KR20190117678A - 친수화 착색 셀룰로오스 미립자 - Google Patents

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Abstract

높은 검출 감도를 유지하면서, 위양성을 대폭으로 저감할 수 있는 착색 셀룰로오스 미립자, 이것을 이용한 면역크로마토 진단 키트의 제공. 평균 입자 직경이 60∼900 ㎚이고, 발색 강도가 1.0∼10.0이며, 미립자 표면에 친수층을 갖고, 또한, 미립자 표면에 스페이서를 개재하여 카르복실기가 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 착색 셀룰로오스 미립자, 상기 착색 셀룰로오스 미립자의 카르복실기에 리간드가 공유 결합되어 있는 구조체, 및 상기 구조체를 포함하는 면역크로마토 진단 키트.

Description

친수화 착색 셀룰로오스 미립자
본 발명은 미립자 표면에 친수층을 갖고, 또한, 스페이서를 개재하여 카르복실기가 도입되어 있는 착색 셀룰로오스 미립자, 및 그것을 이용한 진단약 키트 및 체외 진단약에 관한 것이다.
최근, 의료 분야나 식품 분야에 있어서, 간편하면서 신속하게 질환이나 병원균 등의 유무를 판단할 수 있는 기술이 요구되고 있다. 이러한 필요에 응하기 위해서 여러가지 기술이 개발되고 있다. 현재에는 인플루엔자 등의 병원체 감염의 유무, 임신의 유무, 암 마커나 심근 마커의 유무, 식품 중의 알레르기 물질이나 식중독의 원인이 되는 물질의 유무 등 여러가지 검사를 간편하면서 신속하게 행하는 것이 가능해졌다. 이러한 기술로서는, 면역크로마토 측정법, 형광 면역크로마토 측정법, 효소 면역 측정법, 라텍스 응집 측정법, 화학 발광 측정법 등 많은 측정 방법이 개발되고 있다. 그중에서도, 육안으로 판단할 수 있는 면역크로마토 측정법은, 특별한 장치나 전문적인 지식이 불필요하고, 누구나 간편하게 신속한 진단이 가능하다고 하는 특징으로부터, 폭넓게 사용되고 있다. 예컨대, 면역크로마토 측정법의 일종인 임신 검사약 등은, 일반 약국에서 입수 가능할 정도로 소비자에게 있어서 범용성이 높은 것이 되었다.
면역크로마토 측정법(이하, 「면역크로마토」라고 함)은, 항원항체 반응을 이용한 것으로, 샌드위치법이나 경합법이라는 방법이 있다. 측정 방법은, 검출물을 멤브레인에 대하여 수평 방향으로 전개시키는 래터럴 플로우(lateral flow)식과, 수직 방향으로 전개시키는 플로우 스루식으로 크게 나뉜다. 간편성의 관점으로부터, 래터럴 플로우식으로 샌드위치법을 이용하여, 항원을 항체로 포착하는 방법이 많이 사용되고 있다. 측정 순서는 이하와 같은 것이다:
(i) 니트로셀룰로오스 등의 멤브레인에, 검출 대상이 되는 항원 등과 반응하는 항체를 특정 부위(테스트 라인)에 고정화한다 ;
(ii) 발색 입자라고 불리는 표지 물질에, 검출 대상과 반응하는 항체를 담지한 검출 시약을 제작하고, 컨쥬게이트 패드 상에 도포 후 건조시켜, 상기 멤브레인, 샘플 패드, 흡수 패드를 조합시켜 면역크로마토 키트를 제작한다 ;
(iii) 항원의 유무를 검사하고자 하는 검체를 혼합한 전개액을 샘플 패드 상에 적하하고, 테스트 라인(TL)의 발색의 유무를 육안(혹은 간이적인 면역크로마토 리더)로 관찰하여, 항원의 유무를 판단한다. 검체 중에 항원이 있는 경우, 테스트 라인에 선이 발색한다.
일반적으로, 육안으로 판정하는 경우의 대부분은, 검출 대상이 되는 항원의 유무만을 판단하는 정성 분석으로서 사용되고 있다.
면역크로마토에 사용되는 발색 입자로서, 예컨대, 이하의 특허문헌 1에는, 금 콜로이드가, 그리고 이하의 특허문헌 2에는, 착색 라텍스가 개시되어 있다. 이러한 발색 입자의 문제점은, 미립자 표면이 소수성이기 때문에, 단백질 등의 생체 분자가 흡착하는 비특이 흡착이라는 현상을 일으킨다. 비특이 흡착이 일어나면, 면역크로마토에 있어서 최대의 문제의 하나인 위양성이 발생할 우려가 있다. 위양성이란, 검체 중에 검출 대상이 존재하지 않음에도 불구하고, 테스트 라인에 선이 발색하는 것을 가리킨다. 위양성이 발생하면 오진으로 이어지기 때문에, 면역크로마토 키트를 시판하는 경우, 위양성을 발생시키지 않는 것이 필요 불가결하다. 위양성의 발생 메카니즘의 하나로서, 발색 입자에 비특이 흡착한 물질을 개재하여, 테스트 라인에 도포한 항체에 발색 입자가 흡착해 버린다고 생각되고 있다. 그래서 이하의 특허문헌 3에는, 소수성의 금 콜로이드 표면에 친수성의 폴리에틸렌글리콜(PEG)을 결합시키는 수법에 의해, 비특이 흡착이 억제되고, 위양성을 저감시키는 것이 개시되어 있다. 그러나, 이 방법으로는, 미립자 표면의 PEG 사슬의 입체 구조에 의해서 항체 항원 반응이 저해되고, 검출 감도가 저하될 우려가 있다. 이와 같이 일반적으로, 위양성의 저감 대책을 행하면 검출 감도가 저하되어 버리는 케이스가 많이 보인다.
