CN117288948B - 抗凝血酶原抗体检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抗凝血酶原抗体检测试剂盒，属于检测试剂盒技术领域。本发明利用等离子处理并经负电荷磷脂修饰的载体膜高效结合人凝血酶原，实现对抗凝血酶原抗体的高灵敏检出；本发明的试纸条上包括抗凝血酶原IgG抗体和抗凝血酶原IgM抗体，一次检测即可实现对凝血酶原的检出；避免了反复取样造成患者不适，简化检测操作，有效降低检测时间和成本。因此，本发明专利可以通过高灵敏度地检测抗凝血酶原抗体，应用简便，并进一步提高抗磷脂综合征的准确性和灵敏度，检测结果为下一步准确治疗提供了有力依据，适于大规模推广应用。
Description
技术领域
本发明属于检测试剂盒技术领域，涉及一种抗凝血酶原抗体检测试剂盒。
背景技术
抗磷脂综合征(antiphospholipid syndrome，APS)是以反复血栓形成、病态妊娠以及血清中抗磷脂抗体(antiphospholipid antibody，aPL)持续阳性为特征的一种自身免疫性疾病。与抗磷脂综合征关系最密切的抗体和狼疮抗凝物(lupus anticoagulant，LA)是判断APS危险度最好的抗体。
凝血酶原(II因子)是最常见的一种磷脂结合蛋白，其分子量为72Kda。凝血酶原通过凝血酶原酶复合物触发纤维蛋白原向纤维蛋白的转化，从而表现出促凝血活性。凝血酶原(PT)属于抗磷脂抗体，特异性作用于带负电荷的磷脂，这种磷脂是生物细胞膜和凝血素的组成部分,而抗磷脂综合征(APS)是指身体中存在磷脂抗体进而引发血管栓塞、血小板减少、习惯性流产等临床症状的一组症候群，在系统性红斑狼疮及相关疾病患者体内出现抗磷脂抗体是一种典型的续发性抗磷脂综合症(APS)。与之相对应，没有其它自身免疫疾病患者体内出现的抗磷脂抗体称为原发抗磷脂综合症(APS)。现有临床研究表明反复性流产与抗磷脂抗体有密切的关系，且凝血酶原抗体与流产的APS患者高度相关。
抗凝血酶原抗体的实验室检测可以为系统性红斑狼疮或类狼疮疾病是否形成血栓的辅助诊断提供参考依据。
凝血酶原在机体内和带负电荷的磷脂结合，如，磷脂酰丝氨酸、心磷脂、磷脂酰乙醇胺等。传统的凝血酶原检测方法一般采用磷脂酰丝氨酸、心磷脂、磷脂酰乙醇胺作为偶联物，将凝血酶原蛋白偶联至载体上；根据载体不同，可分为酶联免疫吸附法、化学发光法。
传统的凝血酶原抗体检测方法，因为凝血酶原与负电荷磷脂的偶联效率不高，导致抗凝血酶原抗体的检测灵敏度较低，因此在临床上会频繁出现血清抗体阴性的抗磷脂综合征(seronegative antiphospholipid syndrome,SN-APS)案例，这一现象长期困扰临床诊疗。
为了解决存在的上述问题，需要提供一种试剂盒，其可以通过高效偶联“负电荷磷脂-凝血酶原蛋白”至载体上，检测抗凝血酶原抗体，将可能的影响因素降低至最低，对进行APS，尤其是SN-APS检测，准确性更高。
发明内容
本发明专利的目的是克服了上述现有技术中的缺点，提供一种抗凝血酶原抗体检测试剂盒，该抗凝血酶原抗体检测试剂盒可以高灵敏度地检测抗凝血酶原抗体，应用简便，并进一步提高抗磷脂综合征的准确性和灵敏度，检测结果为下一步准确治疗提供了有力依据，适于大规模推广应用。
为了实现上述目的，本发明提供的抗凝血酶原抗体检测试剂盒具有如下构成：
本发明的第一个目的是提供一种抗凝血酶原抗体检测检测条，包括并排排列的两条试纸，所述试纸上包括样品垫、结合垫、载体膜、吸水纸和底板，所述载体膜上设有检测线和对照线。
在一种实施方式中，所述试纸上样品垫、结合垫、载体膜和吸水纸依次黏贴在底板上。
在一种实施方式中，所述检测线包被有人凝血酶原蛋白。
在一种实施方式中，所述抗人IgG标记抗体或抗人IgM标记抗体分别包被于两条试纸的结合垫上。
