CN110029182A - 快速检测葡萄球菌MecA的试剂盒及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种快速检测葡萄球菌MecA的试剂盒及方法。该试剂盒，包括细胞裂解液、扩增反应液、胶体金检测液和免疫层析试剂条，其特征在于：其中MecA的转录产物和16S rRNA由扩增反应液中的引物对经NASBA扩增获得。该快速检测葡萄球菌MecA基因的试剂盒检测结果稳定，准确率、灵敏度高，成本低，用时短，适合临床推广。该检测方法适用于临床上快速检测耐甲氧西林的葡萄球菌和鼻咽部葡萄球菌的筛查，快速精准，设备简单，对操作人员要求低，具有作为床旁检测和在各级医院应用的潜力。

Description

快速检测葡萄球菌MecA的试剂盒及方法
技术领域
本发明涉及医药生物领域，具体是指一种快速检测葡萄球菌MecA的试剂盒及方法。
背景技术
包括金黄色葡萄球菌(S.aureus)和表皮葡萄球菌(S.epidermidis)在内的葡萄球菌在人群和自然环境中分布广泛，它们是人类和动物的皮肤和黏膜上的正常定植菌，可以从土壤，水，牛奶，食物等中被分离出来(Miragaia 2018)(Huijbers et al.2015)。虽然葡萄球菌属在大多数情况下只是作为定植菌存在，并不会对机体产生危害，但是当宿主处于免疫功能低下或者皮肤、黏膜屏障受损时，它们的侵袭潜能就会显现出来，从而导致医院或社区获得性感染(Natsis and Cohen 2018；Poulakou et al.2019)。
抗生素耐药性对于预防和治疗细菌感染来说是一个威胁。(Miragaia 2018).对于葡萄球菌的感染来说，耐甲氧西林的葡萄球菌由于它的高流行率而备受关注。据报道，耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(MRSA)在金黄色葡萄球菌中的平均分离率是35.3％，最高是62.1％最低是10.0％，而在2017年中国的凝固酶阴性葡萄球菌中，甲氧西林耐药的比率是80.3％(最高100.0％，最低49.0％)(www.chinets.com)。对于韩国、日本和意大利来说，2017年的甲氧西林耐药的葡萄球菌分别占53.0％，41％和34.0％
(resistancemap.cddep.org/AntibioticResistance.php)。因此，MRS的流行依然是一个值得警惕的全球健康问题。(Lindsay 2013；Miragaia 2018；Otto 2013)
抗生素延迟给药，抗生素治疗不足以及甲氧西林抗性都会导致金黄色葡萄球菌菌血症的预后较差(Lodise et al.2003)。跟β-内酰胺类的抗生素相比，糖肽类化合物也与预后不良有关(Mcneil et al.2017)。因此，有必要建立一种快速可靠的方法来鉴定MRS，为临床医生提供抗生素耐药性结果。由于质谱法在临床微生物学实验室的广泛应用，葡萄球菌种属的快速鉴定通常不再是问题(Pinault et al.2019；Simon et al.2019)，但是细菌的药敏报告通常要到第二天才能拿到，因此，在感染了甲氧西林敏感的葡萄球菌的患者中，有时会出现糖肽化合物代替β-内酰胺类抗生素经验性使用的情况，这导致了治疗中不必要的开支，甚至产生严重的毒性和副作用。大多数耐甲氧西林的葡萄球菌包含外源MecA基因拷贝，MecA基因可以编码对临床上常用的抗生素——β-内酰胺类——具有低亲和力的蛋白PBP2a(Berglund et al.2008；Calazans-Silva et al.2014；Miragaia 2018)。几种基于DNA扩增的实时荧光定量PCR技术已经被用来检测葡萄球菌属的MecA基因(Chung etal.2016；Nijhuis et al.2014；Tang et al.2014)，但这些方法需要复杂的DNA提取过程，特殊的PCR扩增条件，专门的实验室和恒温仪(Chung et al.2016；Nijhuis et al.2014；Tang et al.2014)，这些冗杂的过程甚至伴随着较高的费用无法满足床旁检测和临界值报告的要求，因此，它们的广泛应用受到了限制。相比而言，RNA恒温扩增可以在一个很普通的实验室进行，它没有复杂的RNA提取过程，也不需要特殊的仪器(Deng et al.2017；Zhao etal.2015)。由于胶体金免疫层析技术有快速提供结果的潜能，因此将RNA恒温扩增技术即NASBA和胶体金免疫层析法结合起来，建立一个快速可靠的检测葡萄球菌MecA基因的试剂盒有十分地必要和应用价值。