이러한 상황 하, 이하의 특허문헌 4에는, 착색 셀룰로오스 미립자와 항체를 화학적으로 결합시킴으로써 매우 높은 검출 감도를 달성한 것이 개시되어 있다. 이 미립자는 셀룰로오스 유래의 것이기 때문에, 금 콜로이드 등과 비교하면, 표면은 약간 친수성으로 되고 있지만, 아직 소수성이기 때문에, 비특이 흡착이 발생할 가능성이 있고, 지금까지의 발색 입자와 마찬가지로 위양성의 발생 리스크는 아직 있다.
이상과 같이, 높은 검출 감도를 유지하면서, 위양성을 저감시키는 기술을 제공할 필요는 아직 있고, 그 하나로서, 항체 항원 반응을 저해하지 않고, 비특이 흡착을 대폭 억제할 수 있는 발색 입자의 개발이 강하게 요구되고 있다.
특허문헌 1 : 국제 공개 제2015/163384 A1호 특허문헌 2 : 일본 특허 공개 공보 제2009-168495호 특허문헌 3 : 국제 공개 제2013/141122 A1호 특허문헌 4 : 국제 공개 제2011/062157 A1호
상기한 종래 기술의 현상을 감안하여, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는, 높은 검출 감도를 유지하면서, 위양성을 대폭 저감할 수 있는 발색 입자를 제공하는 것이다.
본 발명자들은, 상기 과제를 해결하기 위해 예의 검토하고 실험을 거듭한 결과, 미립자 표면에 친수층을 부여하고, 또한, 스페이서를 개재하여 카르복실기를 도입함으로써, 단백질 등의 생체 분자의 비특이 흡착을 놀라울 정도로 저감시킨 셀룰로오스 미립자를 얻을 수 있는 것을 발견하고, 이것을 발색 입자로서 사용한 면역크로마토가, 높은 검출 감도를 유지하면서 위양성을 대폭 저감시킬 수 있는 것을 확인하여, 본 발명을 완성하기에 이르른 것이다.
즉, 본 발명은 이하와 같은 것이다.
[1] 평균 입자 직경이 60∼900 ㎚이고, 발색 강도가 1.0∼10.0이며, 미립자 표면에 친수층을 갖고, 또한, 스페이서를 개재하여 카르복실기가 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 발색 셀룰로오스 미립자.
[2] 상기 카르복실기의 도입량이, 상기 발색 셀룰로오스 미립자 1 g당 0.20∼3.00 mmol인, 상기 [1]에 기재된 발색 셀룰로오스 미립자.
[3] 상기 친수층이 실란층, 폴리에틸렌글리콜층(PEG), 또는 실란층과 폴리에틸렌글리콜(PEG)층의 혼합층의 어느 하나인, 상기 [1] 또는 [2]에 기재된 발색 셀룰로오스 미립자.
[4] 상기 스페이서가 탄화수소계의 구조체인, 상기 [1]∼[3] 중 어느 하나에 기재된 발색 셀룰로오스 미립자.
[5] 상기 [1]∼[4] 중 어느 하나에 기재된 발색 셀룰로오스 미립자의 상기 카르복실기에 리간드가 공유 결합되어 있는 구조체.
[6] 상기 [5]에 기재된 구조체를 포함하는 면역크로마토 진단 키트.
본 발명에 따른 착색 셀룰로오스 미립자는, 생체 분자의 비특이 흡착이 저감되어 있기 때문에, 이것을 면역크로마토의 발색 입자로서 사용하면, 높은 검출 감도를 유지하면서 위양성을 대폭 저감시킬 수 있다.
도 1은 친수화도를 구하기 위한, 완화 시간의 변화 비율(Rsp값)과 미립자의 총표면적치(TSA값)를 플롯한 그래프이다.
도 2는 면역크로마토 진단 키트의 측정에 있어서의 테스트 라인(TL)의 발색 강도(0-10의 11단계의 육안 등급)를 나타내는 사진이다.
본 발명자들은, 착색 셀룰로오스 미립자에 소정의 친수층과, 소정의 스페이서를 조합시킴으로써, 예상외로 놀랍게도 위양성의 대폭적인 저감 효과와, 높은 검출 감도의 유지가 가능한 것을 발견했다.
특허문헌 4에 개시되어 있는 바와 같이, 입자 직경이 크고, 또한, 색이 짙은 착색 셀룰로오스 미립자와 항체를 화학 결합시킴으로써 검출 감도가 향상되는 것은 판명되어 있다. 그러나, 이러한 미립자 표면의 친수성은 불충분하기 때문에, 단백질 등의 생체 분자가 비특이 흡착하기 쉽고, 면역크로마토에 사용했을 때에 위양성이 발생할 우려가 있다. 따라서 전개액에 계면활성제 등의 첨가제를 첨가하는 등의 위양성 저감 대책을 행하지만, 동시에 감도도 저하시켜 버린다. 본 발명자들은, 미립자 그 자체가 비특이 흡착하기 어렵게 되고, 또한, 항체를 다량으로 미립자 표면에 도입 가능하게 함으로써, 높은 검출 감도를 유지하면서, 위양성이 저감 가능하게 되는 것은 아닌가라고 생각했다. 이러한 가설하에, 실험을 거듭한 결과, 착색 셀룰로오스 미립자 표면에, 친수층을 부여하고, 또한, 탄화수소계의 스페이서를 개재하여 다량으로 카르복실기를 도입하고, 미립자 표면으로의 단백질 등의 생체 분자의 비특이 흡착을 저감시키면서, 다량의 항체를 미립자에 도입하는 것을 가능하게 함으로써, 위양성의 대폭적인 저감을 달성하면서 높은 검출 감도는 유지 가능한 것을 발견했다.
