WO2017202007A1 - 检测早期糖尿病肾病的胶体金试纸条的制备方法 - Google Patents

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WO2017202007A1
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colloidal gold
pad
preparing
monoclonal antibody
test strip
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张贯京
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深圳市前海安测信息技术有限公司
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    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
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    • G—PHYSICS
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    • G01N2800/34—Genitourinary disorders
    • G01N2800/347—Renal failures; Glomerular diseases; Tubulointerstitial diseases, e.g. nephritic syndrome, glomerulonephritis; Renovascular diseases, e.g. renal artery occlusion, nephropathy

Definitions

  • the present invention belongs to the field of clinical medical disease detection, and particularly relates to a method for preparing a colloidal gold test strip for detecting early diabetic nephropathy.
  • Diabetic nephropathy is one of the most serious chronic microvascular complications of diabetes, and eventually causes end-stage renal failure, which is the leading cause of death in diabetic patients.
  • patients with diabetic nephropathy miss the best treatment, resulting in a sharp deterioration of the disease, irreversible. Therefore, early detection and early intervention of biomarkers for early damage of diabetic nephropathy have important practical significance.
  • biomarkers related to early diabetic nephropathy have been discovered. Some biomarkers can be released into the urine at this stage. The type and content of protein in urine directly reflect the urinary system, especially the kidney. The state of health can predict the occurrence, development and prognosis of diabetic nephropathy.
  • podocalyxin is an early biomarker of podocyte injury and is positively associated with the development of the disease;
  • Collagen IV plays an important role in maintaining the correct assembly of the basement membrane;
  • nephropathy Protein (Nephrin) plays an important role in the assembly of ruptured membranes;
  • liver-type fatty acid binding protein (L-FABP) a biomarker of glomerular mesenchymal cell damage, predicts the development of diabetic nephropathy;
  • cystatinC nerve growth factor-1
  • nerve growth factor-1 nerve growth factor-1
  • Immune colloidal gold technique is a novel immunolabeling technique applied to antigen antibodies by colloidal gold as a tracer biomarker, abbreviated as GICT.
  • Colloidal gold is polymerized into a certain size of gold particles by chloroauric acid (HAuC14) under the action of reducing agents such as white phosphorus, ascorbic acid, sodium citrate, citric acid, etc., and becomes a stable colloidal state due to electrostatic action.
  • HUAC14 chloroauric acid
  • reducing agents such as white phosphorus, ascorbic acid, sodium citrate, citric acid, etc.
  • Colloidal gold Colloidal gold is negatively charged in a weakly alkaline environment and forms a strong bond with the positively charged groups of protein molecules. Since this combination is electrostatically coupled, it does not affect the biological properties of the protein.
  • colloidal gold can also be combined with many other biomacromolecules such as SPA, PHA, C onA and the like.
  • colloidal gold According to some physical properties of colloidal gold, such as high electron density, particle size, shape and color reaction, plus the immunological and biological properties of the conjugate, colloidal gold is widely used in immunology, histology, pathology and cells. Fields such as biology.
  • the commonly used method for detecting early diabetic nephropathy is to use enzyme-linked immunosorbent assay (ELIS A), the technical disadvantages of which are as follows:
  • the detection device is bulky and costly; the detection interval is long, the repeatability is not good, Suitable for rapid clinical screening.
  • biomarkers for quantitative detection so multiple biomarkers for early detection of early diabetic nephropathy cannot be achieved, which cannot provide a basis for clinical diagnosis of early diabetic nephropathy.
  • the main object of the present invention is to provide a method for preparing a colloidal gold test strip for detecting early diabetic nephropathy, which aims to solve the problem that the current detection equipment cannot simultaneously detect multiple biomarkers of early diabetic nephropathy.
  • the present invention provides a method for preparing a colloidal gold test strip for detecting early diabetic nephropathy, the colloidal gold test strip comprising a sample pad, a gold standard pad, a nitrocellulose membrane, and an absorbent pad. And a support pad, the preparation method comprising the following steps:
  • Step of preparing colloidal gold 0.01% of chloroauric acid is mixed with 1% sodium citrate, boiled and stirred until red color is obtained to obtain colloidal gold, and the colloidal gold is stored for use;
  • Step of preparing colloidal gold antibody complex Mixing one of the monoclonal antibodies corresponding to each biomarker with the prepared colloidal gold and determining the minimum concentration of monoclonal antibody by gradient dilution method, in the labeling Monoclonal antibody ⁇ , the prepared colloidal gold is mixed with the lowest concentration of monoclonal antibody, stirred, added bovine serum albumin (BSA) and purified to obtain a colloidal gold antibody complex;
  • BSA bovine serum albumin
  • gold standard pad processing steps the gold standard pad is immersed in the BSA for the first stage of the day and dried, the prepared colloidal gold antibody complex is evenly spread on the gold standard pad and the second stage is thermostatically dried;
  • Step of preparing a detection line on a nitrocellulose membrane selecting each of the selected paired monoclonal antibodies corresponding to the biomarker in parallel according to the arrangement order on the nitrocellulose membrane to form a plurality of detections Line and thermostat dry the second section of the day;
  • Step of preparing a control line on the nitrocellulose membrane after the detection line of the secondary antibody on the nitrocellulose membrane is drawn, a line parallel to the detection line is formed into a control line and the second section is thermostatically dried;
  • Sample pad processing step immersing the sample pad in the first stage of the buffer in phosphate buffer (PBS), and drying the second stage to prepare a sample pad for use;
  • PBS phosphate buffer
  • the step of preparing the absorbent pad selecting the absorbent pad and cutting according to a predetermined width
  • Step of assembling the colloidal gold test strip the prepared sample mat, the gold standard mat, the nitrocellulose membrane, and the absorbent pad are overlapped with each other by a preset length and sequentially attached to the support mat, and the colloidal gold test is obtained by cutting. Paper strips.
  • the sample pad and the gold standard pad are both made of a glass fiber film or a polyester film material, and the water absorbing pad is made of a water absorbing fiber or a water absorbing sponge material.
