WO2015163384A1 - 免疫クロマト分析装置、免疫クロマト分析方法及び免疫クロマト分析キット - Google Patents
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Definitions
- Measuring various components contained in specimens such as blood and urine is extremely important clinically in grasping the health status of patients, and conventionally various measuring methods have been adopted depending on the components. .
- an immunochromatographic analyzer and an analysis method are known in which a substance to be detected contained in a specimen is colored by an immune reaction and the colored signal is confirmed.
- HbA1c is conventionally measured by HPLC, capillary electrophoresis, enzymatic method, immunoassay, etc., because these methods require specialized knowledge for specific equipment and analysis.
- HPLC high-density liquid crystal display
- capillary electrophoresis capillary electrophoresis
- enzymatic method enzymatic method
- immunoassay etc.
- a step (S401) of mixing the collected blood with a component (N-terminal exposing agent) that exposes the hemoglobin ⁇ chain N-terminus to the protein surface, and several minutes A step of standing to create a sample solution (S402), a step of dropping the sample solution onto the sample pad b (S403), and a step of separately preparing a developing solution and dropping it onto the sample pad (404) ) Requires two liquids, a sample liquid and a developing liquid, and it is necessary to drop these separately onto the sample pad b, making measurement preparation and operation complicated, taking a long measurement time, and improving efficiency. There was a problem of being bad.
- the present inventor has solved the conventional problems as described above by adding an anionic surfactant to the sample addition part (sample pad) to which a specimen containing a substance to be detected is added.
- the present invention was completed by finding out what can be done.
- a step of adding a specimen-containing solution obtained by diluting a specimen with a specimen diluent to a sample addition section (2) A step of recognizing a substance to be detected by a labeling substance held in a labeling substance holding part (3) A specimen and a label 7. Step of developing a substance as a mobile phase in a chromatographic medium part (4) Step of detecting a substance to be detected in the developed mobile phase by a detection unit 8.
- An immunochromatography analysis kit comprising an immunochromatography analyzer including a sample addition unit, a labeling substance holding unit, a chromatographic medium unit and an absorption unit carrying a detection unit, and a sample dilution solution for diluting and developing the sample.
- An immunochromatographic analysis kit containing a nonionic surfactant in the sample diluent and an anionic surfactant in the sample addition part.
- the sample addition part contains an anionic surfactant, it is not necessary to include a step of exposing the epitope of the substance to be detected before adding the specimen-containing liquid to the sample addition part. . Therefore, according to the present invention, various components contained in various specimens such as blood and urine can be efficiently measured in a short measurement time without requiring complicated measurement preparation and operation.
- porous sheet examples include pads, fibers, membranes, and the like made of glass fiber, cellulose, polyethylene terephthalate, polyurethane, polyacetate, cellulose acetate, nitrocellulose, nylon, cotton cloth, and the like.
- the anionic surfactant has a function of exposing the HbA1c epitope in the collected blood to the surface of the hemoglobin protein. Specifically, it functions as a component (N-terminal exposing agent) that exposes the hemoglobin ⁇ chain N-terminus to the protein surface.
- the contact efficiency between HbA1c and the anionic surfactant is increased.
- the anionic surfactant has an effect of efficiently acting as an N-terminal exposure agent.
- Antibody-producing animal species include humans, mice, rats, rabbits and goats.
- the immunoglobulin may be IgG, IgM, IgA, IgE, or IgD.
- the absorption unit 15 may be made of a material having an ability to quickly absorb an excessive specimen-containing liquid, and cellulose fiber, glass filter paper, or the like is used.
- the HbA1c contained in the specimen-containing solution reaches the labeling substance holding unit 13 by capillary action because the anionic surfactant contained in the sample addition unit 12 exposes the N-terminus of the hemoglobin ⁇ chain to the protein surface.
- HbA1c There are individual differences in blood components, and it is difficult to determine diabetes simply by coloring HbA1c and confirming its intensity. Therefore, it is preferable that the hemoglobin other than HbA1c and HbA1c is colored at the same time, and the determination is made by comparing the degree of coloration of both.
- Example 1 The immunochromatography analyzer 1 as shown in FIGS. 1 (a) and 1 (b) was produced by the following procedure.
