CN111154899A - 4种常见可致病葡萄球菌特异性新分子靶标及其快速检测方法 - Google Patents
4种常见可致病葡萄球菌特异性新分子靶标及其快速检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了4种常见可致病葡萄球菌特异性新分子靶标及其快速检测方法，本发明方法提供了用于鉴别4种常见可致病葡萄球菌——金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌和人葡萄球菌的共19个新特异性分子检测靶标，以及对应的PCR引物组和PCR快速检测方法。本发明的检测方法可用于检测某些生化反应不敏感的菌株，弥补生化鉴定的缺陷，增强了实用性；本发明的检测方法还具有操作简单、结果判定易、检测时间短、特异性强、成本低的优点。
Description
技术领域
本发明属于微生物检验技术领域，涉及鉴别葡萄球菌的方法，具体涉及4 种常见可致病葡萄球菌特异性新分子靶标及其快速检测方法。
背景技术
葡萄球菌(staphylococci)是最常见的医院病原体之一，也是动物(奶牛) 乳腺炎直接相关的重要病原菌。金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)作为 葡萄球菌属中模式菌，是四大食源性致病菌之一。研究表明，每年由金黄色葡 萄球菌引发的食物中毒事件占食源性微生物食物中毒事件的25％，其产生的肠 毒素可导致呕吐腹泻给人类造成重大危害。根据《食品安全国家标准食品中致 病菌限量》(GB 29921-2013)，样品中金黄色葡萄球菌浓度均不得超出100CFU/g。 本研究团队前期对常见人源、食品、环境等样本中微生物分离鉴定中发现，表 皮葡萄球菌(Staphylococcu sepidermidis)(31.45％)、溶血葡萄球菌(Staphylococcus haemolyticus)(24.52％)及人葡萄球菌(Staphylococcus hominis)(12.26％)检出 率最高，且这三种菌也是临床发生交叉感染的常见可致病葡萄球菌(Kilic等， 2011)，其易感人群为老人、儿童、免疫力低下患者，严重感染可导致菌血症、 败血病和心内膜炎等(Pereira等，2010)。由于疾病严重程度及治疗方式取决于 感染葡萄球菌的种类及数量，快速精确鉴定不同种致病性葡萄球菌显得尤为重 要。
常见葡萄球菌检测主要利用国标规定的传统培养方法(GB 4789.4-2016)， 该方法结果较为准确，但检测时间较长(5d以上)，操作复杂(预增菌、选择 性培养、显色培养、生化鉴定)、成本高，无法实现快速检测。此外，应用生化 试验鉴定葡萄球菌，生化反应不稳定，鉴定结果重复性差，易造成误判。随着 分子生物学的发展，以PCR为主的分子生物学检测方法以其快速、准确、简便 的特点，逐渐成为取代传统检测方法最具潜力的检测技术之一。
目前，国内外PCR检测方法对上述四种常见可致病葡萄球菌检测的分子检 测靶标及引物已有一定的报道，其中金黄色葡萄球菌常见的特异性基因有nuc、 Sa422、entC、entB、mecA、FemA、FemB、Kan、tuf；表皮葡萄球菌特异性基 因recN、tuf、Serp0107、Se705、Se-fib、gseA、atlE、sodA；而溶血葡萄球菌特 异性基因仅发现mvaA、Shae 2个，人葡萄球菌特异性基因仅有gap 1个。在实 际应用中发现，已报道的金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌靶标基因数量虽然较 多，但属内具有较高同源性，其特异性较差，易造成假阳性结果导致误判。例 如，选用实验室已有的17种葡萄球菌对金葡菌nuc基因设计的引物进行特异性 验证发现，松鼠葡萄球菌和路邓葡萄球菌扩增结果均为阳性，无法通过此靶标 鉴定。而溶血葡萄球菌和人葡萄球菌在现有报道基因靶标中十分少，难以满足 实际检测的需要。随着临床治疗过程中葡萄球菌新种的不断发现，基于原有的 葡萄球菌分子靶标的精准鉴定面临了巨大的挑战。寻找新型特异性靶标分子用 于常见可致病葡萄球菌快速、精确检测具有重要意义。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的是克服现有技术的不足，提供用于鉴别4种 常见可致病葡萄球菌，即金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、表皮葡萄球 菌(Staphylococcu sepidermidis)、溶血葡萄球菌(Staphylococcus haemolyticus)、人 葡萄球菌(Staphylococcus hominis)的特异性新分子靶标及相应的检测方法。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：本发明要求保护一组用于鉴 别葡萄球菌的核苷酸序列，所述核苷酸序列如SEQ ID NO：1～19所示，所述葡 萄球菌为金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌或人葡萄球菌。
通过生物信息学分析得到4种葡萄球菌中(葡萄球菌为金黄色葡萄球菌、 表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌和人葡萄球菌)分别含有的特异性序列片段，如 SEQ ID NO.1～19所示；所述片段可作为鉴别这4种葡萄球菌的特异性新分子靶 标。通过检测待检测物是否含有相应的序列即可得到待检测物是否含有所述葡 萄球菌为金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌或人葡萄球菌中的至 少一种。
进一步地，所述序列SEQ ID NO.1～5用于鉴别金黄色葡萄球菌；所述序列 SEQ IDNO.6～10用于鉴别表皮葡萄球菌；所述序列SEQ ID NO.11～15用于鉴别 溶血葡萄球菌；所述序列SEQ ID NO.16～19用于鉴别人葡萄球菌。
进一步地，本发明还要求保护用于鉴别葡萄球菌的引物组，所述引物组为 根据如SEQ ID NO.1～19所示核苷酸序列设计得到。
所述引物组对应的产物为SEQ ID NO.1～19所示核苷酸序列全部或部分序 列。
通过根据相应的核苷酸序列设计对应的用于PCR的引物组，每一个引物组 包括一条正向引物和一条反向引物，对应检测一个核苷酸序列。所述引物组扩 增产物对应如SEQID NO.1～19所示核苷酸序列的全部或部分序列。
作为本发明的优选实施方式，所述引物组的核苷酸序列按5’到3’如SEQ ID NO.20～57所示；其中：
SEQ ID NO.20和SEQ ID NO.21为对应SEQ ID NO.1序列的引物组；
SEQ ID NO.22和SEQ ID NO.23为对应SEQ ID NO.2序列的引物组；
SEQ ID NO.24和SEQ ID NO.25为对应SEQ ID NO.3序列的引物组；
SEQ ID NO.26和SEQ ID NO.27为对应SEQ ID NO.4序列的引物组；
SEQ ID NO.28和SEQ ID NO.29为对应SEQ ID NO.5序列的引物组；
SEQ ID NO.30和SEQ ID NO.31为对应SEQ ID NO.6序列的引物组；
SEQ ID NO.32和SEQ ID NO.33为对应SEQ ID NO.7序列的引物组；
SEQ ID NO.34和SEQ ID NO.35为对应SEQ ID NO.8序列的引物组；
SEQ ID NO.36和SEQ ID NO.37为对应SEQ ID NO.9序列的引物组；
SEQ ID NO.38和SEQ ID NO.39为对应SEQ ID NO.10序列的引物组；
SEQ ID NO.40和SEQ ID NO.41为对应SEQ ID NO.11序列的引物组；
SEQ ID NO.42和SEQ ID NO.43为对应SEQ ID NO.12序列的引物组；