특허문헌 3에 개시되어 있는 바와 같이, 미립자 표면에 친수층을 부여함으로써 위양성을 저감 가능한 것은 판명되어 있다. 한편, 일반적으로 탄화수소계의 화합물은, 위양성의 원인이 되는 단백질 등의 생체 분자가 흡착하기 쉽다고 말해지고 있다. 이러한 상황 하, 본 발명자들은, 친수층 부여에 더하여, 탄화수소계의 소수성 스페이서를 조합시킴으로써 대폭으로 위양성 저감이 가능한 것을 예상외로 발견했다. 특정의 이론에 구속되는 것은 바라지 않지만, 본 발명자들은, 탄화수소계의 스페이서가 친수층에 반발하여 미립자 표면에 선 상태가 되고, 또한, 스페이서끼리의 소수성 상호 작용에 의해서 미립자 표면에 조밀하게 도입되기 때문에, 위양성의 원인이 되는 단백질 등의 생체 분자가 미립자 표면에 들어가는 간극이 없어지고, 비특이 흡착이 억제된다고, 바꾸어 말하면, 선형의 탄화수소계 스페이서의 측면은 이 스페이서끼리가 대략 평행하게 미립자 표면에 나란히 배치되어 있기 때문에, 그 측면에는 위양성의 원인이 되는 단백질이 흡착할 수는 없지만, 스페이서의 선단에 있는 카르복실기에는 항체가 공유 결합할 수 있기 때문에, 위양성의 대폭적인 저감에 성공했다고 생각하고 있다.
이하, 실시형태에 관해서 상세하게 설명한다.
본 실시형태의 착색 셀룰로오스 미립자는, 평균 입자 직경이 60∼900 ㎚이고, 발색 강도가 1.0∼10.0이며, 미립자 표면에 친수층을 갖고, 또한, 스페이서를 개재하여 카르복실기가 도입되어 있는 것을 특징으로 한다.
용어「평균 입자 직경」이란, 동적 광산란법으로 측정한 경우의 체적 평균 메디안 직경을 가리킨다. 본 실시형태에서는, 평균 입자 직경은 60∼900 ㎚의 범위에 있다. 평균 입자 직경이 이 범위에 있으면, 미립자의 표면적이 크기 때문에 면역크로마토로서 이용하는 경우에 테스트 라인이 보다 짙어진다, 즉 검출 감도가 높아진다. 평균 입자 직경이 60 ㎚ 미만이면, 표면적이 작아지기 때문에, 미립자 한 개당의 발색 강도가 저하되기 때문에, 검출 감도가 내려가는 경우가 있고, 또한, 미립자의 응집이 발생하는 경우도 있다. 이상의 점에서 입자 직경의 하한은, 바람직하게는 70 ㎚, 보다 바람직하게는 80 ㎚이다. 한편, 미립자 직경이 900 ㎚보다 커지면 멤브레인의 구멍에 막혀 버리기 때문에, 진단 시간이 길어져 버리거나, 검사 후에 멤브레인 표면이 착색하여 검사 결과의 판단에 악영향을 미치거나, 검출 감도가 나빠지거나 하는 경우가 있다. 이상의 점에서 입자 직경의 상한은, 바람직하게는 800 ㎚, 보다 바람직하게는 700 ㎚이다. 또한, 여기서 설명하고 있는 평균 입자 직경은 어디까지나 평균치이며, 입자 직경 분포의 일부가 상기 범위로부터 벗어나 있어도 상관없다.
입자 직경으로서 체적 평균을 이용하는 이유는, 면역크로마토에 있어서는, 너무 큰 미립자는 멤브레인 중에 막혀 버리지만, 체적 평균이면 큰 미립자일수록 영향이 커지기 때문에, 큰 입자가 약간 존재하는 것만으로도 그 영향이 반영되기 때문이다. 입자 직경으로서는 체적 평균 이외에도, 수 평균, 면적 평균 등 여러가지 표시 방법이 있다. 당연하지만 표시 방법이 상이하면 입자 직경의 값도 변한다.
용어「발색 강도」란, 반응성기 도입 후, 항체 결합 전의 미립자의 색의 농도를 정의한 값이며, 본 실시형태에서는 1.0∼10.0의 범위에 있다. 이 값이 클 수록 미립자의 색의 농도가 짙고, 면역크로마토로서 이용하는 경우에 검출 감도가 높다. 물론 값이 크면 클수록 좋고, 색이 짙은 염료를 이용하는 것, 염색 횟수를 늘리는 것, 스페이서로서 어떠한 화합물을 통해 연결시키는 것, 미립자의 비결정 영역을 늘려 염료가 들어가기 쉽게 하는 것, 미립자를 다공성으로 하여 염료가 들어가기 쉽게 하는 것 등의 방법을 채용할 수 있다. 그러나, 경제성을 고려하면 상한은, 바람직하게는 7.0, 보다 바람직하게는 5.0이다. 또한, 값이 작을수록 면역크로마토로서 이용한 경우에 검출 감도가 저하되기 때문에, 하한은, 바람직하게는 1.5, 보다 바람직하게는 2.0이다.
