CN115097129B - 一种用于胎盘生长因子和可溶性fms样酪氨酸激酶-1的检测试剂组合 - Google Patents

一种用于胎盘生长因子和可溶性fms样酪氨酸激酶-1的检测试剂组合 Download PDF

Info

Publication number
CN115097129B
CN115097129B CN202211016439.4A CN202211016439A CN115097129B CN 115097129 B CN115097129 B CN 115097129B CN 202211016439 A CN202211016439 A CN 202211016439A CN 115097129 B CN115097129 B CN 115097129B
Authority
CN
China
Prior art keywords
detection
growth factor
tyrosine kinase
plgf
sfit
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202211016439.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN115097129A (zh
Inventor
何长锋
谢煜萍
王学士
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shandong Zifeng Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Shandong Zifeng Biotechnology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shandong Zifeng Biotechnology Co ltd filed Critical Shandong Zifeng Biotechnology Co ltd
Priority to CN202211016439.4A priority Critical patent/CN115097129B/zh
Publication of CN115097129A publication Critical patent/CN115097129A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN115097129B publication Critical patent/CN115097129B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/558—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using diffusion or migration of antigen or antibody
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/588—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with semiconductor nanocrystal label, e.g. quantum dots
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/475—Assays involving growth factors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/91—Transferases (2.)
    • G01N2333/912—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/36—Gynecology or obstetrics
    • G01N2800/368—Pregnancy complicated by disease or abnormalities of pregnancy, e.g. preeclampsia, preterm labour

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

本发明涉及一种用于胎盘生长因子和可溶性fms样酪氨酸激酶‑1的检测试剂组合。本发明提供了一种基于量子点荧光检测血液中胎盘生长因子、可溶性fms样酪氨酸激酶‑1含量的方法，可用于孕产妇早发型子痫的诊断。本发明相比现有检测方法增加了洗涤步骤，改善了目标物的非特异性吸附，并通过链霉亲和素‑生物素放大体系对检测信号放大，实现了更加灵敏的检测效果，具有较高的临床应用价值。

