CN110964852A - 一种呼吸道合胞病毒和副流感病毒联合检测胶体金层析试剂盒及其应用 - Google Patents
一种呼吸道合胞病毒和副流感病毒联合检测胶体金层析试剂盒及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种呼吸道合胞病毒和副流感病毒联合检测胶体金层析试剂盒及其应用。该试剂盒通过将采集的样本经细胞裂解液裂解后释放病原体核酸，然后在逆转录酶和T7RNA聚合酶的作用下，经过逆转录和转录过程，实现病原体核酸片段的扩增。扩增后的RNA产物被检测液中的特异探针识别捕获，形成RNA扩增产物‑‑‑特异探针‑‑‑金探针复合物，该复合物通过侧向流层析在NC膜上被固定形成可见的条带，实现病原体核酸的检测。本发明没有RNA的提取过程，不需要特殊仪器，基于RNA恒温扩增，在实际检测中不易污染，具有灵敏度高、特异性强以及操作简单的优势，使呼吸道合胞病毒和副流感病毒核酸检测得到广泛应用成为一种可能。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种呼吸道合胞病毒和副流感病毒联合检测胶体金层析试剂盒及其应用。
背景技术
呼吸道合胞病毒(Respiratory Syncytial Virus，RSV)是单链RNA包膜病毒，含有两个亚型—A型和B型。广泛分布于世界各地，是引起婴幼儿下呼吸道感染主要的和常见的病原体，在绝大部分地区RSV所致的1岁以内婴幼儿的肺炎和支气管炎远远高于其他病原微生物。RSV的流行具有季节性，易于在冬天和早春感染并引起多达5个月的流行期。我国每年数千万住院的婴幼儿因RSV感染的占50％，且RSV的再感染率很高，成人RSV的再感染同样很常见。该病毒具有传染性强，症状与副流感病毒肺炎、轻流感病毒肺炎及轻症腺病毒肺炎在临床上几乎无法区别，因此，实验室诊断就显得非常重要。
副流感病毒(Parainfluenza virus，PIV)是单链RNA包膜病毒，四种亚型各有不同的临床和流行病学特征。1型和2型的最典型的临床特征是造成儿童喉气管支气管炎，1 型是儿童喉气管支气管炎的主要原因，而2型次之。1型2型均能造成其他的上呼吸道和下呼吸道疾病。3型经常导致肺炎和细支气管炎。4型通常被认为散发存在，引起的呼吸道症状轻微。副流感病毒是常常引起儿童下呼吸道感染的一种病毒，其致病性仅次于呼吸道合胞病毒(RSV)。人类副流感病毒的潜伏期一般在1～7天左右。
RSV和PIV感染的实验室诊断方法有很多，一般可以分为实验室分离培养，免疫学技术检测和分子生物学诊断。分离培养是最传统的检测，该方法虽然可靠，但耗时长，因此使该方法无法在临床上得到有效应用。免疫学检测主要包括免疫荧光法、酶联免疫法和胶体金法等。免疫学检测方法简便快捷，也是现在临床上常用的检测方法，但抗原检测灵敏度低，抗体检测窗口期长。分子生物学方法包括荧光PCR、RNA恒温扩增等，可直接检测核酸，灵敏度高、特异性强，检测速度也较快，在缩短检测窗口期、提高病原体检出率方面具有相当的优势，目前分子生物学检测在流感病毒的诊断中被应用的越来越广泛，成为流感病毒检测的主要方法之一。但是PCR的方法对硬件设施有一定的要求，要有专门的PCR诊断实验室、昂贵的实验仪器，不利于在一些社区及偏远医院的普及应用。因此，人们仍然需要寻找一种操作简单、快速、价格低廉的RSV和PIV 的诊断方法。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种基于RNA恒温扩增-金探针层析技术联合检测RSV(包括A型和B型)和PIV(包含PIV1、2、3分型)核酸的试剂盒及其应用。该试剂盒通过将采集的样本经细胞裂解液裂解后释放病原体核酸，然后在逆转录酶和T7RNA聚合酶的作用下，经过逆转录和转录过程，实现病原体核酸片段的扩增。扩增后的RNA产物被检测液中的特异探针识别捕获，形成RNA扩增产物 ---特异探针---金探针复合物，该复合物通过侧向流层析在NC膜上被固定形成可见的条带，实现病原体核酸的检测。因此，本发明没有复杂的RNA提取过程，也不需要特殊的仪器，基于RNA分子易降解的特点，本发明在实际检测中不易污染，具有灵敏度高、特异性强以及操作简单的优势，使RSV(包括A型和B型)和PIV(包含PIV1、2、3 分型)核酸检测得到广泛应用成为一种可能。
为了实现上述目标，本发明采用如下技术方案：
第一方面，提供一种呼吸道合胞病毒和副流感病毒核酸联合检测胶体金层析试剂盒，所述试剂盒是基于RNA恒温扩增-金探针层析技术，包括：
1)扩增反应液：含40mM Tris-HCl(pH 8.0)，12mM MgCl2，70mMKCl，15％ DMSO，5mMDTT，每种dNTP各1mM，每种NTP各2mM，扩增引物各0.2μM；其中扩增引物包括五组：呼吸道合胞病毒A型和B型共用一条R，各一条F引物、副流感1、2、3型病毒和人内参基因各一对R和F引物，具体的：
(1)呼吸道合胞病毒(P基因的一段保守区序列)的扩增引物：
RSV-R引物：5’TAATACGACTCACTATAGGGAGACATGGAGAAGATGCAAA3’；
RSVA-F引物：5’TGTTATAGGACTTTCTTT3’；
RSVB-F引物：5’AGTGACTTCTATGTCTAT3’；
(2)副流感病毒(L基因一段保守区序列)的扩增引物：
PIV1-R引物：5’TAATACGACTCACTATAGGGAGATCCGATTGTAAAAAGCAAGA TT3’；
PIV1-F引物：5’GATTTTGATCTGCCGGGGCGAT3’；
PIV2-R引物：5’TAATACGACTCACTATAGGGAGACAAACTCATATACTACTTATT 3’；