发明内容
针对现有技术的不足，为了克服现有的分子生物学检测方法的缺点，本发明将NASBA和免疫层析法结合起来的这一新思路，还涉及由该思路衍生出的试剂盒及其在临床快速检测葡萄球菌及其耐药基因MecA的应用，提供了一种快速检测葡萄球菌MecA的试剂盒及方法。
为了达到上述目的，本发明一方面提供了一种快速检测葡萄球菌MecA的试剂盒，包括细胞裂解液、扩增反应液、胶体金检测液和免疫层析试剂条，其特征在于：其中MecA的转录产物和16SrRNA由扩增反应液中的引物对经NASBA扩增获得：
RNAMecA扩增引物：
MecA-F1，TCTATTAACTGATGGTATGC
MecA-T7-R，AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAGGAGCCATTCCTTTATCTTGTA；
16S rRNA扩增引物：
SP-16S-F1，GCTTGCTTCTCTGATGTTAG；
SP-16S-R，AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAGGGCAGCGCGGATCCATCTATA；
得到的扩增产物通过与下述胶体金检测液中的探针对结合来检测NASBA扩增产物：
MecA的CES系列探针：
MecA-CES1，AACAAGTCGTAAATAAAACACATAA-ACGGACACTACGAGTTTGGGTC
MecA-CES2，AGAAGATATTTATAGATCTTATGCA-ACGGACACTACGAGTTTGGGTC；
MecA的LES系列探针：
MecA-LES1，
AATCCCGTGTTCCCGTAGCACG-AACTTAATTGGCAAATCCGGTACTG-GCCTCAAAGACGGACGCCTTCT
MecA-LES2，
AATCCCGTGTTCCCGTAGCACG-CAGAACTCAAAATGAAACAAGGAGAT-GCCTCAAAGACGGACGCCTTCT
MecA-LES3，
AATCCCGTGTTCCCGTAGCACG-AACTGGCAGACAAATTGGGTGGTTT-GCCTCAAAGACGGACGCCTTCT；
16S rRNA的CES系列探针：
SP-16S-CES1，CGGCGGACGGGTGAGTAA-ATCGACCTAGCAATAGCGTACT
SP-16S-CES2，CACGTGGATAACCTACCT-ATCGACCTAGCAATAGCGTACT；
16S rRNA的LES系列探针：
SP-16S-LES1，
AATCCCGTGTTCCCGTAGCACG-ATAAGACTGGGATAACTT-GCCTCAAAGACGGACGCCT
SP-16S-LES2，
AATCCCGTGTTCCCGTAGCACG-CGGGAAACCGGAGCTAAT-GCCTCAAAGACGGACGCCT
SP-16S-LES3，
AATCCCGTGTTCCCGTAGCACG-ACCGGATAATATTTTGAA-GCCTCAAAGACGGACGCCT；
所述免疫层析试剂条包被下述探针检测NASBA扩增产物：
M线捕获探针，GACCCAAACTCGTAGTGTCCGT-GACCCAAACTCGTAGTGTCCGT；
16s线捕获探针，AGTACGCTATTGCTAGGTCGAT-AGTACGCTATTGCTAGGTCGAT；
C线捕获探针，CGTGCTACGGGAACACGGGATT-CGTGCTACGGGAACACGGGATT。
本发明另一方面提供了一种快速检测葡萄球菌MecA的方法，其特点在于，包括以下步骤：
(1)挑取2-4个细菌菌落至20μl的细胞裂解液中，或是将20μl的细胞裂解液加入3500bpm离心10min后去上清的鼻咽拭子标本中；
(2)取上述液体2μl加入到17μl的扩增反应液中，放入PCR仪中扩增；所述扩增反应液成分为40mM且pH为8.5的Tris–HCl，12mM MgCl2，70mM KCl，dNTP各1mM，NTP各2mM，扩增引物各0.2μM；
(3)恒温扩增设置为95℃2分钟，42℃50分钟，在42℃开始两分钟后加入1μl酶；所述酶为包括0.08U/ml RNaseH，30.0U/ml T7RNA聚合酶和6.4U/ml AMV-RT的混合酶；
(4)向扩增产物中加入30μl的胶体金检测液，53℃孵育10分钟后滴加到试剂条上，42℃孵育10分钟后即可读取结果；所述胶体金检测液成分为4×SSC，0.1％SDS，0.5％BSA，10μl PLGP溶液，取每种检测探针：即MecA-CES系列，MecA-LES系列，16S rRNA-CES系列，16SrRNA-LES系列各0.2μM。