SEQ ID NO.44和SEQ ID NO.45为对应SEQ ID NO.13序列的引物组；
SEQ ID NO.46和SEQ ID NO.47为对应SEQ ID NO.14序列的引物组；
SEQ ID NO.48和SEQ ID NO.49为对应SEQ ID NO.15序列的引物组；
SEQ ID NO.50和SEQ ID NO.51为对应SEQ ID NO.16序列的引物组；
SEQ ID NO.52和SEQ ID NO.53为对应SEQ ID NO.17序列的引物组；
SEQ ID NO.54和SEQ ID NO.55为对应SEQ ID NO.18序列的引物组；
SEQ ID NO.56和SEQ ID NO.57为对应SEQ ID NO.19序列的引物组。
进一步地，所述引物组可用于鉴别金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血 葡萄球菌或人葡萄球菌。
本发明还提供了用于鉴别葡萄球菌的方法，包括如下步骤：
S1：使用所述的引物组中的其中一种对待测样品DNA进行PCR扩增；
S2：进行凝胶电泳检测扩增产物；
S3：观察扩增产物是否符合预期。
一般地，一个PCR体系中仅含有一组引物；可通过设置多个PCR体系，同 时对单个菌的DNA使用不同引物进行扩增，提高检测效率。本发明的引物对应 的产物特异性较好，通过观察扩增产物是否在预期位置即可判断是否存在所述 葡萄球菌。
作为本发明的优选实施方式，所述S1中的PCR扩增体系包括：PCR反应 缓冲液、MgCl2、dNTP、模板DNA、引物组、Tag酶和灭菌双蒸水。
作为本发明的优选实施方式，所述PCR扩增体系为：10×PCR反应缓冲液 2.5μL，25mM MgCl2 2μL，2.5mM dNTP 1μL，模板DNA 100ng，5μM引物 各1μL，Tag酶1U，灭菌双蒸水补足体积至25μL。
作为本发明的优选实施方式，所述S1中的PCR扩增程序为：95℃预变性5 min；95℃变性30s；55～58℃退火30s；72℃延伸30s；变性、退火、延伸共进 行30个循环；最后72℃延伸10min。
本发明公开了用于鉴别4种常见可致病葡萄球菌(金黄色葡萄球菌、表皮 葡萄球菌、溶血葡萄球菌和人葡萄球菌)的特异性分子靶标，并提供了相关的 引物组，以及对应的PCR检测方法。与现有技术相比，本发明的检测方法可用 于检测某些生化反应不敏感的菌株，弥补生化鉴定的缺陷，增强了实用性；本 发明的检测方法还具有操作简单、结果判定易、检测时间短、特异性强、成本 低的优点。
附图说明
图1为实施例2中金黄色葡萄球菌PCR检测方法特异性评价电泳结果。
图2为实施例3中表皮葡萄球菌PCR检测方法特异性评价电泳结果。
图3为实施例4中溶血葡萄球菌PCR检测方法特异性评价电泳结果。
图4为实施例5中人葡萄球菌PCR检测方法特异性评价电泳结果。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实 施例对本发明作进一步说明。
实施例1 4种常见可致病葡萄球菌的特异性新分子靶标的挖掘
根据GenBank数据库及本团队自测的葡萄球菌全基因组DNA序列，进行 生物信息学分析；筛选得到4种常见致病葡萄球菌(金黄色葡萄球菌、表皮葡 萄球菌、溶血葡萄球菌和人葡萄球菌)的特异性基因片段，所述基因片段的核 苷酸序列如SEQ ID NO.1～19所示。
其中，所述序列SEQ ID NO.1～5用于鉴别金黄色葡萄球菌；所述序列SEQ ID NO.6～10用于鉴别表皮葡萄球菌；所述序列SEQ ID NO.11～15用于鉴别溶血葡 萄球菌；所述序列SEQ ID NO.16～19用于鉴别人葡萄球菌。
实施例2所述葡萄球菌的快速检测方法
1)引物设计
根据实施例1中的所述序列SEQ ID NO.1～19设计特异性PCR扩增引物组 (包括正向引物和反向引物)，引物组序列如下表1。
表1特异性PCR检测引物组
2)鉴别葡萄球菌的方法，步骤如下：
S1 DNA模板制备：将待测菌株分别在LB液体培养基中增菌培养，使用商 品化的细菌基因组DNA抽提试剂盒分别提取其细菌基因组DNA，作为待检模 板；
S2 PCR扩增：使用所述的引物组1～19中的其中一种对待测样品DNA进行 PCR扩增
①PCR检测体系：
其中：
当模板DNA用于鉴别是否存在金黄色葡萄球菌时，使用引物组1～5任一组 引物；
当模板DNA用于鉴别是否存在表皮葡萄球菌时，引物为引物组6～10任一 组引物；
当模板DNA用于鉴别是否存在溶血葡萄球菌时，引物为引物组11～15任一 组引物；
当模板DNA用于鉴别是否存在人葡萄球菌时，引物为引物组16～19任一组 引物；
②PCR扩增程序：
其中：
使用引物组1～5中的引物，退火温度为58℃；
使用引物组6～10中的引物，退火温度为57℃；
使用引物组11～19中的引物，退火温度为55℃。
S3：取PCR扩增产物进行凝胶电泳；
S4：观察各引物组对应产物大小的位置是否存在单一扩增条带。如果存在， 说明样品中含有对应的葡萄球菌；如果没有出现相应的单一扩增条带，则样品 中不含有对应的葡萄球菌。
实施例3金黄色葡萄球菌PCR检测方法的特异性评价
取金黄色葡萄球菌91株，非目标葡萄球菌16株(表皮葡萄球菌、人葡萄 球菌、溶血葡萄球菌、路邓葡萄球菌等)，非葡萄球菌90株(沙门氏菌、大肠 埃希氏菌、志贺氏菌等)，按照实施例2的方法进行PCR检测。其中，S1 DNA 模板制备为分别提取各细菌的基因组DNA；S2PCR扩增时，使用的引物为引物 组1～5中任一种引物。设置空白对照，空白对照的模板为不含基因组的水溶液。
所用各细菌的菌株及检测结果如下表2所示，表中，检测结果栏目中“+” 表示阳性，“-”表示阴性。PCR产物电泳结果如图1所示；其中，(a)为1～91 为91金黄色葡萄球菌；(b)为1～90为非葡萄球菌，91为阳性对照；(c)为1～16 为16株非目标葡萄球菌，17为阳性对照；M为2000Maker，C为空白对照。
表2本发明金黄色葡萄球菌检测特异性评价试验结果
由图1和表2可得，5种引物组的检测结果均只有金黄色葡萄球菌显示出特 异性扩增条带，非目标葡萄球菌及非葡萄球菌菌株均无特异性条带，说明本发 明方法特异性高。
实施例4表皮葡萄球菌PCR检测方法的特异性评价
取91株表皮葡萄球菌，非目标葡萄球菌16株(金黄色葡萄球菌、人葡萄 球菌、溶血葡萄球菌、路邓葡萄球菌等)，非葡萄球菌90株(沙门氏菌、大肠 埃希氏菌、志贺氏菌等)，按照实施例2的方法进行PCR检测。其中，S1 DNA 模板制备为分别提取各细菌的基因组DNA；S2PCR扩增时，使用的引物为引物 组6～10中任一种引物。设置空白对照，空白对照的模板为不含基因组的水溶液。
所用各细菌的菌株及检测结果如下表3所示，表中，检测结果栏目中“+” 表示阳性，“-”表示阴性。PCR产物电泳结果如图2所示；其中，(a)为1～91 为91表皮葡萄球菌；(b)为1～90为非葡萄球菌，91为阳性对照；(c)为1～16 为16株非目标葡萄球菌，17为阳性对照；M为2000Maker，C为空白对照。
表3本发明表皮葡萄球菌检测特异性评价试验结果
由图2和表3可得，5种引物组的检测结果均只有表皮葡萄球菌显示出特异 性扩增条带，非目标葡萄球菌及非葡萄球菌菌株均无特异性条带，说明本发明 方法特异性高。
实施例5溶血葡萄球菌PCR检测方法的特异性评价
取33株溶血葡萄球菌，非目标葡萄球菌16株(金黄色葡萄球菌、表皮葡 萄球菌、人葡萄球菌、路邓葡萄球菌等)，非葡萄球菌90株(沙门氏菌、大肠 埃希氏菌、志贺氏菌等)，按照实施例2的方法进行PCR检测。其中，S1 DNA 模板制备为分别提取各细菌的基因组DNA；S2PCR扩增时，使用的引物为引物 组11～15中任一种引物。设置空白对照，空白对照的模板为不含基因组的水溶 液。
所用各细菌的菌株及检测结果如下表4所示，表中，检测结果栏目中“+” 表示阳性，“-”表示阴性。PCR产物电泳结果如图1所示；其中，(a)为1～33 为33溶血葡萄球菌和1～16为16株非目标葡萄球菌，17为阳性对照；(b)为 1～90为非葡萄球菌，91为阳性对照；M为2000Maker，C为空白对照。