PIV2-F引物：5’CATTGTTCTATTGGTTGAAGC3’；
PIV3-R引物：5’TAATACGACTCACTATAGGGAGATCTGACATACTCTATCCTG3’；
PIV3-F引物：5’TCACTTTCTCAGTTAATAT3’；
(3)内参基因(人18SrRNA一段保守区序列)的扩增引物：
内参-R引物：5’TAATACGACTCACTATAGGGAGACACCAGAGACACTCAGCTAA GAGCA3’；
内参-F引物：5’CAGCAGCCGCGGTAATTC3’；
在设计引物时同时要保证各自单项引物扩增效率高、不同引物彼此之间无干扰。各组引物的R引物5’端都引入了T7 RNA聚合酶启动子序列。
2)扩增酶：包含三种，逆转录酶(如AMV或M-MLV)、T7 RNA聚合酶和Rnas eH；
3)细胞裂解液(购至美国Signosis公司，货号CL-0001)：可以裂解细胞，释放核酸；
4)检测液：包含胶体金颗粒标记的核酸探针(金探针)、每个指标的特异探针、C 线显色探针，每个指标特异探针有两种，分别为CES系列和LES系列，其中CES系列和LES系列又可以设计多条，具体如下：
(1)金探针：
金探针5’端被巯基化修饰，所述序列为：
5’-CCTACTCTGCAGTGCTCCATCGTACGTCTGTCATTTTTGCTCAGAGCTCGA GCACTGCG-3’；
(2)RSVA特异探针序列：
RSVA-LES1:5’TTGACAGATATGATACTATTTTCGCAGTGCTCGAGCTCTGAGC 3’；
RSVA-LES2:5’TCTTTTTTCTTGGGATCTTTTTCGCAGTGCTCGAGCTCTGAGC 3’；
RSVA-LES3:5’TTGGGTGATGTGAATTTGTTTTCGCAGTGCTCGAGCTCTGAGC 3’；
RSVA-LES4:5’CCCTTTATTGATTCTAGGTTTTCGCAGTGCTCGAGCTCTGAGC 3’；
RSVA-LES5:5’AATTTGGTGGCTCTGTTGTTTTCGCAGTGCTCGAGCTCTGAGC 3’；
RSVA-CES:5’ACTTCTATATCTATTGAGTTTTGGCCTCTAAGTCGTAGCCCA3’；
(3)RSVB特异探针序列：
RSVB-LES1：5’TTTCTTCTTAGGATCTTTGGATGATTTTTCGCAGTGCTCGAGCT CTGAGC3’；
RSVB-LES2：5’GCAAACTTGCCTTTTATTGATTCTATTTTCGCAGTGCTCGAGCT CTGAGC3’；
RSVB-LES3：5’GGAATTTTGTAGCTTTGTTATTTTCGCAGTGCTCGAGCTCTGAG C3’；
RSVB-CES：5’TTGACAGATATTATGCTATCTTTTGGCCTCTAAGTCGTAGCCCA3’；
(4)PIV1特异探针序列：
PIV1-LES1：5’TCATAGGGTTGATTGATATCTTTTCGCAGTGCTCGAGCTCTGAG C3’；
PIV1-LES2：5’TAGCAAAACGTGAAGTTGAGTTTTCGCAGTGCTCGAGCTCTGA GC3’；
PIV1-CES：5’TTATACTGTTATCTTTTAAATTTTATCGACGTGGTAGGCATAGACG TACT3’；
(5)PIV2特异探针序列：
PIV2-LES1：5’TATTTCAGAAATGTCAAGATTTTTCGCAGTGCTCGAGCTCTGAG C3’；
PIV2-LES2：5’CATGCGGGAAGTGCCCTAGTTTTTCGCAGTGCTCGAGCTCTGA GC3’；
PIV2-CES：5’TCATTATTGTGAAGAGGGCTTTTTATCGACGTGGTAGGCATAGAC GTACT3’；
(6)PIV3特异探针序列：
PIV3-LES1：5’GCTATTTTACCTTTAACGATTTTTCGCAGTGCTCGAGCTCTGAGC 3’；
PIV3-LES2：5’AGGAGAGTTAAGGTGACACTTTTTCGCAGTGCTCGAGCTCTGA GC3’；
PIV3-CES：5’TCATAATTGTGTGTAATTGTTTTTATCGACGTGGTAGGCATAGACG TACT3’；
(7)人内参基因特异探针序列：
内参LES1:5’AAAGCTCGTAGTTGGATCTTTTTCGCAGTGCTCGAGCTCTGAGC 3’；
内参LES2：5’TTGGGAGCGGGCGGGCGGTTTTTCGCAGTGCTCGAGCTCTGAG C3’；
内参LES3：5’TCCGCCGCGAGGCGAGCCTTTTTCGCAGTGCTCGAGCTCTGAG C3’；
内参LES4：5’ACCGCCCGTCCCCGCCCCTTTTTCGCAGTGCTCGAGCTCTGAGC 3’；
内参CES1：5’AGCTCCAATAGCGTATATTTTTGTGGAAGATTATAGC3’；
内参CES2：5’TAAAGTTGCTGCAGTTAATTTTGTGGAAGATTATAGC3’；
(8)C线显色探针序列：
5’TCAGATCACTATGTACttttCGCAGTGCTCGAGCTCTGAGC3’；
5)试纸条：所用试纸条被固定于PVC底板上，从左往右依次是样品垫、NC膜、吸水纸；NC膜上有C线(质控线)和三条T线(检测线)，从样品垫到吸水纸方向分别为RSV-T、PIV-T、内参-T和C线(如图3)；PIV-T处包被PIV包被探针、RSV-T处包被RSV包被探针、内参-T处包被内参包被探针、C线处包被C线包被探针，具体序列为：
C线包被探针序列：
