸扩增方法缺乏对食源性标准菌株的特异性识别能力，在对标准菌株保藏性能评估难以实现菌株水平上的鉴定。因此，利用食源性致病菌标准菌株的菌株特异性基因序列的活细胞定量检测方法的建立对于食源性病原菌菌株来源的快速确证和菌种保藏质量的高效评估具有重要意义。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了一种食源性致病菌活菌的检测方法，该方法专门针对保藏编号分别如表1所示的菌株设计的活菌检测方法，由于这些菌株分别具有一段特异性的分子靶标，可通过特异性的引物进行检测。因此，本发明是通过将PMA-qPCR检测方法与上述各菌株的特异性分子靶标的引物结合用于检测上述各个菌株的活细胞数量。

本发明通过以下技术方案实现：

本发明提供了用于检测食源性致病菌的特异性分子靶标，其核苷酸序列如SEQ IDNO:1～31所示。

优选地，所述特异性分子靶标使用核酸序列如SEQ ID NO：32～93所示的引物分别检测。

优选地，所述食源性致病菌包括单增李斯特菌、副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、蜡样芽孢杆菌、克罗诺杆菌、致泻大肠埃希氏菌、沙门氏菌和空肠弯曲杆菌。

本发明还提供了一种食源性致病菌活菌的检测方法，包括以下步骤：

步骤1：在待测样品加入PMA染料溶液；

步骤2：提取待测样品中的菌体DNA；

步骤3：以步骤2中的菌体DNA为模板，进行实时荧光定量PCR检测；

步骤4：待反应结束后，将获得的荧光定量PCR扩增的曲线和Ct值与建立的标准曲线计算样品中食源性致病菌活菌的数量；

其中，所述步骤3中进行实时荧光定量PCR检测所使用的引物包括如SEQ ID NO：32～93所示的核酸序列。

优选地，所述步骤2中实时荧光定量PCR检测扩增的目的片段的核苷酸序列如SEQID NO：1～31所示。

优选地，所述针对如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列扩增的PCR引物包括：如SEQID NO:32所示的上游引物和如SEQ ID NO:33所示的下游引物；针对如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列扩增的PCR引物包括：如SEQ ID NO:34所示的上游引物和如SEQ ID NO:35所示的下游引物；针对如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列扩增的PCR引物包括如SEQ ID NO:36所示的上游引物和如SEQ ID NO:37所示的下游引物；针对如SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列扩增的PCR引物包括如SEQ ID NO:38所示的上游引物和如SEQ ID NO:39所示的下游引物；针对如SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列扩增的PCR引物包括如SEQ ID NO:40所示的上游引物和如SEQ ID NO:41所示的下游引物；针对如SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列扩增的PCR引物包括如SEQ ID NO:42所示的上游引物和如SEQ ID NO:43所示的下游引物；针对如SEQ IDNO:7所示的核苷酸序列扩增的PCR引物包括如SEQ ID NO:44所示的上游引物和如SEQ IDNO:45所示的下游引物；针对如SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列扩增的PCR引物包括如SEQID NO:46所示的上游引物和如SEQ ID NO:47所示的下游引物；针对如SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列扩增的PCR引物包括如SEQ ID NO:48所示的上游引物和如SEQ ID NO:49所示的下游引物；针对如SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列扩增的PCR引物包括如SEQ ID NO:50所示的上游引物和如SEQ ID NO:51所示的下游引物；针对如SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列扩增的PCR引物包括如SEQ ID NO:52所示的上游引物和如SEQ ID NO:53所示的下游引物；优选地，所述针对如SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列扩增的PCR引物包括：如SEQ ID NO:54所示的上游引物和如SEQ ID NO:55所示的下游引物；针对如SEQ ID NO:13所示的核苷酸序列扩增的PCR引物包括：如SEQ ID NO:56所示的上游引物和如SEQ ID NO:57所示的下游引物；针对如SEQ ID NO:14所示的核苷酸序列扩增的PCR引物包括如SEQ ID NO:58所示的上游引物和如SEQ ID NO:59所示的下游引物；针对如SEQ ID NO:15所示的核苷酸序列扩增的PCR引物包括如SEQ ID NO:60所示的上游引物和如SEQ ID NO:61所示的下游引物；针对如SEQ ID NO:16所示的核苷酸序列扩增的PCR引物包括如SEQ ID NO:62所示的上游引物和如SEQ ID NO:63所示的下游引物；针对如SEQ ID NO:17所示的核苷酸序列扩增的PCR引物包括如SEQ ID NO:64所示的上游引物和如SEQ ID NO:65所示的下游引物；针对如SEQ ID NO:18所示的核苷酸序列扩增的PCR引物包括如SEQ ID NO:66所示的上游引物和如SEQ ID NO:67所示的下游引物；针对如SEQ ID NO:19所示的核苷酸序列扩增的PCR引物包括如SEQ IDNO:68所示的上游引物和如SEQ ID NO:69所示的下游引物；针对如SEQ ID NO:20所示的核苷酸序列扩增的PCR引物包括如SEQ ID NO:70所示的上游引物和如SEQ ID NO:71所示的下游引物；针对如SEQ ID NO:21所示的核苷酸序列扩增的PCR引物包括如SEQ ID NO:72所示的上游引物和如SEQ ID NO:73所示的下游引物；针对如SEQ ID NO:22所示的核苷酸序列扩增的PCR引物包括如SEQ ID NO:74所示的上游引物和如SEQ ID NO:75所示的下游引物；所述针对如SEQ ID NO:23所示的核苷酸序列扩增的PCR引物包括：如SEQ ID NO:76所示的上游引物和如SEQ ID NO:77所示的下游引物；针对如SEQ ID NO:24所示的核苷酸序列扩增的PCR引物包括：如SEQ ID NO:78所示的上游引物和如SEQ ID NO:79所示的下游引物；针对如SEQ ID NO:25所示的核苷酸序列扩增的PCR引物包括如SEQ ID NO:80所示的上游引物和如SEQ ID NO:81所示的下游引物；针对如SEQ ID NO:26所示的核苷酸序列扩增的PCR引物包括如SEQ ID NO:82所示的上游引物和如SEQ ID NO:83所示的下游引物；针对如SEQ ID NO:27所示的核苷酸序列扩增的PCR引物包括如SEQ ID NO:84所示的上游引物和如SEQ ID NO:85所示的下游引物；针对如SEQ ID NO:28所示的核苷酸序列扩增的PCR引物包括如SEQ IDNO:86所示的上游引物和如SEQ ID NO:87所示的下游引物；针对如SEQ ID NO:29所示的核苷酸序列扩增的PCR引物包括如SEQ ID NO:88所示的上游引物和如SEQ ID NO:89所示的下游引物；针对如SEQ ID NO:30所示的核苷酸序列扩增的PCR引物包括如SEQ ID NO:90所示的上游引物和如SEQ ID NO:91所示的下游引物；针对如SEQ ID NO:31所示的核苷酸序列扩增的PCR引物包括如SEQ ID NO:92所示的上游引物和如SEQ ID NO:93所示的下游引物。

优选地，所述食源性致病菌包括以下菌种中的至少一种：单增李斯特菌、副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、蜡样芽孢杆菌、克罗诺杆菌、致泻大肠埃希氏菌、沙门氏菌、空肠弯曲杆菌。

优选地，所述步骤1所述待测样品中的食源性致病菌菌体浓度控制在1×10⁴～1×10⁶cfu/mL范围内。

优选地，所述步骤1具体操作如下：在待测样品中加入PMA溶液，将其置于37℃恒温培养箱中避光培养5min，用500W钨丝灯照射10min。该步骤的目的是为了使死菌或细胞膜破损的菌的DNA与PMA交联，使其不能进行PCR扩增。

优选地，所述PMA终浓度为2～16mg/mL。更优选地，所述PMA终浓度为16mg/mL。本发明通过优化最终得出在该浓度条件下能最同时抑制上述食源性致病死菌的DNA。

优选地，所述步骤2提取菌体DNA采用磁珠法提取菌悬液中的DNA。

优选地，所述步骤3中实时荧光定量PCR的反应体系为：2×qPCR反应缓冲液10μL，5μM上游引物0.4μL，5μM下游引物0.4μL，DNA模板2μL，灭菌双蒸水7.2μL，总体积20μL。

优选地，所述步骤3中实时荧光定量PCR的反应程序为：(1)预变性：95℃，30s，20℃/s，1Cycle；(2)PCR扩增反应：95℃，5s，20℃/s，60℃，5s，20℃/s，40Cycles；(3)溶解曲线分析：95℃，0s，20℃/s，65℃，15s，20℃/s，95℃，0s，0.1℃/s。

本发明的有益效果为：本发明公开了用于识别食源性致病菌所携带的40个特异性基因靶点及相关PMA-qPCR定量检测方法；与现有技术相比，本发明的检测方法具有检测时间短，无须经过传统的培养增菌过程，不受样品中食源性致病菌标准菌株死菌干扰，准确检测并定量样品中食源性致病菌标准菌株的具体含菌数量，有效避免假阳性结果。并且选取的分子靶标为各个食源性标准菌株的独有核酸序列，检测结果特异性强，与其它近缘、同缘菌株无交叉反应，结果判定简单，检测结果与传统平板计数方法基本一致。