表4本发明溶血葡萄球菌检测特异性评价试验结果
由图3和表4可得，5种引物组的检测结果均只有溶血葡萄球菌显示出特异 性扩增条带，非目标葡萄球菌及非葡萄球菌菌株均无特异性条带，说明本发明 方法特异性高。
实施例6人葡萄球菌PCR检测方法的特异性评价
取75株人葡萄球菌，非目标葡萄球菌16株(金黄色葡萄球菌、表皮葡萄 球菌、溶血葡萄球菌、路邓葡萄球菌等)，非葡萄球菌90株(沙门氏菌、大肠 埃希氏菌、志贺氏菌等)，按照实施例2的方法进行PCR检测。其中，S1 DNA 模板制备为分别提取各细菌的基因组DNA；S2PCR扩增时，使用的引物为引物 组16～19中任一种引物。设置空白对照，空白对照的模板为不含基因组的水溶 液。
所用各细菌的菌株及检测结果如下表5所示，表中，检测结果栏目中“+” 表示阳性，“-”表示阴性。PCR产物电泳结果如图4所示；其中，(a)为1～75 为75人葡萄球菌；(b)为1～90为非葡萄球菌，91为阳性对照；(c)为1～16为 16株非目标葡萄球菌，17为阳性对照；M为2000Maker，C为空白对照。
表5本发明人葡萄球菌检测特异性评价试验结果
由图4和表5可得，4种引物组的检测结果均只有人葡萄球菌显示出特异性 扩增条带，非目标葡萄球菌及非葡萄球菌菌株均无特异性条带，说明本发明方 法特异性高。
实施例7葡萄球菌疑似菌株的检测
根据实施例2的PCR检测方法对283株从人源样品中分离葡萄球菌疑似菌 株进行检测，人源样品采集于广东省梅州市蕉岭县长寿乡，样品处理及疑似菌 株的分离参见国标法。其中，S1 DNA模板制备为分别提取各细菌的基因组DNA； S2 PCR扩增时，使用的引物为引物组1～19中任一组的引物。检测结果如表6。
表6葡萄球菌疑似菌株的检测结果
| 葡萄球菌 | 本发明检测法 | 16s rDNA鉴别 |
| 表皮葡萄球菌 | 107 | 107 |
| 人葡萄球菌 | 96 | 96 |
| 溶血葡萄球菌 | 36 | 36 |
| 金黄色葡萄球菌 | 4 | 4 |
| 头状葡萄球菌 | \ | 13 |
| 沃氏葡萄球菌 | \ | 7 |
| 腐生葡萄球菌 | \ | 3 |
| 松鼠葡萄球菌 | \ | 3 |
| 继发性葡萄球菌 | \ | 3 |
| 路邓葡萄球菌 | \ | 2 |
| 科氏葡萄球菌 | \ | 2 |
| 巴氏葡萄球菌 | \ | 2 |
| 坐骨葡萄球菌 | \ | 2 |
| 猪葡萄球菌 | \ | 1 |
| 施氏葡萄球菌 | \ | 1 |
| 显微葡萄球菌 | \ | 1 |
由表6可得，利用本发明方法，目标葡萄球菌检出菌株数分别如下：表皮 葡萄球菌107株、人葡萄球菌96株、溶血葡萄球菌36株、金黄色葡萄球菌4 株，经16S rDNA鉴定方法是4种常见可致病葡萄球菌，其他疑似菌株经鉴定为 其他葡萄球菌。通过本实施例说明本发明的4种常见可致病葡萄球菌的19种 PCR检测方法可靠性高，能有效识别所述4种常见可致病葡萄球菌。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本 发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域 的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换， 而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 广东省微生物研究所
<120> 4种常见可致病葡萄球菌特异性新分子靶标及其快速检测方法
<130> 2020
<160> 57
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 486
<212> DNA
<213> Staphylococcus aureus
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<212> DNA
<213> Staphylococcus aureus
<400> 4
atgagtatgc cattgatgat agatttaaca aataagaacg tggttatagt aggtgggggt 60
acagttgcaa gtcgtcgggc acaaacatta agtcaatacg ttgaacatat gacggtcatc 120
agtccgacaa tcactgaaaa acttcaaaat atggtagata aaggtgtcgt catatggaag 180
ggaaaagagt ttgaaccaag cgatattgta gacgcgtatc tagttattgc agcaaccaat 240
gagccacgtg tcaatgaagc ggtaaaacaa gccttacctg agcatgccct ttttaataat 300
gttggagatg catcaaatgg caatgttgta tttccaagtg cactacaccg agacaagcta 360
actattagtg tatctacaga tggcgcaagt cctaagttga caaaatcgat tatggcagag 420
cttgaggcgt tatatccacc atcatatagt tcgtatatcg actttttata tacttgccga 480
cagaaaataa agttactaga tataacatat aacgaaaagc aacagttact gtcacaaatt 540
gtgtcacaag aatatttaaa tcatgacaaa caagctcaat ttttagcgtg gttggatgta 600
agacaataa 609
<210> 5
<211> 1011
<212> DNA
<213> Staphylococcus aureus
<400> 5
atgtcaatta agattttaca accaggtctc ttttcaacgg tacaagatct aggaagaaaa 60
ggttatgaac atattggatt ttcaggcgca ggtgccatgg atcaatttag ttttaaggtt 120
gcgcagtcat taattaacaa tgatggtcca gcgattgaat atactttgat tggtcctacc 180
attcaattta atacgcaaaa tacatttgtt ataaccggtg gtagtgttaa tgcctcgcta 240
aataataaaa ctatatcaat gaattctgtc atattagctg agaaaggtga cattttaaaa 300
ataggtgcta taaccaaagg tgcacgcggt tatcttactt ttggtcatac tatcaacgta 360
cctccaattg ctgaaagtta tgcaacacat acccgaagta gtataggagg attcaaaggt 420
agaaagttat tagctaatga tgtaataaca gtgaaaataa ataatgactt taaagaaaac 480
attggaaaga ctattcattt acaggacgat ttattgccag aaaataatat tatacacatt 540
cttcaaggac ctcaattcga ggcattttct gaagaggcta gagcgaaaat tgtaaatcat 600
ccatatttaa ttaccgaaca atcagaccgt atggggtatc gtttggaagg tgacagcgtt 660
gcacctatta atcaagcaga tatcatttct gaaccggttg ctcttggcag tgttcaagta 720
ccaaatgatg gtcaacctat tattcttctt aatgataaac aaacgatagg tggttatacc 780
