CN112592993B

CN112592993B - 含有特异性分子靶标的金黄色葡萄球菌标准菌株及其检测和应用

Info

Publication number: CN112592993B
Application number: CN202011619828.7A
Authority: CN
Inventors: 吴诗; 吴清平; 代京莎; 丁郁; 陈谋通; 张菊梅; 薛亮; 王涓; 叶青华; 曾海燕; 古其会; 杨小鹃; 张淑红; 韦献虎; 张友雄; 庞锐; 卢勉飞; 张峰; 黄嘉慧; 陈鲁
Original assignee: Guangdong Detection Center of Microbiology of Guangdong Institute of Microbiology; Guangdong Huankai Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Guangdong Detection Center of Microbiology of Guangdong Institute of Microbiology; Guangdong Huankai Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2020-12-30
Filing date: 2020-12-30
Publication date: 2022-05-20
Anticipated expiration: 2040-12-30
Also published as: CN112592993A; WO2022141934A1

Abstract

本发明涉及生物工程技术领域，具有涉及4株我国自主知识产权的、符合国内传播规律的金黄色葡萄球菌标准菌株，可用作食品、药品、临床检验等不同领域的标准参考菌株。其保藏编号分别为GDMCC 60841、GDMCC 60843、GDMCC 60844和GDMCC 60845。本发明的4株金黄色葡萄球菌菌株，具有标准的葡萄球菌菌体显微形态和生理生化特征，遗传背景清晰，且耐药性、毒力基因和分子检测靶标等信息清晰。本发明还涉及一组用于检测、鉴别上述4株金黄色葡萄球菌标准菌株的特异性靶标基因以及对应的PCR引物。最后，本发明还提供了一种存活率高、特异性的金黄色葡萄球菌冻干保护剂，可用于本发明标准菌株的长期储存。

Description

含有特异性分子靶标的金黄色葡萄球菌标准菌株及其检测和应用

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及含有特异性分子靶标的金黄色葡萄球菌标准菌株及其检测和应用。

背景技术

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,S.aureus)是引起细菌性食物中毒的重要食源性致病菌之一，在我国，20～25％的细菌性食物中毒病例是由金黄色葡萄球菌引起的。金黄色葡萄球菌可产生多种毒素，有些毒素可耐高温，人体摄入几微克便可导致食物中毒；有的毒素可以导致人的白细胞和巨噬细胞的损坏，有的可以导致血液中的纤维蛋白沉积，严重时还可导致中毒性休克综合征、骨髓炎、化脓性心内膜炎、菌血症及致死性肺炎等多种感染，威胁人类健康。了解该菌的传播规律以及致病性进化是有效防控该菌所致的食源性疾病的基础，而是否使用了合适的标准菌株决定了研究结果的可靠性。

目前研究该菌的进化规律和致病性使用的标准菌株大部分为国外临床来源的菌株，并不能很好地反映该菌在食品中的传播特征，中国作为世界重要的食品消费国，食品中金黄色葡萄球菌的检出率一直处于不低的水平，却缺乏代表性的分离株作为具有自主知识产权的标准菌株来研究该菌在中国食品中的遗传结构和传播规律。

目前报道的所采用的保护剂基本用于定性储存金黄色葡萄球菌，在保质期内能够保证还有活菌存在即可。如薛蕾等人采用可溶性淀粉、脱脂奶粉、海藻糖、麦芽糊精、谷氨酸钠、抗坏血酸钠、磷酸盐缓冲液作为金黄色葡萄球菌冷冻干燥保护剂制备能力验证样品，其冻干存活率仅为51.74％，且不能定量储存。又如中国专利CN106497791 A采用2％-6％海藻糖,谷氨酸钠12％-18％，L-半胱氨酸盐酸盐0.5％-1.5％，牛血清白蛋白0.25％-0.75％可使金黄色葡萄球菌冻干存活率达99.82％，但该保护剂并未进行长期储存的考察。又如中国专利CN102140423 B采用0.1～10质量份的水溶性糖、0.1～5质量份的脱脂奶粉、0.1～20质量份的明胶、0～10质量份的活性炭作为定量化保存的保护剂，该保护剂并没有提到冻干存活率的高低，且由于保护剂中含有一定浓度的明胶，在常温条件下或在冬天使用时其溶解度受到影响，溶解速度较慢；此外该保护剂中含有活性炭，活性炭不溶于水溶液，冻干后沉在瓶底，且复苏时，散落在平板表面，影响美观以及菌落的自动计数。因此，提供一种可长期保存定量化金黄色葡萄球菌的冻干保护剂具有重要意义。

发明内容

为克服现有技术的不足，本发明提供了4株金黄色葡萄球菌标准菌株及其应用。本发明提供的4株中国地区食源性金黄色葡萄球菌分离菌株，具有典型的金黄色葡萄球菌生理生化特性，且样品来源、遗传背景、耐药性、毒力基因和分子检测靶标等信息清晰，能较好地反映该菌在中国地区的遗传背景。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

提供一株金黄色葡萄球菌，是金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)Sta3702B3，分离自鸡翅样品，其分类命名为金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，已于2020年1月8号保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC 60841。

提供一株金黄色葡萄球菌，是金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)Sta403，分离自牛肉样品，其分类命名为金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，已于2019年10月27号保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC 60843。

提供一株金黄色葡萄球菌，是金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)Sta4127A1，分离自对虾样品，其分类命名为金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，已于2019年10月27号保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC 60844。

提供一株金黄色葡萄球菌，是金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)Sta1942-0，分离自冻鸡翅样品，其分类命名为金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，已于2019年10月27号保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC 60845。

进一步地，所述保藏编号为GDMCC60841的金黄色葡萄球菌为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)，其分子型别为ST9-t899-SCCmec_type_IVb，携带如下所示的毒力基因：sec、seg、seh、sei、sem、sen、seo、sep和ser；其耐受的抗生素包括：阿莫西林/克拉维酸、氨苄西林、头孢吡肟、头孢西丁、青霉素G、头孢他啶、庆大霉素、卡那霉素、链霉素、氯霉素、克林霉素、红霉素、泰利霉素、环丙沙星、诺氟沙星、四环素和复方新诺明。