附图说明

图1为PMA抑制死菌DNA扩增效果评价qPCR结果及不同浓度PMA处理标准菌株电泳图：(1)2-16分别为浓度2-16μg/mLPMA处理后跑胶结果，M为2000Maker，(2)PMA处理和未处理的含有死菌和含有活菌样品qPCR结果图；

图2为PMA处理和未处理的含有不同浓度梯度食源性致病菌样品的PCR电泳结果图；

图3为PMA处理方法对各食源性致病菌死菌抑制效果；

图4为食源性大肠杆菌活细胞检测标准曲线；

图5为食源性沙门氏菌活细胞检测标准曲线；

图6为食源性克罗诺杆菌活细胞检测标准曲线；

图7为食源性副溶血性弧菌活细胞检测标准曲线；

图8为食源性单增李斯特菌活细胞检测标准曲线；

图9为食源性蜡样芽胞杆菌活细胞检测标准曲线；

图10为食源性小肠结肠炎耶尔森氏菌活细胞检测标准曲线；

图11为食源性空肠弯曲菌活细胞检测标准曲线；

图12为食源性金黄色葡萄球菌活细胞检测标准曲线。

具体实施方式

为了更加简洁明了的展示本发明的技术方案、目的和优点，下面结合具体实施例和附图详细说明本发明的技术方案。

实施例1

一、PMA-qPCR检测方法的建立：

1、检测引物的设计

通过比较基因组学分析，进行同源比对分析，获得以下食源性致病菌的特异性分子靶标，然后针对这些特异性分子靶标设计引物(引物由上海生物工程技术服务有限公司合成)，以便进行PCR扩增，具体信息如表1所示：

表1：各个食源性致病菌的特异性分子靶标及其引物

二、PMA-qPCR检测体系构建：

步骤1：在待测样品加入PMA染料溶液，具体操作如下；

取1mL样品于EP管中，在10000r/min条件下离心5min弃上清液，向沉淀中加入1mL去离子水复溶，加入终浓度为16mg/mL的PMA后采用震荡混合仪涡旋至沉淀悬浮且分散均匀，将其以铝箔纸包裹置于37℃恒温培养箱中避光培养5min，避光培养完成后，用500W钨丝灯照射10min使PMA与DNA充分交联，10000r/min离心5min得到沉淀，用1mL去离子水复溶，再次离心，洗涤3次去除体系中多余的PMA。

步骤2：提取待测样品中的菌体DNA，具体操作如下；

采用磁珠法提取菌悬液NDA，将取处理后的菌悬液10000r/min下离心，尽可能除尽上清液，于沉淀中加入包含溶菌酶的180μL TE buffer，涡旋震荡使体系充分混合，37℃水浴(革兰氏阳性菌60min，革兰氏阴性菌30min)。加入500μL裂解液和20μL蛋白酶K，剧烈震荡15s以充分混匀，56℃温浴20min，离心管加入15μL磁珠并颠倒混匀，通过磁性分离架吸附磁珠去除上清加入500μL去蛋白漂洗液，再次反复颠倒离心管数次确保磁珠完全分散，再次使用磁性分离架吸附磁珠加入800μL洗涤液清洗，磁性分离后开盖干燥5min，最终加入100μL洗脱液在70℃下水浴5分钟，获得目标DNA溶液。

步骤3：以步骤2中的菌体DNA为模板，进行实时荧光定量PCR检测，具体操作如下；

根据上述表1针对各个特异性引物设计的引物和荧光染料嵌入法(q-PCR)对各个食源性致病菌的特异性核酸序列进行定量检测，扩增参数具体为：

qPCR反应体系为：

qPCR反应程序为:

(1)预变性

95℃ 30s 20℃/s

1Cycle；

(2)PCR反应

95℃ 5s 20℃/s

60℃ 5s 20℃/s

40Cycles；

(3)溶解曲线分析

95℃ 0s 20℃/s

65℃ 15s 20℃/s

95℃ 0s 0.1℃/s。

步骤4：待上述反应结束后，将获得的荧光定量PCR扩增的曲线和Ct值与建立的标准曲线计算样品中食源性致病菌活菌的数量；具体操作如下：

各个食源性致病菌标准曲线的建立：取各个表1中的各个菌的高浓度活菌悬液首先按10倍梯度连续稀释8次，通过平板计数法确定菌液浓度，将菌液取出三份，每份1ml，照上述步骤提取DNA。按照q-PCR步骤进行扩增，获得荧光曲线图和有效的Ct值(Ct＜35)，并根据origin计算得到标准曲线如图4～12所示：

(1)致泻大肠埃希氏菌活细胞检测标准曲线如图4所示：

菌株PY002的R2为0.97924，检测极限为10²cfu/mL；菌株2968A1的R2为0.99747，检测极限为10²cfu/mL；菌株3164A1的R2为0.97441，检测极限为10³cfu/mL；菌株3466A3的R2为0.98487，检测极限为10²cfu/mL；菌株3025B1的R2为0.98813，检测极限为10²cfu/mL；菌株3776A3-1的R2为0.99487，检测极限为10²cfu/mL。

(2)致泻沙门氏菌活细胞检测标准曲线如图5：

菌株FSCC(I)215032的R2为0.98151，检测极限为10²cfu/mL；菌株FSCC(I)21501206的R2为0.9767，检测极限为10²cfu/mL；菌株FSCC(I)215467的R2为0.99947，检测极限为10²cfu/mL；菌株FSCC(I)215456的R2为0.98519，检测极限为10²cfu/mL；菌株FSCC(I)215032的R2为0.99634，检测极限为10²cfu/mL。

(3)克罗诺杆菌标准菌株活细胞检测标准曲线如图6：

菌株cro359W的R2为0.9964，极限为10²cfu/mL；菌株cro509C1的R2为0.99483，检测极限为10³cfu/mL；菌株cro611A3的R2为0.98703，检测极限为10²cfu/mL；菌株cro910B3的R2为0.997，检测极限为10⁴cfu/mL；菌株cro1537W的R2为0.99424，检测极限为10³cfu/mL。

(3)副溶血性弧菌活细胞检测标准曲线如图7：

菌株VP2227C2的R2为0.99359，检测极限为10³cfu/mL；菌株VPS179C3的R2为0.98814，检测极限为10³cfu/mL；菌株3630A3的R2为0.96913，检测极限为10²cfu/mL。

(5)单增李斯特菌活细胞检测标准曲线如图8：

菌株428-1LM的R2为0.99454，检测极限为10³cfu/mL；菌株615-1LM的R2为0.9695，检测极限为10²cfu/mL；标准菌株678-1LM的R2为0.98931，检测极限为10⁴cfu/mL；菌株833-1LM的R2为0.99363，检测极限为10³cfu/mL；菌株1382-1LM的R2为0.95412，检测极限为10³cfu/mL。

(6)蜡样芽胞杆菌标准菌株活细胞检测标准曲线如图9：

菌株260-1B的R2为0.97443，检测极限为10³cfu/mL；菌株Y1712的R2为0.98046，检测极限为10³cfu/mL；菌株1761-2A的R2为0.99759，检测极限为10³cfu/mL；菌株2801的R2为0.99613，检测极限为10²cfu/mL；

菌株2841-1B的R2为0.99367，检测极限为10³cfu/mL。

(7)小肠结肠炎耶尔森氏菌活细胞检测标准曲线如图10：

菌株c009的R2为0.99942，检测极限为10²cfu/mL；菌株y802的R2为0.99615，检测极限为10²cfu/mL；菌株c1702的R2为0.9906，检测极限为10¹cfu/mL。

(8)空肠弯曲菌活细胞检测标准曲线如图11：

菌株GDMCC 60857的R2为0.96844，检测极限为10⁴cfu/mL；菌株GDMCC60858的R2为0.96895，检测极限为10⁵cfu/mL。

(9)金黄色葡萄球菌活细胞检测标准曲线如图12：

菌株Sta144-2的R2为0.96381，检测极限为10²cfu/mL；菌株Sta403的R2为0.99793，检测极限为10²cfu/mL；菌株Sta177-0的R2为0.99796，检测极限为10⁵cfu/mL；菌株Sta1942-0的R2为0.99473，检测极限为10⁵cfu/mL；菌株Sta370B3的R2为0.99942，检测极限为10³cfu/mL；菌株Sta4127的R2为0.983，检测极限为10⁴cfu/mL。