aaaattgcaa ctgtatgcaa atttgatctg ccaaagttag cacagatgaa accacaagat 840
acaattcaat ttaaatggat atcattccaa gaagctgtag ataagaatcg ggaacaaatg 900
tctctgttta atgaaattct taagagtcat caaaagactc caatttttga tacatctagc 960
ttgcgacata cttcgaaaaa attagcaaca attttaaaag gggatttgta a 1011
<210> 6
<211> 519
<212> DNA
<213> Staphylococcu sepidermidis
<400> 6
atgttagaaa cacatagatt aaagctagtg aagcctaatt tgagttatac agatgaactt 60
tatcaattgc atacaaataa ggtagctaca aagtatacac ctaaaggtat tcatcagaat 120
aaagtagcaa cccaagattt tattaaagga tggatgaggc attgggatga atatcaattt 180
ggttacttca ttttaattat gagagataat cacgaagtag tgggaatagc gggatttgag 240
tatcgtacaa ttcatcaaca acagtttctt aatgcgtatt atagaatctt tccatcgtat 300
actggtgttg gtttagcttt tgagtcaatg gaggagattg cccgtcattt aaaaaagcat 360
gataccataa caccaaaatt aattcgaaca aatcaatata atacaaattc tattaaatta 420
gcacaaaaac ttggatataa ttatgatgct aactgggacg atgtaattaa taaaggagat 480
cgttgttttt ttaatctaca aacgttggat aataactaa 519
<210> 7
<211> 1185
<212> DNA
<213> Staphylococcu sepidermidis
<400> 7
atgtcacgca tagtattagc tgaagcatat cgaacaccta taggcgtgtt tggtggtgta 60
tttaaggata tacctgccta tgaactaggt gcaacagtta ttcgtcaaat tttagaacat 120
agtcaaatag atcctaatga aatcaatgaa gttattctag gaaacgtatt acaggcaggt 180
caaggacaaa atcctgctcg tattgctgcg attcatggtg gtgtgccaga agcggtacct 240
tcttttactg taaataaagt ttgcggttct ggattaaaag cgattcaact tgcctatcaa 300
tctattgtag cgggagataa tgagattgtt atcgctggag gcatggaaag tatgtctcaa 360
tctccaatgc ttcttaaaaa tagtcgtttc ggttttaaaa tgggaaatca aactttagaa 420
gatagtatga tagctgatgg tttaactgat aagtttaatg attaccatat gggtatcaca 480
gccgaaaatc tagttgaaca gtatcagatt agtcgtaaag aacaagatca atttgcattc 540
gattctcaac aaaaagcatc acgtgcacaa caagctggtg tatttgatgc tgaaattgta 600
cctgtagagg taccacaacg taaaggcgac cccctaatta tttctcaaga tgaaggcatt 660
agacctcaaa cgacaattga taagttagca caactccgtc cagcatttaa aaaagatgga 720
tcagtaactg ctggtaatgc atccggtatc aatgacggtg ctgctgctat gctcgttatg 780
acggaggaca aagcgaaagc attgggctta caacctatag ctgtattaga tagttttggt 840
gcgagtggtg tggcgccttc aattatgggt attggtccag ttgaagcgat acataaagct 900
ttaaaacgtt ctaataaagt gataaatgat gttgatattt ttgaattaaa cgaagctttt 960
gcagcgcaat caattgctgt aaaccgtgag ttgcaattac cgcaagataa agtcaatgtt 1020
aatggtggtg cgattgcact aggacatccg ataggggctt cgggtgcgcg tactttagtt 1080
tcattattac atcaattaag tgatgctaag ccaacaggtg tggcatcttt atgtatcggt 1140
ggcggtcaag gtatcgctac ggttgtatct aaatatgaag tttaa 1185
<210> 8
<211> 957
<212> DNA
<213> Staphylococcu sepidermidis
<400> 8
atgttacttt ttttatgttt tctaatcgaa ttattactta ttgttttatt atatacgaag 60
caatcgttta ctcttaattt atttagtttc atcttatata acatcattgg ttttgttatg 120
atgacttatc atatggtaac tgtatcaata ccatatgata tgtttatcat tgtaattgta 180
gcaatgatac tgttgttgat taaacatcgt tatattttca agttgcaaac aggacgtttt 240
tttattttac aacttagtca tcatttttat actgtggggc tatttgctgt gagttgttta 300
tatataagta ctattcccct aattatcatt aatagcttag ctttatgggc cgctaccatt 360
gcatttagta caatttattc atttatcgga tacttatctt ggtctacagc ttttgaaaat 420
catcaatatt ataaacacgt aaagttaatt atggtgcttg gagctggaat tttctctgaa 480
gaagtgacta cgcttcttgc tgcaagactt gataaagctt tatctgttta tcattcacaa 540
cggactaaac ctatcatcat tgtaagtggt ggccaaggtc ctgacgaacc aatttcagaa 600
gcacttgcga tgaaaagata ccttatagct cacaacgttc cggaaaacca tatatttatg 660
gagaatcaat ccacgaatac acgaaccaat ttcttatact ctaaatctat cattcattcg 720
atgatgccta cttcaaatca tatgttgtgt gtaacaagtc aatttcatgt tttaagagcg 780
cttaaatttg ctaaaaaagc tcatctttct ttcgatggca ttggaagtcg tacaccatac 840