Description

一种用于胎盘生长因子和可溶性fms样酪氨酸激酶-1的检测 试剂组合
技术领域
本发明属于血液标志物检测技术领域，具体涉及一种胎盘生长因子、可溶性fms样酪氨酸激酶-1的检测试剂组合、检测方法及其在早发型子痫诊断领域的应用，本发明还涉及一种孕产妇早发型子痫的诊断试剂盒及诊断方法。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
早发型子痫前期(early-onset preeclampsia，EOPE)属于妊娠期高血压疾病的特殊类型，发生于孕20周后及孕34周前，临床表现为血压迅速升高且难以控制，出现大量蛋白尿，同时合并靶器官损伤，严重影响母婴健康。早期对EOPE进行诊断并干预治疗对减少不良母婴结局具有重要意义。EOEP发病机制尚未完全阐明，目前普遍认为血管内皮损伤、胎盘缺血缺氧与EOPE的发生、发展有关。可溶性fms样酪氨酸激酶-1 (soluble FMS-liketyrosine kinase，sFIt-1)为抗血管生长因子，可引起血管内皮损伤及血管生成障碍，妊娠出现异常时血液中sFIt-1水平显著升高，可反映血管内皮细胞功能损伤程度。胎盘生长因子(placenta growth factor，PLGF)是妊娠期重要蛋白质之一，属于血管内皮生长因子家族，可促进胎盘血管网络生成、保证胎儿生长发育。研究证实：子痫前期孕妇血清及尿液中sFIt-1、PLGF水平高于正常孕妇。
孕妇血液中的可溶性fms样酪氨酸激酶-1（sFIt-1）属于Ⅲ型受体酪氨酸激酶家族，分子量约为63.6KD；由细胞外区1~6个免疫球蛋白样结构域构成，不含酪氨酸激酶域，编码区与fms样酪氨酸激酶-1（sFIt-1）的胞外区完全一致，能与膜表面受体竞争结合血管内皮生长因子（VEGF）。最初于类脐静脉内细胞上被发现sFIt-1作为VEGF和胎盘生长因子（PLGF）的直接抑制物，血清水平升高则可导致胎盘滋养细胞及血管生长不良，从而导致内细胞损伤。sFIt-1主要通过与VEGF和PLGF结合，介导VEGF和PLGF的生物学功能，参与血管的形成、重塑和再植等作用，因而，sFIt-1与子痫前期的预测已成为研究焦点。血循环中的PLGF与sFIt-1浓度水平的变化可先于临床症状出现前鉴别正常妊娠和先兆子痫；PLGF与sFIt-1是首个经过大规模临床试验验证的、可用于孕妇子痫前期预测及诊断的生化标志物。
目前，PLGF的检测已有酶联免疫吸附（ELISA）、时间分辨荧光免疫分析（TR-FIA）、微流控、电化学发光法（ECL）等报道；而sFIt-1的检测报道较少，主要是罗氏的电化学发光法，所有以上方法针对的样本类型均为血清样本。
考虑到量子点免疫荧光技术准确性高，操作简便、快速，对血液样本（全血、血清、血浆）的兼容大大拓宽了其临床应用范围，可实现随到随诊，方便临床应用；并且量子点免疫荧光技术可对血液中PLGF与sFIt-1进行联检，可同时出具PLGF与sFIt-1的浓度以及sFIt-1/PLGF比值检测结果，具有较高的临床应用价值。基于此，提供一种胎盘生长因子、可溶性fms样酪氨酸激酶-1的量子点荧光检测方法具有重要的临床检测意义。
发明内容
正如背景技术所介绍的，血液中胎盘生长因子（PLGF）、可溶性fms样酪氨酸激酶-1（sFIt-1）的浓度，对于孕期女性具有重要的检测意义。目前已知的检测方法存在样本受限或者灵敏度不足等缺陷。为了解决如上的技术问题，本发明提出了一种胎盘生长因子（PLGF）、可溶性fms样酪氨酸激酶-1（sFIt-1）的量子点荧光检测方法。
本发明第一方面，提供一种用于胎盘生长因子（PLGF）和可溶性fms样酪氨酸激酶-1（sFIt-1）的检测试剂组合，所述检测试剂组合中，包括用于清洗待测血液样本的洗涤剂及试纸条；
所述洗涤剂中包括血清、聚乙二醇、非离子型表面活性剂及抑菌剂；
所述试纸条包括底板，底板上覆盖层析结构，所述层析结构按照样品流动方向依次设置滤血膜、结合垫、检测垫和吸水纸，上述各部件相邻处交叠连接。
上述第一方面，提供一种用于同时检测胎盘生长因子（PLGF）和可溶性fms样酪氨酸激酶-1（sFIt-1）的检测试剂组合，该检测试剂以血液样本作为检测对象，基于双抗夹心方法对洗涤后样本中的PLGF与sFIt-1进行量子点荧光检测。与现有检测方法的显著不同之处在于，本发明增加了洗涤步骤，通过上述洗涤剂对加样后的样本进行清洗，可以有效降低血液样本在之后层析检测过程中的非特异性结合，提升检测灵敏度。
优选的，所述血清为可采用胎牛血清、新生牛血清或小牛血清；进一步优选的方案中，采用新生牛血清，包括但不限于高级新生牛血清、标准新生牛血清或普通新生牛血清。
优选的，所述聚乙二醇的分子量为5000~25000，包括聚乙二醇高聚物或聚乙二醇的衍生物；具体的实例中，所述聚乙二醇可采用PEG6000、PEG8000或PEG20000。
优选的，所述非离子型表面活性剂选自S17,S18,S19,S21,S22,S24中的一种或几种的组合；进一步优选的，所述非离子型表面活性剂为S17。
优选的，所述抑菌剂为ProClin300（CAS No. 96118-96-6）。