  • the step of determining the lowest concentration of the monoclonal antibody by the gradient dilution method comprises the following steps
  • the monoclonal antibody dilution was mixed with colloidal gold at 1:5, and the pH was adjusted to 9.0, and incubated for 10 minutes;
  • the lowest concentration of monoclonal antibody is determined by comparing the lowest concentration of each monoclonal antibody.
  • the step of purifying the colloidal gold antibody complex comprises the following steps:
  • the immunocolloidal gold complex is purified by centrifugation, and the supernatant is transferred after centrifugation at 2000 rpm for 10 minutes. Move to a centrifuge tube and centrifuge at 12000 rpm for 20 minutes to remove the supernatant;
  • the red deposit was suspended with TBS buffer, and the red deposit was suspended with TBS to 1/10 of the original volume, which is the purified lml colloidal gold antibody complex.
  • the first stage is 2 to 3 inches
  • the second stage is 3 to 12 hours
  • the constant temperature is 25 to 30 ° C.
  • the biomarker comprises podoside protein, type IV collagen, hepatic fatty acid binding protein and neutrophil gelatinase-associated lipocalin.
  • the monoclonal antibody comprises a monoclonal antibody to a podoside protein, a monoclonal antibody of type IV collagen, a monoclonal antibody against a neutrophil gelatinase-associated lipocalin, and a monoclonal antibody to a liver-type fatty acid binding protein. antibody.
  • the plurality of detection lines are arranged in the order of arrangement of the nitrocellulose membranes along the sample chromatography direction on the sample pad and are arranged at equal intervals in accordance with the molecular weight of the biomarkers from large to small.
  • the predetermined length is 1.5 ⁇ 2 mm
  • the secondary antibody is goat anti-mouse IgG or rabbit anti-mouse IgG.
  • the colloidal gold test strip prepared by the above preparation method can detect various early biomarkers of early diabetic nephropathy, and solve the narrowness and foresight of single biomarker screening spectrum.
  • the problem of poor performance can save the cost of testing and improve the accuracy of detection.
  • the colloidal gold test strip can be used together with a quantitative detector to achieve homologous quantitative detection of various biomarkers, providing a basis for clinical diagnosis of early diabetic nephropathy, and improving detection efficiency.
  • FIG. 1 is a schematic structural view of a preferred embodiment of a colloidal gold test strip for detecting early diabetic nephropathy according to the present invention
  • FIG. 2 is a preferred embodiment of a method for preparing a colloidal gold test strip for detecting early diabetic nephropathy according to the present invention
  • the flow chart of the example The flow chart of the example.
  • the colloidal gold test strip comprises a sample pad 1, a gold standard pad 2, a nitrocellulose film 3, an absorbent pad 4, and a support pad 5.
  • the sample pad 1, the gold standard pad 2, the nitrocellulose film 3, and the absorbent pad 4 overlap each other with a predetermined length (for example, 1.5 to 2 mm) and are pasted on the support pad 5.
  • the gold standard pad 2 is coated with a plurality of biomarker monoclonal antibodies, and the nitrocellulose membrane 3 is provided with a plurality of detecting lines 31 (for example, T1 to T4) and a control line 32, each detecting line 31 is coated with another monoclonal antibody that is paired with the monoclonal antibody coated on the gold pad 2.
  • the control line 32 is coated with a secondary antibody such as goat anti-mouse IgG or rabbit anti-mouse IgG.
  • the secondary antibody refers to a monoclonal antibody that binds to a gold-labeled pad 2, that is, an anti-antibody, and its main function is to detect the effectiveness of the gold-labeled test strip.
  • coating as used in the examples of the present invention means non-specific adsorption and fixation.
  • the materials and reagents used in the examples of the present invention are generally commercially available unless otherwise specified.
  • the plurality of biomarkers include, but are not limited to, podocalyx in, collagen IV, and liver fatty acid binding protein (L-FABP). And neutrophil gelatinase-associated lipocalin (NGAL).
  • L-FABP liver fatty acid binding protein
  • NGAL neutrophil gelatinase-associated lipocalin
  • Each of the detection lines 31 is coated with another monoclonal antibody that is paired with the antibody coated on the gold label pad 2, and the plurality of detection lines are disposed on the nitrocellulose membrane 3
  • the order of arrangement is along the sample chromatography direction 6 on the sample pad and arranged at equal intervals in accordance with the molecular weight of the biomarker from large to small.
  • podocalyxin, type IV collagen (Collagen IV), liver type fatty acid binding protein (L-FABP), and neutrophil gelatinase-associated lipocalin (NGAL) are approximately 55KDa, 160 KDa, 14 KDa, 21 KDa, therefore, another anti-monoclonal antibody coated with different detection lines 31 is anti-type IV collagen (Collagen IV) monoclonal antibody, anti-sufficient glycoside from left to right.
  • the sample pad 1 and the gold standard pad 2 are both made of a glass fiber film or a polyester film material, and the sample pad 1 is a sample of a sample to be detected (for example, urine). position.
  • the gold standard pad 2 is labeled with a monoclonal antibody against a biomarker.
  • the antibody coated with the detection line 31 and the antibody coated with the gold standard pad 2 are a pair of monoclonal antibodies.
  • the antibody coated with the control line 32 is a secondary antibody capable of binding to a monoclonal antibody labeled on the gold label pad 2, for example, a goat anti-mouse IgG or a rabbit anti-mouse IgG.
  • the sample pad 1, the gold standard pad 2, the nitrocellulose membrane 3, and the absorbent pad 4 overlap each other by a predetermined length (for example, 1.5 to 2 mm) and are pasted on the support pad 5.
  • the water absorbing pad 4 is made of a water absorbing fiber or a water absorbing sponge material having strong water absorbing ability, and has a strong suction flow effect on the sample liquid on the sample pad 1 , that is, the sample liquid passes the gold standard pad 2 to the gold standard antibody.
  • the antigen complex or gold standard antibody complex is adsorbed along the chromatographic direction 6 of the sample liquid to the corresponding detection line position or control line position on the nitrocellulose membrane 3.
  • the support pad 5 is a rigid plastic bottom plate or a PVC support bottom plate.
  • FIG. 2 is a schematic flow chart of a preferred embodiment of a method for preparing a colloidal gold test strip for detecting early diabetic nephropathy according to the present invention.