本发明的优点及有益效果如下：本发明试剂盒的检测方法，在经过样本裂解、RNA扩增后，最后由胶体金试剂盒进行检测。如果待检细菌是葡萄球菌，那么16s线处会出现红色条带，若葡萄球菌是甲氧西林抗性，那么MecA线(M线)处会出现红色条带，非葡萄球菌16s线处不会出现条带。若胶体金检测液可以正常工作，那么质控线(C线)处会出现红色条带，反之不会。使用本试剂盒检测结果稳定，准确率、灵敏度高，成本低，用时短，适合临床推广。该检测方法适用于临床上快速检测耐甲氧西林的葡萄球菌和鼻咽部葡萄球菌的筛查，快速精准，设备简单，对操作人员要求低，具有作为床旁检测和在各级医院应用的潜力。
附图说明
图1为本发明胶体金试剂条的正面观：
图中最底端为样本孔，用于滴加样本，从下到上依次为MecA线、16s线、质控线，每条线上包被着相应的捕获寡核苷酸。如果待测细菌含有MecA基因，则M线会变红，若细菌是葡萄球菌，则16s线会变红；
图2为本发明胶体金试剂盒的侧面观：
从上到下依次为样本垫或吸收垫、硝酸纤维素膜、PVC背垫；
图3为本发明反应过程图：
扩增产物中加入胶体金检测液后，纳米金探针可以与LES探针的d部分结合来显色，LES探针的e部分可以与靶RNA的不同片段结合，c部分与C线的捕获寡核苷酸结合；CES探针的a部分与靶RNA的不同片段结合，b部分与试剂条的M线或16s线上的捕获寡核苷酸结合；其中图3中实验显色：胶体金检测液呈粉红色；试剂条条带显色：深色条带呈紫红色，浅色条 带呈粉红色；试剂条为白色；
图4为将细菌菌液浓度从107连续稀释至102CFU/ml，条带逐渐变弱，菌液浓度为10CFU/ml时无条带产生，因此，本发明的检测限为102CFU/ml。当菌液浓度为107CFU/ml时条带最强；
图5为本发明操作中将MecA转录产物扩增液稀释为25nM，10nM，5nM，2.5nM，1nM，0.5nM，0.25nM，0.2nM，0.1nM，0.05nM，由图可知0.2nM是胶体金试剂条可以检测到的最低浓度；
图6为本发明非葡萄球菌的细菌并不会产生16S条带；
图7为本发明咽拭子模型结果图；
图8为咽拭子标本部分结果图。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例来对本发明内容作进一步地说明：实施例1
1.标本的收集
55株临床分离的金黄色葡萄球菌(S.aureus)，包括30株MRSA和25株MSSA被用来建立这个检测方法。55株葡萄球菌已经用PCR法分型，表型与基因型一致。另外2017-2019年的293株来自武汉大学中南医院(n＝229)、海南省总医院(n＝30)和华中科技大学附属同济医院(n＝34)的临床菌株用于回顾性分析。其中有200株金黄色葡萄球菌，56株凝固酶阴性葡萄球菌。凝固酶阴性葡萄球菌包括表皮葡萄球菌(n＝23)，溶血葡萄球菌(n＝15)，缓慢葡萄球菌(n＝3)，沃氏葡萄球菌(n＝3)，人葡萄球菌亚种(n＝8)，头状葡萄球菌(n＝4)。其他类型的37株非葡萄球菌的细菌包括鲍曼不动杆菌(n＝8)，铜绿假单胞菌(n＝5)，洋葱伯克霍尔德菌(n＝2)，肺炎链球菌(n＝2)，肺炎克雷伯氏菌(n＝6)，阴沟肠杆菌(n＝3)，大肠杆菌(n＝3)，粪肠球菌(n＝2)，屎肠球菌(n＝2)，产酸克雷伯式菌(n＝1)，嗜麦芽窄食单胞菌(n＝1)，枯草芽孢杆菌(n＝1)和流感嗜血杆菌(n＝1)。这些菌株的鉴定和药敏实验在VITEK2Compact(梅里埃，美国)全自动微生物鉴定系统上完成，同时，这些细菌用本方法进行再次检测。
2.3引物，探针和试剂
2.3.1引物和探针
引物和探针都由生工生物工程股份有限公司(上海)合成的。用于缀合纳米金颗粒的探针在巯基端修饰了15～20个碱基A，其5'末端可以与金颗粒缀合。探针CES的a部分与靶RNA结合，b部分与固定在硝酸纤维素膜(NC)上的检测区或16s区的捕获寡核苷酸结合。LES探针的c部分与质控区的捕获探针结合，d部分与探针PLGP结合，e部分与靶RNA互补结合。
2.3.2PLGP的制备