另外，所述洗涤剂还应当保持与血液样本相似的渗透环境，采用生理盐水和/或缓冲液作为溶剂；所述缓冲液的一个具体实例如HEPES缓冲液；上述优选的技术方案的一种实施方式中，所述洗涤剂的配方如下：0.07~0.13M的HEPES缓冲液（pH7~8）中，含有0.8~1.0%NaCl，3~6%新生牛血清，1~2 % PEG20000，0.3~0.6%S17和0.03~0.06% Proclin300。
本发明第一方面提供的试纸条为一种免疫层析试纸条，考虑到全血样本中含有45%的血细胞，血细胞（绝大部分为红细胞）若破裂或者流过视窗会对检测结果产生影响，使检测值出现较大偏差，因此，在试纸条加样孔端增加滤血膜（滤血膜经过预处理），截住红细胞，减少对检测结果的不利影响。所述滤血膜中包含抗红细胞抗体（RBC），用于过滤掉全血样本中的红细胞；所述滤血膜的预处理采用喷涂RBC预处理液的方式进行制备，所述预处理液的配方如下：0.07~0.13M的HEPES缓冲液（pH7~8）中，含有0.8~1.0%NaCl、1~3%酪蛋白钠、1~3% PVP-K30、0.4~1.0 %S17和0.03~0.06% Proclin300、140~160μg/mL抗红细胞抗体(RBC)，采用如上配方的预处理液喷涂后干燥得到所述滤血膜；为了保留RBC的活性，上述干燥优选采用低温干燥的方式，如冷冻干燥方式，本发明研究发现，采用预喷涂滤血膜后冻干的方式，不仅能够最大程度保留RBC的活性，还能够封闭滤血膜上的空余位点，避免吸附血液样本中的目标物（PLGF、sFIt-1），从而达到提高灵敏度的目的。
本发明提供的一种实施方式中，所述试纸条通过量子点荧光检测血液样本中的胎盘生长因子（PLGF）、可溶性fms样酪氨酸激酶-1；由于待测目标物（PLGF、sFIt-1）的检测灵敏度要求很高，对比试剂罗氏试剂盒的检测范围分别为3-10000pg/mL、10-85000pg/mL，而量子点免疫荧光法的检测下限在0.02ng/mL左右。为提升检测灵敏度，本发明还引入链霉亲和素-生物素放大体系，在结合垫上包被量子点标记链霉亲和素(Q-SA)、生物素标记PLGF抗体(Bio-Ab1)和生物素标记sFIt-1抗体(Bio-Ab2)的混合物，上述混合物采用复溶液溶解并稀释后喷涂在结合垫上，所述复溶液的配方如下：0.07~0.13M的HEPES缓冲液(pH7~8)中，含有0.8~1.0%NaCl、1~3%酪氨酸、4~6%蔗糖、1~2%β-环糊精，0.3~0.6%S17和0.03~0.06%Proclin300；为了最大程度保证量子点标记链霉亲和素和生物素标记抗体的高活性和稳定性，上述结合垫喷涂后采用低温干燥的方式，例如冷冻干燥。
所述检测垫上沿层析方向依次设置检测线T1、检测线T2及质控线，所述检测线T1处包被有PLGF捕捉抗体，检测线T2处包被有sFIt-1捕捉抗体，所述质控线处包被有羊抗鼠IgG抗体。
上述试纸条中，所述滤血膜、结合垫及检测垫依次搭接，所述吸水纸与检测垫接壤部分搭接在检测垫上；进一步优选的方案中，所述滤血膜为玻璃纤维素膜；所述结合垫为玻璃纤维素膜；所述检测垫为硝酸纤维素膜；所述吸水纸为具有良好吸水性能的材料，如玻纤材质、棉浆材质或玻纤和棉浆的混合材质，优选的材质为棉浆材质，或采用市售吸水材料，例如吸水纸或吸水板。
优选的，所述试纸条中，其底板采用具有一定硬度的疏水材料；进一步的，所述底板为PVC板。
本发明第二方面，提供第一方面所述检测试剂组合在早发型子痫诊断领域的应用。
优选的，所述在早发型子痫诊断领域的应用，其具体应用方式包括但不限于以下任意一种：
（1）将上述检测试剂组合应用于制备早发型子痫诊断产品；
（2）基于上述检测试剂组合获取待测血液样本中胎盘生长因子（PLGF）和可溶性fms样酪氨酸激酶-1（sFIt-1）的含量信息；
（3）基于上述检测试剂组合获取受试者血液样本中胎盘生长因子（PLGF）和可溶性fms样酪氨酸激酶-1（sFIt-1）的含量信息，并确认受试者是否属于子痫患者。
上述（1）方面中，所述早发型子痫诊断产品如诊断试剂盒、诊断器械或诊断平台。
上述（2）方面中，所述待测血样本来源于为哺乳动物，如人、猴、狗、猫、鼠等，上述非人哺乳动物的一种具体实例为疾病模型动物；获取上述胎盘生长因子（PLGF）和可溶性fms样酪氨酸激酶-1（sFIt-1）的含量信息的目的还包括用于活性药物的筛选。
上述（3）方面中，所述血液样本为受试者的外周血，进一步的，采用静脉血即可，可选自全血样本、血清样本或血浆样本。
上述（3）方面中，根据可溶性fms样酪氨酸激酶-1与胎盘生长因子的比值检测（sFIt-1/PLGF）确认受试者是否属于子痫患者。
本发明第三方面，提供一种孕产妇早发型子痫的诊断试剂盒，所述试剂盒中，包括第一方面所述用于胎盘生长因子（PLGF）和可溶性fms样酪氨酸激酶-1（sFIt-1）的检测试剂组合。
优选的，所述检测诊断试剂盒中，所述试纸条外部具有壳体保护。
本发明第四方面，提供一种检测胎盘生长因子（PLGF）和可溶性fms样酪氨酸激酶-1（sFIt-1）含量的方法，所述检测方法基于第一方面所述检测试剂组合获得受试者血液样本中可溶性fms样酪氨酸激酶-1与胎盘生长因子的比值。
优选的，所述检测方法具体步骤如下：将待测血液样本滴加至试纸条的滤血膜上，待其展开后，将上述洗涤液滴加至滤血膜上进行洗涤，再对检测垫中检测线及质控线处荧光含量进行检测。