5’GTACATAGTGATCTGAttttGTACATAGTGATCTGA3’；
内参线包被探针序列：
5’GCTATAATCTTCCACTTTTGCTATAATCTTCCAC3’；
PIV线包被探针序列：
5’AGTACGTCTATGCCTACCACGTCGATTTTTAGTACGTCTATGCCTACCACGTC GAT3’；
RSV线包被探针序列：
5’TGGGCTACGACTTAGAGGCCTTTTTGGGCTACGACTTAGAGGCC3’。
本发明提供利用上述基于RNA恒温扩增-金探针层析技术联合检测呼吸道合胞和副流感病毒核酸的方法，包括如下步骤：
(1)RNA恒温扩增
本发明检测指标有六个：呼吸道合胞病毒A型、呼吸道合胞病毒B型、副流感病毒1型、副流感病毒2型、副流感病毒3型和人内参基因。针对每个指标设计一对(F/R 引物)扩增引物，其中R引物5’端带有T7 RNA聚合酶启动子。本发明在同一扩增管内实现各个指标核酸的扩增，具体如下：扩增时，在带有T7启动子的R引物和逆转录酶的作用下，将待测RNA转化为RNA:cDNA杂合体；扩增酶中的RnaseH消化RNA:cDNA 中的RNA，得到单链cDNA；在F引物和反转录酶的DNA聚合酶功能的作用下合成第二链，形成带有T7启动子的双链DNA；带有T7启动子的双链DNA在T7 RNA聚合酶的作用下转录生成RNA分子产物。转录的RNA分子产物可以进入循环扩增过程，首先 F引物会结合转录的RNA分子产物，在逆转录酶的作用下将转录的RNA转化为 RNA:cDNA杂合体；扩增酶中的RnaseH消化RNA:cDNA中的RNA，得到单链cDNA；接着R引物会结合到单链cDNA上，在反转录酶的DNA聚合酶功能的作用下合成第二链，再次富集合成更多的带有T7启动子的双链DNA分子，为T7 RNA聚合酶提供更多的转录模板，进而在T7 RNA聚合酶的作用下转录生成大量的RNA分子产物(如图1)
本发明设计人内参基因检测的目的是为了监测样本采集的有效性、扩增体系的有效性。当样本采集合格时样本中一定会含有人脱落细胞，在检测时一定会被检测到，样本检测阴性时内参应该为阳性，否则整个检测需要重新采样进行重测。
(2)金探针层析
a，设计特异探针、金探针、C线显色探针和包被探针
特异探针：每个指标特异探针包括两种：CES系列和LES系列，每种探针可以设计多条。其中CES探针包含两个部分，一端可以和扩增的RNA产物特异性结合，另一端可以和包被在NC膜上对应检测线处的包被探针结合，起到固定扩增产物RNA的作用，这两个部分用4～5个T链接。每条LES探针也包含两个部分，一端可以和扩增的 RNA产物特异性结合，另一端可以和标记在胶体金颗粒上的巯基化探针结合，起到富集胶体金在检测线处显色的作用，这两个部分用4～5个T链接。
金探针：金探针5’端被巯基化修饰，巯基基团可以和胶体金颗粒形成共价键，被标记在胶体金颗粒上，可以与特异探针LES系列的一端及质控线检测探针的一部分结合。
包被探针：包被探针被包被在NC膜上，可以和特异探针CES的一端结合，起到固定的作用。每条包被探针包含两个拷贝，每个拷贝之间用3～5个T连接。
C线显色探针：包含两个部分，之间用4～5个T链接。该探针一端可以和金探针结合，另一端可以和包被在NC膜上的C线包被探针结合。在层析时，无论有无RNA扩增产物，C线显色探针都可以形成“C线显色探针---金探针”复合物，该复合物在层析时可以被NC膜上的C线包被探针捕获拦截，形成肉眼可见的条带。该探针可以质控试纸条和检测液的质量，层析过程无误。
所述特异探针在设计时必须要求同种指标不同探针之间无交叉，CES系列同金探针以及包被探针无交叉，以保证检测的特异性。
所述特异探针的CES系列和LES系列设计多条的目的是为了提高固定的效率和结合更多的金探针，从而提高检测的灵敏度。
b，试纸条检测
所用试纸条有检测线和质控线，所述检测线包括PIV-T线、RSV-T线和内参-T线，其中内参-T线为内参检测线，包被的内参包被探针能够特异性结合内参CES系列探针的一端，PIV-T线处包被的PIV包被探针能够特异性结合副流感病毒CES系列探针的一端；RSV-T线处包被的RSV包被探针能够特异性结合呼吸道合胞病毒CES系列探针的一端。所述质控线(C线)上包被C线包被探针能特异性结合C线显色探针。将特异探针CES、特异探针LES、金探针和待测核酸特异扩增产物杂交后滴在试纸条上层析，检测线显色表示有待测核酸存在，质控线显色表示检测有效(如图2)。
结合上述原理，对本发明上述方法的工作过程介绍如下：
(1)核酸提取
采集疑似RSV、PIV患者的咽拭子样本，使用细胞裂解液裂解的方法释放病毒RNA分子。
(2)RNA恒温扩增
向17μL的含有呼吸道合胞病毒、副流感病毒和内参引物的扩增反应液中加入2μL核酸提取物，95℃加热两分钟，42℃预热2分钟，加入1μL扩增酶，42℃恒温扩增45 分钟。待测样本中若有呼吸道合胞病毒和(或)副流感病毒的核酸，扩增时会对指标 RNA分子进行大量扩增富集。
(3)试纸条层析
a，预杂交
将RNA恒温扩增产物与检测液(包括特异探针、金探针以及C线显色探针)混合， 42℃预杂交10分钟。扩增出的RNA分子与特异探针(包括CES系列探针与LES系列探针)互补配对结合。CES系列探针一端同RNA分子杂交互补配对，另一端同NC膜上的包被探针结合；LES系列探针一端同RNA分子杂交互补配对，另一端可以与金探针互补配对结合，当有扩增产物时可以形成“CES探针-RNA分子-LES探针-金探针复合物”。
b，层析检测
将预杂交产物滴在试纸条样品垫处，预杂交液会沿着NC膜向吸水纸方向层析，当有待测RNA扩增产物时，“CES探针-RNA分子-LES探针-金探针复合物”就会形成，在层析时会被NC膜上包被的包被探针拦截，形成肉眼看见的条带，此为阳性(如图4)。