在一种实施方式中，所述抗人IgG标记抗体或抗人IgM标记抗体经荧光微球标记。
在一种实施方式中，所述对照线包被有羊抗鼠IgG。
在一种实施方式中，所述人凝血酶原蛋白的浓度为0.05～0.2mg/mL，喷涂量为0.5～1.5μL/cm。
在一种实施方式中，经荧光微球标记的抗人IgG标记抗体或抗人IgM标记抗体的浓度大于2～5μg/mg，喷涂量为8μL/cm。
正如本领域技术人员所熟知，检测条也可称之为检测卡、试剂盒或其他名称。
在一种实施方式中，所述载体膜先经磷脂酰丝氨酸和心磷脂溶液浸泡，再经等离子处理，最后喷点经羧基活化的人凝血酶原蛋白。
在一种实施方式中，所述磷脂酰丝氨酸的浓度为1～5％(质量浓度)；心磷脂的浓度为1～5％(质量浓度)。
在一种实施方式中，利用酸化乙醇溶剂配制所述磷脂酰丝氨酸和心磷脂。
在一种实施方式中，所述酸化乙醇溶剂为盐酸和乙醇的混合溶液，其中盐酸的浓度为5～10％(体积浓度，V:V)；乙醇的浓度为50～90％(体积浓度，V:V)。
在一种实施方式中，所述等离子处理为将载体膜放入等离子反应室，填充氮气，预处理25～120min。
在一种实施方式中，所述等离子反应室的工作参数为：功率为150～300W，压强为15～35Pa，气体流速为50～250cc/min，温度为18～42℃。
在一种实施方式中，所述人凝血酶原蛋白采用EDC-NHS活化法活化。
在一种实施方式中，所述抗凝血酶原IgG抗体试纸和所述抗凝血酶原IgM抗体试纸分别贴合在所述底板的上、下表面上。
在一种实施方式中，所述的载体膜包括玻璃纤维膜、聚酯纤维膜、无纺布或硝酸纤维素膜。
在一种实施方式中，所述的载体膜为硝酸纤维素膜(NC膜)。
在一种实施方式中，所述底板为PVC板。
有益效果：
(1)本发明通过等离子处理并经负电荷磷脂修饰的载体膜能够高效的结合人凝血酶原，实现对抗凝血酶原抗体的高灵敏检出；
(2)本发明包括抗凝血酶原IgG抗体和抗凝血酶原IgM抗体，从而一次取样，即可对凝血酶原进行检测；避免了反复取样造成患者不适，简化检测操作，节约了采样试剂，并有效降低检测时间和成本。
因此，本发明专利可以通过高灵敏度地检测抗凝血酶原抗体，应用简便，并进一步提高抗磷脂综合征的准确性和灵敏度，检测结果为下一步准确治疗提供了有力依据，适于大规模推广应用。
附图说明
图1是本技术方案的一具体实施例的结构示意图。部分附图标记：1-结合垫(含抗抗人IgG荧光标记抗体)，2-结合垫(含抗抗人IgM荧光标记抗体)，3-部分不透明保护膜，4-第一检测线(包被检测抗原，人凝血酶原蛋白)；5-第二检测线(包被检测抗原，人凝血酶原蛋白)，6-质控线；7-硝酸纤维素膜，8-不透明保护膜，9-底板；
图2实施例2制备的检测试纸条的标准曲线；
图3对比例1制备的检测试纸条的标准曲线；
图4对比例2制备的检测试纸条的标准曲线；
图5对比例3制备的检测试纸条的标准曲线；
图6对比例4制备的检测试纸条的标准曲线；
图7对比例5制备的检测试纸条的标准曲线；
图8对比例6制备的检测试纸条的标准曲线。
具体实施方式
为了能够更清楚地理解本发明专利的技术内容，特结合具体实施例加以详细说明。
实施例1抗凝血酶原抗体检测试剂条结构及检测方法
如图1所示的一种抗凝血酶原抗体检测试剂盒，其检测试剂盒包括凝血酶原检测条，所述检测条上依次排布有样品垫、结合垫(含抗抗人IgG荧光标记抗体)1、结合垫(含抗抗人IgM荧光标记抗体)2，部分不透明保护膜3，第一检测线(包被检测抗原，人凝血酶原蛋白)4，第二检测线(包被检测抗原，人凝血酶原蛋白)5，质控线6，硝酸纤维素膜7和不透明保护膜8。即结合垫上具有抗人IgG标记抗体和/或抗人IgM标记抗体，载体膜上包被有人凝血酶原蛋白，分别同时检测抗凝血酶原抗体。