缀合在纳米金探针(PLGP)上的寡核苷酸(5’-SH-AAAAAAAAAAAAAAATTAGAAGGCGTCCGTCTTTGAGGC-3’)含有有助于降低空间位阻效应的15个碱基A，将5'-硫醇化来与金纳米颗粒表面共价结合(顾子迪2008)。根据Toubanaki等人在2016年描述的方法，向1ml金纳米颗粒溶液(～0.12pmol)中加入75pmol尾部硫醇化的寡核苷酸和0.8μl绝对吡啶(Sigma-Aldrich，Steinhem，Germany)进行反应。将混合物在4℃下孵育24小时后加入至多90mM的NaCl使溶液老化。将溶液在4℃下再温育24小时，然后以1300×g离心30分钟。弃去上清液，通过涡旋或短暂超声处理将沉淀重新分散在100μl含有30％蔗糖，0.25％吐温-20，0.25％十二烷基硫酸钠(SDS)和45mM NaCl的水溶液中。得到的PLGP溶液用于进一步的实验。
2.3.3制备胶体金免疫层析试剂条(GICA)
GICA试剂条由四部分组成，即样品垫，吸收垫，硝酸纤维素膜(NC)和聚氯乙烯(PVC)背衬卡。样品垫和吸收垫各安装在NC的一端，NC固定在PVC背衬卡上。通过向NC上喷射含有0.2M PBS，1.4％Triton X-100和0.5mM相应的捕获寡核苷酸的混合物制备质控线，MecA线和16s线。喷雾后，将膜在37℃(<30％相对湿度)下干燥8小时。制得的试剂条可以在室温下储存长达六个月。
2.4RNA恒温扩增
挑取在血琼脂平板上生长12-16小时的2-4个细菌菌落溶解到含有20μl裂解缓冲液(Signosis，美国)的PCR管中，若是以鼻咽拭子作为标本，则将鼻咽拭子在装有1ml生理盐水的EP管中搅拌混匀，3500bpm离心10分钟，去上清，向沉淀物中加入20μl裂解缓冲液。取上述制备好的细菌裂解液2μl与17μl扩增反应液混合，扩增反应液中含有40mM Tris-HCl(pH8.5)，12mM MgCl2，70mM KCl，每种dNTP各1mM，每种NTP各2mM，每种扩增引物各0.2μM。将含有上述混合物的PCR管放入Techne热循环仪(Touchgene Gradient，UK)，在95℃下扩增2分钟，42℃下扩增50分钟。在42℃反应2分钟后加入1μl酶混合物(0.08U/ml RNaseH(Thermo)，30.0U/ml T7RNA聚合酶(Thermo)，6.4U/ml AMV-RT(Thermo)。
2.5胶体金免疫层析技术
2.5.1GICA的设计
RNA等温扩增完成后，将所得产物与30μl胶体金检测溶液混合。检测溶液中的探针LES和CES可以特异性结合16SrRNA或MecA的RNA扩增产物。探针CES分为两部分，a部分负责与MecA或16SrRNA的部分RNA片段互补结合。CES的b部分用于与检测区或16s区的捕获寡核苷酸结合。M线或16s线能够变红的原因是由于一系列LES探针。LES探针由c，d和e三部分组成，不同的LES在于e部分的差异，它与MecA或16SrRNA的RNA的不同区域结合，类似于CES的a部分。C部分和d部分在不同的LES中是相同的，前者可以与质控区捕获寡核苷酸结合，而后者与金纳米颗粒结合以显示红色。无论是否存在MecA或16S rRNA，质控线始终是显色的，除非金颗粒失效。
2.5.2用GICA检测产物
将20μl扩增产物与含有4×SSC，0.1％SDS，0.5％BSA，10μl PLGP溶液和每种核酸探针(RNAMecA-CES系列，RNAMecA-LES系列，16S rRNA-CES系列，16S rRNA-LES系列)各0.2μM的30μl检测溶液混合。在53℃温育10分钟后，将混合物滴入样品孔中，42℃下10分钟后观察结果。
2.6评估检测范围和检测限
为了评估本发明的检测范围和检测限，将金黄色葡萄球菌从107CFU/ml连续稀释至102CFU/ml。然后将1ml金黄色葡萄球菌悬浮液在3000rpm下离心5分钟，并将得到的沉淀物与20μl裂解缓冲液混合。剩余的检测步骤按照2.4和2.5的描述进行。为评估胶体金试剂条的灵敏度，将已知浓度的MecA转录产物扩增液稀释成25nM，10nM，5nM，2.5nM，1nM，0.5nM，0.25nM，0.2nM，0.1nM，0.05nM浓度的溶液，滴到试剂条上检测。2.7咽拭子模型的建立
挑选一例细菌培养没有葡萄球菌且用本方法也没有检出葡萄球菌的咽拭子，在生理盐水中搅拌制作咽拭子悬液。蘸取在37℃下培养了13h的金葡菌ATCC25923，用咽拭子悬液制备0.5麦氏浊度的菌悬液，此时悬液中的细菌数目为1×108CFU/ml。用咽拭子悬液倍比稀释上述菌悬液至107、106、105、104、103、102CFU/ml。取1ml各梯度的标本，3500rpm离心10分钟，去上清，将沉淀物与20μl的裂解缓冲液混合，重复2.4、2.5部分的步骤。
2.8咽拭子标本的检测