若无待测RNA产物扩增，“CES探针-RNA分子-LES探针-金探针复合物”就不会形成，胶体金颗粒就不能在T线处聚集，就不会形成肉眼可见的条带，此为阴性(如图4)。
无论有无待测RNA产物扩增，C线显色探针都可以形成“C线显色探针---金探针”复合物，该复合物在层析时会沿着NC膜向前流动，当到达C线时，与C线处包被的序列结合，从而滞留在C线处，形成肉眼可见的有色条带，此为实验结果有效(如图4)。
第二方面，提供上述呼吸道合胞病毒和副流感病毒核酸联合检测胶体金层析试剂盒在制备呼吸道合胞病毒和/或副流感病毒检测试剂中的应用。
本发明和现有技术相比较，具有如下有益效果：
1、本发明通过RNA恒温扩增的方法在同一管内能够同时扩增呼吸道合胞病毒、副流感病毒和内参基因三种指标，所扩增出的核酸产物为RNA，RNA在自然环境中容易降解，相比较于PCR的方法扩增出DNA更容易起到防止污染的效果。RNA恒温扩增是在42℃环境中进行，即使是一个水浴锅都能实现扩增反应，最大限度的降低了实验仪器的要求。
2、本发明在设计引物时同时经过多轮测试，保证了各单项引物扩增效率高、不同引物彼此之间无干扰，整体扩增效果好。由表14可知本发明试剂盒对11株不同来源的常见RSV-A、RSV-B、PIV-1、PIV-2、PIV-3具有很好的检出能力。
3、本发明在设计时引入的特异探针CES系列和特异探针LES系列有桥分子成分的作用，两种探针成功的将试纸条上的包被探针和RNA核酸扩增片段以及金探针串联结合到一块，实现指标RNA核酸片段的特异检测。正是这种两套探针的使用，使得其中任何一套探针和指标核酸扩增片段杂交失败，都不能够被成功的固定在试纸条上，也就出现不了阳性检测结果，保证了检测的特异性。本发明试剂盒对表12所列的29种其它微生物的检测结果都为阴性，证明本发明试剂盒与其它微生物之间没有交叉反应。其中每套探针都可以设计两条以上，这样的设计又有利于提高试纸条的灵敏度。本发明试剂盒对RSVA(ATCC VR-26)的最低检测限为1.58×10TCID50/mL、RSVB(ATCC VR-1580) 的最低检测限为4.45×10TCID50/mL、PIV1(ATCC VR-94)的最低检测限为1.58×10 TCID50/mL、PIV2(ATCC VR-92)的最低检测限为5.6TCID50/mL、PIV3(ATCC VR-93) 的最低检测限为1.58×10TCID50/mL。对于448份诊断结果均与呼吸道感染相关临床样本的呼吸道合胞病毒和/或副流感病毒检测灵敏度、特异性高于某商品化检测呼吸道合胞病毒或副流感病毒荧光定量PCR试剂盒。
4、本发明采用RNA恒温扩增技术和试纸条层析技术，即应用了RNA恒温扩增对仪器要求低的特点，又成功的融合了胶体金快速的特点。通过试纸条检测核酸，只需 10min左右即可进行结果判读。在操作上也十分简单，对实验人员技术要求低，更无需特殊的仪器设备，易于呼吸道合胞病毒或副流感病毒核酸检测向基层及偏远农村医疗机构的推广。
附图说明
图1RNA恒温扩增原理图；
图2试纸条显色原理图；
图3试纸条组成示意图；
图4检测阴阳性示意图；
a：PIV阳性、RSV阳性、内参阳性；
b：PIV阳性、RSV阴性、内参阳性；
c：PIV阴性、RSV阳性、内参阳性；
d：PIV阴性、RSV阴性、内参阳性；
e：PIV阴性、RSV阴性、内参阴性；
具体实施方式
通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如《分子克隆：实验室指南》第3版(New York:Cold Spring Harborlaboratory Press,2005)中所述的条件进行。
【实施例1】核酸检测试纸条的制备
在制备核酸检测试纸条时需要的主要原材料：硝酸纤维素膜(NC膜)、样本垫、吸水纸、PVC底板等。
1、喷膜：
检测线RSV-T线：能够捕获结合RSV特异探针CES序列，(10μM)，喷膜量： 2～3μL/cm；
检测线PIV-T线：能够捕获结合PIV特异探针CES序列，(10μM)，喷膜量：2～3μL/cm；
检测线内参-T线：能够捕获结合内参特异探针CES序列，(10μM)，喷膜量： 2～3μL/cm；
质控线(C线)：能够捕获结合C线显色探针序列，(10μM)，喷膜量：2～3μL/cm；
喷膜完毕后，在紫外交联仪中自动交联一次，放于37℃洁净恒温箱内干燥2小时，存于干燥环境中备用。
2、试纸条组装
分别裁取2cm长的吸水纸、包被好的NC膜、样品垫从上到下依次固定于PVC底板上，即成检测试纸条。试纸条的组装结构图如图3。
【实施例2】灵敏度测试
将ATCC来源的病毒原液进行梯度稀释液进行最低检测限确定，每个梯度的病毒稀释液重复3～5份，每份进行20次的重复检测，将具有90％～95％阳性检出率的病毒水平作为最低检测限，
病原体信息如下：
表1病原体信息
| 病原体名称 | ATCC编号 | 浓度(TCID<sub>50</sub>/mL) |
| RSVA | VR-26 | 1.58×10<sup>7</sup> |
| RSVB | VR-1580 | 8.89×10<sup>5</sup> |
| PIV1 | VR-94 | 1.58×10<sup>4</sup> |
| PIV2 | VR-92 | 2.8×10<sup>6</sup> |
| PIV3 | VR93 | 1.58×10<sup>7</sup> |
测试结果：
(1)RSV-A最低检测限检测结果
表2不同滴度RSV-A的检测实验数据
表3 RSV-A最低检测限实验数据
(2)RSV-B最低检测限检测结果
表4不同滴度RSV-B的检测实验数据
表5 RSV-B最低检测限实验数据