- Sample addition section 12 Glass fiber pad (trade name glass fiber conjugate pad manufactured by Millipore, size length 32 mm (specimen-containing liquid developing direction), width 150 mm, thickness 0.43 mm) is added to sodium dodecyl sulfate ( SDS) was uniformly added at a rate of 60 ⁇ g / cm 2 and dried at 50 ° C. for 4 hours, thereby preparing the sample addition section 12.
- SDS sodium dodecyl sulfate
- Example 3 Example 1 was repeated except that in Example 1, the constituent material of the sample addition part 12 was changed from a glass fiber pad to a polyethylene terephthalate (PET) pad (trade name Benrise A-01 manufactured by Asahi Kasei Corporation). The results are shown in Table 1.
- PET polyethylene terephthalate
- Reference example 2 In Reference Example 1, Reference Example 1 was repeated except that blood was added to the developing solution without using the extract. The results are shown in Table 1.
- Example 1 In Example 1, except that the content per SDS of the SDS added to the sample addition unit 12 and the content of the nonionic surfactant contained in the sample diluent are changed to the values shown in Table 2. Example 1 was repeated. The results are shown in Table 2.
Abstract
Description
1.試料添加部、標識物質保持部、検出部が担持されたクロマトグラフ媒体部及び吸収部を含む免疫クロマト分析装置であって、
前記試料添加部中に陰イオン性界面活性剤を含有し、
被検出物質を含む検体を検体希釈液で希釈した検体含有液を展開するための免疫クロマト分析装置。
2.前記試料添加部が、グラスファイバー、セルロース及びポリエチレンテレフタレートからなる群から選ばれた1種である前記1記載の免疫クロマト分析装置。
3.前記試料添加部中に前記陰イオン性界面活性剤を8~800μg含有する前記1又は2に記載の免疫クロマト分析装置。
4.前記被検出物質が血液中の糖化タンパク質である前記1~3のいずれか1項に記載の免疫クロマト分析装置。
5.前記血液中の糖化タンパク質がHbA1cである前記4に記載の免疫クロマト分析装置。
6.前記陰イオン性界面活性剤がドデシル硫酸ナトリウム(SDS)である前記1~5のいずれか1項に記載の免疫クロマト分析装置。
7.陰イオン性界面活性剤を含有する試料添加部、標識物質保持部、検出部が担持されたクロマトグラフ媒体部及び吸収部を含む免疫クロマト分析装置を用いて検体に含まれる被検出物質を検出する、以下の工程(1)~(4)を含む免疫クロマト分析方法。
(1)検体を検体希釈液で希釈した検体含有液を試料添加部に添加する工程
(2)標識物質保持部に保持されている標識物質により被検出物質を認識させる工程
(3)検体及び標識物質を移動相としてクロマトグラフ媒体部に展開させる工程
(4)展開された移動相中の被検出物質を検出部で検出する工程
8.前記検体希釈液中に、非イオン性界面活性剤を含有する前記7に記載の方法。
9.前記検体希釈液中に前記非イオン性界面活性剤を0.01~5質量%含有することを特徴とする前記8に記載の方法。
10.前記試料添加部中に前記陰イオン性界面活性剤を8~800μg含有する前記7~9のいずれか1項に記載の方法。