我们随机挑取了临床上的24株咽拭子标本进行检测，将咽拭子在装有1ml生理盐水的EP管中搅拌，使咽拭子上的物质尽可能多的溶解在生理盐水中。在3500rpm下离心10分钟，去上清，向沉淀中加入20μl的细胞裂解液，剩余步骤如2.4、2.5部分所述。同时，将咽拭子分别接种到血平板和高盐培养基中，通过多种方法验证结果准确度。
2.9MecA的检测
使用TIANamp Bacteria DNA试剂盒(Tiangen，China)提取细菌基因组DNA。通过引物P1(AAAATCGATGGTAAAGGTTGGC)和P2(AGTTCTGCAGTACCGGATTTGC)扩增金黄色葡萄球菌DNA中的MecA。PCR在Techne热循环仪(Touchgene Gradient，UK)上进行，PCR的热循环过程设定为94℃5分钟，94℃30秒，56℃30秒和72℃2分钟，共35个循环，最后在72℃下延伸10分钟结束整个扩增。使用MecA阳性的菌株ATCC43300和MecA阴性的菌株ATCC25923作为阳性和阴性对照。将扩增后的PCR产物在2％琼脂糖凝胶中电泳分离，条件为120V电泳15分钟，用溴化乙锭(0.5μg/ml)染色，并在UV光下显色拍照。
3.结果分析
3.1准确度，阳性预测值，阴性预测值
为了评估GICA的准确性，我们对55株临床分离的金黄色葡萄球菌进行了回顾性检测。其中，30株MecA阳性的MRSA均显示红色的MecA线，16s线和质控线，而25株MecA阴性的MSSA只有红色的16s线和质控线。使用GICA检测293株临床分离的葡萄球菌，并在VITEK2Compact仪器上进行药敏试验。其中，五株细菌的试剂条结果和仪器检测的药敏结果不一致，因此我们用PCR扩增五株细菌基因组的MecA。扩增结果显示有三株细菌含有MecA基因，而另外两株不含MecA基因。五株细菌的表型和基因型也不是一一对应的，三株金黄色葡萄球菌具有与基因型相符的表型，而两株名为180720755和180211899的凝固酶阴性的葡萄球菌虽然含有MecA，但它们是表型的MSS，也就是说，我们发现了两株pre-MRS。综上，这种新的检测方法准确度可达100％，阳性预测值(PPV)、阴性预测值(NPV)也是100％。相比之下，VITEK 2Compact系统的准确度为97.5％，PPV为98.8％，NPV为98.9％。
表格1不一致细菌的其他检测及结果
3.2特异度
特异性实验选取了表2所示的非葡萄球菌属的细菌，检测的部分结果如图6所示，结果显示本发明拥有良好的特异性。
表格2特异性实验中细菌种类和数量
3.3咽拭子模型
由图7可知，咽拭子模型中的最低检测限为103CFU/ml。
3.4咽拭子标本结果
24份咽拭子用本发明检测的结果为，有17份标本(3号、5号、8号、9号、10号、11号、12号、14号、16号、17号、18号、19号、20号、21号、22号、24号)检测出葡萄球菌，其中，12号标本检出MecA耐药基因，其余14份均为甲氧西林敏感的葡萄球菌。血平板培养的结果显示有5号、12号、22号、17号平板可见明显的葡萄球菌生长，质谱鉴定结果均为葡萄球菌，K-B法显示12号平板细菌为耐药细菌，其余三株为敏感细菌。高盐培养基中有9个(6号、7号、10号、12号、15号、16号、17号、22号、24号)试管变色，接种到血平板培养鉴定，7号和15号的培养细菌为肠球菌，其余均是葡萄球菌。由结果可知，本发明相较于传统的培养法更为灵敏，阳性率超过培养法的原因可能是标本放置了一段时间导致细菌死亡，但依然残留核酸或细菌数量太少，无法培养出可见菌落。本发明较高的灵敏度使其对于患者，尤其是长期住院且免疫力低下患者的鼻咽耐药细菌的筛查具有重要意义。
序列表
<110> 武汉大学
<120> 快速检测葡萄球菌MecA的试剂盒及方法
<160> 20
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tctattaact gatggtatgc 20
<210> 2
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aattctaata cgactcacta tagggagagg agccattcct ttatcttgta 50
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gcttgcttct ctgatgttag 20
<210> 4
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aattctaata cgactcacta tagggagagg gcagcgcgga tccatctata 50