进一步地，所述保藏编号为GDMCC60843的金黄色葡萄球菌为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)，其分子型别为ST9-t899-SCCmec_type_IVb，携带如下所示的毒力基因：sea、seg、sei、sek、sem、seo、sep和seq；其耐受的抗生素包括：阿莫西林/克拉维酸、氨苄西林、头孢吡肟、头孢西丁、青霉素G、头孢他啶、庆大霉素、卡那霉素、链霉素、氯霉素、克林霉素、红霉素、泰利霉素、环丙沙星、诺氟沙星、四环素和喹奴普汀/达福普汀。

进一步地，所述保藏编号为GDMCC60844的金黄色葡萄球菌为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)，其分子型别为ST59-t437-SCCmec_type_IVa，携带如下所示的毒力基因：seb、sec、seg、sei、sej、sek、sel、sem、sep、seq和ser；其耐受的抗生素包括：阿莫西林/克拉维酸、氨苄西林、头孢西丁、青霉素G、头孢他啶、卡那霉素、链霉素、克林霉素、红霉素、泰利霉素和褐霉素。

进一步地，所述保藏编号为GDMCC60845的金黄色葡萄球菌的分子型别为ST4456-t13849，携带如下所示的毒力基因：seb、sec、seg、sei、sej、sek、sel、sem、sep、seq和ser；其耐受的抗生素包括：氨苄西林、青霉素G、链霉素、喹奴普汀/达福普汀和褐霉素。

本发明从新获得的金黄色葡萄球菌通过泛基因组分析比较，获得本发明特异性的分子靶标，能特异性的检测出本发明金黄色葡萄球菌，具有较强的特异性，所述分子靶标包括如SEQ ID NO.1～4所示的核苷酸序列。

进一步地，所述保藏编号为GDMCC60841的金黄色葡萄球菌含有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；所述保藏编号为GDMCC 60843的金黄色葡萄球菌含有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；所述保藏编号为GDMCC 60844的金黄色葡萄球菌含有如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列；所述保藏编号为GDMCC 60845的金黄色葡萄球菌含有如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。

本发明还提供了一组用于检测所述特异性分子靶标的引物，针对如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列扩增的PCR引物序列如SEQ ID NO.5～6所示；针对如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列扩增的PCR引物序列如SEQ ID NO.7～8所示；针对如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列扩增的PCR引物序列如SEQ ID NO.9～10所示；针对如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列扩增的PCR引物序列如SEQ ID NO.11～12所示。

本发明还提供了一种用于制备定量本发明所述金黄色葡萄球菌标准菌株的冻干保护剂，其特征在于，包括0.1～10质量份的海藻酸钠，3～15质量份的脱脂奶粉，0.1-3质量份的肌醇六磷酸和0.1-3质量份还原性谷胱甘肽，0.2-4质量份的甘氨酸。

本发明提供的可长期定量保存金黄色葡萄球菌的保护剂作用原理是：其中的海藻酸钠具有多羟基结构，在冷冻或干燥过程中可与菌体细胞膜磷脂中的磷酸基团或与菌体蛋白质极性基团形成氢键，保护细胞膜和蛋白质结构与功能的完整性。脱脂奶粉能够包裹在菌细胞外层保护菌体。甘氨酸离子具有酸、碱两性，因此在冷冻干燥过程中抑制溶液的pH变化。还原性谷胱甘肽和肌醇六磷酸作为抗氧化剂，在冷冻干燥过程和长期储存中降低细胞氧化酶的活性，防止冻干品的氧化变质。

本发明的有益效果：

本发明的金黄色葡萄球菌菌株，具有标准的葡萄球菌菌体显微形态和生理生化特征，可用于检验金黄色葡萄球菌显色平板的准确性。其遗传背景清晰，包括菌株分离源、采样日期及地点、生化鉴定特征、毒力基因携带情况、抗生素耐药性特征、MLST分型特征等，便于科研、生产等领域用作不同研究方向的参考及对照；此外，这些菌株携带特异性基因靶点，具有可识别性。相较于其它类型该物种的标准菌株，这些菌株具有中国地区分离到的食品源金黄色葡萄球菌最为典型的生化反应，可反映中国地区食品源流行背景的菌株，具有一定的代表性，作为参考菌株用于科学研究。

另外，针对本发明的金黄色葡萄球菌，发明人提供了一种长期保存的冻干保护剂。所述保护剂具有以下优点：成型好，外观漂亮且水溶性好，1-2秒内能够完全溶解；冻干存活率能达到90％以上；在-20℃条件下可以保存至少一年以上，量值不发生变化，能够用于定量化质控菌株的长期保存。

生物材料保藏

一株金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)Sta3702B3，其分类命名为金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，已于2020年1月8号保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC 60841。

一株金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)Sta403，其分类命名为金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，已于2019年10月27号保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC 60843。

一株金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)Sta4127A1，其分类命名为金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，已于2019年10月27号保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC 60844。

一株金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)Sta1942-0，其分类命名为金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，已于2019年10月27号保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC 60845。

附图说明

图1为金黄色葡萄球菌菌株标准株的菌落形态图。

图2为金黄色葡萄球菌菌株标准株的镜检观察形态图。

图3为金黄色葡萄球菌菌株Sta3702B3、Sta403、Sta4127A1和Sta1942-0的APIStaph生化鉴定示意图。

图4为金黄色葡萄球菌菌株Sta3702B3、Sta403、Sta4127A1和Sta1942-0的特有基因片段及其他金黄色葡萄球菌PCR扩增图；其中M：DL 2000Marker；Lane 1-9：MRSA食品分离株；Lane 10-19：MSSA食品分离株；Lane 20：金黄色葡萄球菌ATCC6538；Lane 20：金黄色葡萄球菌ATCC25923；Lane 21：金黄色葡萄球菌ATCC29213；+：金黄色葡萄球菌标准株；C：空白对照。

图5为金黄色葡萄球菌菌株Sta3702B3、Sta403、Sta4127A1和Sta1942-0的特有基因片段及其他葡萄球菌PCR扩增图；其中M：DL 2000Marker；Lane 1：腐生葡萄球菌；Lane 2：继发性葡萄球菌；Lane 3：松鼠葡萄球菌；Lane 4：坐骨葡萄球菌；Lane 5：施氏葡萄球菌；Lane 6：猴葡萄球菌；Lane 7：巴氏葡萄球菌；Lane 8：科氏葡萄球菌；Lane 9-10：溶血葡萄球菌；Lane 11：沃氏葡萄球菌；Lane 12：人葡萄球菌；Lane 13：罗斯特里葡萄球菌；Lane14：路邓葡萄球菌；Lane 15-16：猪葡萄球菌；Lane 17：表皮葡萄球菌；Lane 18：溶血葡萄球菌；+：金黄色葡萄球菌标准株；C：空白对照。