11.試料添加部、標識物質保持部、検出部が担持されたクロマトグラフ媒体部及び吸収部を含む免疫クロマト分析装置と、検体を希釈して展開するための検体希釈液とからなる免疫クロマト分析キットであって、前記検体希釈液中に非イオン性界面活性剤を含有し、前記試料添加部中に陰イオン性界面活性剤を含有する免疫クロマト分析キット。
(1)検体を検体希釈液で希釈した検体含有液を試料添加部に添加する工程
(2)標識物質保持部に保持されている標識物質により被検出物質を認識させる工程
(3)検体及び標識物質を移動相としてクロマトグラフ媒体部に展開させる工程
(4)展開された移動相中の被検出物質を検出部で検出する工程
(1)工程においては、まず、検体を検体希釈液で希釈した検体含有液を調製する。検体希釈液は、(3)工程における検体及び標識物質を移動相としてクロマトグラフ媒体部に展開させるための展開液として作用することができる。検体希釈液は、展開性が良好でありかつ抗原抗体反応を阻害しないという観点から、非イオン性界面活性剤を含むことが好ましい。
以下の手順で、図1(a)及び図1(b)に示すような免疫クロマト分析装置1を作製した。
(1)試料添加部12の作製
グラスファイバーパッド(ミリポア社製商品名グラスファイバーコンジュゲートパッド、サイズ縦32mm(検体含有液展開方向)、横150mm、厚さ0.43mm)に、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)を、60μg/cm2の割合で均一に添加し、50℃で4時間乾燥することにより、試料添加部12を作製した。
メンブレンとしてニトロセルロースからなるシート(ミリポア社製、商品名:HF12250mm×25mm)を用いた。5質量%のスクロース及び5質量%のイソプロパノールを含む10mMのリン酸緩衝液(pH7.4)で1.0mg/mlの濃度になるように抗HbA1cモノクローナル抗体、抗ヘモグロビンモノクローナル抗体または抗IgGモノクローナル抗体を希釈し、その希釈された溶液150μLを抗体塗布機(BioDot社製)によりメンブラン上に1mmの幅で別々の場所に塗布し、50℃で30分間乾燥させ、室温で一晩乾燥させ、クロマトグラフ媒体部14上に抗HbA1c抗体塗布部16、抗ヘモグロビン抗体塗布部17、抗IgG抗体塗布部18をそれぞれ設けた。
金コロイド懸濁液(田中貴金属工業社製:平均粒子径40nm)0.5mLに、Tris緩衝(pH8.5)で0.1mg/mLの濃度になるように希釈した抗ヘモグロビンモノクローナル抗体0.1mL加え、室温で10分間静置した。次いで、0.01質量%のPEG-SH(日本油脂株式会社製、商品名:SUNBRIGHT ME-200SH、分子量20000)を含むTris緩衝液(pH8.5)を0.1ml加え(添加後のPEG-SH濃度:0.001質量%)、室温で10分間静置した。その後、十分撹拌した後、8000×gで15分間遠心分離を行い、上清を除去した後、1質量%の牛血清アルブミンを含むリン酸緩衝液(pH7.4)0.1mLを加え、標識物質溶液を作製した。
上記作製した標識物質溶液220μlに100μlの25質量%トレハロース水溶液を含むリン酸緩衝液(pH9.0)を加えたものを8mm×100mmのグラスファイバーパッド(ミリポア社製)に均一になるように添加した後、真空乾燥機にて乾燥させ、標識物質保持部13を作製した。次に、プラスチック製粘着シート11上に、上記作製した試料添加部12、標識物質で標識された標識物質保持部13、クロマトグラフ媒体部14を貼り合わせ、汎用の吸収部15をさらに貼り合わせ、裁断機で幅が5mmとなるように裁断し、免疫クロマト分析装置1を作製した。この時、一装置あたりに含有するSDSの量は、96μgであった。
非イオン性界面活性剤としてTritonX-100(SIGMA 社製、商品名)とTween20(和光純薬社製、商品名)との1:5の質量比の混合物:1.2質量%
バッファーとしてのBicine緩衝液:50mM
無機塩として塩化カリウム:0.6質量%
添加剤としてカゼインナトリウム:2.0質量%残量:水
健康成人男性及び糖尿病男性患者それぞれの指先を穿刺することにより、各種HbA1c濃度を有する血液を採取した。
前記血液と前記検体希釈液とを、前者:後者として(容量比)、1:1000で混合し、検体含有液を調製した。
上記のようにして作製した免疫クロマト分析装置1の試料添加部12に、前記検体含有液110μlを供給し、10分後の抗HbA1c抗体塗布部16における赤色の発色シグナルを目視で確認した。結果を表1に示す。
なお表中の評価基準は以下の通りである。
-:赤色の発色を確認できないもの
±:赤色の発色は確認できるが非常に色が薄いもの
+:赤色の発色を確認できるもの
++:強い赤色の発色を確認できるもの
+++:非常に強い赤色の発色が確認できるもの