<210> 5
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
aacaagtcgt aaataaaaca cataaacgga cactacgagt ttgggtc 47
<210> 6
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
agaagatatt tatagatctt atgcaacgga cactacgagt ttgggtc 47
<210> 7
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
aatcccgtgt tcccgtagca cgaacttaat tggcaaatcc ggtactggcc tcaaagacgg 60
acgccttct 69
<210> 8
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
aatcccgtgt tcccgtagca cgcagaactc aaaatgaaac aaggagatgc ctcaaagacg 60
gacgccttct 70
<210> 9
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
aatcccgtgt tcccgtagca cgaactggca gacaaattgg gtggtttgcc tcaaagacgg 60
acgccttct 69
<210> 10
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
cggcggacgg gtgagtaaat cgacctagca atagcgtact 40
<210> 11
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
cacgtggata acctacctat cgacctagca atagcgtact 40
<210> 12
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
aatcccgtgt tcccgtagca cgataagact gggataactt gcctcaaaga cggacgcct 59
<210> 13
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
aatcccgtgt tcccgtagca cgcgggaaac cggagctaat gcctcaaaga cggacgcct 59
<210> 14
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
aatcccgtgt tcccgtagca cgaccggata atattttgaa gcctcaaaga cggacgcct 59
<210> 15
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
gacccaaact cgtagtgtcc gtgacccaaa ctcgtagtgt ccgt 44
<210> 16
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
agtacgctat tgctaggtcg atagtacgct attgctaggt cgat 44
<210> 17
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
cgtgctacgg gaacacggga ttcgtgctac gggaacacgg gatt 44
<210> 18
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
cgtgctacgg gaacacggga ttcgtgctac gggaacacgg gatt 44
<210> 19
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
aaaaaaaaaa aaaaattaga aggcgtccgt ctttgaggc 39
<210> 20
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
aaaatcgatg gtaaaggttg gc 22