具体检测时，打开荧光免疫分析仪(广州蓝勃生物科技有限公司生产的荧光免疫分析仪AFS-1000)，检查校准卡与试剂盒的批号是否一致，然后把校准卡插入仪器中并将校准卡中的曲线导入仪器；取出平衡至室温后的检测条，吸取样本滴加到检测条的加样孔中(血清样本80μL)，室温反应15分钟；录入样本相关信息，将检测条插入荧光免疫分析仪的承载器中，按测试键，仪器将自动对检测条进行扫描；荧光免疫分析仪自动检测结果并计算样本中抗凝血酶原IgG抗体及抗凝血酶原IgM抗体的含量；取出用过的检测条，按潜在生物危害品来处理。
实施例2检测试剂盒的制备
(1)工作液配制
配制酸化乙醇溶液，盐酸：乙醇：纯化水的比例为5：90：5(体积浓度，V:V)；采用上述的酸化乙醇溶液稀释磷脂酰丝氨酸至2.5％(质量浓度)，稀释心磷脂至1.0％(质量浓度)。所述磷脂酰丝氨酸为大豆提取物(货号：ZL-21351)；所述心磷脂为牛心提取物(货号：CB1944482)。
配制0.05M，pH为7.4的Tris-HCl缓冲液；采用上述的Tris-HCl缓冲液将人凝血酶原蛋白稀释至2.0mg/mL。所述人凝血酶原为人血浆提取物(货号：7298-500)。
(2)载体膜浸泡
将空白载体膜(带PVC背衬的硝酸纤维素膜)裁剪成32～35cm/根，完全浸入步骤(1)配制的经酸化乙醇稀释的磷脂酰丝氨酸和心磷脂溶液中，室温，2h。
(3)载体膜等离子处理
将步骤(2)浸泡的载体膜沥干，放入等离子反应室进行预处理；
预处理条件：将等离子反应室填充氮气(氮气的体积比98％以上)，时间为60min；
等离子反应室的工作参数为：功率为200W，压强为25Pa，气体流速为100cc/min，温度为30℃。
等离子处理结束后应在12h内进行喷点经羧基活化的人凝血酶原蛋白；或，在氮气(氮气的体积比98％以上)条件下保存不超过30天，备用。
(4)人凝血酶原活化
将步骤(1)配制的人凝血酶原溶液进行活化，包括以下步骤：
0.5mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC)(终浓度1.0mM)至1mL的人凝血酶原蛋白(2.0mg/mL)，15min反应后，加入1.0mg的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)(终浓度2.0mM)，充分混匀，室温放置15min；加入1.0μL的2-巯基乙醇(终浓度5～20mM)终止反应；调整至合适浓度(人凝血酶原蛋白浓度0.1mg/mL)，形成活化人凝血酶原溶液。
(5)载体膜喷点
将步骤(3)预处理的载体膜和步骤(4)制备的活化人凝血酶原溶液进行喷点。
制备用于抗凝血酶原抗体诊断用的(人凝血酶原蛋白)载体膜的方法如下：取步骤(4)制备的活化人凝血酶原溶液，加到5mL刻度离心管中。取羊抗鼠IgG抗体25μL，加到5mL刻度离心管中，容器标记C标志。
设定点膜仪，开启点膜仪的电源，设定喷点程序，喷点量为1μL/cm；1号管道为检测带检测线(T线)喷点通道，2号管道为对照带(C线)喷点通道；点膜仪初始化：将1号管道置于人凝血酶原蛋白溶液中，将2号管道置于羊抗鼠IgG抗体溶液中，选择初始化程序，初始化6个循环；喷点：将载体膜按固定位置平放在点膜仪上，按控制面板上“GO”键开始喷点，点完后取下，检查喷点好的载体膜，检测带和对照带为两条均匀、连续和贯通整个载体膜的直线为合格喷点品，两条直线中出现断点为不合格喷点品；每放一片载体膜，按一次控制面板上的“GO”键为喷点一次(一片)；喷点结束，将喷点的载体膜置于室温中自然干燥1小时，膜上应看不到喷点痕迹。
喷点结束的载体膜经37℃烘干24h，干燥保存，备用。
(6)贴膜、切膜
将底板上较宽部分的保护纸除去，沿上面保护纸的下边缘，将划好线的载体膜，以C线在上方的方式贴到底板板上；将结合垫贴在T线下方，与NC膜少许接触；将样品垫贴在结合垫下方，与结合垫少许接触；接着除去上方保护纸，将吸水纸贴在NC膜的上方，与NC膜少许接触；将保护纸及指示带纸逐一贴在组装好的试纸条外面，组装成大卡。