图6为金黄色葡萄球菌菌株Sta3702B3、Sta403、Sta4127A1和Sta1942-0的特有基因片段及其他菌属PCR扩增图。其中，M：DL 2000Marker；Lane 1-2：副溶血性弧菌；Lane 3-6：单增李斯特菌；Lane7-9：铜绿假单胞菌；Lane 10-13：大肠杆菌；Lane 14-16：小肠耶尔森氏菌；Lane 17-19：沙门氏菌；Lane 20-22：阪崎克罗诺杆菌；Lane 23-24：空肠弯曲菌；Lane25-27：蜡样芽孢杆菌；Lane 28：苏云金芽孢杆菌；Lane29：枯草芽孢杆菌；+：金黄色葡萄球菌标准株；C：空白对照。

图7为金黄色葡萄球菌定量质控菌储存期内的变化曲线。

具体实施方式

为更清楚地表述本发明的技术方案，下面结合具体实施例进一步说明，但不能用于限制本发明，此仅是本发明的部分实施例。

实施例1金黄色葡萄球菌菌株的分离、鉴定和培养

对采集的样品同时进行定性和定量检测，检测方法在国标《食品微生物检验》GB4789.10-2010的基础上略做调整。取样25g(mL)加入225mL生理盐水的无菌均质袋中均质摇匀，制成1:10的样品液，并从中取1mL加入到装有9mL 10％氯化钠胰酪胨大豆肉汤的试管中，制成1:100的样品液，按照上述方法制成1:1000的样品液；每个梯度3个平行，将样品液放置于恒温培养箱中37℃培养48h后，将每个梯度浓度的样品液分别划线于金黄色葡萄球菌显色板培养基上，37℃中培养24-48h。其典型的金黄色葡萄球菌菌落在显色平板上为粉色球型湿润边缘平整(图1)。

将目标菌落从NA平板上转接到脑心浸液营养肉汤(BHI)中，于37℃过夜复苏。在无菌条件下将菌液加入终浓度为40％甘油管中，保存于-40℃冰箱，并进行冻干管保存。纯化后的菌落可进行形态特征、生理生化、血清型以及分子生物学等方面的鉴定。

共分离得到6株金黄色葡萄球菌，分别为金黄色葡萄球菌菌株Sta3702B3、Sta403、Sta4127A1以及Sta1942-0，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，地址为中国广州市先烈中路100号省微生物所实验楼五楼，保藏日为2019年10月27号和2020年1月8号，保藏编号分别为GDMCC 60841，GDMCC 60843，GDMCC 60844，GDMCC 60845。

上述菌株分别分离自中国南京市、汕头市和西安市等城市的不同食品类型样品中，具体的分离信息如表1所示。

表1菌株的分离信息

实施例2金黄色葡萄球菌菌株的生理生化特征和药敏特征

染色镜检：将可疑菌落涂片，进行革兰氏染色，镜检观察形态。金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性，显微镜下成原型葡萄串状(图2)。

血浆凝固酶实验：接种单菌落至5mL BHI培养液中，于37℃培养18-24h。吸取培养液1mL，加入血浆凝固酶中，于37℃培养。2.5小时后，每一小时观察一次是否凝结，若6h后没凝固，培养过夜再观察验证。

API Staph鉴定：从显色平板上刮取粉色单个菌落，用生理盐水制备成浊度适当的细胞悬浮液，使用API Staph生化鉴定试剂条鉴定，结果如图3和表2所示。

药敏特征分析：利用KB法进行金黄色葡萄球菌菌株的药敏确证。经NA平板活化后加入生理盐水稀释至终浓度为1×10⁷cfu/mL涂布于MH平板上，待菌液干了之后将抗生素纸片贴在培养基表面，37℃培养24h。采用游标卡尺测定抑菌圈大小，精确至0.01mm。选用的抗生素如下：阿莫西林克拉维酸(AMC，30μg)、氨苄西林(AMP，10μg)、头孢吡肟(FEP，10μg)、头孢西丁(FOX，30μg)、青霉素(P，10U)、头孢他啶(CAZ，30μg)、阿米卡星(AK，30μg)、庆大霉素(CN，10μg)、卡那霉素(K，30μg)、链霉素(S，25μg)、氯霉素(C，30μg)、克林霉素(DA，2μg)、红霉素(E，15μg)、泰利霉素(TEL，15μg)、环丙沙星(CIP，5μg)、诺氟沙星(NOR，10μg)、四环素(TE，30μg)，利奈唑胺(LZD，30μg)、利福平(RD，5μg)、复方新诺明(SXT，25μg)、喹奴普汀/达富普汀(QD，15μg)、替拉考宁(TEC，30μg)、呋喃妥因(F，300μg)和褐霉素(FD，10μg)。Staphylococcus aureus ATCC25923和Escherichia coli ATCC25922作为质控菌株。

表2金黄色葡萄球菌API Staph系统鉴定结果

实施例3金黄色葡萄球菌菌株的分子遗传背景分析

分别对金黄色葡萄球菌菌株进行了多位点序列分型(MLST)、葡萄球菌A蛋白(SPA)分型、SCCmec分型及相关基因的检测。

(1)实验方法

MLST分型主要是基于7个金黄色葡萄球菌管家基因(arcC、aroE、glpF、gmk、pta、tpi和yqil)的序列进行分析。引物与扩增方法参考先前文献报道。所使用的7对引物由北京六合华大基因科技有限公司合成(引物序列见表3)。PCR扩增条件如下：94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min，进行35个循环；最后72℃延伸10min。反应体系(25μL)包含：12.5μl 2×DreamTaq mastermix，8.5μl超纯水，80ng模板DNA，0.5μM上下游引物。DNA产物用PCR纯化试剂盒进行纯化(Qiagen，Genman)，经过纯化的PCR产物委托北京六合华大基因科技有限公司进行序列测定。每种管家基因的编号和ST型都是通过金黄色葡萄球菌MLST数据库进行比对(https://pubmlst.org/saureus/)。