  • the preparation method of the colloidal gold test strip comprises the steps of:
  • Step S21 the step of preparing colloidal gold: mixing 0.01% of chloroauric acid with 1% sodium citrate, boiling and stirring until red color is obtained to obtain colloidal gold, and the colloidal gold is stored for use;
  • 100 ml of colloidal gold particles having a diameter of 20 to 30 nm were prepared by a trisodium citrate reduction method.
  • 0.01% chloroauric acid for example, add 99 ml of trihydrated water to a 500 ml Erlenmeyer flask, add 1% chloroauric acid aqueous solution to 1 ml, and make the concentration of chloroauric acid 0.01%; % chloroauric acid is heated to boil, then add 1.0 ⁇ 2.0ml of 1% sodium citrate, stir constantly, continue to boil until red appears, continue to boil for 10 minutes, dilute to 100ml, and prepare the colloid
  • the gold is stored at 4 °C for use.
  • Step S22 preparing a colloidal gold antibody complex: each monoclonal antibody is separately mixed with the prepared colloidal gold and the minimum concentration of the monoclonal antibody is determined by a gradient dilution method, and the antibody is labeled and prepared. Good colloidal gold is mixed with the lowest concentration of monoclonal antibody, and then added to bovine serum albumin (BSA) after stirring, stirring is continued and purified to obtain a colloidal gold antibody complex;
  • BSA bovine serum albumin
  • a monoclonal antibody was selected using a 0.002 mol/L phosphate buffer at pH 9.0.
  • Sodium chloride NaCl
  • the minimum antibody concentration for stabilizing 1 ml of colloidal gold is the lowest concentration of the selected labeled antibody; the lowest concentration of other monoclonal antibodies The same method was used to determine; the lowest concentration of monoclonal antibody was determined by comparing the minimum concentration of each monoclonal antibody.
  • Step S23 the gold standard pad processing step: the gold standard pad 2 is immersed in the BSA in the first stage (for example, 2 to 3), and dried, and the prepared colloidal gold antibody complex is evenly spread. Treat the gold standard pad 2 and dry it at a constant temperature for the second stage;
  • the gold standard pad 2 is prepared by the immersion gold method. First, soak the gold standard pad 2 (such as glass fiber film or polyester film) with 2.0% BSA for 2 ⁇ 3 hours, and then use it for drying. Use colloidal gold antibody compound with a spray gun to make the spray volume uniform with 1.0ul/cm. Spread on the treated gold standard pad 2, and keep the second section of the crucible (for example, 3 to 12 hours) at a constant temperature (for example, 25 ° C to 30 ° C).
  • a constant temperature for example, 25 ° C to 30 ° C.
  • Step S24 the step of preparing a detection line on the nitrocellulose membrane: preparing each of the selected paired monoclonal antibodies corresponding to the biomarker in parallel according to the arrangement order on the nitrocellulose membrane 3 Forming a plurality of detection lines 31 and thermostatically drying the second section of the crucible;
  • a monoclonal antibody having a concentration of 2.0 to 2.5 mg/ml is taken, and a plurality of parallel lines are respectively arranged on the nitrocellulose membrane 3 according to 1 ul/cm, and the distance between each parallel line is 5 to 10 mm. , each line length is 0.5 ⁇ 0. 8cm, constant temperature 25 ° C ⁇ 30 ° C drying the second section of the day (for example, 3 to 12 hours) is made into the detection line 31.
  • the plurality of detection lines 31 are arranged in the order in which the nitrocellulose membranes 3 are arranged along the sample chromatography direction on the sample pad 1 and are arranged at equal intervals in accordance with the molecular weight of the biomarkers from large to small.
  • Step S25 a step of preparing a control line on the nitrocellulose membrane: after the detection line 31 on the nitrocellulose membrane 3 (for example, the detection line T4), the secondary antibody is drawn in a line parallel to each of the detection lines 31. Making the control line 32 and drying the second section of the chamber at a constant temperature;
  • a secondary antibody having a concentration of 2.0 to 2.5 mg/ml is taken, and the nitrocellulose membrane 3 is scribed on the ul/cm, and is parallel to the detection line 31 by 5 to 10 mm, and the line length is 0.5 ⁇ . 0.8cm, constant temperature (eg 25°C
  • Step S26 the sample pad processing step: soaking the sample pad in the first stage of the PBS buffer (for example, 2
  • the sample pad 1 is immersed in O.lmol/L PBS buffer for 2 to 3 hours, and the second stage is dried at a constant temperature (for example, 25 ° C to 30 ° C) (for example) 3 ⁇ 12 small ⁇ ) Small ⁇ spare.
  • Step S27 the step of making the absorbent pad: selecting the absorbent pad 4 and cutting according to a predetermined width; in the embodiment, cutting the absorbent pad 4 of a predetermined width (for example, 2 cm * width lcm).
  • Step S28 the step of assembling the colloidal gold test strip: the prepared sample pad 1, the gold standard pad 2, the nitrocellulose membrane 3, and the absorbent pad 4 are overlapped with each other by a preset length and sequentially attached to the support pad. 5, the colloidal gold test strip is obtained by cutting;
  • a support pad 5 having a length of 8 to 15 cm is taken, and a sample pad 1, a gold standard pad 2, a nitrocellulose film 3, an absorbent pad 4, and adjacent pads are sequentially attached to the support pad 5.
  • the preset length (for example, 1.5 to 2 mm) is overlapped with each other, and cut into a colloidal gold test strip having a width of (0.5 to 0.8) cm and a length of (8 to 10) cm.
  • the colloidal gold test strip is used to detect the urine (sample) of the patient with early diabetic nephropathy, the urine of the patient flows through the sample pad 1, and the biomarkers associated with early diabetic nephropathy in the patient's urine are The corresponding antibody on the gold pad 2 binds to form a colloidal gold antibody complex (i.e., an antigen-antibody immune complex); the complex flows as the sample liquid is chromatographed on the nitrocellulose membrane 3.