接通切割机电源，设定切膜程序，设定切割宽度为4mm；将大卡合格品平放入切割机平台轨道中，正面朝上，按操作面板上“GO”键，开始切割；每放一片大卡合格品，按操作面板上“GO”键一次，直至切割完所有大卡合格品；切割完成后，分别将用于检测抗凝血酶原抗体的试纸条黏贴于底板上，组成抗凝血酶原抗体检测试纸条。
(7)荧光标记鼠抗人IgG抗体
清洗：取荧光微球(Bangs Lab，货号：11233)至离心管中，加0.1M MES(pH 5.0)缓冲液混匀，并以13000rpm，15min，4℃条件离心，弃上清，用0.1M MES(pH 5.0)缓冲液重悬待用。
活化并清洗：将活化剂EDC、NHS和荧光微球按照质量比2:1:2的量进行活化，具体操作如下：
称取EDC、NHS加入0.1M MES(pH 5.0)缓冲液中溶解，迅速加入至清洗完毕的荧光微球中，用封口膜封好放置在200rpm摇床上室温摇匀30min，取出后13000rpm，30min，4℃离心除去上清，用等量0.1M MES(pH 6.5)缓冲液重悬超声混匀并清洗，重复一次以上操作即清洗两次。离心完成后弃掉上清待用，得活化后的微球。
标记：将活化后的微球重悬至0.1M MES(pH 6.5)缓冲液中，迅速加入鼠抗人IgG抗体，混匀，放置室温，200rpm摇床上摇匀4小时。
封闭：取上述标记好的微球于13000rpm，30min，4℃离心除去上清，立即向微球中加入等量封闭液(牛血清白蛋白BSA，配制在MES、Tris-HCl或PBS溶液中，pH为6.5～8.0)，超声重悬后再放置室温，200rpm摇床上摇匀1小时。反应完成后13000rpm，20min，4℃离心，取上清待检，检测方法如表1所示。
表1微球质量检测
| 检测内容 | 质量标准 | 检测方法 |
| 包被量 | 包被量≥10μg鼠抗人IgG抗体/mg微球 | BCA蛋白浓度测定法 |
清洗&重悬：向微球中加入0.1M MES(pH 6.5)缓冲液，超声吹打重悬，用高速冷冻离心机13000rpm，20min，4℃离心，弃掉上清；加入0.1M MES(pH 6.5)缓冲液，超声吹打重悬。重悬好的微球溶液做好标记，备用。
(8)荧光标记鼠抗人IgM抗体
清洗：取荧光微球(Bangs Lab，货号：11233)至离心管中，加0.1M MES(pH 5.0)缓冲液混匀，并以13000rpm，15min，4℃条件离心，弃上清，用0.1M MES(pH 5.0)缓冲液重悬待用。
活化并清洗：将活化剂EDC、NHS和荧光微球按照质量比2:1:2的量进行活化，具体操作如下：
称取EDC、NHS加入0.1M MES(pH 5.0)缓冲液中溶解，迅速加入至清洗完毕的荧光微球中，用封口膜封好放置在200rpm摇床上室温摇匀30min，取出后13000rpm，30min，4℃离心除去上清，用等量0.1M MES(pH 6.5)缓冲液重悬超声混匀并清洗，重复一次以上操作即清洗两次。离心完成后弃掉上清待用，得活化后的微球。
标记：将活化后的微球重悬至0.1M MES(pH 6.5)缓冲液中，迅速加入鼠抗人IgM抗体，混匀，放置室温，200rpm摇床上摇匀4小时。
封闭：取上述标记好的微球于13000rpm，30min，4℃离心除去上清，立即向微球中加入等量封闭液，超声重悬后再放置室温，200rpm摇床上摇匀1小时。反应完成后13000rpm，20min，4℃离心，取上清待检，检测方法如表2所示。
表2微球质量检测
清洗&重悬：向微球中加入0.1M MES(pH 6.5)缓冲液，超声吹打重悬，用高速冷冻离心机13000rpm，20min，4℃离心，弃掉上清；加入0.1M MES(pH 6.5)缓冲液，超声吹打重悬。重悬好的微球溶液做好标记，备用。