葡萄球菌A蛋白(SPA)是金黄色葡萄球菌细胞壁的组成部分，包括Fc结合区，X域和C末端3个区域，X区域是由可变数量24bp重复序列组成的，呈现出基因多态性。引物与扩增方法参考先前文献报道。所使用的引物由北京六合华大基因科技有限公司合成(引物序列见表3)。PCR扩增条件如下：80℃预变性5min，94℃变性45s，60℃退火45s，72℃延伸2min，共进行35个循环，最后继续72℃延伸10min。反应体系(25μL)包含：12.5μl 2×DreamTaqmastermix，9.5μl超纯水，40ng模板DNA，0.5μM上下游引物。扩增得到的产物进行测序，选取spa基因的重复序列(24p为一个单元)与数据库(http://spaserver2.ridom.de)中已有的型别进行比对，得到spa型别。

表3金黄色葡萄球菌MLST引物和spa引物及扩增片段

由于部分菌株对所选的β-酰胺类抗生素均产生耐药，为进一步确证其是否为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，采用PCR的方法确认这些菌株是否含有mecA/mecC基因。mecA/mecC基因可编码青霉素结合蛋白2a(PBP2a)，使相关菌株与β-内酰胺类抗生素亲和力极低。当其他PBP被β-内酰胺类抗生素抑制时，PBP2a不被抑制而替代其他PBP，起到催化细胞壁合成的作用，使细菌得以生存。mecA和mecC基因的引物与扩增方法参考先前文献报道。采用单重PCR的方法，引物序列见表4。PCR扩增条件如下：95℃预变性5min，95℃变性45s，56℃退火45s，72℃延伸50s，进行35个循环；最后72℃延伸8min。反应体系(25μL)包含：12.5μl 2×DreamTaq mastermix，9.5μl超纯水，40ng模板DNA，0.5μM上下游引物。5μL的PCR产物上样于2.0％琼脂糖凝胶进行电泳分离(120V，25min)，使用2000bp DNA Marker。

表4金黄色葡萄球菌mecA/mecC引物及扩增片段

多重PCR的方法确认MRSA菌株的SCCmec型别。引物与扩增方法参考先前文献报道。所使用的16对引物由北京六合华大基因科技有限公司合成(引物序列见表5)。这16对引物可进行TypeI、TypeII、TypeIII、TypeIVa、TypeIVb、TypeIVc、TypeIVd和TypeV型别的鉴定，反应体系(50μL)包含：23μl 2×DreamTaq mastermix，9μl超纯水，80ng模板DNA，0.5μM上下游引物。PCR扩增条件如下：94℃预变性5min，95℃变性45s，65℃退火45s，72℃延伸90s，进行10个循环；95℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸90s，进行25个循环；最后72℃延伸10min。10μL的PCR产物上样于2.0％琼脂糖凝胶进行电泳分离(120V，40min)，使用100pbDNA ladder Marker。

表5金黄色葡萄球菌SCCmec型别引物序列及扩增片段

对金黄色葡萄球菌常见的18种肠毒素和类肠毒素(sea,seb,sec,sed,see,seg,seh,sei,sej,sek,sel,sem,sen,seo,sep,seq,ser,seu)、中毒休克征毒素1(tsst-1)以及杀白细胞素(pvl)编码的基因分别进行了PCR检测。引物与扩增方法参考先前文献报道。所使用的引物由北京六合华大基因科技有限公司合成(引物序列见表6)。反应体系(50μL)包含：23μl 2×DreamTaq mastermix，9μl超纯水，80ng模板DNA，0.5μM上下游引物。PCR扩增条件如下：94℃预变性5min，94℃变性45s，65℃[△T-1℃]退火45s，72℃延伸90s，进行15个循环；94℃变性45s，50℃退火45s，72℃延伸90s，进行20个循环；最后72℃延伸10min。10μL的PCR产物上样于2.0％琼脂糖凝胶进行电泳分离(120V，40min)，使用2000bp DNA Marker。

表6金黄色葡萄球菌相关特征性基因引物序列及扩增片段

(2)实验结果

表7本发明菌株的ST型别

表8本发明菌株的spa型别

这些菌株可培养于TSA、BHI和NA培养基中。

表9本发明菌株对不同抗生素的耐药性

注：*R＝耐药；I＝中度耐药；S＝敏感

经PCR进一步确证，Sta3702B3、Sta403和Sta4127A1为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，相关菌株含有mecA基因，序列如SEQ ID No:13所示，SCCmec型别分别为TypeIII型、TypeIVb型和TypeIVa型。