(3)PIV-1最低检测限检测结果
表6不同滴度PIV-1的检测实验数据
表7 PIV-1最低检测限实验数据
(4)PIV-2最低检测限检测结果
表8不同滴度PIV-2的检测实验数据
表9 PIV-2最低检测限实验数据
(5)PIV-3最低检测限检测结果
表10不同滴度PIV-3的检测实验数据
表11 PIV-3最低检测限实验数据
最终确定本发明试剂盒的检测灵敏度为：
【实施例3】特异性验证
1，测试菌株
将表12中的微生物提取核酸后检测，验证本发明试剂盒引物及探针设计的特异性。相关病原体、滴度及特异性验证结果如下：
表12特异性验证测试菌株信息及特异性验证测测试结果
2，测试结果
测试结果如下：
表13特异性验证测测试结果
3，结论
从以上数据可以看出，本发明试剂盒对这些微生物的检测结果都为阴性，证明本发明试剂盒与其他微生物之间没有交叉反应，体现试剂盒检测病原体的特异性强。
【实施例4】病原体检出力验证
使用本发明试剂盒对11株病原体株进行检测，验证本试剂盒对不同病原体株的检出能力。检测结果如下：
表14不同病原体株检测结果
从以上结果可以看出，本试剂盒对不同的病原体株具有很好的检出能力。
【实施例5】临床样本的验证
1，临床样本信息
在湖北省人民医院共检测咽拭子样本448份，其中男性标本和女性标本分别为236例和212例，分别占比为52.38％和47.62％。448例标本中，患者年龄最大为68岁，最小为1个月，平均年龄为11.13岁，标准差为13.5岁，中位数为6岁。入组患者的诊断结果均与呼吸道感染相关，具体分布情况如下：疑似流感182例，(急性)上呼吸道感染107例，(感染性)发热73例，(急性、喘息性)支气管炎44例，流行性感冒27 例，其他15例。
2，检测结果
(1)呼吸道合胞病毒检测结果
检测时同时使用本发明试剂盒和某商品化检测呼吸道合胞病毒荧光定量PCR试剂盒同时对样本进行检测，将检测结果汇总成四格表，如下：
对于不一致的3例样本采用“基因测序法”进行复测，测序结果与本试剂盒检测结果一致，因此可见某商品化检测呼吸道合胞病毒荧光定量PCR试剂盒漏检1例，假阳2 例，显而易见，本发明专利试剂盒检测临床样本呼吸道合胞病毒检测灵敏度更高，特异性更强。
(2)副流感病毒检测结果
检测时同时使用本发明试剂盒和某商品化检测副流感病毒荧光定量PCR试剂盒同时对样本进行检测，将检测结果汇总成四格表，如下：
对于不一致的8例样本采用“基因测序法”进行复测，结果阳性6例，5例为本发明试剂盒检测阳性某商品化荧光定量PCR试剂盒检测阴性样本，另一例为本发明试剂盒检测阴性某商品化荧光定量PCR试剂盒检测阳性样本。显而易见，本发明专利试剂盒检测临床样本时副流感病毒检测灵敏度更高，特异性更强。
序列表
<110> 武汉中帜生物科技股份有限公司
<120> 一种呼吸道合胞病毒和副流感病毒联合检测胶体金层析试剂盒及其应用
<160> 42
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
taatacgact cactataggg agacatggag aagatgcaaa 40
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tgttatagga ctttcttt 18
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
agtgacttct atgtctat 18
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<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
taatacgact cactataggg agatccgatt gtaaaaagca agatt 45
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gattttgatc tgccggggcg at 22
<210> 6
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
taatacgact cactataggg agacaaactc atatactact tatt 44
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cattgttcta ttggttgaag c 21
<210> 8
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
taatacgact cactataggg agatctgaca tactctatcc tg 42
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tcactttctc agttaatat 19
<210> 10
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
taatacgact cactataggg agacaccaga gacactcagc taagagca 48
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
cagcagccgc ggtaattc 18
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<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