(9)结合垫的喷点
用于抗凝血酶原IgG抗体诊断的抗体结合垫的喷点方法如下：
用0.1M MES(pH 6.5)缓冲液将上述制备的荧光标记鼠抗人IgG抗体稀释4倍；
设定点膜仪，开启点膜仪的电源，设定喷点程序，喷点量为8μL/cm；1号管道为喷点通道；点膜仪初始化：将1号管道置于稀释后的荧光标记鼠抗人IgG抗体中，选择初始化程序，初始化6个循环；喷点：将结合垫按固定位置平放在点膜仪上，按控制面板上“GO”键开始喷点，点完后取下，检查喷点好的结合垫，喷点的荧光标记抗体条带均匀、连续和贯通整个结合垫的直线为合格喷点品，两条直线中出现断点为不合格喷点品；每放一片结合垫，按一次控制面板上的“GO”键为喷点一次(一片)；喷点结束，将喷点的结合垫置于室温中自然干燥1小时，膜上应看不到喷点痕迹。
用于抗凝血酶原IgM抗体诊断的抗体抗体结合垫喷点方法同上。
(10)试剂盒组装
将上述的试纸条装入卡盒中，形成检测条。
取铝箔袋和干燥剂；打开热封机，预热；将待装袋的检测条、1袋干燥剂装入铝箔袋中；按照规定的长度切断装有检测条和干燥剂的铝箔袋；用热封机封好铝箔袋；贴上标签。
实施例3标准曲线制定
采用抗凝血酶原IgG、IgM定标品稀释至不同的浓度，滴加至试纸条的样品垫处，对实施例2制备的试纸条进行定标，建立“浓度(U/mL)-信号(T/C比值)”的标准曲线，具体数据如表3和图2所示：
表3标准曲线
实施例4抗人凝血酶原IgG抗体临床检测效果评估
将上述实施例2的检测条，用临床样本进行验证。
样本为临床确诊的系统红斑狼疮合并动静脉血栓的患者，合计89例。
对照试剂盒为雅仕通诊断有限公司生产的凝血素抗体检测试剂盒(酶联兔疫法)，96人份/盒(货号：3229)。
将待测样本滴加到检测条的样本孔中，然后置于荧光检测仪中进行读数。
检测结果与随访结果(临床诊断，且结合血管造影)如下：
表4检测结果
| 对照试剂盒：阳性 | 对照试剂盒：阴性 | 合计 | |
| 本发明试剂盒检测阳性 | 58 | 11 | 69 |
| 本发明试剂盒检测阴性 | 0 | 20 | 20 |
| 合计 | 58 | 31 | 89 |
本发明试剂盒的检测灵敏度为：69/(69+20)×100％＝77.53％；
对照试剂盒的检测灵敏度为：58/(58+31)×100％＝65.17％；
上述实施例结果表明本发明试剂盒的准确率较高，满足临床应用。
实施例5抗人凝血酶原IgG抗体临床检测效果评估
将上述实施例2的检测条，用临床样本进行验证。
样本为临床确诊的健康人群，合计102例。
对照试剂盒为雅仕通诊断有限公司生产的凝血素抗体检测试剂盒(酶联兔疫法)，96人份/盒(货号：3229)。
将待测样本滴加到检测条的样本孔中，然后置于荧光检测仪中进行读数。
检测结果与随访结果(临床诊断，且结合血管造影)如下：
表5检测结果
本发明试剂盒的检测特异性为：102/(102+0)×100％＝100％；
对照试剂盒的检测特异性为：1/(101+1)×100％＝99.01％；
上述实施例结果表明本发明试剂盒的准确率较高，满足临床应用。
实施例6抗人凝血酶原IgM抗体临床检测效果评估
将上述实施例2的检测条，用临床样本进行验证。
样本为临床确诊的系统红斑狼疮合并动静脉血栓的患者，合计67例。
对照试剂盒为雅仕通诊断有限公司生产的凝血素抗体检测试剂盒(酶联兔疫法)，96人份/盒(货号：3229)。
将待测样本滴加到检测条的样本孔中，然后置于荧光检测仪中进行读数。
检测结果与随访结果(临床诊断，且结合血管造影)如下：
表6检测结果
| 对照试剂盒：阳性 | 对照试剂盒：阴性 | 合计 | |
| 本发明试剂盒检测阳性 | 52 | 7 | 59 |
| 本发明试剂盒检测阴性 | 1 | 7 | 8 |