  • a colloidal gold antibody complex i.e., an antigen-antibody immune complex
  • the chromatogram When the chromatogram is detected in the detection line region, another monoclonal antibody that has been pre-coated with the marker is captured and trapped on the detection line 31 (for example, T1 to T4), and the more certain markers are captured, at a certain The darker the color on the detection line 31; at the same time, during the chromatography, the untrapped colloidal gold antibody complex continues to advance, and when it reaches the control line 32 area, it will be The pre-coated secondary antibody (e.g., goat anti-mouse IgG) is identified and retained on control line 32, displaying red. The content of different markers in the sample is judged based on the depth of red on the different detection lines 31.
  • the pre-coated secondary antibody e.g., goat anti-mouse IgG
  • the colloidal gold test strip of the invention has the advantages of easy detection, wide application, convenient carrying and comprehensive screening, and can be combined with color collection equipment to realize the same-quantity quantitative detection of various markers, thereby improving the detection efficiency.
  • the colloidal gold test strip prepared by the above preparation method can detect various early biomarkers of early diabetic nephropathy, and solve the narrowness and foresight of single biomarker screening spectrum.
  • the problem of poor performance can save the cost of testing and improve the accuracy of detection.
  • the colloidal gold test strip can be used together with a quantitative detector to achieve homologous quantitative detection of various biomarkers, providing a basis for clinical diagnosis of early diabetic nephropathy, and improving detection efficiency.

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Abstract

一种检测早期糖尿病肾病的胶体金试纸条的制备方法，该胶体金试纸条包括样品垫(1)、金标垫(2)、硝酸纤维素膜(3)、吸水垫(4)以及支撑垫(5)，制备方法包含：制备胶体金的步骤；制备胶体金抗体复合物的步骤；金标垫(2)处理步骤；在硝酸纤维素膜(3)上制备检测线(31)的步骤；在硝酸纤维素膜(3)上制备控制线(32)的步骤；样品垫(1)处理步骤；制备吸水垫(4)的步骤；组装胶体金试纸条的步骤。通过上述步骤制备成的胶体金试纸条可以实现同时定量检测早期糖尿病肾病的多种生物标志物，解决单一生物标志物筛查谱狭窄及预见性较差的问题，从而节省检测早期糖尿病肾病的成本，提高检测的准确性及效率。

Description

检测早期糖尿病肾病的胶体金试纸条的制备方法 技术领域
[0001] 本发明属于临床医学疾病检测领域， 尤其涉及一种检测早期糖尿病肾病的胶体 金试纸条的制备方法。
背景技术
[0002] 糖尿病肾病是糖尿病最严重的慢性微血管并发症之一， 并最终引起终末肾衰竭 ， 是糖尿病患者死亡的主要原因。 然而， 糖尿病肾病早期很难发现， 且临床糖 尿病肾病诊断黄金标准肌酐和蛋白尿也只能间接反映肾脏实质性病变， 在正常 蛋白尿期间无法诊断早期糖尿病肾病。 通常当临床确诊吋， 糖尿病肾病患者错 过了最佳的治疗吋机， 致使疾病急剧恶化， 不可逆转。 因此， 针对糖尿病肾病 早期损伤生物标志物早发现、 早干预， 具有重要的现实意义。