발색 강도의 측정 방법은, 농도가 이미 알려진 미립자의 순수 분산액을 조제하고, 광로 길이 10 mm로 하여, 400∼800 ㎚의 범위에서 적분구를 이용한 가시 흡광도 측정을 행하고, 얻어진 흡광도 곡선의 피크값(ABS)을 측정하고, 얻어진 값을 발색 입자의 중량 퍼센트로 나누어, 발색 입자 0.01 wt% 당의 흡광도로 환산한 값으로서 정의한다. 예컨대, 조제한 미립자의 농도가 0.0045 wt%이며, 흡광도 곡선의 피크값이 1.0일 때, 그 발색 강도는 (1×0.01)÷0.0045=2.2가 된다.
미립자의 색의 농도의 측정에 적분구를 이용한 가시 흡광도 측정을 행하는 이유는, 액체에 분산된 상태의 미립자의 색의 농도를 가장 정확하게 측정할 수 있기 때문이다. 미립자의 색의 농도를 측정하는 방법으로서는, 미립자를 건조시켜 얻어진 고체를 측색계 등으로 측정하는 방법도 있지만, 이러한 방법으로는 미립자의 색의 농도를 정확하게 측정할 수 없다. 예컨대, 금속 콜로이드 등은 입자 직경에 따라서 색조나 최대 파장이 상이하고, 건조한 응집 상태는 액체에 분산된 상태의 색의 농도를 정확하게 반영할 수 없다. 또한, 액체 중에 동일한 입자 농도로 분산시켜도 응집이 발생하면 색의 농도는 옅어진다. 또한, 가시 흡광도 측정을 행할 때에 적분구를 이용하는 이유는, 입자 자체의 산란에 의한 영향을 제거하기 위함이다. 통상의 가시 흡광도 측정은 투과광을 측정하는 방법이며, 입사광에 대하여 착색 성분에 의한 흡수뿐만 아니라 미립자 자체의 산란에 의한 영향도 반영되어 버린다. 예컨대, 면역크로마토에 일반적으로 사용되는 금 콜로이드는, 입자 직경이 40 ㎚∼60 ㎚, 때로는 100 ㎚인 것이 이용되는 경우도 있지만 어느것도 입자 직경이 작기 때문에 산란광의 영향은 거의 없다. 그것에 반하여, 라텍스 입자는 입자 직경이 크고 분명히 산란광의 영향이 크다. 상기와 같은 이유에서, 입자 직경이나 입자 소재가 다른 경우라도, 미립자 자체의 색의 농도를 보다 정확하게 반영하기 위해서, 적분구를 이용한 가시 흡광도 측정을 사용한다.
용어「친수층」이란, 문자 그대로 친수성이 높은 구조체로 구성된 층이며, 미립자의 수산기와 화학적으로 결합하고 있는 층이다. 이 친수층의 구조는 특별히 한정되는 것은 아니고 실란층, 폴리에틸렌글리콜(PEG)층, 포스포릴콜린층 등을 이용할 수 있다. 경우에 따라서는, 상기 층 중의 2개의 층의 혼합체라도 좋다. 예컨대, 실란층과 PEG층이 1:1의 비율로 포함된 층을 형성하는 것도 가능하다. 여기서 말하는, 실란층이란 Si기를 포함하는 구조체가 입자의 수산기와 결합하여 생긴 층이다. 마찬가지로, PEG층, 포스포릴콜린층도 각각, PEG기, 포스포릴콜린기를 포함하는 구조체가 입자의 수산기와 결합하여 생긴 층이다. 그 후의 반응제와의 결합성이라는 점에서는, 친수층을 형성하는 구조체의 하나에는 아미노기가 포함되어 있는 것이 바람직하다. 친수층이 형성되었는지 아닌지는, 적외 분광법, 현미경 관찰, 원소 분석 등에 의해 판단한다.
또한, 본 명세서 중, 「스페이서」는, 「친수층」중의 반응기와 결합하는 점에서, 「친수층」과는 상이하다.
친수층을 부여하기 위한 친수화제로서는, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 구체예로서는 이하의 것을 들 수 있다: 비닐트리메톡시실란, 비닐트리에톡시실란, 2-(3,4-에폭시시클로헥실)에틸트리메톡시실란, 3-글리시독시프로필메틸디메톡시실란, 3-글리시독시프로필메틸디에톡시실란, 3-글리시독시프로필트리에톡시실란, p-스티릴트리메톡시실란, 3-메타크릴옥시프로필메틸디메톡시실란, 3-메타크릴옥시프로필트리메톡시실란, 3-메타크릴옥시프로필메틸디에톡시실란, 3-메타크릴옥시프로필트리에톡시실란, 3-아크릴옥시프로필트리메톡시실란, N-2-(아미노에틸)-3-아미노프로필메틸디메톡시실란, N-2-(아미노에틸)-3-아미노프로필트리메톡시실란, 3-아미노프로필트리메톡시실란, 3-아미노프로필트리에톡시실란, 3-트리에톡시실릴-N-(1,3-디메틸-부틸리덴)프로필아민, N-페닐-3-아미노프로필트리메톡시실란, 3-머캅토프로필메틸디메톡시실란, 3-머캅토프로필트리메톡시실란, 3-이소시아네이트와 프로필트리메톡시실란, 폴리에틸렌글리콜트리메톡시실란, 폴리에틸렌글리콜트리에톡시실란, 아미노-PEG12-프로피온산, 아미노-PEG8-프로피온산, 아미노-PEG4-프로피온산, 폴리(에틸렌글리콜)2-아미노에틸아세트산, FMOC-PEG 5k-숙신이미드부타네이트, HO-PEG 5k-NHS, O-〔2-(Fmoc-아미노)-에틸〕-O’-2-카르보에틸)폴리에틸렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜비스아민, 1-O-옥타데실-2-O-메틸-sn-글리세로-3-포스포릴콜린. 이 중에서 바람직하게는, N-2-(아미노에틸)-3-아미노프로필메틸디메톡시실란, N-2-(아미노에틸)-3-아미노프로필트리메톡시실란, 3-아미노프로필트리메톡시실란, 3-아미노프로필트리에톡시실란, 3-트리에톡시실릴-N-(1,3-디메틸-부틸리덴)프로필아민, 아미노-PEG12-프로피온산, 아미노-PEG8-프로피온산, 아미노-PEG4-프로피온산, 폴리(에틸렌글리콜)2-아미노에틸아세트산, 폴리에틸렌글리콜비스아민이며, 보다 바람직하게는 N-2-(아미노에틸)-3-아미노프로필메틸디메톡시실란, N-2-(아미노에틸)-3-아미노프로필트리메톡시실란, 3-아미노프로필트리메톡시실란, 3-아미노프로필트리에톡시실란, 3-트리에톡시실릴-N-(1,3-디메틸-부틸리덴)프로필아민이다.