| 合计 | 53 | 14 | 67 |
本发明试剂盒的检测灵敏度为：59/67×100％＝88.06％；
对照试剂盒的检测灵敏度为：53/67×100％＝79.10％；
上述实施例结果表明本发明试剂盒的准确率较高，满足临床应用。
实施例7抗人凝血酶原IgM抗体临床检测效果评估
将上述实施例2的检测条，用临床样本进行验证。
样本为临床确诊的健康人群，合计102例。
对照试剂盒为雅仕通诊断有限公司生产的凝血素抗体检测试剂盒(酶联兔疫法)，96人份/盒(货号：3229)。
将待测样本滴加到检测条的样本孔中，然后置于荧光检测仪中进行读数。
检测结果与随访结果(临床诊断，且结合血管造影)如下：
表7检测结果
| 对照试剂盒：阳性 | 对照试剂盒：阴性 | 合计 | |
| 本发明试剂盒检测阳性 | 2 | 1 | 3 |
| 本发明试剂盒检测阴性 | 3 | 96 | 99 |
| 合计 | 5 | 97 | 102 |
本发明试剂盒的检测特异性为：99/102×100％＝97.06％；
对照试剂盒的检测特异性为：97/102×100％＝95.10％；
上述实施例结果表明本发明试剂盒的准确率较高，满足临床应用。
本实施例制得的试剂盒不仅准确、灵敏的对抗凝血酶原抗体进行检测，通过同时检测抗凝血酶原IgG抗体和IgM两个指标，避免了反复取样检测造成结果不准确以及环境对检测结果的干扰，提高抗磷脂综合征检测的准确性，并可以根据检测结果，进行针对性更强的治疗方案。
因此，本发明专利的检测结果为下一步准确治疗提供了有力依据，适于大规模推广应用。
对比例1
检测试剂盒的制备方法同实施例2，仅调整步骤(3)载体膜等离子处理的工作参数：
将步骤(2)浸泡的载体膜沥干，放入等离子反应室进行预处理；
预处理条件：将等离子反应室填充氮气(氮气的体积比98％以上)，时间为60min；
等离子反应室的工作参数为：功率为100W，压强为25Pa，气体流速为100cc/min，温度为30℃。
等离子处理结束后应在12h内进行喷点经羧基活化的人凝血酶原蛋白；或，在氮气(氮气的体积比98％以上)条件下保存不超过30天，备用。
采用实施例3相同的方法测定标准曲线，结果如表8和图3所示。
表8标准曲线
| IgG定标品浓度(U) | 信号值(T/C比值) | IgM定标品浓度(U) | 信号值(T/C比值) |
| 6.0 | 0.33293 | 3.0 | 0.5986 |
| 7.0 | 0.40682 | 6.0 | 1.1894 |
| 9.0 | 0.48204 | 12.0 | 2.3801 |
| 11.0 | 0.64727 | 18.0 | 3.5059 |
| 14.0 | 0.82324 | 25.0 | 4.5338 |
| 19.0 | 1.06543 | 50.0 | 9.0711 |
| 27.0 | 1.52659 | 75.0 | 13.3180 |
| 40.0 | 2.04582 | 100.0 | 17.8752 |
| 116.0 | 5.84184 | 125.0 | 21.4315 |
对比例2
检测试剂盒的制备方法同实施例2，仅调整步骤(3)载体膜等离子处理的工作参数：
将步骤(2)浸泡的载体膜沥干，放入等离子反应室进行预处理；
预处理条件：将等离子反应室填充氮气(氮气的体积比98％以上)，时间为60min；
等离子反应室的工作参数为：功率为400W，压强为25Pa，气体流速为100cc/min，温度为30℃。
等离子处理结束后应在12h内进行喷点经羧基活化的人凝血酶原蛋白；或，在氮气(氮气的体积比98％以上)条件下保存不超过30天，备用。
采用实施例3相同的方法测定标准曲线，结果如表9和图4所示。
表9标准曲线