cactttttgg cacaatctat gattatagac tttttgggtt taatgtatca atataaaaca 900
atacttacta tttatttcgc tatgttgttt tggcttgcaa tactacaaac catataa 957
<210> 9
<211> 819
<212> DNA
<213> Staphylococcu sepidermidis
<400> 9
atgaaaataa atgttttatg cgagaagagg gacaatatgg atattaaaca atcttcagag 60
aaacaaggtc gaccgcatca tttatcagac agtaggacag ttttaaaaag aaattttata 120
ttaataccaa cttatatttt attacaaagt atcataccaa tcattgttgt tttcggctca 180
ttaggcatca ctgccatgat aacacaacag gcaccaccac aatggttgta tcattgttca 240
ttgagtttaa gttttgtgat tgctcaaggt ctaatattaa ttatctttta taaaatacat 300
caatctgtaa taaatgatgt gatgaagcaa caatggataa ttgcaaagaa taaaataatt 360
aaaattgtaa tagttgcgat tgtcgtatat ttattattac ttataattcg ggtgattgga 420
acatcattac ctaatcattt aagttatcat ctcactcaat ccgaacaacg tacgctaggg 480
ctatttaaat caccatatgt gttgttagtt acttttatat ccatggtatt cttacgtcca 540
atggtagaac aaatcattta tagatatctc atcatccatg aattaggaaa agtatggaat 600
agacaatttg taattggttt gtctattgtt attgaaacga tcgtacatgt ttacgacatg 660
gcatcgattt ttgaaatttt tccatatatc gttattgctt cagcagctac aatactatat 720
attaaatcgc gggataattt aattgtcgct tatatatttc aagtgatttt gcaatgtatc 780
ctttttatag aaattttatg taagtatacc aacttttaa 819
<210> 10
<211> 804
<212> DNA
<213> Staphylococcu sepidermidis
<400> 10
atgaaaaaaa ttgcagcgat aatattttta ataggcttgt cactaattat tatttgtagc 60
gtgggagttt atgcacaaaa taaaaaattg agtaaagaca atcaatataa taatcaaaca 120
acaaatttaa tgaaaaacta tgatgataat actgtgaaaa gtatttacgt tgatggaaaa 180
gtaagtgata taactgtgaa aaaaggtaaa catttttcgg ttaagtccaa agggaatgac 240
aaaaatttaa acgtaactag caaggtgaac aatcaacgtt gggtaattac agagcgtcaa 300
acaagtccac atattaattt tagaatacaa ggtaaagtta gtaatcacat tacgattaca 360
gtacctaaat atattaaaaa catagatatt aaaactaatg ccggggattt aaatattgtt 420
ggagtaaata gtggcacagg aagatttgat gctgaatctg gagacattaa agttcaaaaa 480
ggacgatata aaaaggtgac acttcataat gaggatgggg atattcatac gaaagatatt 540
cattttaatc aagctaatat tcaaaatgac aatggggata ttcaaatgaa acaattagac 600
cctgatattc ctttacgtat taaaaatgaa gaaggggata taaacttgaa ttataaaaaa 660
gaacttcatc acacccaaat catcactcgt aatgaagaag gggaaacaga catcgatcat 720
cgtgtgttat ataatagtaa agttgaaaat ggaaataata aagtgaaatt aatcaatgaa 780
aatggagata ttaaagtaaa ataa 804
<210> 11
<211> 687
<212> DNA
<213> Staphylococcus haemolyticus
<400> 11
atgaataaac aaataagtga aatttcacct aagatgacgt tgcctatgtt catgattggg 60
ttaattattt ttgtcgttgt tgcaataaat gtaattcacg atacattatt ggttcaaaat 120
gtcgatatag gttctttaca ttggctgaca gattattttg gtgagccgga acgtaaatac 180
ggcgatggta tttggcataa tttcatgact ttttgtgctg agataggaga agtaaagtca 240
gttatctata tcacactatt tttagcaatt gttttattgt ttaaacatta taaattatcg 300
atttggatgg ttttaactat aacgagtggt acgttattaa attatttaat taaacaactc 360
atcgagagac aacgtccatt taatcatttg atgcgagacc acggatattc atttccaagt 420
gggcattcta atgcaagtac gttacttgct ttaatattgt taattatttt aattccttta 480
ataaaactca aagcaataag gataatagcc aatactatca ctattatcat ttggataggt 540
gtgctgtgtt gccgactata ttttcatgcg cattatatta cagatgtagt tggaggcgtt 600
acactaggta tcatttgggt agcattgttt ttaatgatat taccattgtt ttatcttaat 660
ttacgtaata agcctaataa taaatag 687
<210> 12
<211> 318
<212> DNA
<213> Staphylococcus haemolyticus
<400> 12
atgatgccaa aggtttatgg ctcacttgta gacaatgaaa cacgatgcac acattaccat 60
acttttttag atgttatagc aataaaattc aaatgctgca ataaatatta tccgtgttat 120
caatgtcacg aagaacacga aacacaccct atcaaaagat ggtcagaaca agaatttgat 180
gaaaaggcaa ttatgtgtgg tgtatgtaaa catgaaatgt ctattcaaga ttatatgatg 240
acagagctat gtcctaaatg ccaagcacat tttaatagtc gttgtaaatt ccactatcat 300