아미노기를 갖는 친수층을 이용하는 경우, 카르복실기를 도입한 후의 잔존 반응성 아미노기량은, 착색 셀룰로오스 미립자 1 g당 0.20 mmol 미만인 것이 바람직하다. 이 범위에 있음으로써 소수성 물질의 흡착을 억제할 수 있을 뿐만 아니라, 이온성 물질, 수소 결합성 물질의 흡착도 억제 가능하기 때문에, 비약적으로 생체 분자의 흡착량을 감소시킬 수 있다. 카르복실기를 도입한 후의 잔존 반응성 아미노기량은, 착색 셀룰로오스 미립자 1 g당 0.20 mmol 이상에서는 특히 수소 결합에 의한 흡착이 증대하기 때문에, 위양성의 저감 효과가 작아져 버린다. 이상의 점에서, 잔존 반응성 아미노기량의 상한은 바람직하게는 0.15 mmol, 보다 바람직하게는 0.10 mmol 이다.
잔존 반응성 아미노기량의 측정 방법으로서는, 형광 측정을 이용한다. 아미노기와 반응한 경우만 발광하는 형광 시약을 사용한다. 우선, 아미노기량이 이미 알려진 샘플로, 아미노기량과 발광 강도의 관계에 대해서 검량선을 작성한다. 그 후, 형광시약을 미립자에 반응시킨다. 그 미립자의 형광 강도를 측정하여, 발광 강도를 얻는다. 얻어진 발광 강도를 검량선에 대입하여 아미노기량을 산출한다.
친수층의 친수화의 정도를 나타내는 지표로서, 「친수화도」를 정의한다. 본 명세서 중, 「친수화도」란, 미립자 표면의 젖기 쉬움, 즉 물과의 친화성을 나타내는 지표이다. 친수화도는 펄스 NMR법에 의해 측정한다. 펄스 NMR법은, 미립자 분산액에 라디오파를 조사하여 수분자의 프로톤을 여기시킨 후, 기저 상태로 되돌아가기까지의 시간(완화 시간)을 측정하는 분석 수법이다. 미립자 표면에 흡착하고 있는 수분자는 운동성이 제한되기 때문에 완화 시간이 짧고, 벌크 수분자(미립자 표면과 흡착하고 있지 않은 수분자)는 운동성에 제한이 적고 자유롭게 운동할 수 있기 때문에 완화 시간이 길다. 따라서, 펄스 NMR법에 의해 얻어지는 미립자 분산액의 완화 시간은, 미립자 표면에 흡착하고 있는 수분자와 벌크 수분자의 비율에 의해 변화된다. 즉, 미립자 표면의 친수성이 높을수록, 보다 많은 수분자를 흡착할 수 있기 때문에 완화 시간은 짧아진다.
펄스 NMR의 측정에는, 브루커사 제조의 Minispec mq20 장치를 이용한다. 농도 1%(wt/vol)의 미립자 분산액을 교반 후, 0.5 ㎖를 외직경 10 mm의 유리제 NMR 관으로 옮기고, 30℃로 설정된 펄스 NMR 장치에 설치하고, 각종 파라미터를 이하와 같이 설정하여 측정한다.
·관측핵: 1H
·측정하는 완화 시간: 가로 완화 시간 T2(ms)
·측정 모드: CPMG 법
·적산 횟수: 32회
·리사이클 지연: 10(s)
·90°-180° 펄스 분리(τ) : 2(ms)
·획득된 에코의 총수: 2000점.
얻어진 자화 감쇠 곡선(자화 강도의 경시적 변화를 나타내는 곡선)을, Microsoft Excel의 지수 근사 기능을 이용하여 최소 제곱법에 의해 하기 식(1):
M(t)=M0·exp(-t/T2)···식(1)
{식 중, M(t): 어떤 시간 t 에서의 신호 강도, M0: 신호 강도의 초기값, T2: 완화 시간.}으로 피팅했다.
측정한 완화 시간으로부터 친수화도를 산출하기 위해서는, 세로축에 완화 시간의 변화 비율(Rsp값)을, 가로축에 미립자의 총표면적치(TSA값)를 플롯한 그래프를 준비하고, 최소 제곱법에 의해 근사 직선을 작성하고, 그 기울기를 친수화도로 정의한다.