| IgG定标品浓度(U) | 信号值(T/C比值) | IgM定标品浓度(U) | 信号值(T/C比值) |
| 6.0 | 0.38050 | 3.0 | 0.4129 |
| 7.0 | 0.42571 | 6.0 | 0.7604 |
| 9.0 | 0.59895 | 12.0 | 1.5489 |
| 11.0 | 0.69285 | 18.0 | 2.4351 |
| 14.0 | 0.96473 | 25.0 | 3.5112 |
| 19.0 | 1.20165 | 50.0 | 6.9592 |
| 27.0 | 1.67354 | 75.0 | 9.7954 |
| 40.0 | 2.46486 | 100.0 | 13.1729 |
| 116.0 | 7.29316 | 125.0 | 16.6720 |
对比例3
检测试剂盒的制备方法同实施例2，仅调整步骤(3)载体膜等离子处理的工作参数：
将步骤(2)浸泡的载体膜沥干，放入等离子反应室进行预处理；
预处理条件：将等离子反应室填充氮气(氮气的体积比98％以上)，时间为30min；
等离子反应室的工作参数为：功率为200W，压强为25Pa，气体流速为100cc/min，温度为30℃。
等离子处理结束后应在12h内进行喷点经羧基活化的人凝血酶原蛋白；或，在氮气(氮气的体积比98％以上)条件下保存不超过30天，备用。
采用实施例3相同的方法测定标准曲线，结果如表10和图5所示。
表10标准曲线
对比例4
检测试剂盒的制备方法同实施例2，仅调整步骤(3)载体膜等离子处理的工作参数：
将步骤(2)浸泡的载体膜沥干，放入等离子反应室进行预处理；
预处理条件：将等离子反应室填充氮气(氮气的体积比98％以上)，时间为120min；
等离子反应室的工作参数为：功率为200W，压强为25Pa，气体流速为100cc/min，温度为30℃。
等离子处理结束后应在12h内进行喷点经羧基活化的人凝血酶原蛋白；或，在氮气(氮气的体积比98％以上)条件下保存不超过30天，备用。
采用实施例3相同的方法测定标准曲线，结果如表11和图6所示。
表11标准曲线
| IgG定标品浓度(U) | 信号值(T/C比值) | IgM定标品浓度(U) | 信号值(T/C比值) |
| 6.0 | 0.40321 | 3.0 | 0.2971 |
| 7.0 | 0.52301 | 6.0 | 0.5937 |
| 9.0 | 0.66078 | 12.0 | 1.2539 |
| 11.0 | 0.76774 | 18.0 | 1.7908 |
| 14.0 | 0.97355 | 25.0 | 2.5727 |
| 19.0 | 1.33467 | 50.0 | 5.2122 |
| 27.0 | 1.83558 | 75.0 | 7.2748 |
| 40.0 | 2.92641 | 100.0 | 9.8596 |
| 116.0 | 8.64642 | 125.0 | 12.0425 |
对比例5
检测试剂盒的制备方法同实施例2，仅调整步骤(3)载体膜等离子处理的工作参数：
将步骤(2)浸泡的载体膜沥干，放入等离子反应室进行预处理；
预处理条件：将等离子反应室填充空气，时间为60min；
等离子反应室的工作参数为：功率为200W，压强为25Pa，气体流速为100cc/min，温度为30℃。
等离子处理结束后应在12h内进行喷点经羧基活化的人凝血酶原蛋白；或，在氮气(氮气的体积比98％以上)条件下保存不超过30天，备用。
采用实施例3相同的方法测定标准曲线，结果如表12和图7所示。
表12标准曲线
对比例6
检测试剂盒的制备方法同实施例2，仅调整步骤(3)载体膜等离子处理的工作参数：
将步骤(2)浸泡的载体膜沥干，放入等离子反应室进行预处理；
预处理条件：将等离子反应室填充氧气(氧气的体积比98％以上)，时间为60min；