SEQ ID No:13

>mecA

ATGAAAAAGATAAAAATTGTTCCACTTATTTTAATAGTTGTAGTTGTCGGGTTTGGTATATATTTTTATGCTTCAAAAGATAAAGAAATTAATAATACTATTGATGCAATTGAAGATAAAAATTTCAAACAAGTTTATAAAGATAGCAGTTATATTTCTAAAAGCGATAATGGTGAAGTAGAAATGACTGAACGTCCGATAAAAATATATAATAGTTTAGGCGTTAAAGATATAAACATTCAGGATCGTAAAATAAAAAAAGTATCTAAAAATAAAAAACGAGTAGATGCTCAATATAAAATTAAAACAAACTACGGTAACATTGATCGCAACGTTCAATTTAATTTTGTTAAAGAAGATGGTATGTGGAAGTTAGATTGGGATCATAGCGTCATTATTCCAGGAATGCAGAAAGACCAAAGCATACATATTGAAAATTTAAAATCAGAACGTGGTAAAATTTTAGACCGAAACAATGTGGAATTGGCCAATACAGGAACAGCATATGAGATAGGCATCGTTCCAAAGAATGTATCTAAAAAAGATTATAAAGCAATCGCTAAAGAACTAAGTATTTCTGAAGACTATATCAAACAACAAATGGATCAAAATTGGGTACAAGATGATACCTTCGTTCCACTTAAAACCGTTAAAAAAATGGATGAATATTTAAGTGATTTCGCAAAAAAATTTCATCTTACAACTAATGAAACAAAAAGTCGTAACTATCCTCTAGAAAAAGCGACTTCACATCTATTAGGTTATGTTGGTCCCATTAACTCTGAAGAATTAAAACAAAAAGAATATAAAGGCTATAAAGATGATGCAGTTATTGGTAAAAAGGGACTCGAAAAACTTTACGATAAAAAGCTCCAACATGAAGATGGCTATCGTGTCACAATCGTTGACGATAATAGCAATACAATCGCACATACATTAATAGAGAAAAAGAAAAAAGATGGCAAAGATATTCAACTAACTATTGATGCTAAAGTTCAAAAGAGTATTTATAACAACATGAAAAATGATTATGGCTCAGGTACTGCTATCCACCCTCAAACAGGTGAATTATTAGCACTTGTAAGCACACCTTCATATGACGTCTATCCATTTATGTATGGCATGAGTAACGAAGAATATAATAAATTAACCGAAGATAAAAAAGAACCTCTGCTCAACAAGTTCCAGATTACAACTTCACCAGGTTCAACTCAAAAAATATTAACAGCAATGATTGGGTTAAATAACAAAACATTAGACGATAAAACAAGTTATAAAATCGATGGTAAAGGTTGGCAAAAAGATAAATCTTGGGGTGGTTACAACGTTACAAGATATGAAGTGGTAAATGGTAATATCGACTTAAAACAAGCAATAGAATCATCAGATAACATTTTCTTTGCTAGAGTAGCACTCGAATTAGGCAGTAAGAAATTTGAAAAAGGCATGAAAAAACTAGGTGTTGGTGAAGATATACCAAGTGATTATCCATTTTATAATGCTCAAATTTCAAACAAAAATTTAGATAATGAAATATTATTAGCTGATTCAGGTTACGGACAAGGTGAAATACTGATTAACCCAGTACAGATCCTTTCAATCTATAGCGCATTAGAAAATAATGGCAATATTAACGCACCTCACTTATTAAAAGACACGAAAAACAAAGTTTGGAAGAAAAATATTATTTCCAAAGAAAATATCAATCTATTAACTGATGGTATGCAACAAGTCGTAAATAAAACACATAAAGAAGATATTTATAGATCTTATGCAAACTTAATTGGCAAATCCGGTACTGCAGAACTCAAAATGAAACAAGGAGAAACTGGCAGACAAATTGGGTGGTTTATATCATATGATAAAGATAATCCAAACATGATGATGGCTATTAATGTTAAAGATGTACAAGATAAAGGAATGGCTAGCTACAATGCCAAAATCTCAGGTAAAGTGTATGATGAGCTATATGAGAACGGTAATAAAAAATACGATATAGATGAATAACAAAACAGTGAAGCAATCCGTAACGATGGTTGCTTCACTGTTTTATTATGAATTATTAATAAGTGCTGTTACTTCTCCCTTAAATACAATTTCTTCATTTTCATTGTATGTTGAAAGTGACA

实施例4金黄色葡萄球菌菌株的特征序列分析

主要根据金黄色葡萄球菌的泛基因组分析结果获得这四株菌株特有的非必需基因。共选取了564株代表性金黄色葡萄球菌(含分析菌株)的基因组序列来进行泛基因组分析。泛基因组采用原核生物泛基因组自动化分析软件(Pan-Genomics Analysis Pipeline，PGAP)中的MP方法来分析，通过本地Perl脚本对分析结果进行处理，得到所有菌株的核心基因及非核心基因信息。

提取这四株菌株特有的非核心基因蛋白序列，通过本地Blast分别将其比对回金黄色葡萄球菌的蛋白总库及NCBI非冗余蛋白数据库(NR)。去除能比对到已知的金黄色葡萄球菌蛋白的序列，剩下的则为标准菌株特有的基因。特有基因在相关菌株、其它金葡菌株(图4)及葡萄球菌属(图5)及其他菌属微生物(图6)中通过PCR扩增检验其特异性。

结果表明，这些菌株还携带有各自特有的基因岛，序列如SEQ ID No:1～SEQ IDNo:4所示，相关基因岛可通过表10中的引物SEQ ID No:5～SEQ ID No:12进行扩增检验。

本发明2株金黄色葡萄球菌分别携带的特有的基因岛(特征序列)如下：金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)Sta3702B3

SEQ ID No:1

>3702B3_01242group_19024

ATGAGAATTGAATTAGATGAATTACCACATCAAAGTCAAGCAATAGATGCTATAAAAAAATCATTTTCAGGATTACAAAAGTTAAGTGTTCCTACTGTCTTTTCGAATCCTGAAATCAAATTTAGCGGAGAAGAAAAAGCAAATATTGATATAAAAATGGAAACTGGGACTGGCAAAACTTATGTCGGAGTTCGTTCAATATATGAACTTTTTGATGAATATAAAATCTTTAAATTTATTATAGTTGTACCCACTCCTGCAATAAAAGAAGGATGGAAAAATTTTATAGAATCGGATTATGCAAAACAGCATTTCTCAAATGATTTTGAAAATATTAAAATTAATCTAACCACTATAAATTCAGGTGATTTCAGAAGCAAGAGGGGATTTTTGCCAGCGCATTTAACTGAATTTATAGAATCAGATAATATGGATAGTTCAACTATCCAAGTATTATTAATAAATTCATCTATGCTAATTTCTGAGAACATGAAAGGTGTTATAACCAGAGGGAAGAACAAAGGACAAGATAGATTTAATCAAATTTTATTGAATGAATATACAAAACCTATAGAGGCAATTAGTGCTACTCGACCAATAGTAATTATAGATGAGCCTCATAGATTTCCTCCTAAAGGTGAATTTTATAAAGGAATATTAAATATAAAACCTCAAATGATTTTGAGATTAGGTGCAACGTTTCCATACACTCCAAGTGAAAAAAATCCTGTAGTAGATAATAAATATTTCAATGGAAATCCTAATTTCGAACTCAATGCTATAGATAGTTTTAACTTAGGTTTAGTTAAAGGTATTGATATATATTATCCTAATTTAACTTTTGAACAAGCTAAAAGTCGATATAAAGTTGATAATGTAAAAAATAAAGAATTAGTTCTAAGAAAAGGAAAAAATAAGTGGAATATAAAAATTGGAGACAACTTAGCAAACATAGATAGTTTATTTGAAGGTAACCTAACTGGTTCTGTTGCAAAGTAA