·Rsp값의 계산 방법
Rsp값=Rav÷Rb-1
{식 중, Rav: 평균 완화 시상수(시료의 완화 시간 역수), Rb:벌크 수분자의 완화 시상수(블랭크수의 완화 시간 역수). },
·TSA값(㎡)의 계산 방법
TSA값=SA×V×Ψp×ρ
{식 중, SA:미립자의 비표면적(㎡/g)=6÷(ρ×d), 여기서, ρ:미립자 밀도(g/㎤)(미립자 밀도: 1.4 g/㎤, 라텍스 입자 밀도: 1.0 g/㎤, 금 콜로이드 입자 밀도: 19.3 g/㎤), d: 미립자 직경(μm), V: 라디오파가 조사되는 부분의 NMR관 체적(㎤)(≒시료량), Ψp: 미립자 체적비, 여기서, 미립자 체적(i)=미립자 농도(wt%)÷100÷미립자 밀도, 물의 체적(ii)=(1-미립자 체적(i))÷물의 밀도(0.997 g/㎤),Ψp(미립자 체적비)=미립자 체적(i)÷물의 체적(ii), ρ:상동.}.
예컨대, 도 1에 나타내는 바와 같이, A 미립자(TSA값 0.5, Rsp값 10)와 B 미립자(TSA값 1, Rsp값 5)의 수치를 그래프에 플롯하고, 최소 제곱법에 의해 각각의 근사 직선을 작성한다. A 미립자의 경우는 Y=20x, B 미립자의 경우는 Y=5x가 된다. 근사 직선의 기울기(친수화도)가 큰 쪽, 즉 A 미립자쪽을 친수화도가 크다고 판정한다.
본 실시형태에 있어서는, 친수화도는 30.0∼200.0의 범위인 것이 바람직하다. 친수화도가 이 범위에 있으면, 입자 표면이 친수적이기 때문에, 멤브레인 내를 이동하기 쉬워지는 것에 더하여, 미립자 표면으로의 단백질 등의 흡착량이 저감된다. 그 결과, 면역크로마토에 사용했을 때에 위양성이 저감된다. 그것에 더하여 놀랍게도, 이 범위에 있는 미립자는 친수층이 보호층으로서 기능하기 때문에, 카르복실기의 도입 시에 발색 강도의 저하를 일으키기 어려워진다. 그 때문에, 가혹한 반응 조건에 견딜 수 있는 미립자가 되기 때문에, 카르복실기의 도입량을 다량으로 하는 것이 가능해진다. 그 결과, 항체도 다량으로 미립자에 담지할 수 있기 때문에, 높은 검출 감도를 유지한 미립자가 될 수 있다. 친수화도가 30.0 미만이면 미립자 표면은 소수적으로 되기 때문에, 미립자 표면에 단백질 등이 흡착해버리고, 위양성이 발생하기 쉬워져 버린다. 또한 멤브레인 중에서의 흐름이 나빠지고, 진단 시간도 길어져 버린다. 또한, 30.0 미만이면 카르복실기 도입 반응을 행할 때에 미립자의 발색 강도의 저하가 일어나기 쉬워지기 때문에, 검출 감도가 저하되어 버린다. 이상의 점에서, 친수화도의 하한은 보다 바람직하게는 35.0, 더욱 바람직하게는 40.0이다. 한편, 친수화도가 200.0보다 커지면, 수소 결합이 지배적이게 되기 때문에 단백질 등의 생체 분자의 흡착량이 증가하고, 위양성이 발생할 우려가 있기 때문에, 친수화도의 상한은 보다 바람직하게는 190.0, 더욱 바람직하게는 180.0이다.
용어「스페이서」란, 「친수층」을 개재하여, 미립자와 카르복실기를 잇는 화학기이다. 본 실시형태에 있어서는, 「스페이서」는「친수층」의 반응성기와 결합하는 한편으로, 「친수층」은, 미립자의 수산기와 결합한다. 예컨대, 미립자에 결합한 실란층을 개재하여 18-브로모스테아르산을 반응시킨 경우, 친수층은 실란층, 스페이서는 (CH2)17이 된다. 스페이서의 구조는 특별히 한정되는 것은 아니고, 알킬기, 알켄기, 알칸기, 및 벤젠 고리와 같은 탄화수소계 등의 소수성의 구조체를 이용할 수 있다. 탄소수에 관해서도 특별히 한정되는 것은 아니지만, 입자 표면의 전기 이중층의 영향을 받지 않고 감도 향상을 기대할 수 있다는 점에서는, 3 이상이 바람직하다. 일반적으로는 친수성의 구조체가 생체 분자의 흡착 억제에 효과적이기 때문에, 미립자 표면이 소수적인 금 콜로이드, 라텍스 입자, 실리카 입자 등은 PEG 등의 친수성의 스페이서가 잘 사용된다. 예컨대, 나가사키 등은, 금 표면에 길이가 상이한 PEG 사슬을 도입함으로써, 비특이 흡착을 대폭으로 저감할 수 있는 것을 보고하고 있다(나가사키 등, 고분자 61권 2호 2012년 참조). 탄화수소계 등의 소수성의 스페이서에서는 소수성 상호 작용에 의해, 미립자 표면에 스페이서가 흡착해 버린다고 생각되고 있기 때문이다. 그 때문에, 카르복실기와 항체의 반응성이 나빠져, 항체가 미립자에 필요량 고정할 수 없고, 검출 감도가 저하될 우려가 있다. 또한, 일반적으로 소수성의 구조체는 단백질 등과 소수성 상호 작용을 하기 쉽다. 즉 스페이서에 사용하면 단백질 등의 생체 분자가 흡착해버려, 위양성이 발생할 가능성이 높다. 이것에 반하여, 본 발명자들은, 이러한 상식을 뒤집고, 미립자 표면의 친수층과 탄화수소계 등의 소수성의 스페이서를 조합시킴으로써 놀랍게도 위양성의 원인이 되는 생체 분자의 흡착량을 대폭으로 저감시키는 것에 성공하고, 검출 감도를 유지하면서, 위양성이 대폭으로 저감될 수 있는 것을 확인했다. 스페이서가 친수성이면, 미립자 표면에 친수층이 존재하기 때문에, 친수층과 수소 결합 등의 상호 작용이 일어난다고 생각된다. 그 때문에, 스페이서가 친수층에 흡착해버리고, 항체가 미립자에 필요량 고정화할 수 없어 검출 감도가 저하되는 것에 더하여, 생체 분자의 흡착량도 저감시킬 수 없어, 위양성의 억제도 달성할 수 없었다. 한편, 탄화수소계 등의 소수성의 스페이서를 이용한 실시형태에서는, 스페이서가 친수층으로 흡착하지 않을 뿐만 아니라, 스페이서끼리가 소수성 상호 작용에 의해 깨끗하게 정렬하여, 미립자 상에 간극없이 확실히 도입되기 때문에, 생체 분자가 미립자 표면이나 스페이서에 근접하는 간극이 없어져, 흡착량이 대폭으로 저감될 수 있고, 위양성도 대폭으로 저감될 수 있었다고 생각된다.