实施例2PMA-qPCR检测体系PMA条件优化

1、死菌未进行PMA处理的对比试验

以沙门氏菌FSCC(I)215467为例，取10⁶cfu/mL数量级菌液4mL分成4份，2份通过加热制备为死菌样品。取一份活菌样品和死菌样品采用PMA处理：离心去上清液，加入1mL去离子水复溶，再加入1mg/mL的PMA溶液10μL，漩涡震荡10s，盖上铝箔纸摇床室温避光孵育5min，采用500W钨丝灯照射10分钟，使PMA与死菌DNA充分交联。10000r/min条件下离心5分钟，去上清，再次用去1mL离子水复溶，漩涡震荡10s，再次离心，重复以上步骤3次，彻底去除未结合的PMA成分。4份样品按照提取DNA流程获得其DNA溶液，分别标记为Killed-PMA(死菌未经PMA处理)，Lived-PMA(活菌未经PMA处理)，Lived+PMA(活菌PMA处理)，Killed+PMA(死菌PMA处理)，进行qPCR扩增检测。结果如图1(1)所示，Lived-PMA和Killed-PMA的Ct值最小且数值接近，其次是Lived+PMA，Killed+PMA的Ct值最小，说明PMA处理在具有显著抑制死菌扩增的效果。

2、PMA终浓度对死菌DNA扩增的影响

取10⁶cfu/mL数量级沙门氏菌FSCC(I)215467菌液8mL经过加热制成死菌悬浮液后涡旋等分封装至8个1mL离心管，在10000r/min条件下离心5min，用去离子水复溶至1mL，并分别使得PMA终浓度为2、4、6、8、10、12、14、16μg/mL，并通过其特异性引物的PCR扩增，电泳跑胶观察PCR产物，如图1(2)，跑胶条带荧光强度随着PMA量的增加呈现递减趋势，至16μg/mL时可以完全抑制死菌DNA的核酸扩增。

3、菌体浓度对PMA处理结果的影响

以沙门氏菌株FSCC(I)215032,FSCC(I)21501206,FSCC(I)215467为考察对象，通过梯度稀释分别制备含有不同浓度标准菌株含量(10¹-10⁸cfu/mL)的样品。经过PMA处理和未处理的样品电泳跑胶结果如图3所示，在相同浓度条件下，经过PMA处理的样品条带荧光强度明显弱于左侧未经PMA处理样品，对FSCC(I)215032的检测灵敏度从10⁵降至10⁶cfu/mL,对FSCC(I)21501206的检测灵敏度从10³降至10⁵cfu/mL,对FSCC(I)215467的检测灵敏度从10⁶降至10⁷cfu/mL。说明在处理实际样品中PMA-PCR法可以有效去除常见的浓度梯度中死菌DNA的干扰，减少假阳性结果。

4、PMA-PCR方法对各食源性致病菌抑制数量

PMA加入量过多会造成试剂的浪费和假阴性结果，加入量过少可能不能完全抑制死菌浓度。制备各个食源性致病菌常见浓度的死菌悬浮液检测PMA-PCR方法抑制各株死菌浓度最高极限，检测结果如图4所示。16μg/mLPMA浓度可以有效抑制各个标准菌株的最高浓度为：副溶血性弧菌(10⁶cfu/mL)、致泻大肠埃希氏菌(10⁶cfu/mL)、单增李斯特菌(10⁶cfu/mL)、金黄色葡萄球菌(10⁵cfu/mL)、克罗诺杆菌(10⁵cfu/mL)、蜡样芽胞杆菌(10⁴cfu/mL)、沙门氏菌(10⁶cfu/mL)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(10⁶cfu/mL)、空肠弯曲菌(10⁴cfu/mL)。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 具有特异性分子靶标的食源性致病菌标准菌株活菌的检测方法及应用