cctactctgc agtgctccat cgtacgtctg tcatttttgc tcagagctcg agcactgcg 59
<210> 13
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ttgacagata tgatactatt ttcgcagtgc tcgagctctg agc 43
<210> 14
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
tcttttttct tgggatcttt ttcgcagtgc tcgagctctg agc 43
<210> 15
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
ttgggtgatg tgaatttgtt ttcgcagtgc tcgagctctg agc 43
<210> 16
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
ccctttattg attctaggtt ttcgcagtgc tcgagctctg agc 43
<210> 17
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
aatttggtgg ctctgttgtt ttcgcagtgc tcgagctctg agc 43
<210> 18
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
acttctatat ctattgagtt ttggcctcta agtcgtagcc ca 42
<210> 19
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
tttcttctta ggatctttgg atgatttttc gcagtgctcg agctctgagc 50
<210> 20
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
gcaaacttgc cttttattga ttctattttc gcagtgctcg agctctgagc 50
<210> 21
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
ggaattttgt agctttgtta ttttcgcagt gctcgagctc tgagc 45
<210> 22
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
ttgacagata ttatgctatc ttttggcctc taagtcgtag ccca 44
<210> 23
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
tcatagggtt gattgatatc ttttcgcagt gctcgagctc tgagc 45
<210> 24
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
tagcaaaacg tgaagttgag ttttcgcagt gctcgagctc tgagc 45
<210> 25
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
ttatactgtt atcttttaaa ttttatcgac gtggtaggca tagacgtact 50
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<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
tatttcagaa atgtcaagat ttttcgcagt gctcgagctc tgagc 45
<210> 27
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
catgcgggaa gtgccctagt ttttcgcagt gctcgagctc tgagc 45
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<212> DNA
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tcattattgt gaagagggct ttttatcgac gtggtaggca tagacgtact 50
<210> 29
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gctattttac ctttaacgat ttttcgcagt gctcgagctc tgagc 45
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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aggagagtta aggtgacact ttttcgcagt gctcgagctc tgagc 45
<210> 31
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tcataattgt gtgtaattgt ttttatcgac gtggtaggca tagacgtact 50
<210> 32