예컨대, 이하의 표 1에 나타내는 바와 같이, PEG 사슬을 이용한 실시예 15의 위양성 발생률이 1%인데 대하여, 소수성 스페이서를 이용한 실시예 2의 위양성 발생률은 0%이며, PEG 사슬을 이용한 실시예 17의 위양성 발생률이 1%인데 대하여, 소수성 스페이서를 이용한 실시예 1의 위양성 발생률은 0%이며, PEG 사슬을 이용한 실시예 18의 위양성 발생률이 2%인데 대하여, 소수성 스페이서를 이용한 실시예 16의 위양성 발생률은 1%이며, 그리고 PEG 사슬을 이용한 실시예 20의 위양성 발생률이 2%인데 대하여, 소수성 스페이서를 이용한 실시예 19의 위양성 발생률은 1%이다.
스페이서의 동정 방법에는, 적외 분광법, 원소 분석, 핵자기 공명법(NMR), 질량 분석(MS)법 등을 이용할 수 있다. 예컨대, 카르복실기가 도입된 미립자에 강산 또는 강염기를 고온으로 반응시키고, 스페이서부를 미립자로부터 이탈시킨다. 그 후, 원심 분리 등에 의해 미립자를 분리하고, 상청액을 NMR이나 MS 측정함으로써 스페이서의 구조를 동정할 수 있다.
용어「카르복실기의 도입량」이란, 착색 셀룰로오스 미립자 1 g당 도입된 카르복실기의 양이다. 이러한 도입량은 0.20∼3.00 mmol/g인 것이 바람직하다. 이 범위에 있음으로써, 항체나 블로킹제에 이용하는 단백질 등이 미립자와 화학적으로 강고하게 그리고 다량으로 결합 가능해지기 때문에, 고감도화와 위양성 저감의 양립이 가능해진다. 도입량이 0.20 mmol/g 미만에서는 항체 등의 단백질의 결합량이 충분하지 않기 때문에, 첨가제를 첨가하는 등의 위양성 저감 대책을 행하면, 검출 감도가 저하될 우려가 있다. 또한, 0.20 mmol/g 미만에서는, 도입된 카르복실기끼리의 거리가 멀기 때문에, 항체 등과 반응하지 않은 카르복실기는 분자내가 아니라 분자간의 수소 결합을 유발하기 쉬워진다. 즉 단백질 등이 수소 결합을 개재하여 흡착하고, 위양성이 발생할 우려가 있다. 그 때문에, 카르복실기의 도입량의 하한은 바람직하게는 0.25 mmol/g, 보다 바람직하게는 0.30 mmol/g 이다. 한편, 도입량이 3.00 mmol/g를 넘으면 입자 1개당의 중량이 무거워지기 때문에, 미립자 1개당의 발색 강도가 저하된다. 발색 강도가 저하되면, 면역크로마토에 사용했을 때에 검출 감도가 저하될 우려가 있기 때문에, 상한은 바람직하게는 2.50 mmol/g, 보다 바람직하게는 2.00 mmol/g이다.
도입량의 산출 방법으로서는, 형광 측정법, 중화 적정법, 적외 분광법 등을 들 수 있다. 본 실시형태에서는, 항체나 단백질과 반응 가능한 카르복실기량을 정확하게 측정하기 위해서, 주로 형광 측정법을 사용한다. 카르복실기와 반응한 경우만 발광하는 형광 시약을 사용한다. 우선, 카르복실기량이 이미 알려진 샘플로, 카르복실기량과 발광 강도의 관계에 대하여 검량선을 작성한다. 그 후, 형광 시약을 미립자에 반응시킨다. 그 미립자의 형광 강도를 측정하여, 발광 강도를 얻는다. 얻어진 발광 강도를 검량선에 대입하여, 카르복실기량을 산출한다.