进一步的，所述荧光含量检测的方式包括但不限于流式、荧光显微镜、共聚焦显微镜、全内反射或双光子显微镜、荧光检测仪等，所述荧光检测波长为610nm。
进一步的，所述血液样本展开时间为4~6min。
进一步的，所述洗涤时间为4~6min。
上述第三方面所述的诊断试剂盒，其使用方式同本发明第四方面提供的检测方法。本发明基于量子点荧光技术的胎盘生长因子（PLGF）检测方法原理如下：
采用双抗夹心法，主体反应部分为结合垫和检测垫（检测垫的硝酸纤维素膜（NC膜）上依次设置检测线T1、检测线T2和质控线）：将量子点与链霉亲和素相偶联（Q-SA），将待测抗原Ag1（PLGF）和待测抗原Ag2（sFIt-1）的特异性抗体分别与生物素相偶联（Bio-Ab1、Bio-Ab2），三者混匀后喷于结合垫上。当加入样本后，由于层析作用，量子点标记链霉亲和素与生物素标记抗体，随着样本溶液沿硝酸纤维素膜向前移动。样本中存在的待测抗原Ag1、Ag2，会分别与之反应形成复合物Q-SA-Bio-Ab1-Ag1、Q-SA-Bio-Ab2-Ag2，当通过固相化有捕捉抗体的检测线T1、检测线T2区域，所形成的复合物被捕捉抗体捕获，并分别形成T1、T2两个峰。未结合的样本溶液继续前移，通过固相化有羊抗鼠IgG（Ab3）的质控线区域，被质控线抗体捕获，并形成C峰，完成质控校准反应。随后加入样本洗涤液进行洗涤，除掉非特异性吸附。
洗涤完毕后将检测卡放入检测仪器，检测线区域的荧光值T1、T2随PLGF、sFIt-1浓度的增加而上升，通过标准曲线计算即可得出待测样本中PLGF、sFIt-1的含量；进一步得到sFIt-1/PLGF的比值，从而对患者子痫发病概率进行评估。
本发明第五方面，提供一种孕产妇早发型子痫的诊断方法，所述诊断方法包括获取受试者的血液样本，采用第一方面所述检测试剂组合、第三方面所述诊断试剂盒或第四方面所述检测方法对上述血液样本中的胎盘生长因子（PLGF）和可溶性fms样酪氨酸激酶-1（sFIt-1）进行检测。
以上一个或多个技术方案的有益效果是：
1、本发明中提供的检测试剂组合中，在现有检测试纸的基础上，增加了链霉亲和素-生物素放大体系，提高了检测灵敏度，实现了PLGF检出限不高于15pg/mL、sFIt-1 检出限不高于30pg/mL。
2、试纸条加样孔位置设置滤血装置：滤血膜经过含RBC缓冲液预处理后，采用冷冻干燥方式，最大程度保留了RBC的活性，还能够封闭滤血膜上的空余位点，避免其吸附血液样本中的目标物（PLGF、sFIt-1），从而达到有效过滤红细胞的目的，实现了全血样本的检测，且全血样本与血清及血浆样本的检测结果有良好的一致性。
3、本发明检测对象“胎盘生长因子（PLGF）和可溶性fms样酪氨酸激酶-1（sFIt-1）”对灵敏度的检测要求较高，检出限在15~30pg/mL。为了提升检测试纸条的荧光信号值，本发明引入上述链霉亲和素-生物素放大体系，可以将荧光强度提升约4-10倍，但有可能会同时引入某些非特异性吸附，导致本底同步升高；因此，为了实现检测灵敏度和特异性的同步提升，本发明还设计添加了洗涤步骤，当加入50μL样本完成展板4-6min后，再加入洗涤剂（含有表面活性剂和蛋白、高分子聚合物等），继续展板4-6min，达到去除非特异性吸附，封闭位点的作用，并提升检测灵敏度。另外，本发明提供的检测试纸具有良好的稳定性，可在常温下进行运输和保存。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明试纸条结构示意图；
其中，1-滤血膜，2-结合垫，3-NC膜，4-吸水纸，5-底板（PVC板），6-检测线T1和检测线T2，7-质控线。
图2为试纸条外部壳体结构示意图；
其中，8-加样孔，9-视窗。
图3为实施例1中所述试纸条的PLGF标准曲线图；
图4为实施例1中所述试纸条的sFlt标准曲线图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例与对比例详细说明本发明的技术方案。
实施例1
本实施例提供一种胎盘生长因子（PLGF）、可溶性fms样酪氨酸激酶-1（sFIt-1）的量子点荧光检测方法，所述检测方法基于图1所述的检测试纸条实现，所述试纸条包括底板5，通过底板5承载层析结构。所述层析结构自加样端向样品层析方向具有滤血膜1、结合垫2、NC膜3及吸水纸4，所述滤血膜1、结合垫2、NC膜3依次搭接，所述吸水纸4接触NC膜3的部分搭在NC膜3上。
本实施例中，上述检测试纸条的制备方法如下：
1）制备包被膜：
取NC膜和PVC板，将NC膜非点样面贴于PVC板的既定位置，应用三维划线喷金仪进行抗体对NC膜的划线包被。
取浓度为1.2mg/mL的抗PLGF单克隆抗体，划线包被于NC膜的检测线T1的位置；取浓度为1.1mg/mL的抗sFIt-1单克隆抗体，划线包被于NC膜的检测线T2的位置；取浓度为0.5mg/mL的羊抗鼠IgG,划线包被于NC膜的质控线C的位置。将上述划线完毕的包被膜放入烘箱，37℃下干燥8h，即得所述的包被膜。
2）制备结合垫
（A）量子点标记链霉亲和素