<120> 广东省微生物研究所（广东省微生物分析检测中心）

<130> 12.20

<160> 93

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 897

<212> DNA

<213> 细菌

<400> 1

atgcagaggc aggataaacc ggcgacaaca taccaaattc aaattgaaaa gatgaaacaa 60

aaaaatataa taattgaaga tgaggcattt gcaattagtt ttttaaaaaa ggttcaatat 120

tatagactaa gtggatactg gttatcatat tttgaagata gagaaaaaga tattttgaaa 180

cctggaataa catttgaaaa aatttcttca gtttatttat ttgataaaga attaagaaat 240

attttattgt ctatgctaga tacgattgaa acggaattta aatctgttct tgcttatgat 300

ttttcgcata attgcggccc gttagcttac aaatatgcta ataattttaa taaaccagaa 360

tactacgcaa aatggcttaa taaattttat agtagcataa gttattctga tactaataga 420

gaactttata ttgaatggta taaaaaagaa tataacggga aatttccttt ttggattgta 480

gtagaagttt gcaatttcaa tgatatttct aagttttata gtaatctaca tattaaaatt 540

aaaaagaaaa tggttaaaat ttatggatat gatgcagaat atattcaaag ttggttacac 600

acagttgtgt taatacgaaa tatatgcgcc cataatggga ggctctataa tagaacgata 660

acagtatcgc caaaattacc taatgggacg gctaaactaa atataaagag aatatttatt 720

gttatattta tattcaaatt tttgtgcgtt gatcaaacag agtgggaaat atttgtaaat 780

aaaatagaag aattaataca aaaataccaa gaggttattg aactagaaat gattggtttt 840

cctgaaacgt ggaaagaaat gttaattgac agagtggtag ttaattcgaa taactag 897

<210> 2

<211> 2061

<212> DNA

<213> 细菌

<400> 2

atgttaggaa aagttattga tgattataag ctggtggaat ttatcggaaa agggtcgttt 60

ggtactgtct atagagcaga aaaaaatggt tcaaattatg cattgaaaat atttaattat 120

gattacgttt tccaggagtt taagaggaat ggtgaaaata ataggatttc aagagaaatt 180

gctgtattgg aaaaagtaga gcatataaat gttactaaat atatagataa aggaagctat 240

agtgataaca cgcagtcata tttgtattta gtaatggaat atattaatgg tagtgatttg 300

aaaacccatt taaactcgtt ggaaggtccg atgagtatta gcgaaacaaa taattatgtg 360

caacaaattc tttctggatt agatgcagtt cataaacata atatagttca tagagactta 420

aaacccgaaa atatttttgt tactaaaaat ggaaccatta aaatactaga ttttgggtta 480

tcaaagctaa ttgattatac ttcaataact tcaacaggaa gtactgtagg aagtccactt 540

tatatgtcgc ctgaacagat tagagatagt aaatcaattg actacagatc agattattat 600

tcattaggtg taatcattta tgagatgtta gcaaaatgta gtccttatgg ggatgttgat 660

tcaatacatc aattgtatta caaaattcta aatgaacccc cgaaatctat acttctatat 720

aattatgaaa ttcctaatta tatagataat ttgattaatt ctttgttgag caaaaataat 780

tatgaaagac caaattctat agaaaatata aaggatttgt ttagatcaga agtggtatcc 840

gttgaaatag aaaatagttc acaagaaaaa tcagagtttg tcctgcgagt ctggaatgaa 900

aaaagtatac tatctgattt tgctcaagat ggttttcgca taccaaattg catctttcca 960

atcaatcatc aagatcaaca aaaaggtctg ttaaaattaa ttcaatctaa ttctaatttt 1020

tttattgatc ctgcaacaac aagattggcc tatgattcat attctgatgt aaaaggattg 1080

gttgctttac cttatgctcc gaaagggttc gataggttag aaataccatc ttttgaagag 1140

tattcaaaaa tacaagaata tgtagaacta gtggtagaag agcaattaaa gtttaatccg 1200

aaccaaattg ttgcaccttt tcatgtcagt aacaacactt ctgataatgc ggctttaaag 1260

tattcagatg aatcttggtt ctctttagat gttaagtttt taaaagaagc taaagactat 1320

ttagttaaga ataatattaa aaaagaacta attatgggtg tatgtatcaa gagtgagcta 1380

ctgtctattg cctctgaacg cgaatatttt attaatgtgc taagttcgtt accagcagac 1440

gtgtattgga tatatgttga tagtataaac tacgactcag gtgtttctca aatttttaat 1500

tatataaaga ctttgttagc aattcagaat tcaacaggaa aaaaagtaat tgctggtaga 1560

gttggtagta tagggatgct attgaattca tttggaattt atggatttga atcgggtgct 1620

tctagatttg aaacattttc tgaagatttg tttaagtcat cagaagacag ctacaacatg 1680

tacattagtt attattttcc agacctatta cgatcagtcc caattttaag aaaagacccc 1740

tcgaagctag tttctatatt tgattcttct gtaggagatg gaataaaatg caactgtccg 1800

tactgtaaag ataaagaaat tagtgctgta ctgaaagaac caaatgtaaa gaaacatttt 1860

ctataccata gaaatatgga gatggaaaaa atgaattcct tcgagagtat ttctgagaaa 1920

attgattact tttatgatag aatgagtaag gcacttattt tatatcaaaa tttaggacct 1980

atttttaaac ccaatcaata tcagtttgta aagacttgga tgcaagtggt tgagaaactt 2040

agaatagaag taggggtgta a 2061

<210> 3

<211> 630

<212> DNA

<213> 细菌

<400> 3

atgagtgaaa tagtcgtgag aaaaattgct gtcgaattcg aagaaaatag gaaatatcgt 60

tattcttggt cgatatcgta cgaaagtgac agttcacttc cacatgatct gcttgtaatt 120

atgatgaatc ctagcaaagc agatgaaagt ggtccagaca gaacaataaa gaagataatg 180

gattggaaca aagataaacg tctttgtgaa aattcatcat ataagagtat cataattatg 240

aatatctccc ccttggtgga aacagatagt aagaaggcct taaatgtatt tataaaaaat 300

gaaattccat gcgatatttt aaaagataac ctttcaaagc tggcatgtga aatctccgaa 360

gtgaaaaata taattattgc ttgggggatc ataggggaca aaatcttccg tgaagtttta 420

gaaaagtatc caaacaatga acaagtaaaa tgtttagtat ctgcattaaa agaaaaagtg 480

tccgcaaggt atgtgaaatg cttagaaatg aatgagacta ctacaacatt tcggcaccca 540

agaagagctt gggaagatga taaaaaagaa aactttataa aaactgttga gcaagaagat 600

tttcctgcgc tatatgaaga tcaaaagtaa 630

<210> 4

<211> 759

<212> DNA

<213> 细菌

<400> 4

atgttgttga agtcacgtgt tttatttgat aagttcgttt tgaaacgtga gtatgctcgt 60

gattataaag aaacagggaa atggtcactt caaaagcttg agaaatatac ggataataaa 120

ggtaataagc caaaatacgt tgggactttt ggtggcgatg aagataatcg aaataaacaa 180

attcgcacat tacaatctgc acttcgtatt acctacacat cacctaaaac tatgcattgg 240

atttctctaa ttctgacaag ctgtttaaat aatgatgatt ctgatatttt acaaattctt 300

gaagcttatg gtcaaactaa agtagatgct tcgggataca caacggcgac tggattcagt 360

tttgaaagaa ttgtatttag ctatttggat tatcttcttt atcgaaacgg atattcatat 420

aatggaaaag aagtggtaag acctcttgct gatgactggc aattccagtt tagaagttca 480

atagaacatt tttatccaca gcatcctact gaattggtgg tatgggctaa tgaagatttg 540

aactgtttcg ggaacttagc actaattaca gtttcaggga attcaacgtt taacaatgcg 600

atgccggttg ggaaagctag caccaaccct ggaattattg aacaaagttt gaagttaaaa 660

ataatgactg agatgatgag acagaatgat aataactgga atcaagaatt agctcataaa 720

catcaaaggg aaatgtttaa cgttcttgag aaaggctga 759

<210> 5

<211> 546

<212> DNA

<213> 细菌

<400> 5

atgaaacgtt ttttaatcaa tttagctgag attcattatt ctcttggctt cattaatcgt 60

aatgagctgg aagaaagatt tcttgttgct ttgtggctat ctgatgaaat agataaagac 120

ccacgtgtgg acttatcgga agaagacaat ttaagtcgag aagacggcaa tgaagaatat 180

cgtgaagagg ggttaactcc tcgggtggtt tctcctaaaa atcatgacga tgaatggatg 240

gagttcttat gcttgaacaa atgggtattc acgaaatccg accctgatga ttacccgtca 300

gttcctcatg ggcactatga aagccaaaat agaaaatggc caaaacttaa tccttatact 360

ggaagagttt ttgccgcaaa acaccaagaa gataaatcta aaaagttaaa taaaaagcaa 420

ctgaaaatca tttggtcaga tgcaaaattc aaggcttttt gtcgagaaat ggtagcttgg 480

tacttagagg aaaacccaca ttataaattt gctgtgaagc atccgttacg tatgcctaaa 540

aggtaa 546

<210> 6

<211> 486

<212> DNA

<213> 细菌

<400> 6

atgaatgatt tgattgaaaa gattagatta caacaagata tcaacaactt ctatacagat 60

tactgtgatg ttctctgcga gagtcaaatt gaaaactggc cctcatattt tactaatgat 120

gcgttgtaca gaatcactac aaaagaggcc atagaagaaa agtaccttat taacatagtt 180

ttttgtgacg gaaaaaaaat gattaaagat agagccatag gtatacaaaa agctgtattt 240

ttccgtcggc aaatagaaag aaaggttata gggaatataa gaatcataga aacagaaaat 300

atgcaaataa atgtatccac atcatttttt atagtgaaaa gtatcgaggg ttaccctcca 360

agtcttcttt gtagcggaat aagtaaagac atcatagcga tggataaaaa tcagctcaga 420

ttcaagcaaa gactatgcat tttagatgcc gatgttttac cagactctct ggtttaccca 480

atctag 486

<210> 7

<211> 999

<212> DNA

<213> 细菌

<400> 7