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)Sta403

SEQ ID No:2

>403_02653group_26914

ATGGAATCCAGATGTAATAAAAATATTTTTGATTATCTTTCTAGAAATGAAATTGCTAATAATAGACTTTACAATACTTTAAAAGATATTGGTAATTCAGAACCTAAAGTTACTATTAGGCAACATGATAGTTCTGATGTAAATAAGATTTTTCCAGATAATTCTTTTGATTTATTGGTCACTTCTCCGCCATATGGGGATAGTTCAACTACTGTTGCTTATGGACAATTTTCTAGATTGTCATTGCAGTGGTTAGATTTAGAAATTGATGAAAATACGGCCTTAAGTAAATTAGATTCTATAATGTTAGGAGGAAAAGTAGATAAGAAAGTAGTAATTGATAGTATTCTTGATTATTTAGACTCATTGACTTTAAAGGACTTATTTAAAAAAATAAATGAAAAAGATGAAAAAAGAGCTAAGCAAGTTCTTCAGTTTTTTATAGATCTTGATTCTTCTTTAGATAATACAGCTAAGTTAATGAAGAATGACACGTATCAATATTGGGTTGTGGCTAATAGAACGGTGAAAATGATTAGTGTTCCGACTGATATTATTATTGCTGAAATGTTTGAAAAGTATGATGTATATCATATTCATAGCTTTTATAGAAATATTCCTAATAAGAGAATGCCTTCGAAGAATTCTCCTACAAATATTGTTGGAAATCATTCTGTTACTATGTCTTCTGAGATAATTTTAATGTTTAGAAAGTCAGTATGA

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)Sta4127A1

SEQ ID No:3

>4127A1_01781group_22698

TTGATAAAAAAAGAAATTAATAAACAGCTAAACAAAAAGAAAAAGACAGAAAAAGAGGCTAAATCATTCATCAAAGATTATACAGAACAACTCAACAAAGGCTATGAATCATCTGACTTTAGCAGATTGAAACGTTACTTTGAAGATGATAAATCAGACGTAGCAACTAACATTAAGCAACAAGTAGAATCCGACAAAAGAACACATTTCAAAGATTTAAATATAGAATCTTCACAACTTAAAGATAATGAGGTTACAGTGATTATTAATAAGAAAAACGAGAAAAAACAACGTATACGTTCACAATATGACCTCATATACAACGGAGATAAAGACGAATTTAAAATCAGAGAATACAAAGATATTTAA

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)Sta1942-0

SEQ ID No:4

>1942-0_00061group_24002

ATGAAAAAGCTATATGATTTTAAATGGTCTATTCTTTTGATTGTTATACCGCTTGTTTTTTTATTCATGAACAATATGTTCTTCCACTTTAGTATGAATAATAAACTGTTACCTGTTTATATAAGTAGCAATTTCGCGTTGATAATTGCGTTTATTAAAATTGAGATGGATGAGCATAAGGAAAAAAACAAAATAGAGATGAATAATAAGCGTATTACCCTTGCTTATTATAATGACTTAAATACTTTGCATTTAAAATTCATGCAAAACAAGTATAAAGAACGTACAATCACCCCTGATATTGAAAATATTGATAATTACGTAAAAAAACATTATTATTGCTTGAACTACTCAACTGAAATTCTTGAAGAAACAAAACGTGCTAAAATTAATATAAAAGTAGCTAAAGTTAGAAGTGAATTACATCGTGAATTATTAGAAATTATCAAAAAGATGTTGTTAGAAAGTAGTATCAATGTTGATAATGAGTTATATAATCAATTCAAAGTAATACAAACGAAAGCATTTGTATCTAAGGCACGGAATTTAGATCGAATTGAAACAGAATTAAAAAGAATCTCACCTATAGTAATCAATCAGAATGGTGAGATTAATGCTAATCTATGGCATAAAATATATCCTCATCTTGACGATTTAAAAGTATTTATTTTGGGAGATGAAGGGGTAATTCAAAAAGAATTAAAAGTCTTAATTAAAGAAATTGATGATAACAGTAAAATTTAA

表10本发明所述菌株的基因岛扩增引物序列

表11本发明菌株携带的部分毒力基因

序号	菌株编号	毒力基因携带情况
			1	Sta3702B3	sec-seg-seh-sei-sem-sen-seo-sep-ser
2	Sta403	sea-seg-sei-sek-sem-seo-sep-seq
			3	Sta4127A1	seb-sec-seg-sei-sej-sek-sel-sem-sep-seq-ser
4	Sta1942-0	seb-sec-seg-sei-sej-sek-sel-sem-sep-seq-ser

本发明还提供一种金黄色葡萄球菌的冻干保护剂，并提供了冻干保护剂的几个具体实施例(实施例5～7)和对比例(对比例1～3)。

实施例5

一种金黄色葡萄球菌的冻干保护剂，含有3质量份的海藻酸钠，10质量份的脱脂奶粉，0.2质量份的肌醇六磷酸和0.1质量份还原性谷胱甘肽，0.2质量份的甘氨酸。

实施例6

一种金黄色葡萄球菌的冻干保护剂，含有5质量份的海藻酸钠，12质量份的脱脂奶粉，0.5质量份的肌醇六磷酸和0.2质量份还原性谷胱甘肽，2质量份的甘氨酸。

实施例7

一种金黄色葡萄球菌的冻干保护剂，含有5质量份的海藻酸钠，9质量份的脱脂奶粉，1质量份的肌醇六磷酸和0.3质量份还原性谷胱甘肽，1质量份的甘氨酸。

对比例1

冻干保护剂与实施例1相比，不含有还原性谷胱甘肽，仅含有3质量份的海藻酸钠，10质量份的脱脂奶粉，0.2质量份的肌醇六磷酸，0.2质量份的甘氨酸。

对比例2

冻干保护剂与实施例1相比，不含有海藻酸钠，仅含有10质量份的脱脂奶粉，0.2质量份的肌醇六磷酸和0.1质量份还原性谷胱甘肽，0.2质量份的甘氨酸。

对比例3

冻干保护剂与实施例1相比，仅含有10质量份的脱脂奶粉。

实施例8不同组成的冻干保护剂冻干存活率的比较

(1)标准菌株菌粉的制备方式如下：将菌种复苏后接入摇瓶中进行培养至对数后期至稳定期前期选取合适的菌量加入到保护剂中，混合均匀后分装至西林瓶中，并取样进行稀释计数，为冻干前含菌量A0。将分装好的西林瓶半加塞转入冻干机中进行预冻，预冻温度为-40℃，时间为3小时，开启主干燥，时间20-25h，之后进入解析干燥阶段，时间为6-8小时，结束干燥，在真空状态下压塞并移出冻干机，进行自动轧盖，保证样品的完全真空状态，并置于2-8℃低温保存。取冻干后的样品进行稀释计数，计数结果为冻干后含菌量A，冻干存活率为A与A0的百分比。