ttatattttg aattataa 318
<210> 13
<211> 465
<212> DNA
<213> Staphylococcus haemolyticus
<400> 13
atggaaattc gaccatattc aaatcaagat aaaccattat tagatgtatt tgaaatatta 60
ccagaagata gaaaattcac tcggacacct atccaaaata ttgatttagc taaaggagac 120
gacgagcgtc acccgactct tgttatgaga gataatcaat gtgtgggctt ctttacttta 180
catgaaggtc agggtgttaa accatatagt gacaataata aagctatatt tttccgttca 240
tttagtgtgg atgcacgata tcgtggtcaa ggtcttggaa aagcagtgat tcaacaacta 300
ccaagctata taaattcaac atttccttac attaatgaaa taatattaac tgtgaatact 360
gacaacgaca aagccatcgg attatataag cgagcccaat attctattac tggagatgca 420
attttagaag ggcgaccagt ttacgttatg aattttaaaa tatag 465
<210> 14
<211> 732
<212> DNA
<213> Staphylococcus haemolyticus
<400> 14
atggagaaac tgttgttcta tacaggcacg gtattactaa ttattgcgat tatattaatc 60
ttgttcgcta ttgtggcagt atttaaaaat aagaattatt ttaaatattt tgcgatggct 120
attacgatta ttctactaag tatacttgct ttaggcattc ataaaatgat tgaaagtaat 180
aatccatcta aaaatcaagc aactcaatct aaagataagc aatctaaaga ggataaatca 240
tctaaagata aaaagaaaaa agacaaaaaa atggacgaca aagatgataa taatgttact 300
caagaagaac aaaatcgttc tgaagaaaca tcaactaatg aagaattaaa tactcaagaa 360
caacaaagct cacaacaaga gcaaccaaca accgaagaat caaataacga agcaccttct 420
actcaacaag atactacaca ggataatact gtaaacaatc aaaataatac ttcttctaat 480
aataatcaaa atgcgaatca agcaaacgac acaaatcaaa actataatca aagtaataga 540
aatagtaata acaatggtga taatagcggt tcaaacggaa atgtttctac agaggatagt 600
tcaagtactg agaatcagtc taatgaaaat caaacacaga catattcaga aaatagctcc 660
gctgaacaat ctgaaaatgg cgaagcaata actgagacta atacagatga atcaaataat 720
agtgcaaact aa 732
<210> 15
<211> 738
<212> DNA
<213> Staphylococcus haemolyticus
<400> 15
atgacgaaca ttataacgtt acttgatatt gaatataaat tattatttcg acgcaaatta 60
tcatcattta tggctttcat cttccctttg gcattctatt tattgtttac atcattaatt 120
gatatgccag cagatgcgaa aaaagtattt tacaaagagt atatgtatag tatgacggta 180
ttcagtttaa tgggattttg cctgatgcaa tttccattag aaataatcga ggaaagaaac 240
agtggttggt ataaaagatt aatttctaca ccgatcacag tgttaaatta ttatttagct 300
aagattatta aaactatgac tttattttta gcttcaatat tgcttttatt ctgcgtagca 360
cacttctata aaggggtaga tctaagtgta agtgaatgga ttttatctgg tgtctcttta 420
tggttaggtg ctagcatgtt tttgacatta ggtttaatca ttacgcaatt tactgaaaca 480
cagaaagcaa gcagcgtagc taatctatgt aatattgtat tagccattat tggtggattg 540
tggttccctg ttagtacatt tcctgattgg atgcaaacaa ttgctaaact aacaccaacg 600
tatcatttac gtcatttggc acttgaattt ggtaaaggta atggctttaa tgtacaatca 660
ttcataattt taggtattta tagcattatt ttcttaatta ttgcattatt aattaataag 720
agcaaagagg tggaataa 738
<210> 16
<211> 441
<212> DNA
<213> Staphylococcus hominis
<400> 16
ttgaatttag aatttaacat tgccgttcac gtacttagct ttttagtaaa acacgacaac 60
caacaattca gtagtcaaac tttagcaaaa ttaacctgcc tcaatccagt tcaattacgt 120
agagtaacta cggttttaaa tcaatatcag tttattcata cttcccgtgg taaaaatggt 180
ggatatagtg caaattattc aactgctagt attaagctat cagtactata tcgtatattt 240
gtgcttgaaa aagatagcca acagcgtatt ttcacaggtc atgagcagag cgattgtgaa 300
atatcaagaa acatagcaaa gaccatgtca cactataatc aaaaagaaca tcgtgttatt 360
ttaaattttt atgataccct cactattaat gatgtaatta atgatacact tcaggaggat 420
acaacatatg acacattata a 441
<210> 17
<211> 957
<212> DNA
<213> Staphylococcus hominis
<400> 17
atgctagcaa tcattttatt atttattgtt ttaattatta tcctaagtgt tttgtttaat 60
ataagacact ttatctctct ttcttttttt attacaagcg tgatattatg tttcaccatt 120
agtctcatta atatcatgac catgacccta ccaactggat tgtttatatt aattatcatt 180
tctaccatcg gtttgcttgt caaacattct catctattca aaattaaaaa aggaacccgt 240