a：取10μL硒化镉量子点，加入到3mL离子强度为50mM的HEPES缓冲液（pH7.0）中，再加入15 μL的20mg/mLEDC和15 μL的20mg/mLNHS，之后加入130μL的 5mg/mL链霉亲和素，避光反应4h；
b：向步骤a中制备的量子点标记液中，加入终浓度为6mg/mL的酪蛋白，避光搅拌反应30min进行封闭；
c：取步骤b中的标记后混合液转移至200KD超滤管中进行离心，以3000g/min离心15min，确保离心后液体体积小于原体积的1/10；用50mM 硼酸盐缓冲液（pH7.4）作为洗脱液，洗脱5次，确保每次离心后液体体积小于原体积的1/10；
d：应用复溶液对步骤c中得到的标记后溶液进行稀释，并混匀，得到量子点标记链霉亲和素。
（B）生物素标记PLGF、sFIt-1单克隆抗体
a：将待标记抗体PLGF、sFIt-1分别溶于PBS缓冲液中，得到两种终浓度为5mg/mL的待标记抗体；
b：称量生物素并溶于超纯水中，使终浓度10mM；
c：分别向步骤a中两种待标记抗体溶液1mL中各加入生物素溶液30μL，室温下搅拌反应30min；
d：取步骤c中的标记后混合液转移至100KD超滤管中进行离心，以3000g/min离心10min，确保离心后液体体积小于原体积的1/10；用10mM PBS缓冲液（pH7.4）作为洗脱液，洗脱2次，确保每次离心后液体体积小于原体积的1/10；
e：应用复溶液对步骤d中得到的标记后溶液进行稀释，并混匀，即分别得到生物素标记PLGF抗体、生物素标记sFIt-1抗体。
（C）喷垫
将步骤（A）中制备的量子点标记链霉亲和素与步骤（B）中制备的生物素标记PLGF抗体和生物素标记sFIt-1抗体按1：1：1混匀，然后应用三维划线喷金仪按3μL/cm的喷量喷于玻璃纤维膜上。将上述喷垫完毕的玻璃纤维膜放入烘箱，37℃下干燥4h，即可得到所述的结合垫。
3）滤血膜预处理
a：配制预处理液：0.1M的HEPES缓冲液（pH7.4）中，含有0.9%NaCl、2%酪蛋白钠、2%PVP-K30、0.6 %S17和0.05% Proclin300、150μg/mL抗红细胞抗体(RBC)；
b：应用步骤a中所配制的预处理液，浸泡处理滤血膜，室温1h；
c：将步骤b中的预处理滤血膜用冻干机进行干燥，即得预处理的滤血膜；
4）组装：
将底板上对应位置的粘纸撕去，将吸水纸粘贴在NC膜上方对应位置，覆盖NC膜1mm；将结合垫粘贴在NC膜下方，覆盖结合垫1mm；将滤血膜粘贴在结合垫下方，覆盖结合垫2mm，即可得到组装好的大板。
5）切条装壳：应用微电脑自动斩切机，设置好试纸条宽度后，进行裁切，即为制备好的试纸条，将试纸条装入壳体组装形成图2所示的检测卡，再放入铝箔袋中密封，即得到单人份胎盘生长因子（PLGF）、可溶性fms样酪氨酸激酶-1（sFIt-1）的检测卡。
基于上述试纸条对胎盘生长因子（PLGF）、可溶性fms样酪氨酸激酶-1（sFIt-1）的量子点荧光检测方法，具体操作步骤如下：
1）配制样本洗涤剂。按照最优配方，0.1M的HEPES缓冲液（pH7.4）中，含有0.9%NaCl，5%新生牛血清，1 % PEG20000，0.4%S17和0.05% Proclin300。
2）用于检测样本中PLGF、sFIt-1时，所述检测方法包括以下步骤：
a.吸取50μL待测样本（血清/血浆/全血）加入检测卡加样孔中，等待样本展板5min。
b.向上述检测卡加样孔中加入50μL样本洗涤剂，洗涤后静置5min，将检测卡插入荧光免疫分析仪ZF06，点击“测试”对检测卡的荧光信号强度进行检测，检测线T1、检测线T2和质控线的荧光值分别以T1、T2、C表示，最终得到的检测结果以比值形式提供（即分别为T1/C、T2/C、T2/T1作为输出结果），将检测结果比值代入到标准曲线（图3、图4）中，并对待测样本中PLGF、sFIt-1浓度进行计算，同时提供sFIt-1/PLGF的比值。
对比例1
本实施例中，提供又一种胎盘生长因子（PLGF）、可溶性fms样酪氨酸激酶-1（sFIt-1）的量子点荧光检测方法，其中，检测卡的制备方法同实施例1，区别在于样本检测过程中时，只加样血清样本，不滴加样本洗涤剂。
对比例2
本实施例中，提供又一种胎盘生长因子（PLGF）、可溶性fms样酪氨酸激酶-1（sFIt-1）的量子点荧光检测方法，其中，检测卡的制备方法同实施例1，区别在于胎盘生长因子（PLGF）、可溶性fms样酪氨酸激酶-1（sFIt-1）检测试剂盒的检测试纸条的滤血膜部分没有经过预处理。
对比例3
本实施例中，提供又一种胎盘生长因子（PLGF）、可溶性fms样酪氨酸激酶-1（sFIt-1）的量子点荧光检测方法，检测卡的试纸条部分没有引入链霉亲和素与生物素放大体系，即量子点标记PLGF、sFIt-1抗体后，混匀喷结合垫，然后组装成试纸条。
对10余份临床赋值浓度较低的血清样本进行检测，经过与实施例1的同步检测比对发现，与实施例1相比较，对比例3的检测结果与临床检测结果差异显著，且线性相关性很差，说明在未引入放大体系的情况下，灵敏度达不到临床检测需求。
效果验证
1、实施例1与对比例1-2的中检测方法的准确性验证
以下临床样本来源于山东省耳鼻喉医院，其中样本的赋值浓度是分别由罗氏诊断公司（Roche Diagnostics GmbH）生产的胎盘生长因子检测试剂盒(电化学发光法)ElecsysPLGF和可溶性fms样酪氨酸激酶-1检测试剂盒(电化学发光法)Elecsys sFlt-1进行测定的，基于上述检测方法分别对该20例临床样本进行检测的结果如下表1-2所示：