atgagaattg aattagatga attaccacat caaagtcaag caatagatgc tataaaaaaa 60

tcattttcag gattacaaaa gttaagtgtt cctactgtct tttcgaatcc tgaaatcaaa 120

tttagcggag aagaaaaagc aaatattgat ataaaaatgg aaactgggac tggcaaaact 180

tatgtcggag ttcgttcaat atatgaactt tttgatgaat ataaaatctt taaatttatt 240

atagttgtac ccactcctgc aataaaagaa ggatggaaaa attttataga atcggattat 300

gcaaaacagc atttctcaaa tgattttgaa aatattaaaa ttaatctaac cactataaat 360

tcaggtgatt tcagaagcaa gaggggattt ttgccagcgc atttaactga atttatagaa 420

tcagataata tggatagttc aactatccaa gtattattaa taaattcatc tatgctaatt 480

tctgagaaca tgaaaggtgt tataaccaga gggaagaaca aaggacaaga tagatttaat 540

caaattttat tgaatgaata tacaaaacct atagaggcaa ttagtgctac tcgaccaata 600

gtaattatag atgagcctca tagatttcct cctaaaggtg aattttataa aggaatatta 660

aatataaaac ctcaaatgat tttgagatta ggtgcaacgt ttccatacac tccaagtgaa 720

aaaaatcctg tagtagataa taaatatttc aatggaaatc ctaatttcga actcaatgct 780

atagatagtt ttaacttagg tttagttaaa ggtattgata tatattatcc taatttaact 840

tttgaacaag ctaaaagtcg atataaagtt gataatgtaa aaaataaaga attagttcta 900

agaaaaggaa aaaataagtg gaatataaaa attggagaca acttagcaaa catagatagt 960

ttatttgaag gtaacctaac tggttctgtt gcaaagtaa 999

<210> 8

<211> 723

<212> DNA

<213> 细菌

<400> 8

atggaatcca gatgtaataa aaatattttt gattatcttt ctagaaatga aattgctaat 60

aatagacttt acaatacttt aaaagatatt ggtaattcag aacctaaagt tactattagg 120

caacatgata gttctgatgt aaataagatt tttccagata attcttttga tttattggtc 180

acttctccgc catatgggga tagttcaact actgttgctt atggacaatt ttctagattg 240

tcattgcagt ggttagattt agaaattgat gaaaatacgg ccttaagtaa attagattct 300

ataatgttag gaggaaaagt agataagaaa gtagtaattg atagtattct tgattattta 360

gactcattga ctttaaagga cttatttaaa aaaataaatg aaaaagatga aaaaagagct 420

aagcaagttc ttcagttttt tatagatctt gattcttctt tagataatac agctaagtta 480

atgaagaatg acacgtatca atattgggtt gtggctaata gaacggtgaa aatgattagt 540

gttccgactg atattattat tgctgaaatg tttgaaaagt atgatgtata tcatattcat 600

agcttttata gaaatattcc taataagaga atgccttcga agaattctcc tacaaatatt 660

gttggaaatc attctgttac tatgtcttct gagataattt taatgtttag aaagtcagta 720

tga 723

<210> 9

<211> 369

<212> DNA

<213> 细菌

<400> 9

ttgataaaaa aagaaattaa taaacagcta aacaaaaaga aaaagacaga aaaagaggct 60

aaatcattca tcaaagatta tacagaacaa ctcaacaaag gctatgaatc atctgacttt 120

agcagattga aacgttactt tgaagatgat aaatcagacg tagcaactaa cattaagcaa 180

caagtagaat ccgacaaaag aacacatttc aaagatttaa atatagaatc ttcacaactt 240

aaagataatg aggttacagt gattattaat aagaaaaacg agaaaaaaca acgtatacgt 300

tcacaatatg acctcatata caacggagat aaagacgaat ttaaaatcag agaatacaaa 360

gatatttaa 369

<210> 10

<211> 744

<212> DNA

<213> 细菌

<400> 10

atgaaaaagc tatatgattt taaatggtct attcttttga ttgttatacc gcttgttttt 60

ttattcatga acaatatgtt cttccacttt agtatgaata ataaactgtt acctgtttat 120

ataagtagca atttcgcgtt gataattgcg tttattaaaa ttgagatgga tgagcataag 180

gaaaaaaaca aaatagagat gaataataag cgtattaccc ttgcttatta taatgactta 240

aatactttgc atttaaaatt catgcaaaac aagtataaag aacgtacaat cacccctgat 300

attgaaaata ttgataatta cgtaaaaaaa cattattatt gcttgaacta ctcaactgaa 360

attcttgaag aaacaaaacg tgctaaaatt aatataaaag tagctaaagt tagaagtgaa 420

ttacatcgtg aattattaga aattatcaaa aagatgttgt tagaaagtag tatcaatgtt 480

gataatgagt tatataatca attcaaagta atacaaacga aagcatttgt atctaaggca 540

cggaatttag atcgaattga aacagaatta aaaagaatct cacctatagt aatcaatcag 600

aatggtgaga ttaatgctaa tctatggcat aaaatatatc ctcatcttga cgatttaaaa 660

gtatttattt tgggagatga aggggtaatt caaaaagaat taaaagtctt aattaaagaa 720

attgatgata acagtaaaat ttaa 744

<210> 11

<211> 906

<212> DNA

<213> 细菌

<400> 11

atgcctaagt ataaaatgga tatattgaac aatgctattg atagtctcaa tgaatctctt 60

gataaatacg atcagggaca ggcaggtaat ataaggcaac ataaatttgc attacttcat 120

ttttgtcatt tcatggagtt agcccttaaa tactatttaa caacaaaaaa tgaaaatcta 180

atctataaaa aggtatatat ttatattaaa aataaagcta agagtgaaaa gatttctcta 240

tcagatgcat atgacaaatt agaagatgaa gattttgatt tcaatgagtt acttgttggt 300

gactctaatc cattcacaat aacagcagat caagcattag cctttattaa atcagacgat 360

gcaggtattg atgatgaact tatttcagag atatctgcta tgaaacaact gagaaataac 420

attgaacact gtcgttttga gatggatact aaagatgttc gattagctct aggccggtta 480

actcgtggat ttgatcaatt ctatgaatat gttggtttcg gtgagttaca acattcagta 540

aataaagcac agttgggtat atttcaaact ttagccaatg aatatgatca taacttatcc 600

gaagcgaaag cagatgctca ggaagctcac agggatgcat ttcgcggggt taggctgaag 660

cattatgaat tcgttaactt cacgacttat gattgtcatg aatgtaatca aactaaccta 720

atgataccta atgaagaatc tccttcagga tatcgttgta cgcattgtgg caacgaagag 780

tctgacgata ttgaggttga atgtgaaatt tgtggtggaa tttggcctaa tggggacatg 840

tgttcttggg aggatacata tgattatact tgccctgact gcaatgactt ctctagcaga 900

gattga 906

<210> 12

<211> 246

<212> DNA

<213> 细菌

<400> 12

atgattatcg acattattgc tatcagcctc atcttagtgg tcatgtatat ccgtagaagc 60

caatccgctg acctgcattg tagatactta cagctatcca gcttgggcta tgagtccata 120

gagctgatgt gtacagatga tagattcgct aaggcctaca gacacactaa gttactgaca 180

acggtcctaa ggattctcgt agttggctat gctgcctcat gggtggtaac tctgctcagt 240

cgatag 246

<210> 13

<211> 999

<212> DNA

<213> 细菌

<400> 13

atgatttttg agcttgcttt tctgtttttc tcttcattca ctaccttgtt tttaatgaga 60

aaagtcgcaa aacgcattgg tttggttgac aaacccaatg caagaaaact acacgaggga 120

gcgattcctc ttgtcggcgg aatttctatc acattggtgt tagctcaatt tcttatttat 180

aaacctgatc taatcaagca cagcgggtta tttattattt caattatggt gctgacttta 240

attggcgctc ttgatgataa atttgaccta agcgttcgcg tgcgtattgg ggtgcaaacg 300

gttctctctt tagtcatgat gcatattggc gggctagagc ttcaccacat tggtaatatt 360

ttaggctttg gtgatattta tctaggctgg ataggaagcg tcattaccat tatggcagtg 420

attggagcaa ttaatgcctt caatatggtg gatgggattg acggcctgtt aggcgggctt 480

tcgattgtga cttttggtgc attagccttc ttattgaaag tagacagcca acatgggttg 540

gcttatctat gcgtggtgat tattgtggcg atgctacctt atatttgtat gaacctcggc 600

atattaggac gtaaacgtaa agtctttatg ggtgatgcgg gaagcatgat gataggcttt 660

actgtgattt ggatgctatt aggcgtcagc caagttgatg caaaaccact catgcgacca 720

gttacggctt tatggcttat cgcggtaccg ctcatggaca tgactgcaat tatgatccgt 780

cgcatacgac gcggagactc accatttaaa ccagacagag aacatttgca tcatatttgt 840

cagcgtttag gccttagctc tcgacaaaca ctagtagcca tttgctctgt tgccattctg 900

ttcgccagtt ttggtattta cggtgaagcg gttaatttaa ctgaagctgt catgttttat 960

agctttatcg gcagcttttt atttactcac tactattaa 999

<210> 14

<211> 141

<212> DNA

<213> 细菌

<400> 14

tgctaatcaa gaaaagatag cggtaaaagc taattcttat tatgtaacca atttaaagca 60

attcatggaa ttttatgagg acttttattt tgatggtgag gaatgggaaa aagatatatg 120

ggatagacgg aaaatgaatc t 141

<210> 15

<211> 226

<212> DNA

<213> 细菌

<400> 15

ggggtatact cttacgtacc tggtacatgg aaaacttaga tatatagata taaaggaaaa 60

aagtttttat gatgctaacg aaaaggcact aaatatttta aagaatgaaa aggcgttaaa 120

aggtaagttt actaaaaaca tgaatattaa attacgttca aataattcta aagcaatata 180

taaacttgaa tggaaaaaaa aatccgccac tatcaggaca aggagg 226

<210> 16

<211> 544

<212> DNA

<213> 细菌

<400> 16

atgagaagga aaacacgacc taaattgatt ttgttagaga aaaagccgat tcatagaaat 60