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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aaagctcgta gttggatctt tttcgcagtg ctcgagctct gagc 44
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ttgggagcgg gcgggcggtt tttcgcagtg ctcgagctct gagc 44
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<212> DNA
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tccgccgcga ggcgagcctt tttcgcagtg ctcgagctct gagc 44
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accgcccgtc cccgcccctt tttcgcagtg ctcgagctct gagc 44
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
agctccaata gcgtatattt ttgtggaaga ttatagc 37
<210> 37
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
taaagttgct gcagttaatt ttgtggaaga ttatagc 37
<210> 38
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
tcagatcact atgtactttt cgcagtgctc gagctctgag c 41
<210> 39
<211> 36
<212> DNA
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gtacatagtg atctgatttt gtacatagtg atctga 36
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
gctataatct tccacttttg ctataatctt ccac 34
<210> 41
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
agtacgtcta tgcctaccac gtcgattttt agtacgtcta tgcctaccac gtcgat 56
<210> 42
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
tgggctacga cttagaggcc tttttgggct acgacttaga ggcc 44
Claims (2)
1.一种呼吸道合胞病毒和副流感病毒核酸联合检测胶体金层析试剂盒，其特征在于，所述试剂盒是基于RNA恒温扩增-金探针层析技术，所述试剂盒包括：
1）扩增反应液：含40 mM Tris-HCl (pH 8.0)，12 mM MgCl2，70 mMKCl，15% DMSO，5mMDTT，每种dNTP各1 mM，每种NTP各2mM，扩增引物各0.2 µM；其中扩增引物包括五组：呼吸道合胞病毒A型和B型共用一条R，各一条F引物、副流感1、2、3型病毒和人内参基因各一对R和F引物，具体的：
（1）呼吸道合胞病毒的扩增引物：
RSV-R引物：5’TAATACGACTCACTATAGGGAGACATGGAGAAGATGCAAA3’ ；
RSVA-F引物：5’ TGTTATAGGACTTTCTTT3’ ；
RSVB-F引物：5’ AGTGACTTCTATGTCTAT3’ ；
（2）副流感病毒的扩增引物：
PIV1-R引物：5’TAATACGACTCACTATAGGGAGATCCGATTGTAAAAAGCAAGATT3’ ；
PIV1-F引物：5’ GATTTTGATCTGCCGGGGCGAT3’ ；
PIV2-R引物：5’TAATACGACTCACTATAGGGAGACAAACTCATATACTACTTATT3’ ；
PIV2-F引物：5’ CATTGTTCTATTGGTTGAAGC3’ ；
PIV3-R引物：5’TAATACGACTCACTATAGGGAGATCTGACATACTCTATCCTG3’ ；
PIV3-F引物：5’ TCACTTTCTCAGTTAATAT3’ ；
（3）内参基因的扩增引物：
内参-R引物：5’TAATACGACTCACTATAGGGAGACACCAGAGACACTCAGCTAAGAGCA3’ ；
内参-F引物：5’CAGCAGCCGCGGTAATTC3’ ；
2）扩增酶：包含三种，逆转录酶、T7 RNA聚合酶和RnaseH；优选地所述逆转录酶为AMV或M-MLV；
3）细胞裂解液：购至美国Signosis公司，货号CL-0001；
4）检测液：包含胶体金颗粒标记的核酸探针、每个指标的特异探针、C线显色探针，每个指标特异探针有两种，分别为CES系列和LES系列，其中CES系列和LES系列又可以设计多条，具体如下：
（1）金探针：
金探针5’端被巯基化修饰，所述序列为：
5’-CCTACTCTGCAGTGCTCCATCGTACGTCTGTCATTTTTGCTCAGAGCTCGAGCACTGCG-3’；
（2）RSVA特异探针序列：
RSVA-LES1: 5’TTGACAGATATGATACTATTTTCGCAGTGCTCGAGCTCTGAGC3’ ；