実施例1において、試料添加部12の構成素材をグラスファイバーパッドから、セルロースファイバーパッド(旭化成せんい社製商品名SR-601)に変更したこと以外は、実施例1を繰り返した。結果を表1に示す。
実施例1において、試料添加部12の構成素材をグラスファイバーパッドから、ポリエチレンテレフタレート(PET)パッド(旭化成せんい社製商品名ベンリーゼ A-01)に変更したこと以外は、実施例1を繰り返した。結果を表1に示す。
実施例1において、試料添加部12の構成素材をグラスファイバーパッドから、ニトロセルロースメンブレン(ミリポア社製商品名HF120)に変更したこと以外は、実施例1を繰り返した。結果を表1に示す。
実施例1において、SDSを添加しない試料添加部を用い、下記の組成を有するN末端露出剤を含有する抽出液に血液を添加し2分間静置して調製した試料液10μlと、下記の組成を有する展開液100μlとを、それぞれ個別に試料添加部12に滴下したこと以外は、実施例1を繰り返した。結果を表1に示す。(抽出液の組成)陰イオン性界面活性剤としてドデシル硫酸ナトリウム:1.0質量%添加剤としてチオシアン酸ナトリウム:100mM添加剤としてEDTA:5mM残量:水(展開液の組成)非イオン性界面活性剤としてTritonX-100(SIGMA 社製、商品名)とTween20(和光純薬社製、商品名)との1:5の質量比の混合物:1.2質量%
バッファーとしてのBicine緩衝液:50mM
無機塩として塩化カリウム:0.6質量%
添加剤としてカゼインナトリウム:2.0質量%残量:水
参考例1において、抽出液を用いずに、展開液に血液を添加したこと以外は、参考例1を繰り返した。結果を表1に示す。
参考例1において、抽出液を用いずに、展開液に表1に示す濃度のSDS及び血液を添加したこと以外は、参考例1を繰り返した。結果を表1に示す。
実施例1において、試料添加部12に添加するSDSの一装置あたりの含有量と検体希釈液に含有する非イオン性界面活性剤の含有率とを表2に記載の値に変更したこと以外は、実施例1を繰り返した。結果を表2に示す。
11 プラスチック製粘着シート
12 試料添加部
13 標識物質保持部
14 クロマトグラフ媒体部
15 吸収部
16 抗HbA1c抗体が塗布された抗HbA1c抗体塗布部
17 抗ヘモグロビン抗体が塗布された抗ヘモグロビン抗体塗布部
18 抗IgG抗体が塗布された抗IgG抗体塗布部
Claims (11)
- 試料添加部、標識物質保持部、検出部が担持されたクロマトグラフ媒体部及び吸収部を含む免疫クロマト分析装置であって、
前記試料添加部中に陰イオン性界面活性剤を含有し、
被検出物質を含む検体を検体希釈液で希釈した検体含有液を展開するための免疫クロマト分析装置。 - 前記試料添加部が、グラスファイバー、セルロース及びポリエチレンテレフタレートからなる群から選ばれた1種である請求項1記載の免疫クロマト分析装置。
- 前記試料添加部中に前記陰イオン性界面活性剤を8~800μg含有する請求項1又は2に記載の免疫クロマト分析装置。
- 前記被検出物質が血液中の糖化タンパク質である請求項1~3のいずれか1項に記載の免疫クロマト分析装置。
- 前記血液中の糖化タンパク質がHbA1cである請求項4に記載の免疫クロマト分析装置。
- 前記陰イオン性界面活性剤がドデシル硫酸ナトリウム(SDS)である請求項1~5のいずれか1項に記載の免疫クロマト分析装置。
- 陰イオン性界面活性剤を含有する試料添加部、標識物質保持部、検出部が担持されたクロマトグラフ媒体部及び吸収部を含む免疫クロマト分析装置を用いて検体に含まれる被検出物質を検出する、以下の工程(1)~(4)を含む免疫クロマト分析方法。
(1)検体を検体希釈液で希釈した検体含有液を試料添加部に添加する工程
(2)標識物質保持部に保持されている標識物質により被検出物質を認識させる工程
(3)検体及び標識物質を移動相としてクロマトグラフ媒体部に展開させる工程
(4)展開された移動相中の被検出物質を検出部で検出する工程 - 前記検体希釈液中に、非イオン性界面活性剤を含有する請求項7に記載の方法。
- 前記検体希釈液中に前記非イオン性界面活性剤を0.01~5質量%することを特徴とする請求項8に記載の方法。
- 前記試料添加部中に前記陰イオン性界面活性剤を8~800μg含有する請求項7~9のいずれか1項に記載の方法。
- 試料添加部、標識物質保持部、検出部が担持されたクロマトグラフ媒体部及び吸収部を含む免疫クロマト分析装置と、検体を希釈して展開するための検体希釈液とからなる免疫クロマト分析キットであって、前記検体希釈液中に非イオン性界面活性剤を含有し、前記試料添加部中に陰イオン性界面活性剤を含有する免疫クロマト分析キット。
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