表1 胎盘生长因子（PLGF）检测结果
Figure DEST_PATH_IMAGE001
表2 可溶性fms样酪氨酸激酶-1（sFIt-1）检测结果
Figure 202221DEST_PATH_IMAGE002
2、检测灵敏度验证
本发明中试纸条的技术指标包括：
1、“准确度：相对偏差不超过±10%
重复性：CV不超过±10%”
检出限：PLGF 检出限不高于15pg/mL
sFIt-1 检出限不高于30pg/mL
线性范围：PLGF 线性范围[20, 10000]pg/mL
sFIt-1 线性范围[50, 85000]pg/mL
3、试纸条稳定性验证
以已知PLGF浓度为439pg/mL、sFIt-1浓度为2200pg/mL的样本对不同批次的试纸条进行放置稳定性测试，共抽取3个批次试纸条放置在室温条件下，检测结果如下表3所示：
表3
Figure DEST_PATH_IMAGE003
从上述表3的检测结果可以看出，本发明提供的三个批次的检测试纸条在室温情况放置12个月之后检测数值偏差不超过5%，相比市面上大多数检测试纸需要低温保存，上述验证结果表明本发明提供的试纸条及检测卡即便在常温条件下也能保持良好的稳定性，可显著降低保存及运输成本。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种用于胎盘生长因子和可溶性fms样酪氨酸激酶-1的检测试剂组合，其特征在于，所述检测试剂组合包括用于清洗待测血液样本的洗涤剂及试纸条；所述洗涤剂中包括基础溶液、血清、聚乙二醇、非离子型表面活性剂及抑菌剂；所述试纸条包括底板，底板上覆盖层析结构，所述层析结构按照样品流动方向依次设置滤血膜、结合垫、检测垫和吸水纸，上述各部件相邻处交叠连接；所述结合垫上包被量子点标记链霉亲和素、生物素标记PLGF抗体和生物素标记sFIt-1抗体的混合物；所述基础溶液为生理盐水和/或缓冲液；所述血清为新生牛血清；所述聚乙二醇的分子量为5000~25000，包括聚乙二醇高聚物或聚乙二醇的衍生物；所述非离子型表面活性剂选自S17,S18,S19,S21,S22,S24中的一种或几种的组合；所述抑菌剂为ProClin300；所述滤血膜中包含抗红细胞抗体，用于过滤掉血液样本中的红细胞；所述滤血膜喷涂含RBC预处理液的方式进行制备，所述预处理的配方如下：0.07~0.13M的HEPES缓冲液中，含有0.8~1.0%NaCl、1~3%酪蛋白钠、1~3% PVP-K30、0.4~1.0 %S17和0.03~0.06% Proclin300、140~160μg/mL抗红细胞抗体；所述混合物采用复溶液溶解并稀释后喷涂在结合垫上，所述复溶液的配方如下：0.07~0.13M的HEPES缓冲液中，含有0.8~1.0%NaCl、1~3%酪氨酸、4~6%蔗糖、1~2%β-环糊精，0.3~0.6%S17和0.03~0.06% Proclin300；所述检测垫上沿层析方向依次设置检测线T1、检测线T2及质控线，所述检测线T1处包被有PLGF捕捉抗体，检测线T2处包被有sFIt-1捕捉抗体，所述质控线处包被有羊抗鼠IgG抗体。
2.如权利要求1所述用于胎盘生长因子和可溶性fms样酪氨酸激酶-1的检测试剂组合，其特征在于，所述洗涤剂的配方如下：0.07~0.13M的HEPES缓冲液中，含有0.8~1.0%NaCl，3~6%新生牛血清，1~2% PEG20000，0.3~0.6%S17和0.03~0.06% Proclin300。
3.一种孕产妇早发型子痫的诊断试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中，包括权利要求1-2任一项所述用于胎盘生长因子和可溶性fms样酪氨酸激酶-1的检测试剂组合，基于检测试剂组合获得受试者血液样本中可溶性fms样酪氨酸激酶-1与胎盘生长因子的比值；所述检测诊断试剂盒中，试纸条外部具有壳体保护。
4.如权利要求3所述孕产妇早发型子痫的诊断试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的使用方法如下：将待测血液样本滴加至试纸条的滤血膜上，待其展开后，将上述洗涤液滴加至滤血膜上进行洗涤，再对检测垫中检测线及质控线处荧光含量进行检测；其中，所述荧光含量检测的方式选自流式、荧光显微镜、共聚焦显微镜、全内反射或双光子显微镜、荧光检测仪中的一种，所述荧光检测波长为610nm；所述血液样本展开时间为4~6min，所述洗涤时间为4~6min。
CN202211016439.4A 2022-08-24 2022-08-24 一种用于胎盘生长因子和可溶性fms样酪氨酸激酶-1的检测试剂组合 Active CN115097129B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202211016439.4A CN115097129B (zh) 2022-08-24 2022-08-24 一种用于胎盘生长因子和可溶性fms样酪氨酸激酶-1的检测试剂组合