ttcttaaata aaatgtttcg tagattaata aatggtgtct tatttattgg tatatttata 300
tatcttagta caataccatt acctatttta aatggcatgt ttttatggat tgctttaatt 360
ttatttagtg cttgttacgc tttcattata tatttaattt tttcttctgc atttgaacgt 420
gctaaaaccc ataaacaata tgatatgatt cttatacttg gcgcaggtat attcaatgaa 480
acagtcactc ctatgctagc ctctagactg gatagagctt tagaaatcta taaagtacag 540
tcgcataatt gcaatatatt ggtaagtggt ggtcaaggtc ctgacgaacc aatttcagag 600
gccttagcaa tgaagaatta tctcattaaa tgtggtgtat catcttcttc aatattgatg 660
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ttacgttttg cacaaaagtt aaatataaaa ataataggat taggaagttc aacgccttat 840
cattttctag ataaagcgct cttacgagat tttcttgcac ttatatatca atataaatta 900
cttttgactt tgtatttagt cggagtattt atagcgtcaa tttggatatt actttaa 957
<210> 18
<211> 957
<212> DNA
<213> Staphylococcus hominis
<400> 18
atgaaacaac atctatattt aacattttca gtttggacac ttttcttatg tatcataatg 60
gctataagtc ttttttggga tttagggtca ttacatcaag catttaatca aatgattttt 120
tttaaagtta gagttcctag aacatttgag gcgcttatgg taggagctat attaacgttg 180
acgggtcaat tatttcaaac ggtattaaat aatcctttag cagatagctt tacacttggt 240
ttagcgagtg gagcgacttt tggatcaagt ttagctatat ttttaggcgt atcttttcta 300
tttattccaa ttttttctat catttttagt atcacgacac ttttacttgt tgttataatg 360
acaatcgtat tgtctagaaa ttttccaatt agagtactca tcatatctgg acttatggta 420
ggcgcttttt ttaatgcatt aatatatata cttacactca ttaaaccaga acgtacgaat 480
cgtatgttag cctattattt cggaggattt gcgaatgccg aaatgaatga gctcgtttat 540
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cttgctatac aaatgacatt aaacatattg ataggtgcat taacgatgct attcgctgat 840
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gttgggatac ccatattatt ttatatttta gtcactcaat ctaatacaac acgttag 957
<210> 19
<211> 810
<212> DNA
<213> Staphylococcus hominis
<400> 19
atgacttcgg aacataatga tacatactac caaacctcag aacagcgacc gataagaaat 60
gaatttgatt caaaacgtat tgttaaacgt gatttttggc taatacctac atacttagtc 120
atgaatattg tttttccatt gattcttaca tttattgtga tggcaatgat ttcaggcatc 180
acaggtggtc atatatcgga aagtaagttt acaaaatatt atttaggata tgcgcaagtc 240
tttacgttaa ttggtcaatg tcttgtatta gtagtctttt atttaatgca tcgcaaaacc 300
attattccta ttgccatctc acgttttaaa gctttaaaaa aacatattcc actcattatt 360
attgtgatgg tggcccttta tgtgttgcaa ggtgcatatg gttatttagt agaattttta 420
ccgaaacaat atcagtttga tgatacagaa aataacaaaa tgattattaa aatgtttgaa 480
atcaattggc tttggcctgt tttattttta gatattgtga ttattacacc tgttgtagaa 540
gaattattat tcagacattt gttaattcat gagttaggta aaaaattaac gtatggtgtg 600
atgtatgtcg tgtcagtact cggatttgca ggattacata tgacaagtgc atcatcacca 660
tttgaagttg gtccttatat aattatggct acaggatttg ttgtggcata tcacttaagt 720
ggtcgaaatt tagcgatgac gattacccta catatgataa ataactttgt ttcttttata 780
gcgattatta tgagtatcat ttggggttaa 810
<210> 20
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
gcaccattta gcgataacca ag 22
<210> 21
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
aacaggtctt ccgacgaaca tac 23
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
aagttcgcaa agttcatcac 20
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
ctgacagaag ttgtttcggt 20
<210> 24
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
gtgagcgaga cagatgaacc t 21
<210> 25
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
cgtaactgag caaagaaatg agc 23
<210> 26
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 26
ggtcatcagt ccgacaatca c 21
<210> 27
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 27
tataacgcct caagctctgc c 21
<210> 28
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 28