表12不同组成的冻干保护剂冻干存活率的比较

(2)分别按照实施例5～7和对比例1～3的配方制备得到不同的保护剂，对本发明的金黄色葡萄球菌GDMCC 60841、GDMCC 60843、GDMCC 60844和GDMCC 60845进行保存，并置于2-8℃条件下储存，每个月抽取3支按照前述计数方法进行检验含菌量。为了更好的比较各保护剂在长期储存过程中的效果，在制备定量质控菌时按照各保护剂的冻干存活率进行计算冻干前的活菌数，使冻干后，菌含量均约为1000cfu/瓶。

结果如图7所示，实施例5～7的冻干保护剂在长期储存过程中活菌数变化不大，而对比例1～3的冻干保护剂在长期储存过程中活菌数显著下降。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 广东省微生物研究所（广东省微生物分析检测中心）

广东环凯生物科技有限公司

<120> 含有特异性分子靶标的金黄色葡萄球菌标准菌株及其检测和应用

<130> 2020.12.28

<160> 13

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 999

<212> DNA

<213> 金黄色葡萄球菌

<400> 1

atgagaattg aattagatga attaccacat caaagtcaag caatagatgc tataaaaaaa 60

tcattttcag gattacaaaa gttaagtgtt cctactgtct tttcgaatcc tgaaatcaaa 120

tttagcggag aagaaaaagc aaatattgat ataaaaatgg aaactgggac tggcaaaact 180

tatgtcggag ttcgttcaat atatgaactt tttgatgaat ataaaatctt taaatttatt 240

atagttgtac ccactcctgc aataaaagaa ggatggaaaa attttataga atcggattat 300

gcaaaacagc atttctcaaa tgattttgaa aatattaaaa ttaatctaac cactataaat 360

tcaggtgatt tcagaagcaa gaggggattt ttgccagcgc atttaactga atttatagaa 420

tcagataata tggatagttc aactatccaa gtattattaa taaattcatc tatgctaatt 480

tctgagaaca tgaaaggtgt tataaccaga gggaagaaca aaggacaaga tagatttaat 540

caaattttat tgaatgaata tacaaaacct atagaggcaa ttagtgctac tcgaccaata 600

gtaattatag atgagcctca tagatttcct cctaaaggtg aattttataa aggaatatta 660

aatataaaac ctcaaatgat tttgagatta ggtgcaacgt ttccatacac tccaagtgaa 720

aaaaatcctg tagtagataa taaatatttc aatggaaatc ctaatttcga actcaatgct 780

atagatagtt ttaacttagg tttagttaaa ggtattgata tatattatcc taatttaact 840

tttgaacaag ctaaaagtcg atataaagtt gataatgtaa aaaataaaga attagttcta 900

agaaaaggaa aaaataagtg gaatataaaa attggagaca acttagcaaa catagatagt 960

ttatttgaag gtaacctaac tggttctgtt gcaaagtaa 999

<210> 2

<211> 723

<212> DNA

<213> 金黄色葡萄球菌

<400> 2

atggaatcca gatgtaataa aaatattttt gattatcttt ctagaaatga aattgctaat 60

aatagacttt acaatacttt aaaagatatt ggtaattcag aacctaaagt tactattagg 120

caacatgata gttctgatgt aaataagatt tttccagata attcttttga tttattggtc 180

acttctccgc catatgggga tagttcaact actgttgctt atggacaatt ttctagattg 240

tcattgcagt ggttagattt agaaattgat gaaaatacgg ccttaagtaa attagattct 300

ataatgttag gaggaaaagt agataagaaa gtagtaattg atagtattct tgattattta 360

gactcattga ctttaaagga cttatttaaa aaaataaatg aaaaagatga aaaaagagct 420

aagcaagttc ttcagttttt tatagatctt gattcttctt tagataatac agctaagtta 480

atgaagaatg acacgtatca atattgggtt gtggctaata gaacggtgaa aatgattagt 540

gttccgactg atattattat tgctgaaatg tttgaaaagt atgatgtata tcatattcat 600

agcttttata gaaatattcc taataagaga atgccttcga agaattctcc tacaaatatt 660

gttggaaatc attctgttac tatgtcttct gagataattt taatgtttag aaagtcagta 720

tga 723

<210> 3

<211> 369

<212> DNA

<213> 金黄色葡萄球菌

<400> 3

ttgataaaaa aagaaattaa taaacagcta aacaaaaaga aaaagacaga aaaagaggct 60

aaatcattca tcaaagatta tacagaacaa ctcaacaaag gctatgaatc atctgacttt 120

agcagattga aacgttactt tgaagatgat aaatcagacg tagcaactaa cattaagcaa 180

caagtagaat ccgacaaaag aacacatttc aaagatttaa atatagaatc ttcacaactt 240

aaagataatg aggttacagt gattattaat aagaaaaacg agaaaaaaca acgtatacgt 300

tcacaatatg acctcatata caacggagat aaagacgaat ttaaaatcag agaatacaaa 360

gatatttaa 369

<210> 4

<211> 744

<212> DNA

<213> 金黄色葡萄球菌

<400> 4

atgaaaaagc tatatgattt taaatggtct attcttttga ttgttatacc gcttgttttt 60

ttattcatga acaatatgtt cttccacttt agtatgaata ataaactgtt acctgtttat 120

ataagtagca atttcgcgtt gataattgcg tttattaaaa ttgagatgga tgagcataag 180

gaaaaaaaca aaatagagat gaataataag cgtattaccc ttgcttatta taatgactta 240

aatactttgc atttaaaatt catgcaaaac aagtataaag aacgtacaat cacccctgat 300

attgaaaata ttgataatta cgtaaaaaaa cattattatt gcttgaacta ctcaactgaa 360

attcttgaag aaacaaaacg tgctaaaatt aatataaaag tagctaaagt tagaagtgaa 420

ttacatcgtg aattattaga aattatcaaa aagatgttgt tagaaagtag tatcaatgtt 480

gataatgagt tatataatca attcaaagta atacaaacga aagcatttgt atctaaggca 540

cggaatttag atcgaattga aacagaatta aaaagaatct cacctatagt aatcaatcag 600

aatggtgaga ttaatgctaa tctatggcat aaaatatatc ctcatcttga cgatttaaaa 660

gtatttattt tgggagatga aggggtaatt caaaaagaat taaaagtctt aattaaagaa 720

attgatgata acagtaaaat ttaa 744

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

accacatcaa agtcaagcaa taga 24