[0003] 目前研究发现了许多早期糖尿病肾病相关的生物标志物， 有些生物标志物可以 在此阶段释放到尿液中， 尿液中的蛋白种类及含量的高低直接反映了泌尿系统 ， 尤其是肾脏的健康状态， 可以预测糖尿病肾病发生、 发展及预后的情况。 比 如足糖萼蛋白 （podocalyxin) ， 是足细胞损伤的早期生物标志物， 并与疾病的发 展正相关； IV型胶原蛋白 （Collagen IV) ， 在维持细胞基底膜正确装配方面具有 重要的作用； 肾病蛋白 （Nephrin) ， 在裂空隔膜的装配中发挥重要的作用； 肝 型脂肪酸结合蛋白 (L-FABP) , 是肾小球间质细胞损伤的生物标志物， 可以预测 糖尿病肾病的发生； 中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白 （NGAL) 、 胱抑素 C
(cystatinC) 、 神经生长因子 -1 (Netrin-l) 是肾小管近端损伤的生物标志物。 对这些与疾病发生发展密切相关的生物标志物进行检测， 有助于了解糖尿病肾 病发生和发展， 有效提高对肾病并发症的预测能力。
[0004] 免疫胶体金技术 （Immune colloidal gold technique) 是以胶体金作为示踪生物标 志物应用于抗原抗体的一种新型的免疫标记技术， 英文缩写为 GICT。 胶体金是 由氯金酸 （HAuC14) 在还原剂如白磷、 抗坏血酸、 枸橼酸钠、 鞣酸等作用下， 聚合成为特定大小的金颗粒， 并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态， 称为 胶体金。 胶体金在弱碱环境下带负电荷， 可与蛋白质分子的正电荷基团形成牢 固的结合， 由于这种结合是静电结合， 所以不影响蛋白质的生物特性。 胶体金 除了与蛋白质结合以外， 还可以与许多其它生物大分子结合， 如 SPA、 PHA、 C onA等。 根据胶体金的一些物理性状， 如高电子密度、 颗粒大小、 形状及颜色反 应， 加上结合物的免疫和生物学特性， 因而使胶体金广泛地应用于免疫学、 组 织学、 病理学和细胞生物学等领域。
[0005] 目前检测早期糖尿病肾病的检测设备中常用的方法是采用酶联免疫技术 （ELIS A) ， 其技术缺点如下： 检测设备体积大、 成本高； 检测吋间长、 重复性不好， 不适合临床的快速筛査。 然而， 目前尚无利用多种生物标志物同吋进行定量检 测的设备， 因此不能实现同吋定量检测早期糖尿病肾病的多种生物标志物， 从 而无法为早期糖尿病肾病临床诊断提供依据。
技术问题
[0006] 本发明的主要目的在于提供一种检测早期糖尿病肾病的胶体金试纸条的制备方 法， 旨在解决目前检测设备无法同吋定量检测早期糖尿病肾病多种生物标志物 的问题。
问题的解决方案
技术解决方案
[0007] 为实现上述目的， 本发明提供了一种检测早期糖尿病肾病的胶体金试纸条的制 备方法， 所述胶体金试纸条包括样品垫、 金标垫、 硝酸纤维素膜、 吸水垫以及 支撑垫， 所述制备方法包含以下步骤：
[0008] 制备胶体金的步骤： 将 0.01%的氯金酸与 1%柠檬酸钠混合， 煮沸搅拌直到出现 红色得到胶体金， 将该胶体金保存备用；
[0009] 制备胶体金抗体复合物的步骤： 将与每种生物标志物对应的其中一种单克隆抗 体分别与制备好的胶体金混合并通过梯度稀释法确定最低浓度的单克隆抗体， 在标记单克隆抗体吋， 取制备好的胶体金与最低浓度的单克隆抗体混合， 搅拌 后加入牛血清白蛋白 （BSA) 并经纯化获得胶体金抗体复合物；
[0010] 金标垫处理步骤： 将金标垫在 BSA中浸泡第一段吋间后并干燥， 将制备好的胶 体金抗体复合物均匀铺在金标垫上并恒温干燥第二段吋间； [0011] 在硝酸纤维素膜上制备检测线的步骤： 将选择的每种与生物标志物对应的另一 种配对单克隆抗体按照排列顺序在硝酸纤维素膜上平行划线制作成多条检测线 并恒温干燥第二段吋间；
[0012] 在硝酸纤维素膜上制备控制线的步骤： 将二抗在硝酸纤维素膜上的检测线之后 划一根与检测线平行的线制作成控制线并恒温干燥第二段吋间；
[0013] 样品垫处理步骤： 将样品垫在磷酸缓冲液 （PBS) 中浸泡第一段吋间， 恒温干 燥第二段吋间制作成样品垫备用；
[0014] 制备吸水垫的步骤： 选择吸水垫并按照预定宽度进行裁剪；
[0015] 组装胶体金试纸条的步骤： 将上述制备好的样品垫、 金标垫、 硝酸纤维素膜以 及吸水垫首尾相互重叠预设长度并依次粘贴在支撑垫上， 经裁剪得到胶体金试 纸条。
[0016] 优选的， 所述样品垫和金标垫均采用玻璃纤维膜或聚酯膜材料制成， 所述吸水 垫采用吸水纤维或吸水海绵材料制成。
[0017] 优选的， 所述通过梯度稀释法确定最低浓度的单克隆抗体的步骤包括如下步骤
[0018] 选择一种单克隆抗体， 利用 0.002mol/L、 pH 9.0的 PBS将选择的单克隆抗体稀释 到预设浓度梯度 0.01〜0.1 mg/ml;
[0019] 将所述单克隆抗体稀释液与胶体金按照 1:5混合， 并将 PH调整为 9.0， 孵育 10分 钟；
[0020] 加入 0.1ml的 10%氯化钠 （NaCl) 得到胶体金抗体复合物， 然后检测 520 nm下 的吸光值， 经比较分析确定稳定 lml胶体金的最低抗体量即为选择的单克隆抗体 的最低浓度；
[0021] 确定其他单克隆抗体的最低浓度采用以上相同步骤；
[0022] 通过比较每一种单克隆抗体的最低浓度来确定最低浓度的单克隆抗体。
[0023] 优选的， 所述纯化获得胶体金抗体复合物的步骤包括如下步骤：
[0024] 将胶体金与最低浓度的一种单克隆抗体混合液搅拌 10分钟， 缓慢加入 BSA使浓 度为 1%， 继续搅拌 30分钟， 4°C静置 2〜3小吋， 获得免疫胶体金复合物；
[0025] 将所述免疫胶体金复合物采用离心法纯化， 先 2000rpm离心 10分钟后将上清转 移到离心管中， 再 12000rpm离心 20分钟后去掉上清；
[0026] 用 TBS缓冲液悬起红色沉积物， 再用 TBS悬起红色沉积物为原体积的 1/10， 即 为纯化的 lml胶体金抗体复合物。
[0027] 优选的， 所述第一段吋间为 2〜3小吋， 所述第二段吋间为 3〜12小吋， 所述恒 温为 25°C〜30°C。
[0028] 优选的， 其特征在于， 所述生物标志物包括足糖萼蛋白、 IV型胶原蛋白、 肝型 脂肪酸结合蛋白和中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白。
[0029] 优选的， 所述单克隆抗体包括足糖萼蛋白单克隆抗体、 IV型胶原蛋白单克隆抗 体、 中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白单克隆抗体以及肝型脂肪酸结合蛋白 单克隆抗体。
[0030] 优选的， 所述多条检测线设置在所述硝酸纤维素膜的排列顺序是沿着样品垫上 的样品层析方向并按照生物标志物分子量从大到小平行等间隔排列。
[0031] 优选的， 所述预设长度为 1.5〜2mm， 所述二抗为羊抗鼠 IgG或兔抗鼠 IgG。
发明的有益效果
有益效果
[0032] 相较于现有技术， 本发明通过上述制备方法制备成的胶体金试纸条可以针对早 期糖尿病肾病的多种早期生物标志物进行检测， 解决单一生物标志物筛査谱狭 窄及预见性较差的问题， 可以节省检测成本， 提高检测准确性。 此外， 所述胶 体金试纸条可以结合定量检测仪一起使用实现多种生物标志物的同吋定量检测 ， 为早期糖尿病肾病临床诊断提供依据， 提高检测效率。
对附图的简要说明
附图说明
[0033] 图 1是本发明检测早期糖尿病肾病的胶体金试纸条较佳实施例的结构示意图； [0034] 图 2是本发明检测早期糖尿病肾病的胶体金试纸条的制备方法较佳实施例的流 程示意图。
[0035] 本发明目的的实现、 功能特点及优点将结合实施例， 参照附图做进一步说明。
实施该发明的最佳实施例 本发明的最佳实施方式
[0036] 为更进一步阐述本发明为达成上述目的所采取的技术手段及功效， 以下结合附 图及较佳实施例， 对本发明的具体实施方式、 结构、 特征及其功效进行详细说 明。 应当理解， 此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明， 并不用于限定 本发明。
[0037] 如图 1所示， 图 1是本发明检测早期糖尿病肾病的胶体金试纸条较佳实施例的结 构示意图。 在本实施例中， 所述胶体金试纸条包括样品垫 1、 金标垫 2、 硝酸纤 维素膜 3、 吸水垫 4以及支撑垫 5。 其中， 所述样品垫 1、 金标垫 2、 硝酸纤维素膜 3、 吸水垫 4首尾相互重叠预设长度 （例如 1.5〜2mm) 并粘贴在所述支撑垫 5上。 所述金标垫 2上包被多种生物标志物的单克隆抗体， 所述硝酸纤维素膜 3上设置 有多条检测线 31 (例如 T1〜T4) 和一条控制线 32， 每一条检测线 31包被有一种 与所述金标垫 2上所包被的单克隆抗体相配对的另一种单克隆抗体。 所述控制线 32包被二抗， 例如羊抗鼠 IgG或者兔抗鼠 IgG。 所述二抗是指能和金标垫 2上标记 的一种单克隆抗体结合， 即抗抗体， 其主要作用是检测金标试纸条的有效性。 本发明实施例中所使用的包被一词意为非特异性吸附固定意思， 本发明实施例 中所使用的材料和试剂除特别说明外， 均为普通市售。
[0038] 在本实施例中， 所述多种生物标志物包括， 但不限于， 足糖萼蛋白 （podocalyx in) 、 IV型胶原蛋白 （Collagen IV) 、 肝型脂肪酸结合蛋白 (L-FABP)和中性粒细 胞明胶酶相关脂质运载蛋白 (NGAL)。
[0039] 每一条检测线 31包被有一种与所述金标垫 2上所包被的抗体相配对的另一种单 克隆抗体， 所述多条检测线设置在所述硝酸纤维素膜 3的排列顺序是沿着样品垫 上的样品层析方向 6并按照生物标志物分子量从大到小平行等间隔排列。 例如， 足糖萼蛋白 （podocalyxin) 、 IV型胶原蛋白 （Collagen IV) 、 肝型脂肪酸结合蛋 白 (L-FABP)和中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白 (NGAL), 按照分子量依次大 约为 55KDa、 160 KDa、 14 KDa、 21 KDa, 因此， 不同检测线 31包被的另一种抗 单克隆抗体从左到右依次为抗 IV型胶原蛋白 （Collagen IV) 单克隆抗体、 抗足糖 萼蛋白 （podocalyxin) 单克隆抗体、 抗中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白 (NG AL)单克隆抗体及抗肝型脂肪酸结合蛋白 (L-FABP)单克隆抗体。 [0040] 在本实施例中， 所述样品垫 1和金标垫 2均采用玻璃纤维膜或聚酯膜材料制成， 所述样品垫 1为待检测的样品 （例如尿液） 的加样位置。 所述金标垫 2上标记有 针对生物标志物的单克隆抗体。 所述检测线 31包被的抗体和金标垫 2包被的抗体 为一种相互配对单克隆抗体。 所述控制线 32包被的抗体为一种能和金标垫 2上标 记的一种单克隆抗体结合的二抗， 例如， 羊抗鼠 IgG或兔抗鼠 IgG。 所述样品垫 1 、 金标垫 2、 硝酸纤维素膜 3、 吸水垫 4首尾相互重叠预设长度 （例如 1.5〜2mm) 并粘贴在所述支撑垫 5上。 所述吸水垫 4采用吸水能力强的吸水纤维或吸水海绵 材料制成， 能够对所述样品垫 1上的样品液体具有强吸引流作用， 即样品液体通 过所述金标垫 2将金标抗体 -抗原复合物或者金标抗体复合物沿着样品液体的层析 方向 6吸附至所述硝酸纤维素膜 3上相应的检测线位置或控制线位置。 所述支撑 垫 5为一种硬质塑料底板或 PVC支撑底板。
[0041]
[0042] 如图 2所示， 图 2是本发明检测早期糖尿病肾病的胶体金试纸条的制备方法较佳 实施例的流程示意图。 所述胶体金试纸条的制备方法包括步骤：
[0043] 步骤 S21， 制备胶体金的步骤： 将 0.01%的氯金酸与 1%柠檬酸钠混合， 煮沸搅 拌直到出现红色得到胶体金， 将该胶体金保存备用；
[0044] 在本实施例中， 采用柠檬酸三钠还原法制备直径为 20〜30nm的胶体金颗粒 100 ml。 首先， 配制 0.01%的氯金酸， 例如取 99 ml三蒸水加入至 500ml的锥形瓶中， 加入 1%氯金酸水溶液 lml， 使氯金酸的浓度为 0.01%; 将配制好的 0.01%的氯金 酸加热煮沸， 然后加入 1.0〜2.0ml的 1%柠檬酸钠， 期间不停的搅拌， 继续煮沸直 到出现红色， 再继续煮沸 10分钟， 定容至 100ml， 并将配制好的胶体金保存在 4 °C温度下备用。
[0045] 步骤 S22， 制备胶体金抗体复合物的步骤： 将每一种单克隆抗体分别与制备好 的胶体金混合并通过梯度稀释法确定最低浓度的单克隆抗体， 在标记抗体吋， 取制备好的胶体金与最低浓度的单克隆抗体混合， 搅拌之后加入牛血清白蛋白 (BSA) ， 继续搅拌并经纯化获得胶体金抗体复合物；
[0046] 在本实施例中， 选择一种单克隆抗体， 利用 0.002mol/L、 pH 9.0的磷酸缓冲液
(PBS) 将选择的与生物标志物对应的单克隆抗体稀释到预设的浓度梯度 （例如 0.01〜0.1
mg/ml) ； 将抗体稀释液与胶体金按照 1:5混合 （例如将抗体稀释液 0.2ml加入到 1 ml的胶体金中） ， PH调整为 9.0， 孵育 10分钟后， 在加入 0.1ml的 10%
氯化钠 （NaCl) 得到胶体金抗体复合物， 然后检测 520纳米 （nm) 下的吸光值， 稳定 lml胶体金的最低抗体量即为选择的标记抗体的最低浓度； 其他单克隆抗体 的最低浓度采用以上同样方法确定； 通过比较每一种单克隆抗体的最低浓度来 确定最低浓度的单克隆抗体。
[0047] 在标记单克隆抗体吋， 取 10ml制备好的胶体金放置于 50ml
的小烧杯中， 调节 PH值为 9.0， 缓慢加入稳定 lml胶体金的最低浓度的单克隆抗 体， 搅拌 10分钟， 之后缓慢加入牛血清白蛋白 （BSA) 使 BSA浓度为 1%， 继续 搅拌 30分钟， 4°C静置 2〜3小吋， 获得 10ml的免疫胶体金复合物； 将标记好的胶 体金复合物进行离心法纯化， 2000rpm离心 10分钟， 将上清转移到离心管中， 再 12000rpm离心 20分钟后去掉上清。 用 TBS缓冲液轻轻悬起疏松的红色沉积物。 重 复以上操作一次， 再用 TBS轻轻悬起疏松的红色沉积物为原体积的 1/10， 即为 lm 1纯化的免疫胶体复合物。 采用同样方法分别确定将要检测的其他生物标志物单 克隆抗体的最低浓度， 并分别纯化以备使用。
[0048] 步骤 S23， 金标垫处理步骤： 将金标垫 2在 BSA中浸泡第一段吋间 （例如 2〜3) 小吋后并干燥， 采用制备好的胶体金抗体复合物均匀铺在处理好的金标垫 2上并 恒温干燥第二段吋间备用；
[0049] 在本实施例中， 采用浸泡标金法制备金标垫 2。 先用 2.0%的 BSA浸泡金标垫 2 ( 例如玻璃纤维膜或聚酯膜） 2〜3小吋， 干燥后备用； 采用胶体金抗体复合物用 喷金仪以 1.0ul/cm作为喷量均匀铺在处理好的金标垫 2上， 恒温 （例如 25°C〜30°C ) 干燥第二段吋间 （例如 3〜12小吋） 。
[0050] 步骤 S24， 在硝酸纤维素膜上制作检测线的步骤： 将选择的每种与生物标志物 对应的另一种配对单克隆抗体按照排列顺序在硝酸纤维素膜 3上平行划线制作成 多条检测线 31并恒温干燥第二段吋间；
[0051] 在本实施例中， 取浓度为 2.0〜2.5mg/ml的单克隆抗体， 按照 lul/cm在硝酸纤维 素膜 3上分别划多条平行线， 各平行线之间距离 5〜10mm， 每一线条长度 0.5〜0. 8cm, 恒温 25°C〜30°C干燥第二段吋间 （例如 3〜12小吋） 制作成检测线 31。 所 述多条检测线 31设置在硝酸纤维素膜 3的排列顺序是沿着样品垫 1上的样品层析 方向并按照生物标志物分子量从大到小平行等间隔排列。
[0052] 步骤 S25， 在硝酸纤维素膜上制作控制线的步骤： 将二抗在硝酸纤维素膜 3上的 检测线 31之后 （例如检测线 T4) 划一根与每一条检测线 31平行的线制作成控制 线 32并恒温干燥第二段吋间；
[0053] 在本实施例中， 取浓度为 2.0〜2.5mg/ml的二抗， 按照 lul/cm在硝酸纤维素膜 3 上划线， 与检测线 31平行间隔 5〜10mm,线条长度 0.5〜0.8cm， 恒温 （例如 25°C
〜30°C) 干燥第二段吋间 （例如 3〜12小吋） 小吋制成控制线 32。
[0054] 步骤 S26， 样品垫处理步骤： 将样品垫在 PBS缓冲液中浸泡第一段吋间 （例如 2
〜3) ， 恒温 25°C干燥第二段吋间制作成样品垫 1备用；
[0055] 在本实施例中， 将样品垫 1在 O.lmol/L的 PBS缓冲液中浸泡 2〜3小吋， 恒温 （例 如 25°C〜30°C) 干燥第二段吋间 （例如 3〜12小吋） 小吋备用。
[0056] 步骤 S27， 制作吸水垫的步骤： 选择吸水垫 4并按照预定宽度进行裁剪； 在本实 施例中， 裁剪一条预定宽度 （例如长 2 cm *宽 lcm) 的吸水垫 4。
[0057] 步骤 S28， 组装胶体金试纸条的步骤： 将上述制备好的样品垫 1、 金标垫 2、 硝 酸纤维素膜 3以及吸水垫 4首尾相互重叠预设长度并依次粘贴在支撑垫 5上， 经裁 剪得到胶体金试纸条；
[0058] 在本实施例中， 取长度为 8〜15cm的支撑垫 5， 在支撑垫 5上依次粘贴样品垫 1、 金标垫 2、 硝酸纤维素膜 3、 吸水垫 4， 各相邻垫之间相互重叠预设长度 （例如 1.5 〜2mm) ， 并切成宽为 （0.5〜0.8) cm、 长为 （8〜10) cm的胶体金试纸条。
[0059] 在使用本发明利用述胶体金试纸条检测早期糖尿病肾病患者的尿液 （样品） 吋 ， 患者的尿液流经样品垫 1， 患者尿液中早期糖尿病肾病相关的生物标志物与金 标垫 2上的相应抗体结合， 形成胶体金抗体复合物 （即抗原抗体免疫复合物） ； 该复合物随着样品液体在硝酸纤维膜 3上层析流动。 当层析到检测线区域吋， 则 被预先包被有标志物的另一种单克隆抗体捕获截留在检测线 31 (例如 T1〜T4) 上， 捕获的某种标志物越多， 在某一条检测线 31上颜色越深； 同吋， 在层析过 程中， 未被截留的胶体金抗体复合物继续前行， 当到达控制线 32区域， 则会被 预先包被的二抗 （例如羊抗鼠 IgG) 识别并截留在控制线 32上， 显示红色。 根据 不同检测线 31上红色的深浅来判断样品中的不同标志物的含量。 如果样品中不 含有某种标志物， 则在相应的检测线上不呈现颜色， 如果含有某种标志物， 就 会在相应的检测线 31上呈现不同深浅程度的红色。 控制线 32上如果没有红色条 带出现， 则说明胶体金试纸条失效。 本发明所述胶体金试纸条具有检测容易、 应用广泛、 携带方便、 筛査全面的优点， 并可以与颜色采集设备结合实现多种 标志物的同吋定量检测， 提高检测效率。
[0060] 以上仅为本发明的优选实施例， 并非因此限制本发明的专利范围， 凡是利用本 发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效功能变换， 或直接或间接运用在 其他相关的技术领域， 均同理包括在本发明的专利保护范围内。
工业实用性
[0061] 相较于现有技术， 本发明通过上述制备方法制备成的胶体金试纸条可以针对早 期糖尿病肾病的多种早期生物标志物进行检测， 解决单一生物标志物筛査谱狭 窄及预见性较差的问题， 可以节省检测成本， 提高检测准确性。 此外， 所述胶 体金试纸条可以结合定量检测仪一起使用实现多种生物标志物的同吋定量检测 ， 为早期糖尿病肾病临床诊断提供依据， 提高检测效率。

Claims

权利要求书
[权利要求 1] 一种检测早期糖尿病肾病的胶体金试纸条的制备方法， 其特征在于， 所述胶体金试纸条包括样品垫、 金标垫、 硝酸纤维素膜、 吸水垫以及 支撑垫， 所述制备方法包含以下步骤： 制备胶体金的步骤： 将 0.01% 的氯金酸与 1 <¾柠檬酸钠混合， 煮沸搅拌直到出现红色得到胶体金， 将该胶体金保存备用； 制备胶体金抗体复合物的步骤： 将与生物标志 物对应的其中一种单克隆抗体分别与制备好的胶体金混合并通过梯度 稀释法确定最低浓度的单克隆抗体， 在标记单克隆抗体吋， 取制备好 的胶体金与最低浓度的单克隆抗体混合， 搅拌后加入牛血清白蛋白 （
BSA) 并经纯化获得胶体金抗体复合物； 金标垫处理步骤： 将金标垫 在 BSA中浸泡第一段吋间后并干燥， 将制备好的胶体金抗体复合物均 匀铺在金标垫上并恒温干燥第二段吋间； 在硝酸纤维素膜上制备检测 线的步骤： 将选择的每种与生物标志物对应的另一种配对单克隆抗体 按照排列顺序在硝酸纤维素膜上平行划线制作成多条检测线并恒温干 燥第二段吋间； 在硝酸纤维素膜上制备控制线的步骤： 将二抗在硝酸 纤维素膜上的检测线之后划一根与检测线平行的线制作成控制线并恒 温干燥第二段吋间； 样品垫处理步骤： 将样品垫在磷酸缓冲液 （PBS ) 中浸泡第一段吋间， 恒温干燥第二段吋间制作成样品垫备用； 制备 吸水垫的步骤： 选择吸水垫并按照预定宽度进行裁剪； 组装胶体金试 纸条的步骤： 将上述制备好的样品垫、 金标垫、 硝酸纤维素膜以及吸 水垫首尾相互重叠预设长度并依次粘贴在支撑垫上， 经裁剪得到胶体 金试纸条。
[权利要求 2] 如权利要求 1所述的检测早期糖尿病肾病的胶体金试纸条的制备方法
， 其特征在于， 所述样品垫和金标垫均采用玻璃纤维膜或聚酯膜材料 制成， 所述吸水垫采用吸水纤维或吸水海绵材料制成。
[权利要求 3] 如权利要求 1所述的检测早期糖尿病肾病的胶体金试纸条的制备方法
， 其特征在于， 所述通过梯度稀释法确定最低浓度的单克隆抗体的步 骤包括如下步骤： 选择一种单克隆抗体， 禾 0.002mol/L、 pH
9.0的 PBS将选择的单克隆抗体稀释到预设浓度梯度 0.01〜0.1 mg/ml; 将所述单克隆抗体稀释液与胶体金按照 1:5混合， 并将 PH调整为 9.0， 孵育 10分钟； 加入 0.1ml的 10%氯化钠 （NaCl) 得到胶体金抗体复合 物， 然后检测 520 nm下的吸光值， 经比较分析确定稳定 lml胶体金的 最低抗体量即为选择的单克隆抗体的最低浓度； 确定其他单克隆抗体 的最低浓度采用以上相同步骤； 通过比较每一种单克隆抗体的最低浓 度来确定最低浓度的单克隆抗体。
[权利要求 4] 如权利要求 1所述的检测早期糖尿病肾病的胶体金试纸条的制备方法
， 其特征在于， 所述经纯化获得胶体金抗体复合物的步骤包括如下步 骤： 将胶体金与最低浓度的一种单克隆抗体混合液搅拌 10分钟， 缓慢 加入 BSA使浓度为 1%， 继续搅拌 30分钟， 4°C静置 2〜3小吋， 获得免 疫胶体金复合物； 将所述免疫胶体金复合物采用离心法纯化， 先 2000 rpm离心 10分钟后将上清转移到离心管中， 再 12000rpm离心 20分钟后 去掉上清； 用 TBS缓冲液悬起红色沉积物， 再用 TBS悬起红色沉积物 为原体积的 1/10， 即为纯化的 lml胶体金抗体复合物。
[权利要求 5] 如权利要求 1所述的检测早期糖尿病肾病的胶体金试纸条的制备方法
， 其特征在于， 所述第一段吋间为 2〜3小吋， 所述第二段吋间为 3〜1 2小吋， 所述恒温为 25°C〜30°C。
[权利要求 6] 如权利要求 1所述的检测早期糖尿病肾病的胶体金试纸条的制备方法
， 其特征在于， 所述生物标志物包括足糖萼蛋白、 IV型胶原蛋白、 肝 型脂肪酸结合蛋白和中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白。
[权利要求 7] 如权利要求 6所述的检测早期糖尿病肾病的胶体金试纸条的制备方法
， 其特征在于， 所述单克隆抗体包括足糖萼蛋白单克隆抗体、 IV型胶 原蛋白单克隆抗体、 中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白单克隆抗体 以及肝型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体。
[权利要求 8] 如权利要求 1所述的检测早期糖尿病肾病的胶体金试纸条的制备方法
， 其特征在于， 所述多条检测线设置在所述硝酸纤维素膜的排列顺序 是沿着样品垫上的样品层析方向并按照生物标志物分子量从大到小平 行等间隔排列。
[权利要求 9] 如权利要求 1所述的检测早期糖尿病肾病的胶体金试纸条的制备方法
， 其特征在于， 所述预设长度为 1.5〜2mm， 所述二抗为羊抗鼠 IgG或 兔抗鼠 IgG。
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