agaaacagga acttaagatt ggtagattcg catgaaaatg aatatacacg taaaattaca 120

gggaaacctt tgatacataa aattttaaat tttctttgta ctgttagtgt tgtagcagga 180

attatatatt atgcatccaa ttacgatatt ccttggataa ctactggagt tactgaagaa 240

gaagccatgt caattacaga tgatgttgta aaaacacaaa cacaattaat tttgcaggat 300

ctaggtgtcg gagatgatgg aatctcgggt aaaattacaa ttcataatac ctatccaagt 360

aatggttatg ctggcttgtt ccatggccaa tctgtgatta caaatggatt gcaatcgtat 420

gttcaaagct ctggttttat tgatatatat ccgatggttt attttatgaa gcgggataag 480

gaagggaact tagtatcgat tccttctaat cagcgtctca ataaggatag attccgtgac 540

gcga 544

<210> 17

<211> 643

<212> DNA

<213> 细菌

<400> 17

tcgttggtta tggttactct gtattgcagt tcttgttctt attacaggtt gttcgaaaaa 60

aaatgagatc ccaaaaggtt tttcagagca aagttatcaa gacttcacaa aagtatacag 120

cgattatcaa aaagcaaaaa agacaaatag tgaagatgaa aaaggtttag caaatttggc 180

tgattatcat gaaaaaaaag accaaggaaa actaactgtg gaagagataa aggtatggga 240

tgcgatggga gaactcttga tgattcacaa tacgattgtg aagaatgatc ggcatgaatt 300

ggataacgct gattcaggtg tgaaaaaaat agcgaatgct tatctgtcga aaaaaaatga 360

gatacctgcg ttagagaaaa gcattgaaga catgttgaag ctgccgaaat ccaaaacagc 420

aaaagaaacg tctttatcgt ctaaggaaga agtgaaggat acaaaagata aaaaggacac 480

agaggggact acgaattctg cagagtttcc aactgctgaa aactgcccaa agccatatac 540

aaaagaagat tgtgaaaaat tcacggagta ctatacaaac ggcgagggga aacaagaacc 600

agaaaaaaat gatgtacaag catcgggagc taatgcgttt tcc 643

<210> 18

<211> 365

<212> DNA

<213> 细菌

<400> 18

agaaagagat gccacattga gagtagaagt aacagagaag attgaagaaa ttgaaaatat 60

cgtaaataag gtagttgagc agaaaaaaga attattaact tccaaagaaa aacaaaaaga 120

agttagtgat acatatggag aaataaatga acagttgatg acgttagagg atgaaaaatc 180

tcaattaatt caaagaaaga aagaactttt attttcgaaa agtagtcata cgattttgtt 240

agaacgatat aaaaaagaaa aagaatcata ttgtgcaaca caagaagtat tatataaatt 300

agaaatttca aatcatgaaa aagtctgtcc tctgtgtaat tctcacgttc aatgcgatgg 360

ggtag 365

<210> 19

<211> 398

<212> DNA

<213> 细菌

<400> 19

agttcgacat atcccgggaa aaccggaggt tagcggcggg gtgctacagt acaggctgca 60

aaacaacacg gattcccccc aaactgtcaa gatatactct ggctatttag gctcatccta 120

cggatggccg gtaaaaaaaa ctttaactct ggctgcgaga gggcagccgt gcagcatcga 180

ttatgaaccg caagttagtt tcacgataat gagaggaaat gccctggaaa agcgactcct 240

tatgaatgga aagggtcgtg gagaaattac tgtcaagcct tctccagcgg acgataacgg 300

cgggtatctc cgttcatcgg ctgaacaaaa gatccgctat agtcttagag gaggtcagca 360

ggtgtgggac agttccagcc ggctatggaa gggagtta 398

<210> 20

<211> 927

<212> DNA

<213> 细菌

<400> 20

ccgccaatgt cactaccaaa tatttaagca aagccaggat accagggtta atgctggtgg 60

tcaaagcctg agcgctcctg tgattacagg aactgcggca ttggcgcaca ccccatttcc 120

ccaaatctgg ggagaacaag atcagcgtgc cgggtgtact gcaatgcagc ataccccgga 180

gaaatgccgt agtctcgact gtcacccaga tattgggtat caaatcctga gcaatttttc 240

gctcgctgat gtaattcagc tttttggcgc tgaatttaat ttgttttcac atgtttggcg 300

tagcaggtct ttttcctctt ttccacatgc taccgacgaa gtgctacaag agcggaaaaa 360

gaaaaatgcg gcaacagcaa ttagtaggat gagtaaccct tttttaaaat tatccattgc 420

tcactcccta ggctcgatgc cgcgctgctg taactctttg cggatgatgc gcttgatcca 480

ggccgccaga gattcatcac catcttgctg ctgggcctgt tccattagcg cacgtaactc 540

aggatctagt ctgaactgga atggtggatt accacgtctt tcattcttgt gtgttgacac 600

gtcaattaca cccgatgtaa tgtgtttatg tgtaatgaca cattacatac ataagttaca 660

aatagcaacg ccccggagtg cgggaacact gccgaggcgt ctgaccaaaa cgttatcaga 720

ggtaacgact atggctgaat tacagtctac ccaaactcgc actgaattta catggagatt 780

tatctctgct tctgagcgct accctaccgc caaaccattg gtgatctacg tcaacgcatc 840

cagcgaacag gaggcccgcg agactatgcc gggggtaaac ctcatttttg ctgctcgtct 900

gccatttcat gatcttcggg ttgtgga 927

<210> 21

<211> 938

<212> DNA

<213> 细菌

<400> 21

gagctctccc gtgtctcatt tctcagaaag caggagctca gggaaaacgt taaagtgcct 60

gtggataaag aaagtggttc tccccttgcg cagatcattt ttccggaaga gcttgccaat 120

gccgagcttc cggtcatgcc cgacgagctg gcatccgcgg tcagtcagct gattgagcaa 180

tggaataatc tggataaact ggctcggttt ggtgtgatgc catcgctgag ctgcctgctt 240

ttcggactgc cggggacggg taaaaccatg ctttcctttt atatcgccag gatgctcgga 300

ttaccgatcg tgctggccaa gctggatggg cttgtttcgt ctttactggg taccagtgca 360

agaaatatca ataatctgtt tgattttgct gctcagtatg actgcctgct gctgctggac 420

gagtttgatg ctgtggctaa agcccgcaat gacaaacatg aggtcggtga aatcaagcgt 480

atcgtcaaca cattactgca gtgtattgat gccagatcga agagtggtat gacgctggca 540

attaccaatc atgaagtatt actggatcct gcagtctggc gaagatttga gatgcgtata 600

ctggtaccta agccaaatta cgtagcaagg ttgaagatta ttgaaaaata tattaatccc 660

ttgaactttg cggcggaaga gataaaattt ttgaccgtac tgacagatgg atttaacggt 720

tcagatattc agttaatgtt aaatcacttc aagagaatgt ccgctattgg taacgccgat 780

cagactttta ttgaggctgt tcggtcattt gcagtcattc atgcaggcag tgaagttaac 840

gaattcatgc agttgttatc aaataatcag gacgcagcaa taatgagctt gttgcataaa 900

aagcatgagt tcacgcaaaa agagattgcg ctggtttt 938

<210> 22

<211> 832

<212> DNA

<213> 细菌

<400> 22

gggcaatgtg taagggttgt agagggtgag cttatcgacc ctctgcctga gtcatcaaca 60

agggccaatt cttttctggt ttttgatagc accggaaatg cgactgtttt atcgaaagat 120

gacgttgcca ttctggaccc ggaagggaaa attcccgtat cgatgattcc tgctattgcc 180

attacccaac cttttgtcgt ttccagtcag gctgcaatgc ttgcactgga cgctcaggta 240

ggtgacgtcg caaagagaac ggataaaggg ttttcattca ttctgtcagc cgaaccagcg 300

tcaacactgt ccaactgggt gcaactgaat gatgatgtac tggctcaact tggcctgtca 360

tccggtgccg ctcaggtagg agcgttggat gatgccggag gatcaaccac ggttcagaga 420

gctctgaacc taaaagcaac gaccgcatca cttacatcga ctgatgctgc aaatcgtgca 480

tggacaaacg aaaacttcgt cgactccacc tacaagaagt tgcaaacagg gaattttgct 540

accggattta ccatcacaag tcagtttcag gttgttttgt atcctactga cgggttctgg 600

tatcgctatc ttgggaccct atcaggtggc ggcctgactc ttcccgccgg aagctcgccc 660

gacagcagtt gggaaaacat taataagcag caaatggtga gcctgcgcaa gcttaacgag 720

ctatctacgc aaagcatcgc aggctatatc ggcgttaata ttgatatgcc tgtgtcggtt 780

aaggattctg acaatcaggg cgcgcgtgtt ggttctggtg tgactatccg ca 832

<210> 23

<211> 591

<212> DNA

<213> 细菌

<400> 23

ttacatgaaa tcttttcttg atattttatc agaagataga attgaaataa gttgttttag 60

ctccaggcta ctccccagac aaagcttgca ccttaaataa tgtagtttat ttgtgcctgg 120

ccgaccttta cttaaataag ttttttttgt tggatcgtat atattaatta aaaaagataa 180

gcaatcttct gataaaatac tgttcaatct atgatgcaac acactaatca aactacaggc 240

agctccagct aaagggagtt tagcagcacg atggcaaata ttttttaact cttcaatcgt 300

cgatattaga ccaaatgctt taaaaaagct atccttggca atttctgctt gagcaataaa 360

atagacattt ttgaataatc cgcgctcagc caagcgcagg cagatccagc gaatactctc 420

tttcctttca tgtaccgtat cgataagaat atatgggtta tcaaaaatcg ttgcacaaac 480

taaaaactct agacgattat caaagaagaa aatctttctt ttttcatagg tcaatgttat 540

tattgactgt cgcatagcaa aattttttgt aaaacaaaga acaactgcca c 591

<210> 24

<211> 1473

<212> DNA

<213> 细菌

<400> 24

tcaaaaatca ttgccctccc atgagcatgc tgttatcgaa cacgataaga acttaaaaaa 60

ataagcgctg gttgttgttg gtgctatttt tagtcccaaa gctatatttt tagctgtttc 120

taaacaaact gatattccag aattgttatt tagcgtataa gaacgcatgg gtgttaatgt 180

gtaataatca tcagttgtat agaatatttc cacagtagtg cttgagtcag tggcatgatc 240