Claims (2)

1.一种快速检测葡萄球菌MecA的试剂盒，包括细胞裂解液、扩增反应液、胶体金检测液和免疫层析试剂条，其特征在于：其中MecA的转录产物和16SrRNA由扩增反应液中的引物对经NASBA扩增获得：
RNAMecA扩增引物：
MecA-F1，TCTATTAACTGATGGTATGC
MecA-T7-R，AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAGGAGCCATTCCTTTATCTTGTA；
16S rRNA扩增引物：
SP-16S-F1，GCTTGCTTCTCTGATGTTAG；
SP-16S-R，AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAGGGCAGCGCGGATCCATCTATA；
得到的扩增产物通过与下述胶体金检测液中的探针对结合来检测NASBA扩增产物：
MecA的CES系列探针：
MecA-CES1，AACAAGTCGTAAATAAAACACATAA-ACGGACACTACGAGTTTGGGTC
MecA-CES2，AGAAGATATTTATAGATCTTATGCA-ACGGACACTACGAGTTTGGGTC；
MecA的LES系列探针：
MecA-LES1，
AATCCCGTGTTCCCGTAGCACG-AACTTAATTGGCAAATCCGGTACTG-GCCTCAAAGACGGACGCCTTCT
MecA-LES2，
AATCCCGTGTTCCCGTAGCACG-CAGAACTCAAAATGAAACAAGGAGAT-GCCTCAAAGACGGACGCCTTCT
MecA-LES3，
AATCCCGTGTTCCCGTAGCACG-AACTGGCAGACAAATTGGGTGGTTT-GCCTCAAAGACGGACGCCTTCT；
16S rRNA的CES系列探针：
SP-16S-CES1，CGGCGGACGGGTGAGTAA-ATCGACCTAGCAATAGCGTACT
SP-16S-CES2，CACGTGGATAACCTACCT-ATCGACCTAGCAATAGCGTACT；
16S rRNA的LES系列探针：
SP-16S-LES1，
AATCCCGTGTTCCCGTAGCACG-ATAAGACTGGGATAACTT-GCCTCAAAGACGGACGCCT
SP-16S-LES2，
AATCCCGTGTTCCCGTAGCACG-CGGGAAACCGGAGCTAAT-GCCTCAAAGACGGACGCCT
SP-16S-LES3，
AATCCCGTGTTCCCGTAGCACG-ACCGGATAATATTTTGAA-GCCTCAAAGACGGACGCCT；
所述免疫层析试剂条包被下述探针检测NASBA扩增产物：
M线捕获探针，GACCCAAACTCGTAGTGTCCGT-GACCCAAACTCGTAGTGTCCGT；
16s线捕获探针，AGTACGCTATTGCTAGGTCGAT-AGTACGCTATTGCTAGGTCGAT；
C线捕获探针，CGTGCTACGGGAACACGGGATT-CGTGCTACGGGAACACGGGATT。
2.一种利用如权利要求1所述快速检测葡萄球菌MecA的试剂盒的检测方法，其特点在于，包括以下步骤：
(1)挑取2-4个细菌菌落至20μl的细胞裂解液中，或是将20μl的细胞裂解液加入3500bpm离心10min后去上清的鼻咽拭子标本中；
(2)取上述液体2μl加入到17μl的扩增反应液中，放入PCR仪中扩增；所述扩增反应液成分为40mM且pH为8.5的Tris–HCl，12mM MgCl2，70mM KCl，dNTP各1mM，NTP各2mM，扩增引物各0.2μM；
(3)恒温扩增设置为95℃2分钟，42℃50分钟，在42℃开始两分钟后加入1μl酶；所述酶为包括0.08 U/ml RNaseH，30.0 U/ml T7 RNA聚合酶和6.4U/ml AMV-RT的混合酶；
(4)向扩增产物中加入30μl的胶体金检测液，53℃孵育10分钟后滴加到试剂条上，42℃孵育10分钟后即可读取结果；所述胶体金检测液成分为4×SSC，0.1％SDS，0.5％BSA，10μlPLGP溶液，取每种检测探针：即MecA-CES系列，MecA-LES系列，16S rRNA-CES系列，16S rRNA-LES系列各0.2μM。
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