等离子反应室的工作参数为：功率为200W，压强为25Pa，气体流速为100cc/min，温度为30℃。
等离子处理结束后应在12h内进行喷点经羧基活化的人凝血酶原蛋白；或，在氮气(氮气的体积比98％以上)条件下保存不超过30天，备用。
采用实施例3相同的方法测定标准曲线，结果如表13和图8所示。
表13标准曲线
| IgG定标品浓度(U) | 信号值(T/C比值) | IgM定标品浓度(U) | 信号值(T/C比值) |
| 6.0 | 0.0396 | 3.0 | 16.3391 |
| 7.0 | 0.0365 | 6.0 | 33.0521 |
| 9.0 | 0.0400 | 12.0 | 50.9167 |
| 11.0 | 0.1286 | 18.0 | 98.7756 |
| 14.0 | 0.1255 | 25.0 | 104.8093 |
| 19.0 | 0.2046 | 50.0 | 211.3862 |
| 27.0 | 0.3230 | 75.0 | 444.5774 |
| 40.0 | 0.1884 | 100.0 | 407.3466 |
| 116.0 | 1.0226 | 125.0 | 778.8831 |
将实施例2、对比例1～6制备的载体膜的检测试剂盒进行检测性能的比较：
样本为临床确诊的系统红斑狼疮合并动静脉血栓的患者，合计15例阳性样本；以及健康志愿者，合计30例阴性样本。将待测样本滴加到检测条的样本垫中，然后置于荧光检测仪中进行读数。
检测结果与随访结果(临床诊断，且结合血管造影)如下：
表14不同等离子参数处理载体膜的检测性能比较
综上，等离子处理参数，对检测性能的影响如下：
时间：30～120min，对检测性能无显著影响；功率：100～400W，对检测性能无显著影响；气体：氮气、空气和氧气，对检测性能有显著影响，利用氮气制备得到的检测试纸条的性能更加稳定。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (6)
1.一种抗磷脂综合征的检测条，其特征在于，包括并排排列的两条试纸，所述试纸上包括样品垫、结合垫、载体膜、吸水纸和底板，所述载体膜上设有检测线和对照线；所述检测线包被有人凝血酶原蛋白；抗人IgG标记抗体或抗人IgM标记抗体分别包被于两条试纸的结合垫上；所述对照线包被有羊抗鼠IgG；所述载体膜先经磷脂酰丝氨酸和心磷脂溶液浸泡，再经等离子处理，最后喷点经羧基活化的人凝血酶原蛋白；所述磷脂酰丝氨酸的浓度为1～5%；心磷脂的浓度为1～5%；
利用酸化乙醇溶剂配制所述磷脂酰丝氨酸和心磷脂；所述酸化乙醇溶剂为盐酸和乙醇的混合溶液，其中盐酸的体积浓度为5%；乙醇的体积浓度为90%；
所述等离子处理为将载体膜放入等离子反应室，填充氮气，预处理60 min；所述等离子反应室的工作参数为：功率为200 W，压强为25 Pa，气体流速为100 cc/min，温度为30℃；
所述的载体膜为硝酸纤维素膜。
2.根据权利要求1所述的检测条，其特征在于，所述试纸上样品垫、结合垫、载体膜和吸水纸依次黏贴在底板上。
3.根据权利要求1所述的检测条，其特征在于，所述抗人IgG标记抗体或抗人IgM标记抗体经荧光微球标记。
4. 根据权利要求1所述的检测条，其特征在于，所述人凝血酶原蛋白的浓度为0.05~0.2 mg/mL，喷涂量为0.5~1.5 μL/cm。
5. 根据权利要求3所述的检测条，其特征在于，经荧光微球标记的抗人IgG标记抗体或抗人IgM标记抗体的浓度大于5 µg/mg，喷涂量为8 μL/cm。
6.根据权利要求1所述的检测条，其特征在于，所述底板为PVC板。
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