tctataccca attgaaatgg caatactatt cattgtttct atatcaagtg cagcattccc 300

accactattt ctgaatgcca gccctgaatc tgagaatgct tgatgccttt catctgttgg 360

tgttccggta ttcaataccg cccatggcct cacatcatct gatgtatatg tctgattcag 420

attcctgata agtccgccga caccaagtcc tgccccccac agatagtatt tgtactgata 480

agattcttgc tcaaaaatat tattgaaaac tcttgcttgt ttatagaaat cattatctgt 540

aattatatca aggtgcgttg gatctgctac tgatgactcc caagaaaaac ttgcatacga 600

tccatcacca aagcggaaaa aacttttaga aaatgaaatt tgcttttctt tattcgaaaa 660

aacatctcca gtaaaaagac caacagcagg aatcagcttt gcatgtgagg atttatactt 720

taactcacca aaagaaataa tagcattctt tttattgtca acatcagata ctgtcccaat 780

gtagtaataa tcgacaaaaa taatatcata atgttttgag atggtatcat taccatatcc 840

ccaatcgccg ttatcagcaa tacaaagtga cttccctgta acagctctcc atgcattgat 900

tctggcatct tgttccgcaa ctgaaacccc ctgatgctgg ggttcatcaa ataaataata 960

acctattaca cagtcccttc ttcctaaaga cacaatatca ggtggtggcg tatcattagg 1020

gctattgatt atgacattaa ttccaacagc ttcagcagca ttacatgctt tctcaaatgt 1080

tccaccatcc gtaaaattgt atccataatg aataatcgta ttgaaaccag cggtcttaag 1140

ctgaagcata tcacatatat cgaaaacacc atgaacccat gtagccttca tttttgaatg 1200

attcacagga gtgtaactat caagattaca cgggactgaa ggcctacggg tataagtaat 1260

ggtactcttc ccttctatct tggcaccatt aggccagtcg aagcgagaca gagttatatt 1320

accgctaata taagcctttc ctgttcgttt aattgcctca agtatcgact gttttgcatc 1380

aatgccgggg tttgaataat catatccaaa aagggctata tcagattcat tataaatctg 1440

attatcaata ttttcttgta ctgtttttac cat 1473

<210> 25

<211> 237

<212> DNA

<213> 细菌

<400> 25

atgcagtggc tgattgctgc gttcagtaac cagtttcacc agttcctggt catccagagc 60

atcaagcatc ctttcataca gttcagcagg cacacagtag aatgccggct gattccggtt 120

aagaatggcg acagggtaac catctccggc actgactgta gccataggat ttttttcagt 180

tcactgacac ttgcactggt gtcagacaga atgatgttag gcataacgca cctttga 237

<210> 26

<211> 192

<212> DNA

<213> 细菌

<400> 26

atgaatctaa ttgataagat cgcccttgtc ggtcaacgca tgaagagcga gcagatctct 60

ctgaaagagt cattattggt ctcttcgagg gtttcggtat cggatgatag tgtagacggt 120

gttgatcgcc taatctataa ccactgcttg aataaaaaaa tctgtcagat ttttttggta 180

aatctcgcgt aa 192

<210> 27

<211> 414

<212> DNA

<213> 细菌

<400> 27

atgttgaaaa aaaacgccat aaaaataaaa ctatatcgtt atgctatttt acattcgaaa 60

aactgtattg ttaccattaa gaacaagtca aagccagagg aaataaaaat aactagaggc 120

aacatagcct taatagaaaa aaatatagaa gccgttgtgg aaattgaata tatggatgac 180

attgaatcat ttgacattat tactttgcca gatgaattat taagtagagt tttatgctta 240

tttgaggctt ctaattgctc agaaagttta tcaccaatac gctacagaac atttagcgat 300

aaggttttta ttataaccga caatggaatt aatggaattt tatttgaata tttaaaaaga 360

gaaaaaataa caataatgat atttatgaaa ttgcctgctt attttcaaaa gtga 414

<210> 28

<211> 156

<212> DNA

<213> 细菌

<400> 28

atgtccctca gtaaatcccc gggagcgtac attaagtatg cgaccggggt gagcgacaaa 60

tctgccggga gcagatttga acgctgctcg cagcgccccg aaggggcgag gcctatggat 120

gggccgagta ataaagccaa cacagatgcg gcttga 156

<210> 29

<211> 3087

<212> DNA

<213> 细菌

<400> 29

atgcaaaaaa tagttagggc agtcttacat ttacatgcta tgcaattaca acatggggat 60

ctgcacccta acaatattct aatagaagtg ggagatgttc gcttcattga tgcacttgat 120

ataccttgtt caggtgagaa tataatattc actcctgcat atgtacctac agattacgaa 180

tctttgccta tggaggaacg tgattgctac gctgtggcca aagtgtgtaa tgagatttta 240

gaacacgacg ttaactggga agggattgat ccatcagctt tacttaatga gatcagaagt 300

tgtatggggc gggattttaa aatttattct cttgaccgaa taaatgatga aatagagatg 360

ttaatcaacc ctccacaaat aaatgaggga gtgaggttgt cagtattaat gaggcaactg 420

acctccagcc agaaattaat aaatgacaat ggtgtatacc atatcagtat tagtgaagaa 480

cgagtccgtt cgccaaagca gcagcctcat attatcgtag cttttgccgg agtacgtaaa 540

cagttacaaa tctatcttaa agcgacccaa ttagattttg catttttacg aactaaagat 600

atagcccata gcttatttgt acgaatggca tcacaagcca ttacacaact cgaagctaat 660

atactattcg aaccctcatc cgcggatgac cctagcaagt tattagaaca tgtaaaaaaa 720

atacctgagg ttatctctgc aatatcgaga attcagaata gaattctcgg tggcgatttt 780

tcttctgatg aggaagaaat tgagaactca gaaactttaa ctgtttctca aacaagacca 840

catacagcat cactttggcg tgcaatttta gatgcagaag aagattcctt acctgaaatt 900

gaaatcacct catcagttgt cagggatatg gataagcgtc atgagaaatt gcgaatacct 960

tacagaaaag agggagagtc tttagactat gaatcagatg caaaagttga ggcattacaa 1020

gaaataaacg gtgaactgat tcgtgtaggg aatgttgata taagagagac tacccaatct 1080

actctcgtac ttgaaaatcc aaagattcgc attcagacta atattggcga cactttgaaa 1140

ttacgaagtc aacaagatct atcatctttt attcgtaggc gtcatgcagt tacacgtatt 1200

ttaaatgctg aatcggctat cccctcatta atcaattact ttgaaccatt aacttgccct 1260

catccacaat atctacaacc agagccaact gattctgatc ttgatgctta taatcgatat 1320

gataaagatg gagagctatc tttttcactc aatcgacagc aacgagatgc cttttctaaa 1380

ctttggtcat acggcccatt gagtcttttg caaggccctc caggcactgg taaaacttca 1440

ttcattgctt catttatcca ttatgctctc tcacaaggag cccaaagtat acttcttgca 1500

agccagtcac atgaagcagt taataatgct gcagaaaaag taattgaact ttgtcagcac 1560

agcaatctgc ccctagatgt tgttaggttt ggtgcagaag gaatggtctc agaaaaactt 1620

catccatatc attcatcttc cattttgcaa aattatcgag acttattccg ctcagaaatg 1680

cgagttagaa tttcagcaat gaaccgaaat ttaggtctcc ctaacaaatt tgtagaaaga 1740

tggttcgata ttgaatatca acttaagcgt ttgaatcgtg aaatagaaag attaaccaca 1800

aaactaaata aaaatgaaat atcagaagct aataataatc ctctgatagc tcgaataaat 1860

cagcgacttg aacgatttaa aaaaattgca tctgaaaagt ttggttatgc gggggaggga 1920

actccagagg aagtgattaa tcaattaagc cgtgagacaa tgaatcagtt tggtgtaact 1980

tctttagatg cagtgtctag actggagcaa gtaattgcaa tgtctcaaga gtgggtagat 2040

cgcttaggca ctctgagagg taactttgaa gaatttcttg cgaagacccg atcacttgta 2100

tgtgggactt gtgtgggtct aggacgctca caatttggtg tagcaaaaaa tcgctatgat 2160

tgggtgatag tcgacgaagc tgctcgtgcg acacctggcg aattggctat agcaattcag 2220

tcgggtcgca gggtgttact ggtcggcgat catcgtcaat tgccaccttt gtatcctgaa 2280

ccagtggtgc gaaaaatatc gatagaacta aattactctg atcgcgcggt actaacacgt 2340

agtgattttg aacgtgcttt cgaatcagat tatggtaaac aagtcggagc aacattacgt 2400

actcaatata gaatggcccc accaataggt gaaatggttt cagcttgttt ttatcccaaa 2460

ccgttagaac ctggacgtgg aaatccagaa ccttggttta atcaattacc taaaagatta 2520

agttctatta ttacttgggt tgatacttcc gatgctgggg gagaatctta tgaaagagca 2580

aaacatcctg gatttgacaa tccttatgaa gctagagaaa ttattgatac gctgcgttca 2640

atatgtacag cagaatcatt catcaaatat ttaattgatg aaacttcaga tgaggaaaaa 2700

ccaattggtg taatttgcat gtatgcaaat caagaacgcc tattgcaacg tttacttagc 2760

gaacaagatt gggctactgg ttatagacat cttattaaaa ttgatacagt tgatagttat 2820

caaggtaagg aaaatcggat cattatcgtt gcaacgacgc gcaataataa tcagtgtatt 2880

caagggttcc ttagcagctc ggagcgaata aatgtggcga tttcgcgtgc aatggataga 2940

ttagtaatca ttggggctgc tcgtatgtgg cgtgagaggc atcaaacttc agcgttaggc 3000

cgtgtattaa accacattga aacacatcgt gatgggaata acttcaattt ggttcaggca 3060

ttagccattg aggagggaca gaaatga 3087

<210> 30

<211> 348

<212> DNA

<213> 细菌

<400> 30

atgaaacacc aagacttaac aagtaagcta aaaaactatt taaaacatga acaaaacaat 60

aattatatca tatatggcaa aaagaaaata ggaaagacat atttcattaa agatttcatt 120