RSVA-LES2: 5’TCTTTTTTCTTGGGATCTTTTTCGCAGTGCTCGAGCTCTGAGC3’ ；
RSVA-LES3: 5’TTGGGTGATGTGAATTTGTTTTCGCAGTGCTCGAGCTCTGAGC3’ ；
RSVA-LES4: 5’CCCTTTATTGATTCTAGGTTTTCGCAGTGCTCGAGCTCTGAGC3’ ；
RSVA-LES5: 5’AATTTGGTGGCTCTGTTGTTTTCGCAGTGCTCGAGCTCTGAGC3’ ；
RSVA-CES: 5’ACTTCTATATCTATTGAGTTTTGGCCTCTAAGTCGTAGCCCA3’ ；
（3）RSVB特异探针序列：
RSVB-LES1：5’TTTCTTCTTAGGATCTTTGGATGATTTTTCGCAGTGCTCGAGCTCTGAGC3’ ；
RSVB-LES2：5’GCAAACTTGCCTTTTATTGATTCTATTTTCGCAGTGCTCGAGCTCTGAGC3’ ；
RSVB-LES3：5’GGAATTTTGTAGCTTTGTTATTTTCGCAGTGCTCGAGCTCTGAGC3’ ；
RSVB-CES：5’TTGACAGATATTATGCTATCTTTTGGCCTCTAAGTCGTAGCCCA3’ ；
（4）PIV1特异探针序列：
PIV1-LES1：5’TCATAGGGTTGATTGATATCTTTTCGCAGTGCTCGAGCTCTGAGC3’ ；
PIV1-LES2：5’TAGCAAAACGTGAAGTTGAGTTTTCGCAGTGCTCGAGCTCTGAGC3’ ；
PIV1-CES：5’TTATACTGTTATCTTTTAAATTTTATCGACGTGGTAGGCATAGACGTACT3’ ；
（5）PIV2特异探针序列：
PIV2-LES1：5’TATTTCAGAAATGTCAAGATTTTTCGCAGTGCTCGAGCTCTGAGC3’ ；
PIV2-LES2：5’CATGCGGGAAGTGCCCTAGTTTTTCGCAGTGCTCGAGCTCTGAGC3’ ；
PIV2-CES：5’TCATTATTGTGAAGAGGGCTTTTTATCGACGTGGTAGGCATAGACGTACT3’ ；
（6）PIV3特异探针序列：
PIV3-LES1：5’GCTATTTTACCTTTAACGATTTTTCGCAGTGCTCGAGCTCTGAGC3’ ；
PIV3-LES2：5’AGGAGAGTTAAGGTGACACTTTTTCGCAGTGCTCGAGCTCTGAGC3’ ；
PIV3-CES：5’TCATAATTGTGTGTAATTGTTTTTATCGACGTGGTAGGCATAGACGTACT3’ ；
（7）人内参基因特异探针序列：
内参LES1: 5’AAAGCTCGTAGTTGGATCTTTTTCGCAGTGCTCGAGCTCTGAGC3’ ；
内参LES2：5’TTGGGAGCGGGCGGGCGGTTTTTCGCAGTGCTCGAGCTCTGAGC3’ ；
内参LES3：5’TCCGCCGCGAGGCGAGCCTTTTTCGCAGTGCTCGAGCTCTGAGC3’ ；
内参LES4：5’ACCGCCCGTCCCCGCCCCTTTTTCGCAGTGCTCGAGCTCTGAGC3’ ；
内参CES1：5’AGCTCCAATAGCGTATATTTTTGTGGAAGATTATAGC3’ ；
内参CES2：5’TAAAGTTGCTGCAGTTAATTTTGTGGAAGATTATAGC3’ ；
（8）C线显色探针序列：
5’TCAGATCACTATGTACttttCGCAGTGCTCGAGCTCTGAGC3’ ；
5）试纸条：所用试纸条被固定于PVC底板上，从左往右依次是样品垫、NC膜、吸水纸；NC膜上有C线（质控线）和三条T线（检测线），从样品垫到吸水纸方向分别为RSV-T、PIV-T、内参-T和C线；PIV-T处包被PIV包被探针、RSV-T处包被RSV包被探针、内参-T处包被内参包被探针、C线处包被C线包被探针，具体序列为：
C线包被探针序列：
5’ GTACATAGTGATCTGAttttGTACATAGTGATCTGA 3’ ；
内参线包被探针序列：
5’GCTATAATCTTCCACTTTTGCTATAATCTTCCAC3’ ；
PIV线包被探针序列：
5’AGTACGTCTATGCCTACCACGTCGATTTTTAGTACGTCTATGCCTACCACGTCGAT3’ ；
RSV线包被探针序列：
5’TGGGCTACGACTTAGAGGCCTTTTTGGGCTACGACTTAGAGGCC3’ 。
2.权利要求1所述的试剂盒在制备呼吸道合胞病毒和/或副流感病毒检测试剂中的应用。
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| CN110964853A (zh) * | 2019-12-19 | 2020-04-07 | 武汉中帜生物科技股份有限公司 | 一种基于双扩增技术联合检测呼吸道合胞病毒、副流感病毒及腺病毒的试剂盒及其应用 |
| CN110964853B (zh) * | 2019-12-19 | 2023-06-02 | 武汉中帜生物科技股份有限公司 | 一种基于双扩增技术联合检测呼吸道合胞病毒、副流感病毒及腺病毒的试剂盒及其应用 |
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| CN110964852B (zh) | 2023-06-06 |
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