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202211016439.4A CN115097129B (zh) 2022-08-24 2022-08-24 一种用于胎盘生长因子和可溶性fms样酪氨酸激酶-1的检测试剂组合

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN115097129A CN115097129A (zh) 2022-09-23
CN115097129B true CN115097129B (zh) 2023-03-10

Family

ID=83299918

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202211016439.4A Active CN115097129B (zh) 2022-08-24 2022-08-24 一种用于胎盘生长因子和可溶性fms样酪氨酸激酶-1的检测试剂组合

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN115097129B (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115791340B (zh) * 2023-01-17 2023-05-02 北京水木济衡生物技术有限公司 一种子痫复合质控品及其制备方法和应用
CN116430036B (zh) * 2023-06-15 2023-09-08 可孚医疗科技股份有限公司 一种滤血膜检测装置及制备方法和应用

Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1434297A (zh) * 2003-01-24 2003-08-06 武汉大学 一种快速检测风疹病毒抗体的酶免疫学方法
CN104730248A (zh) * 2015-03-17 2015-06-24 吉林吉和迅生物技术有限公司 用于检测猪瘟的快速诊断检测试纸卡及其制备和使用方法
CN106198997A (zh) * 2016-06-28 2016-12-07 广州华弘生物科技有限公司 一种快速定量检测肌钙蛋白和肌酸激酶同工酶的试剂盒
CN106918698A (zh) * 2015-12-25 2017-07-04 广州瑞博奥生物科技有限公司 一种检测人受体酪氨酸激酶的磷酸化抗体芯片试剂盒
CN111057791A (zh) * 2019-12-31 2020-04-24 阿吉安(福州)基因医学检验实验室有限公司 一种检测血液中HBV pgRNA的试剂盒
CN111273030A (zh) * 2020-02-25 2020-06-12 芜湖天明生物技术有限公司 一种定量检测重组人表皮生长因子直接竞争elisa法试剂盒及其应用
CN112083160A (zh) * 2019-06-14 2020-12-15 冯颖淑 一种宫颈癌检测量子点免疫荧光试剂盒的制备及应用
CN113567687A (zh) * 2021-09-26 2021-10-29 天津云检医疗器械有限公司 检测样品中两种生物标志物的表达水平的试剂在制备用于检测子痫前期试剂盒中的应用
CN114460287A (zh) * 2022-01-28 2022-05-10 上海八通生物科技股份有限公司 一种中和抗体的检测方法和试剂盒
CN114609391A (zh) * 2022-02-26 2022-06-10 北京泰格科信生物科技有限公司 人胎盘生长因子测定试剂盒及其制备方法
CN114660285A (zh) * 2022-02-26 2022-06-24 北京泰格科信生物科技有限公司 一种子痫前期测定试剂盒、制备方法及应用