tacaggacga tttattgcca g 21
<210> 29
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 29
gttcccgatt cttatctaca gc 22
<210> 30
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 30
cagaataaag tagcaaccca ag 22
<210> 31
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 31
tacatcgtcc cagttagcat c 21
<210> 32
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 32
gagattgtta tcgctggagg c 21
<210> 33
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 33
tgctggacgg agttgtgct 19
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 34
ggggctattt gctgtgagtt 20
<210> 35
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 35
ggttcgtgta ttcgtggatt g 21
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 36
tgttttatgc gagaagaggg 20
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 37
cgttgttcgg attgagtgag atg 23
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<212> DNA
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gtgtgggctt ctttacttt 19
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taatccgatg gctttgtc 18
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cattcatttc ggcattcg 18
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<212> DNA
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<400> 56
cagcgaccga taagaaat 18
<210> 57
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 57
cacaacaaat cctgtagcc 19
Claims (9)
1.核苷酸序列在鉴别葡萄球菌的应用，其特征在于，所述核苷酸序列如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.19所示；所述葡萄球菌为金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌或人葡萄球菌。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述序列SEQ ID NO.1～5用于鉴别金黄色葡萄球菌；所述序列SEQ ID NO.6～10用于鉴别表皮葡萄球菌；所述序列SEQ ID NO.11～15用于鉴别溶血葡萄球菌；所述序列SEQ ID NO.16～19用于鉴别人葡萄球菌。
3.用于鉴别葡萄球菌的引物组，其特征在于，所述引物组为根据如权利要求1所述序列设计得到。
4.如权利要求3所述引物组，其特征在于，所述引物组的序列按5’到3’如SEQ ID NO.20～57所示；其中：
SEQ ID NO.20和SEQ ID NO.21为对应SEQ ID NO.1序列的引物组；
SEQ ID NO.22和SEQ ID NO.23为对应SEQ ID NO.2序列的引物组；
SEQ ID NO.24和SEQ ID NO.25为对应SEQ ID NO.3序列的引物组；
SEQ ID NO.26和SEQ ID NO.27为对应SEQ ID NO.4序列的引物组；
SEQ ID NO.28和SEQ ID NO.29为对应SEQ ID NO.5序列的引物组；
SEQ ID NO.30和SEQ ID NO.31为对应SEQ ID NO.6序列的引物组；
SEQ ID NO.32和SEQ ID NO.33为对应SEQ ID NO.7序列的引物组；
SEQ ID NO.34和SEQ ID NO.35为对应SEQ ID NO.8序列的引物组；
SEQ ID NO.36和SEQ ID NO.37为对应SEQ ID NO.9序列的引物组；
SEQ ID NO.38和SEQ ID NO.39为对应SEQ ID NO.10序列的引物组；
SEQ ID NO.40和SEQ ID NO.41为对应SEQ ID NO.11序列的引物组；
SEQ ID NO.42和SEQ ID NO.43为对应SEQ ID NO.12序列的引物组；
SEQ ID NO.44和SEQ ID NO.45为对应SEQ ID NO.13序列的引物组；
SEQ ID NO.46和SEQ ID NO.47为对应SEQ ID NO.14序列的引物组；
SEQ ID NO.48和SEQ ID NO.49为对应SEQ ID NO.15序列的引物组；
SEQ ID NO.50和SEQ ID NO.51为对应SEQ ID NO.16序列的引物组；
SEQ ID NO.52和SEQ ID NO.53为对应SEQ ID NO.17序列的引物组；
SEQ ID NO.54和SEQ ID NO.55为对应SEQ ID NO.18序列的引物组；
SEQ ID NO.56和SEQ ID NO.57为对应SEQ ID NO.19序列的引物组。
5.如权利要求3或4所述引物组在鉴别葡萄球菌中的应用，所述葡萄球菌为金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌或人葡萄球菌。
6.用于鉴别葡萄球菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1：使用如权利要求3或4所述引物组中的其中一种对待测样品DNA进行PCR扩增；
S2：进行凝胶电泳检测扩增产物；
S3：观察扩增产物是否符合预期。
7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述S1中的PCR扩增体系包括：PCR反应缓冲液、MgCl2、dNTP、模板DNA、引物组、Tag酶和灭菌双蒸水。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增体系为：10×PCR反应缓冲液2.5μL，25mM MgCl2 2μL，2.5mM dNTP 1μL，模板DNA 100ng，5μM引物各1μL，Tag酶1U，灭菌双蒸水补足体积至25μL。
9.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述S1中的PCR扩增程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s；55～58℃退火30s；72℃延伸30s；变性、退火、延伸共进行30个循环；最后72℃延伸10min。
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