aaaattaatg aatatcagga aaatagttat attaattctt taatatctac ttttgaagaa 180

attaaaaaaa atattataga agatcaaaca aatataatcg taatagatga attaaataaa 240

atttcaaaaa ataaattaaa aaaaatactc aatttagtca acgtctatca agataaaaaa 300

aaatttttta ttgataagca caaaaaaagg aaaagaagta atttctaa 348

<210> 31

<211> 162

<212> DNA

<213> 细菌

<400> 31

atgatagaat taaaagcata tgaagaaagt aaagggaatc ctgataaaaa aaataaaaat 60

atcctactcc tgcaaaatat aaaaaaagag catgagtttc taaaagaagt cgatggtctt 120

gctttagcta atgctcaaat gaatctagat aaaagcatat aa 162

<210> 32

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成

<400> 32

ctagatacga ttgaaacgga 20

<210> 33

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成

<400> 33

cattttgcgt agtattctgg 20

<210> 34

<211> 21

<212> DNA

<213> 合成

<400> 34

aattttaaga aaagacccct c 21

<210> 35

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成

<400> 35

ttatctttac agtacggaca 20

<210> 36

<211> 19

<212> DNA

<213> 合成

<400> 36

tactacaaca tttcggcac 19

<210> 37

<211> 19

<212> DNA

<213> 合成

<400> 37

tcttcatata gcgcaggaa 19

<210> 38

<211> 23

<212> DNA

<213> 合成

<400> 38

cgtgttttat ttgataagtt cgt 23

<210> 39

<211> 19

<212> DNA

<213> 合成

<400> 39

tcgccaccaa aagtcccaa 19

<210> 40

<211> 22

<212> DNA

<213> 合成

<400> 40

ttctcttggc ttcattaatc gt 22

<210> 41

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成

<400> 41

gatattcttc attgccgtct 20

<210> 42

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成

<400> 42

attttactaa tgatgcgttg 20

<210> 43

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成

<400> 43

ttttgtatac ctatggctct 20

<210> 44

<211> 18

<212> DNA

<213> 合成

<400> 44

ctggcaaaac ttatgtcg 18

<210> 45

<211> 18

<212> DNA

<213> 合成

<400> 45

ctgttttgca taatccga 18

<210> 46

<211> 19

<212> DNA

<213> 合成

<400> 46

ttggtcactt ctccgccat 19

<210> 47

<211> 21

<212> DNA

<213> 合成

<400> 47

atctaaccac tgcaatgaca a 21

<210> 48

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成

<400> 48

gaacaactca acaaaggcta 20

<210> 49

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成

<400> 49

tcggattcta cttgttgctt 20

<210> 50

<211> 22

<212> DNA

<213> 合成

<400> 50

cttttgattg ttataccgct tg 22

<210> 51

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成

<400> 51

attatcaacg cgaaattgct 20

<210> 52

<211> 22

<212> DNA

<213> 合成

<400> 52

agctctaggc cggttaactc gt 22

<210> 53

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成

<400> 53

cccgcgaaat gcatccctgt 20

<210> 54

<211> 19

<212> DNA

<213> 合成

<400> 54

agaagccaat ccgctgacc 19

<210> 55

<211> 22

<212> DNA

<213> 合成

<400> 55

acgagaatcc ttaggaccgt tg 22

<210> 56

<211> 21

<212> DNA

<213> 合成

<400> 56

gcgggctaga gcttcaccac a 21

<210> 57

<211> 21

<212> DNA

<213> 合成

<400> 57

ggccgtcaat cccatccacc a 21

<210> 58

<211> 23

<212> DNA

<213> 合成

<400> 58

tgctaatcaa gaaaagatag cgg 23

<210> 59

<211> 23

<212> DNA

<213> 合成

<400> 59

agattcattt tccgtctatc cca 23

<210> 60

<211> 21

<212> DNA

<213> 合成

<400> 60

atggttatgc tggcttgttc c 21

<210> 61

<211> 22

<212> DNA

<213> 合成

<400> 61

agttcccttc cttatcccgc tt 22

<210> 62

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成

<400> 62

gctgaaaact gcccaaagcc 20

<210> 63

<211> 22

<212> DNA

<213> 合成

<400> 63

ggaaaacgca ttagctcccg at 22

<210> 64

<211> 22

<212> DNA

<213> 合成

<400> 64

caaacacttg ggggtatgca at 22

<210> 65

<211> 22

<212> DNA

<213> 合成

<400> 65

atgttccggc taaacacgtc cc 22

<210> 66

<211> 22

<212> DNA

<213> 合成

<400> 66

tgggcaaggt ttattcctgc at 22

<210> 67

<211> 22

<212> DNA

<213> 合成

<400> 67

ctgctatttg ttgcgttgtc gt 22

<210> 68

<211> 22

<212> DNA

<213> 合成

<400> 68

caagccttct ccagcggacg at 22

<210> 69

<211> 22

<212> DNA

<213> 合成

<400> 69

cggctggaac tgtcccacac ct 22

<210> 70

<211> 22

<212> DNA

<213> 合成

<400> 70

ggcgcacacc ccatttcccc aa 22

<210> 71

<211> 23

<212> DNA

<213> 合成

<400> 71

acggcatttc tccggggtat gct 23

<210> 72

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成

<400> 72

atgccatcgc tgagctgcct 20

<210> 73

<211> 22

<212> DNA

<213> 合成

<400> 73

agcccatcca gcttggccag ca 22

<210> 74

<211> 23

<212> DNA

<213> 合成

<400> 74

tcagccgaac cagcgtcaac act 23

<210> 75

<211> 21

<212> DNA

<213> 合成

<400> 75

cctacctgag cggcaccgga t 21

<210> 76

<211> 21

<212> DNA

<213> 合成

<400> 76

taatcaaact acaggcagct c 21

<210> 77

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成

<400> 77

ctcaagcaga aattgccaag 20

<210> 78

<211> 21

<212> DNA

<213> 合成

<400> 78

ttaattgcct caagtatcga c 21

<210> 79

<211> 21

<212> DNA

<213> 合成

<400> 79

aatgaatctg atatagccct t 21

<210> 80

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成

<400> 80

tgctgcgttc agtaaccagt 20

<210> 81

<211> 22

<212> DNA

<213> 合成

<400> 81

accctgtcgc cattcttaac cg 22

<210> 82

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成

<400> 82

attgataaga tcgcccttgt 20

<210> 83

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成

<400> 83

atcaacaccg tctacactat 20

<210> 84

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成

<400> 84

aatatagaag ccgttgtgga 20

<210> 85

<211> 21

<212> DNA

<213> 合成

<400> 85

ggtgataaac tttctgagca a 21

<210> 86

<211> 18

<212> DNA

<213> 合成

<400> 86

gggagcgtac attaagta 18

<210> 87

<211> 18

<212> DNA

<213> 合成

<400> 87

gcatctgtgt tggcttta 18

<210> 88

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成

<400> 88

aggcaactga cctccagcca 20

<210> 89

<211> 23

<212> DNA

<213> 合成

<400> 89

acgtactccg gcaaaagcta cga 23

<210> 90

<211> 21

<212> DNA

<213> 合成

<400> 90

agatcaaaca aatataatcg t 21

<210> 91

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成

<400> 91

ttttatcttg atagacgttg 20

<210> 92

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成

<400> 92

aaaatatcct actcctgcaa 20

<210> 93

<211> 23

<212> DNA

<213> 合成

<400> 93

tttatctaga ttcatttgag cat 23

Claims (9)

1.用于检测食源性致病菌的特异性分子靶标组合，其特征在于，所述特异性分子靶标组合的核苷酸序列见表格所示：

2.检测如权利要求1所述的特异性分子靶标组合的引物，其特征在于，所述引物的核苷酸序列见表格所示：

3.一种非诊断和治疗目的检测食源性致病菌活菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1：在待测样品加入PMA染料溶液；

步骤2：提取待测样品中的菌体DNA；

步骤3：以步骤2中的菌体DNA为模板，进行实时荧光定量PCR检测；

步骤4：待反应结束后，将获得的荧光定量PCR扩增的曲线和Ct值与建立的标准曲线计算样品中食源性致病菌活菌的数量；

其中，所述步骤3中进行实时荧光定量PCR检测所使用如权利要求2所述的引物。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤3中实时荧光定量PCR检测扩增的目的片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：1～14及SEQ ID NO：19～31所示。

5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤1所述待测样品中的食源性致病菌菌体浓度控制在1×10⁴～1×10⁶cfu/mL范围内。

6.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤1具体操作如下：在待测样品中加入PMA溶液，将其置于37℃恒温培养箱中避光培养5min，用500W钨丝灯照射10min，该步骤的目的是为了使死菌或细胞膜破损的菌的DNA与PMA交联，使其不能进行PCR扩增。

7.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述PMA终浓度为2～16mg/mL。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述PMA终浓度为16mg/mL。

9.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤2待测样品中的菌体DNA采用磁珠法提取菌悬液中的DNA。

Images