Patent Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1434297A (zh) * 2003-01-24 2003-08-06 武汉大学 一种快速检测风疹病毒抗体的酶免疫学方法
CN104730248A (zh) * 2015-03-17 2015-06-24 吉林吉和迅生物技术有限公司 用于检测猪瘟的快速诊断检测试纸卡及其制备和使用方法
CN106918698A (zh) * 2015-12-25 2017-07-04 广州瑞博奥生物科技有限公司 一种检测人受体酪氨酸激酶的磷酸化抗体芯片试剂盒
CN106198997A (zh) * 2016-06-28 2016-12-07 广州华弘生物科技有限公司 一种快速定量检测肌钙蛋白和肌酸激酶同工酶的试剂盒
CN112083160A (zh) * 2019-06-14 2020-12-15 冯颖淑 一种宫颈癌检测量子点免疫荧光试剂盒的制备及应用
CN111057791A (zh) * 2019-12-31 2020-04-24 阿吉安(福州)基因医学检验实验室有限公司 一种检测血液中HBV pgRNA的试剂盒
CN111273030A (zh) * 2020-02-25 2020-06-12 芜湖天明生物技术有限公司 一种定量检测重组人表皮生长因子直接竞争elisa法试剂盒及其应用
CN113567687A (zh) * 2021-09-26 2021-10-29 天津云检医疗器械有限公司 检测样品中两种生物标志物的表达水平的试剂在制备用于检测子痫前期试剂盒中的应用
CN114460287A (zh) * 2022-01-28 2022-05-10 上海八通生物科技股份有限公司 一种中和抗体的检测方法和试剂盒
CN114609391A (zh) * 2022-02-26 2022-06-10 北京泰格科信生物科技有限公司 人胎盘生长因子测定试剂盒及其制备方法
CN114660285A (zh) * 2022-02-26 2022-06-24 北京泰格科信生物科技有限公司 一种子痫前期测定试剂盒、制备方法及应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN115097129A (zh) 2022-09-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN115097129B (zh) 一种用于胎盘生长因子和可溶性fms样酪氨酸激酶-1的检测试剂组合
US8093057B2 (en) System for quantitative measurement of glycohemoglobin and method for measuring glycohemoglobin
CA1223813A (en) Colorimetric immunoassay on solid surface
JP5775197B1 (ja) 免疫クロマト分析キット及び免疫クロマト分析方法
JPH04351962A (ja) 特異結合分析方法および特異結合分析装置
JP5831918B2 (ja) イムノクロマトグラフィーを利用した検出方法
WO2015163384A1 (ja) 免疫クロマト分析装置、免疫クロマト分析方法及び免疫クロマト分析キット
CN113227791A (zh) 具有多个检查线的妊娠诊断用免疫色谱条及包含其的妊娠诊断试剂盒
JP7184054B2 (ja) 測定試料希釈液およびキットおよび測定方法
JP2014062820A (ja) イムノクロマトグラフ試験ストリップ用メンブレン、試験ストリップ及び検査方法
CN106546750A (zh) 一种微量白蛋白快速定量检测试纸条的制备及检测方法
EP3422004B1 (en) Method for detecting carcinoembryonic fibronectin using immunochromatography
CN115639366A (zh) β2-微球蛋白荧光免疫层析法测定试剂盒及其检测方法
CN114252594B (zh) 一种胎盘生长因子检测试剂盒及其制备方法与应用
CN109212196A (zh) 一种快速检测游离雌三醇的试剂盒
CN115184620B (zh) 一种pla2r抗体的量子点荧光检测试纸条、试剂盒及其应用
JPH0772152A (ja) 特異的バインディングアッセイ方法及び分析要素
JP6168580B1 (ja) イムノクロマトグラフィーを利用した癌胎児性フィブロネクチンの検出方法
JP3408751B2 (ja) 免疫クロマトグラフィー装置
JP3298812B2 (ja) 尿中トリプシンインヒビターの測定方法
JPH08220099A (ja) 物質の検出試薬及び慢性関節リウマチの検知法
WO2022211009A1 (ja) 高感度な免疫学的測定試薬及び測定方法
KR20220007021A (ko) 라텍스 비드, 링커 및 항체를 포함하는 면역 크로마토그래피용 시약 및 이를 포함하는 래피드 키트
JP2023069668A (ja) エストロン定量用のイムノクロマト測定キット
CN117890576A (zh) 一种检测CD89-IgA免疫复合物的试剂、方法及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant