CN115015538B - 一种抗磷脂抗体检测试剂盒及其在系统性红斑狼疮肾炎检测中的应用 - Google Patents
一种抗磷脂抗体检测试剂盒及其在系统性红斑狼疮肾炎检测中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于免疫性疾病的快速检测领域，具体涉及一种抗磷脂抗体检测试剂盒及其在系统性红斑狼疮肾炎检测中的应用。本发明通过将anti‑PS IgG的检测试剂磷脂酰丝氨酸包被于固相载体，制作成试剂盒，利用磷脂酰丝氨酸与anti‑PS IgG的特异性结合，实现对待测样本中anti‑PS IgG表达水平的快速检测，提高了系统性红斑狼疮肾炎快速检测的检出率、正确率，有利于无症状高危人群的筛查和早期发现，从而大大降低了系统性红斑狼疮肾炎患者的死亡率，具有检测方便、快捷，能够作为现有狼疮肾炎生化诊断和组织活检的补充诊疗手段，有效提高狼疮肾炎的检测效率和诊断效率，具有极好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于免疫性疾病的快速检测领域，具体涉及一种抗磷脂抗体检测试剂盒及其在系统性红斑狼疮肾炎检测中的应用。
背景技术
系统性红斑狼疮(SLE)是影响多个系统和脏器的自身免疫性疾病，SLE患者在疾病发展过程中其外周血存在多种自身抗体(包括抗磷脂抗体)的升高。临床上检测SLE患者中的抗磷脂抗体(aPL)包括针对β2-糖蛋白I(β2GPI)、心磷脂和凝血酶原的自身抗体，这些自身抗体参与血栓形成、妊娠并发症和神经系统损伤。目前基于狼疮肾炎和原发性抗磷脂综合征病人队列研究发现，抗磷脂抗体水平与肾脏的微血管病变，微血栓形成和局灶性病变密切相关，提示抗磷脂抗体参与了肾脏靶器官的损伤进程，然而抗磷脂抗体是否参与SLE进程和促进肾脏靶器官损伤的机制尚不清楚。
由肾脏免疫复合物沉积和淋巴细胞浸润引起的狼疮性肾炎(LN)是SLE患者最严重的临床症状，直接导致将近50％的SLE患者的死亡。目前狼疮肾炎的诊断金标准是对肾穿组织的活检分析，通过对肾小球进行组化染色，免疫复合物染色和电镜观察，评估肾小球的损伤程度，属于有创性诊断手段。而在狼疮病人临床指标中，常规检测的抗双链DNA自身抗体(anti-dsDNA IgG)水平虽然有助于诊断系统性红斑狼疮的发病，但仍不足以诊断和评估狼疮肾炎的进程。
因此，迫切需要与临床指标相关性更好的检测指标辅助进行狼疮肾炎的早期诊断，以预测患者的肾损伤。然而目前除了基于肾脏功能的分析(如血肌酐，血尿素氮，蛋白尿，eGFR等指标)以及对肾穿组织的活检分析外，尚缺乏直接诊断狼疮肾炎的相关指标。
现有临床研究表明常规抗磷脂抗体引起的肾脏疾病是一种以小血管病变为主的肾血管病变，通过影响肾脏静脉血管、毛细血管和动脉血管进而表现为伴随着动脉高压的肾脏病变，分为急性和慢性两种形式。其中，常规抗磷脂抗体引起的肾脏组织学改变主要以血栓性微血管病(TMA)为主，即急性发病中的纤维蛋白微血栓和慢性发病中的持续性连续的血栓性损伤和动脉硬化瘢痕形成，内膜细胞过度增生、血管壁增厚、纤维动脉闭塞、小动脉血管闭塞性病变(动脉和小动脉再通血栓)等，均与抗磷脂综合征患者血浆抗体水平密切相关。
然而本发明研究团队于近期的研究中发现，SLE、抗磷脂综合征和干燥综合征等患者中，均可检测到一种新型自身抗体，即抗磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine，PS)IgG自身抗体(anti-PS IgG)，狼疮患者的血浆中磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine，PS)水平显著高于健康人群，并与疾病活动度密切相关，而PS是真核细胞膜的重要组成部分，是真核细胞中主要的阴离子磷脂，占细胞内脂质总量的10％，PS的功能主要由其在细胞膜中的浓度和定位所调控，当细胞受到损伤或激活信号刺激后，在特定磷脂酶的作用下，PS从细胞膜的胞浆内侧翻转到细胞膜的外表面，暴露在细胞的外环境中。在SLE病人和动物模型中均观察到巨噬细胞对凋亡细胞清除，即吞噬功能的缺陷，由于细胞外表面的PS磷脂作为凋亡细胞的关键标志，也为吞噬细胞提供了吞噬信号，因此，anti-PS IgG可能通过阻断PS介导的吞噬途径选择性地抑制凋亡细胞清除。
本发明研究团队进一步研究发现，新型anti-PS IgG并非如常规抗磷脂抗体通过血管损伤和血栓形成进而诱导肾脏病变，而是直接沉积于狼疮患者的肾小球基底膜，影响肾小球滤过功能，诱导肾小球基底膜增厚型肾脏病变，即anti-PS IgG直接参与了自身抗体在肾小球的沉积以及狼疮肾炎的发病，狼疮肾炎患者血浆中anti-PS IgG与无伴发肾炎狼疮患者相比显著增高，本发明首次发现了尚未应用于临床检测的anti-PS IgG水平与狼疮肾炎发病的相关性，因此，本发明基于新型抗磷脂抗体即抗磷脂酰丝氨酸IgG自身抗体(anti-PS IgG)在狼疮肾炎中的新致病机制，构建一种抗磷脂抗体检测试剂盒及其在系统性红斑狼疮肾炎检测中的应用，为精准诊断自身免疫导致的狼疮肾损伤提供了新指标，为现有狼疮肾炎生化诊断和组织活检提供了补充诊疗手段，也为将来对狼疮肾炎的进一步研究提供新思路。
发明内容
针对现有技术存在的问题以及本发明首次提出的新型anti-PS IgG在狼疮肾炎中的新致病机制，本发明旨在提供一种抗磷脂抗体检测试剂盒及其在系统性红斑狼疮肾炎检测中的应用，本发明试剂盒通过对待测血清或血浆样本中anti-PS IgG抗体水平进行检测，实现对早期自身免疫导致的系统性红斑狼疮肾损伤的快速、准确、无创检测。
基于上述目的，本发明采用的技术方案如下：
第一方面，本发明提供抗磷脂酰丝氨酸IgG自身抗体的检测试剂在制备系统性红斑狼疮肾炎检测仪器中的应用。
现有临床研究提示常规抗磷脂抗体引起的肾脏疾病是一种以小血管病变为主的肾血管病变，通过影响肾脏静脉血管、毛细血管和动脉血管进而表现为伴随着动脉高压的肾脏病变，即常规抗磷脂抗体引起的肾脏疾病是间接性的，本发明团队最新研究发现，在狼疮肾炎患者血浆中存在一种异常高表达的新型抗磷脂抗体anti-PS IgG，并且anti-PS IgG并非如常规抗磷脂抗体通过血管损伤和血栓形成进而诱导肾脏病变，而是直接沉积于狼疮患者的肾小球基底膜，影响肾小球滤过功能，诱导肾小球基底膜增厚型肾脏病变，即anti-PS IgG直接参与了自身抗体在肾小球的沉积以及狼疮肾炎的发病，因此，本发明以anti-PSIgG作为系统性红斑狼疮肾炎的标志物，通过对狼疮患者体内anti-PS IgG水平进行检测，对系统性红斑狼疮肾炎具有更优的相关性和指示准确性。
优选地，抗磷脂酰丝氨酸IgG自身抗体的检测试剂通过Western Blot、免疫组织化学或酶联免疫吸附检测样本中抗磷脂酰丝氨酸IgG自身抗体的表达水平。
优选地，抗磷脂酰丝氨酸IgG自身抗体的检测试剂包括磷脂酰丝氨酸。
本发明基于磷脂酰丝氨酸与抗磷脂酰丝氨酸IgG自身抗体的特异性结合，通过Western Blot、免疫组织化学或酶联免疫吸附等方法对待测样本中的抗磷脂酰丝氨酸IgG自身抗体的表达水平进行检测。
优选地，检测样本为血清或血浆。
由于本发明的检测样本为血清或血浆，仅通过抽取待测人体的血液即可进行系统性红斑狼疮肾炎的快速检测，相对于现有组织活检、DNA检测等更加无创、快捷。
第二方面，本发明提供一种抗磷脂抗体检测试剂盒，该试剂盒包括固相载体和包被于固相载体上的磷脂酰丝氨酸；抗磷脂抗体为抗磷脂酰丝氨酸IgG自身抗体。
优选地，试剂盒的检测样本为血浆或血清，血浆或血清的稀释比例为1:100～250。
经试验发现，当待测血浆或血清样品稀释至1:100～250时，ELISA分析血浆中anti-PS IgG水平，能够更显著的区分健康人和系统性红斑狼疮病患，尤其是当待测血浆样品稀释至1:100时，系统性红斑狼疮病患血浆中的anti-PS IgG水平将近健康人的四倍。
优选地，磷脂酰丝氨酸通过如下方法包被于固相载体上：
将磷脂酰丝氨酸溶解于有机溶剂中，并稀释至适宜的包被浓度，将稀释后的磷脂酰丝氨酸加入固相载体上，经挥干有机溶剂，将磷脂酰丝氨酸包被于固相载体上。
ELISA即酶联免疫吸附实验是将特定浓度的抗原通过物理吸附的方法固定于固相载体(如酶标板、聚苯乙烯微孔板)的表面，通过加入待检血浆标本，以及后续的生物素-链霉亲和素系统使用抗人IgG特异性抗体放大信号后，通过辣根过氧化物酶HRP标物显色底物TMD的原理和酶标仪读板后，精准反映被检抗原相关特异性抗体的含量多少。本发明中抗原并非常规的蛋白，而是磷脂酰丝氨酸，属于带负电荷的磷脂分子，不溶于水，难以通过常规方法包被于固相载体上，因此，本发明采用将商品化的磷脂酰丝氨酸(PS)使用异丙醇:甲醇(V:V＝95:5)溶解为5mg/mL的原溶液后，加入乙醇中，稀释至PS终浓度为5μg/ml，将稀释后的PS加入固相载体，通过干燥的方式，使得溶解或稀释PS的有机溶剂如异丙醇、甲醇、乙醇等挥发完全，实现将抗原PS有效吸附在固相载体的表面。本发明检测方法能够在不引入外来抗原的条件下，保障anti-PS IgG检测的精准度。
第三方面，本发明提供上述抗磷脂抗体检测试剂盒在系统性红斑狼疮肾炎检测中的应用。
本发明首次发现anti-PS IgG水平与狼疮患者肾功能损伤的相关性及发病机制，并且狼疮肾炎患者血浆中anti-PS IgG水平显著高于无伴发肾炎狼疮患者，本发明试剂盒通过对待测血浆或血清中的anti-PS IgG进行检测，能够实现对早期自身免疫导致的系统性红斑狼疮肾损伤的快速、准确、无创检测，能够作为现有的狼疮肾炎相关检测的有效补充手段。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
本发明首次发现了新型抗磷脂抗体anti-PS IgG在狼疮肾炎中的致病机制，为精准诊断自身免疫导致的狼疮肾损伤提供了新指标，通过将anti-PS IgG的检测试剂磷脂酰丝氨酸包被于固相载体制作成试剂盒，基于Western Blot、免疫组织化学或酶联免疫吸附等方法，实现对待测样本中的抗磷脂酰丝氨酸IgG自身抗体表达水平的快速检测，提高了系统性红斑狼疮肾炎快速检测的检出率、正确率，有利于无症状高危人群的筛查和早期发现，从而大大降低了系统性红斑狼疮肾炎患者的死亡率，具有检测方便、快捷，能够作为现有狼疮肾炎生化诊断和组织活检的补充诊疗手段，有效提高狼疮肾炎的检测效率和诊断效率，具有极好的应用前景。
附图说明
图1为实施例1试验流程示意图；
图2为梯度稀释评估anti-PS IgG的最优检测血浆浓度结果；
图3为狼疮无肾炎患者与狼疮肾炎患者血浆中anti-PS IgG水平差异。
具体实施方式
为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。本领域技术人员应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例中所用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
本实施例检测了来源于重庆西南医院风湿免疫科于2017年间收集的10例SLE患者，合并或不合并肾炎患者，以及10例健康人作为对照，评价上述受体血浆中anti-PS IgG的水平，并进行自身抗体水平与临床指标相关性分析。其中，本发明试剂盒基于ELISA方法检测血浆anti-PS IgG，操作流程如图1所示，按照以下试剂盒实验步骤进行：
抗原包被：本发明采用纯化PS(3-sn-Phosphatidyl-L-serine,from bovinebrain,amorphous powder,Sigma-Aldrich)作为抗原，使用异丙醇:甲醇(V:V＝95:5)混合液将PS溶解为5mg/mL的原溶液，随后将原溶液加入乙醇中，稀释至PS终浓度为5μg/ml。每孔加入50μl抗原至ELISA板内，在通风橱中将加入抗原的ELISA板干燥风干4小时后，封闭液中的有机溶剂均已挥发；每孔加入含0.05％Tween20(Shanghai Macklin Biochemical Co.,Ltd.)的PBST洗涤液200μl，洗涤3次备用。
封闭非特异性结合位点：配置含0.5％明胶(Beijing Solarbio Science&Technology Co.,Ltd.)和0.5％牛血清白蛋白(Beijing Solarbio Science&TechnologyCo.,Ltd.)的PBST封闭液，每孔加入封闭液100μl，密封板，室温放置1h封闭非特异结合位点后，弃去孔内液体，每孔加入含0.05％Tween20的PBST洗涤液200μl，洗涤3次。
添加待测样本：设置样本孔和空白孔。样本孔中加待测样本50μL，空白孔加PBS 50μl。室温(25℃)孵育4小时后，去除孔内溶液，每孔加入含0.05％Tween20的PBST洗涤液200ul，洗涤3次。
添加抗体：将Biotin-IgG抗体(BD Biosciences,USA)进行1:2000稀释，每孔加入60μl稀释后抗体，室温孵育1小时。弃去孔内液体，每孔加入含0.05％Tween20的PBST洗涤液200ul，洗涤3次。
将链酶亲和素-辣根过氧化物酶(BioLegend,California,USA)进行1:2000稀释，每孔加60μl，室温孵育30分钟。弃去孔内液体，每孔加入含0.05％Tween20的PBST洗涤液200μl，洗涤5次。
TMB显色：每孔加入TMB显色液(BioLegend,California,USA)100μl，37℃孵育15分钟。每孔加入50μl TMB终止液(J&L Biological Company,Shanghai,China)，终止显色反应。
读数：用酶标仪读取每个孔的光密度值(OD)，检测波长设置为450nm。
计算：去除对照孔的背景数值后，计算血浆样品对应的实际OD450nm值。
最优血浆检测浓度选择试验
分别将上述20例血浆样品利用PBS缓冲液稀释至如下四个稀释浓度：1:100、1:250、1:800和1:1800，参照上述方法，ELISA分析各个稀释血浆中anti-PS IgG水平，如图2所示，当血浆的稀释比例为1:100或1:250时，稀释后的血浆样本能够更显著的区分健康人(HC)与狼疮病人(SLE)，尤其是当血浆的稀释比例为1:100时，健康人血浆的OD450nm均值为0.24，狼疮病人的OD450nm均值为0.98，可见狼疮病人血浆中anti-PS IgG水平是健康人的4倍，具有显著统计学差异。
实施例2
本实施例选取了重庆西南医院风湿免疫科在2018-2019年间被确诊为狼疮无肾炎患者(SLE)38例和狼疮肾炎患者(SLE+LN)21例，以及健康人血浆样品18例，健康人和患者年龄均在18-60岁之间。
采集上述血浆样本后，利用实施例1所述试剂盒中筛选的1:200稀释比例进行检测，旨在对本发明所述试剂盒对狼疮肾炎的诊断的准确度和有效性进行分析，实验步骤如下：
1、收取血浆标本
用EDTA作为抗凝剂采集标本，收集健康人(18例)，狼疮无肾炎患者(SLE，38例)和狼疮肾炎患者(SLE+LN，21例)的新鲜全血，室温静置30min，3000rpm离心5分钟，吸取上层血浆冷冻备用。
2、抗原制备
称量5mg PS，使用950μl异丙醇+50μl甲醇的混合溶液溶解PS，充分溶解，配制成PS浓度为5mg/mL的原溶液，吸取10μl PS原溶液加入10mL纯乙醇，充分震荡溶解混匀后，稀释PS终浓度至5μg/ml，作为抗原溶液备用。
3、抗原包被
于ELISA板的每孔中加入50μl 5μg/ml的PS抗原溶液，在通风橱中将加入抗原的ELISA板干燥风干4小时后，抗原溶液中的有机溶剂均已挥发；每孔加入含0.05％Tween20(Shanghai Macklin Biochemical Co.,Ltd.)的PBST洗涤液200μl，洗涤3次备用。
4、封闭液封闭非特异性结合位点
称取0.2g明胶，加入40mL PBST，加热使明胶充分溶解并降温后，加入等量0.2g牛血清白蛋白，配置成含0.5％明胶和0.5％牛血清白蛋白的封闭液，置于冰上，每孔加入封闭液200μl，保鲜膜封好，室温放置1h。弃去孔内液体，每孔加入含0.05％Tween20的PBST洗涤液200μl，洗涤3次。
5、上样孵育
取血浆样本室温融化，用PBS按照1:200比例稀释血浆。向ELISA板的样本孔中加入稀释血浆50μl，空白对照孔中加入PBS 50μl。保鲜膜密封，室温下孵育2h。弃去孔内液体，每孔加入含0.05％Tween20的PBST洗涤液200μl，洗涤3次。
6、检测抗体
将Biotin-IgG抗体按照抗体:PBS＝1:2000稀释，每孔加入60μl稀释后Biotin-IgG抗体，室温孵育1小时。弃去孔内液体，每孔加入含0.05％Tween20的PBST洗涤液200μl，洗涤3次。将链酶亲和素-辣根过氧化物酶进行1:2000稀释，每孔加60μl，室温孵育30min。弃去孔内液体，每孔加入含0.05％Tween20的PBST洗涤液200μl，洗涤5次。
7、显色
每孔加100μl TMB显色液，37℃孵育15min。加入50μl TMB终止液，立即置于酶标仪上，读取每个孔的光密度OD值，波长设置为450nm。
8、计算结果
取复孔平均值，各个血浆样本的OD值原始数据下表1所示，去除空白对照孔(Blank)数值后，计算每个样本的OD值。
表1检测血浆样本的OD值
9.统计分析
使用上述数据进行健康人(HC)，狼疮无肾炎患者(SLE)以及狼疮肾炎患者(SLE+LN)三组间分析，结果如表1和附图3所示，基于上述样本检测结果，本发明试剂盒设定的判定标准如下，其中，判定标准中的OD值指的是去除空白对照孔数值后计算得到的样本的OD值：
当OD值＜0.55，则判定为阴性，表明所测样本对应的个体既不是系统性红斑狼疮患者，也不是狼疮肾炎患者；
当0.55≤OD值≤1.62，则判定为狼疮无肾炎；
当OD值＞1.62，则判定为阳性，表明所测样本对应的个体为狼疮肾炎患者。
基于上述判定标准，本发明试剂盒对狼疮肾炎的检测有效性分析如下：
基于狼疮肾炎阳性的判定标准即OD值＞1.62，本发明试剂盒对非狼疮肾炎病患(HC和SLE)总计56例样本，其中56例样本检测计算的OD值均小于1.62，表明，利用本发明试剂盒检测后均被正确地判定为非狼疮肾炎，即本发明试剂盒对狼疮肾炎的检测特异度为100％。在总计21例狼疮肾炎患者血浆样本中，有17例血浆样本检测计算的OD值＞1.62，即本申请试剂盒对狼疮肾炎患者进行检测时，被正确地诊断为狼疮肾炎的比率为81.0％，即本发明试剂盒对狼疮肾炎的检测灵敏度为81.0％。
此外，本发明试剂盒不仅能够有效地用于对狼疮肾炎的检测，还能够有效区分健康人和狼疮患者(SLE和SLE+LN)，本发明试剂盒对系统性红斑狼疮的检测有效性分析如下：
基于本发明试剂盒阴性的判定标准即OD值＜0.55，本发明试剂盒对18例健康人进行检测时，其中17例样本检测的OD值小于0.55，表明健康人利用本发明试剂盒能够被正确地诊断为非狼疮病患(SLE和SLE+LN)的比率为94.4％，故本发明对系统性红斑狼疮的检测特异度为94.4％；在59例系统性红斑狼疮患者(SLE和SLE+LN)中，有49例样本的OD值≥0.55，即本发明试剂盒对系统性红斑狼疮的检测灵敏度为83％。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (2)
1.抗磷脂酰丝氨酸IgG自身抗体的检测试剂在制备区分系统性红斑狼疮无肾炎和系统性红斑狼疮肾炎的检测仪器中的应用；所述抗磷脂酰丝氨酸IgG自身抗体的检测试剂通过酶联免疫吸附检测血清或血浆样本中抗磷脂酰丝氨酸IgG自身抗体的表达水平；所述区分系统性红斑狼疮无肾炎和系统性红斑狼疮肾炎以OD值1.62为判定分界点。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抗磷脂酰丝氨酸IgG自身抗体的检测试剂包括磷脂酰丝氨酸。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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