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

actttgcaac agaaccagtt agg 23

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 7

ttggtcactt ctccgccata 20

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 8

cttcgaaggc attctcttat tagg 24

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 9

acagaacaac tcaacaaagg ct 22

<210> 10

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 10

tctttatctc cgttgtatat gaggt 25

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 11

atttcgcgtt gataattgcg tt 22

<210> 12

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 12

gaattacccc ttcatctccc aaa 23

<210> 13

<211> 2129

<212> DNA

<213> 金黄色葡萄球菌

<400> 13

atgaaaaaga taaaaattgt tccacttatt ttaatagttg tagttgtcgg gtttggtata 60

tatttttatg cttcaaaaga taaagaaatt aataatacta ttgatgcaat tgaagataaa 120

aatttcaaac aagtttataa agatagcagt tatatttcta aaagcgataa tggtgaagta 180

gaaatgactg aacgtccgat aaaaatatat aatagtttag gcgttaaaga tataaacatt 240

caggatcgta aaataaaaaa agtatctaaa aataaaaaac gagtagatgc tcaatataaa 300

attaaaacaa actacggtaa cattgatcgc aacgttcaat ttaattttgt taaagaagat 360

ggtatgtgga agttagattg ggatcatagc gtcattattc caggaatgca gaaagaccaa 420

agcatacata ttgaaaattt aaaatcagaa cgtggtaaaa ttttagaccg aaacaatgtg 480

gaattggcca atacaggaac agcatatgag ataggcatcg ttccaaagaa tgtatctaaa 540

aaagattata aagcaatcgc taaagaacta agtatttctg aagactatat caaacaacaa 600

atggatcaaa attgggtaca agatgatacc ttcgttccac ttaaaaccgt taaaaaaatg 660

gatgaatatt taagtgattt cgcaaaaaaa tttcatctta caactaatga aacaaaaagt 720

cgtaactatc ctctagaaaa agcgacttca catctattag gttatgttgg tcccattaac 780

tctgaagaat taaaacaaaa agaatataaa ggctataaag atgatgcagt tattggtaaa 840

aagggactcg aaaaacttta cgataaaaag ctccaacatg aagatggcta tcgtgtcaca 900

atcgttgacg ataatagcaa tacaatcgca catacattaa tagagaaaaa gaaaaaagat 960

ggcaaagata ttcaactaac tattgatgct aaagttcaaa agagtattta taacaacatg 1020

aaaaatgatt atggctcagg tactgctatc caccctcaaa caggtgaatt attagcactt 1080

gtaagcacac cttcatatga cgtctatcca tttatgtatg gcatgagtaa cgaagaatat 1140

aataaattaa ccgaagataa aaaagaacct ctgctcaaca agttccagat tacaacttca 1200

ccaggttcaa ctcaaaaaat attaacagca atgattgggt taaataacaa aacattagac 1260

gataaaacaa gttataaaat cgatggtaaa ggttggcaaa aagataaatc ttggggtggt 1320

tacaacgtta caagatatga agtggtaaat ggtaatatcg acttaaaaca agcaatagaa 1380

tcatcagata acattttctt tgctagagta gcactcgaat taggcagtaa gaaatttgaa 1440

aaaggcatga aaaaactagg tgttggtgaa gatataccaa gtgattatcc attttataat 1500

gctcaaattt caaacaaaaa tttagataat gaaatattat tagctgattc aggttacgga 1560

caaggtgaaa tactgattaa cccagtacag atcctttcaa tctatagcgc attagaaaat 1620

aatggcaata ttaacgcacc tcacttatta aaagacacga aaaacaaagt ttggaagaaa 1680

aatattattt ccaaagaaaa tatcaatcta ttaactgatg gtatgcaaca agtcgtaaat 1740

aaaacacata aagaagatat ttatagatct tatgcaaact taattggcaa atccggtact 1800

gcagaactca aaatgaaaca aggagaaact ggcagacaaa ttgggtggtt tatatcatat 1860

gataaagata atccaaacat gatgatggct attaatgtta aagatgtaca agataaagga 1920

atggctagct acaatgccaa aatctcaggt aaagtgtatg atgagctata tgagaacggt 1980

aataaaaaat acgatataga tgaataacaa aacagtgaag caatccgtaa cgatggttgc 2040

ttcactgttt tattatgaat tattaataag tgctgttact tctcccttaa atacaatttc 2100

ttcattttca ttgtatgttg aaagtgaca 2129

Claims

1.检测特异性分子靶标的引物在制备金黄色葡萄球菌检测试剂中的用途，其特征在于，所述特异性分子靶标为：

如SEQ ID NO:1~4所示的任意一种或几种核苷酸序列；

其中，检测SEQ ID NO:1所示的特异性分子靶标的引物用于制备金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）Sta3702B3，保藏编号为GDMCC 60841的检测试剂；

其中，检测SEQ ID NO:2所示的特异性分子靶标的引物用于制备金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）Sta403，保藏编号为GDMCC 60843的检测试剂；

其中，检测SEQ ID NO:3所示的特异性分子靶标的引物用于制备金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）Sta4127A1，保藏编号为GDMCC 60844的检测试剂；

其中，检测SEQ ID NO:4所示的特异性分子靶标的引物用于制备金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）Sta1942-0，保藏编号为GDMCC 60845的检测试剂。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，

针对检测如SEQ ID NO:1所示的特异性分子靶标的引物包括：如SEQ ID NO:5所示的上游引物和如SEQ ID NO:6所示的下游引物；

针对检测如SEQ ID NO:2所示的特异性分子靶标的引物包括：如SEQ ID NO:7所示的上游引物和如SEQ ID NO:8所示的下游引物；

针对检测如SEQ ID NO:3所示的特异性分子靶标的引物包括：如SEQ ID NO:9所示的上游引物和如SEQ ID NO:10所示的下游引物；

针对检测如SEQ ID NO:4所示的特异性分子靶标的引物包括：如SEQ ID NO:11所示的上游引物和如SEQ ID NO:12所示的下游引物。