카르복실기를 도입할 때의 카르복실화제로서는, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 구체예로서는 이하의 것을 들 수 있다: 2-브로모아세트산, 3-브로모프로피온산, 4-브로모부티르산, 5-브로모펜탄산, 6-브로모헥산산, 7-브로모헵탄산, 8-브로모옥탄산, 11-브로모운데칸산, 18-브로모스테아르산, 16-헵타데센산, 5-헥센산, 에피클로로히드린, 4-아미노부티르산, 3-아미노프로피온산, 5-아미노펜탄산, 6-아미노헥산산, 7-아미노헵탄산, 8-아미노옥탄산, 아디프산, 에이코산이산, 1,8-옥탄디카르복실산, 1,4-부탄디카르복실산, 1,6-헥산디카르복실산, 2-클로로아세트산, 3-클로로프로피온산, 4-클로로부티르산, 5-클로로펜탄산, 6-클로로헥산산, 7-클로로헵탄산, 8-클로로옥탄산, 11-클로로운데칸산, 18-클로로스테아르산, 아미노-PEG12-프로피온산, 아미노-PEG8-프로피온산, 아미노-PEG4-프로피온산, α,w-비스[2-{(3-카르복시-1-옥소프로필)아미노}에틸]폴리에틸렌글리콜, HO-PEG12-COOH, HO-PEG12-프로피온산, HO-PEG8-프로피온산, O-(2-카르복시에틸)폴리에틸렌글리콜, COOH-PEG12-COOH, 폴리(에틸렌글리콜)비스(카르복시메틸)에테르, 프로피온산-PEG12-프로피온산, 프로피온산-PEG8-프로피온산, 프로피온산-PEG4-프로피온산. 이 중에서 바람직하게는, 3-브로모프로피온산, 4-브로모부티르산, 5-브로모펜탄산, 6-브로모헥산산, 7-브로모헵탄산, 8-브로모옥탄산, 11-브로모운데칸산, 18-브로모스테아르산, 아디프산, 에이코산2산, 1,8-옥탄디카르복실산, 1,4-부탄디카르복실산, 1,6-헥산디카르복실산이며, 보다 바람직하게는 8-브로모옥탄산, 11-브로모운데칸산, 18-브로모스테아르산, 아디프산, 에이코산2산, 1,8-옥탄디카르복실산이다.
본 명세서 중, 「미립자」란, 장직경(L)과 단직경(D)의 길이가 가깝고 형상이 구에 가까운 구조체를 가리킨다. 구체적으로는, L÷D로 표시되는 L/D 비가 1.0∼3.0인 구조체를 가리킨다. L/D가 이 범위에 있으면 면역크로마토 진단 키트로서 이용하는 경우에 눈막힘을 일으키기 어려워지고, 보다 바람직하게는 1.0∼2.0, 더욱 바람직하게는 1.0∼1.5, 가장 바람직하게는 1.0∼1.3이다. 측정 방법으로서는, 입자의 전자 현미경 화상을 촬영하여, 100개의 입자의 장직경(L)과 단직경(D)을 측정하고, 그 100개의 평균치를 산출한다.
착색 셀룰로오스 미립자의 제조 방법은, 특별히 한정되지 않는다. 미립자를 우선 성형하고, 색소, 염료 등의 착색 성분을 담지시키는 방법, 미립자를 성형하고, 금속 콜로이드나 안료 등의 보다 작은 발색 미립자를 담지시키는 방법, 미립자의 성형시에 색소, 염료, 안료, 금속 콜로이드 등의 착색 성분도 함께 첨가하여 성형하는 방법 등을 들 수 있다. 그 중에서도 입자 직경의 조정, 색의 농도의 조정, 색의 종류의 조정, 미립자 표면 상태의 조정 등의 미립자의 특징의 조정을 하기 쉽기 때문에, 미립자를 우선 성형하고, 색소, 염료 등의 착색 성분을 담지시키는 방법이 바람직하다. 또한, 담지시키는 착색 성분으로서는, 담지의 용이함으로부터 염료가 바람직하다.
착색 성분으로서 염료를 이용하는 경우, 염료의 종류는 특별히 한정되지 않는다. 반응 염료, 직접 염료, 함금 염료, 산성 염료, 염기성 염료, 분산 염료, 황화 염료, 식물 염료, 나프톨 염료, 형광 염료 등의 염료를 이용할 수 있다. 물론 임의의 염료를 조합시켜도 상관없다. 그 중에서도 셀룰로오스의 수산기와 공유 결합으로 결합하는 반응성 염료가, 대량으로 염료를 유지할 수 있는 점이나 안정성의 면에서 특히 바람직하다.
셀룰로오스 미립자를 우선 성형하고, 그 후 착색 성분을 담지시키는 경우, 셀룰로오스 미립자의 성형 방법은 특별히 한정되지 않는다. 천연의 셀룰로오스를 볼 밀이나 고압 호모게나이저로 물리적으로 미세화하는 방법, 산이나 알칼리 등으로 화학적으로 처리하여 미세화하는 방법, 셀룰로오스를 그 양용매에 한번 용해시켜 입자상으로 성형하는 방법 등을 들 수 있다. 또한, 유도체화된 셀룰로오스를 용해, 입자상으로 성형하고, 유도체화된 치환기를 수산기로 되돌려 셀룰로오스 미립자를 조제해도 좋다. 또한 이러한 성형 방법을 조합시켜도 좋다. 또한 셀룰로오스의 종류도 특별히 한정되는 것은 아니고, 재생 셀룰로오스, 정제 셀룰로오스, 천연 셀룰로오스, 유도체화된 치환기를 수산기로 되돌린 셀룰로오스 등을 이용할 수 있다. 그 중에서도 입자 직경의 조정, 입자 형상의 조정 등의 점에서 양용매에 한번 용해시켜 입자상으로 성형하는 방법이 바람직하고, 셀룰로오스의 종류로서는 재생 셀룰로오스가 바람직하다.
셀룰로오스를 그 양용매에 한번 용해시켜 입자상으로 성형하는 경우, 셀룰로오스를 용해시키는 양용매의 종류도 특별히 한정되는 것은 아니고, 구리 암모니아 용액, 비스코스 용액, N-메틸모르폴린, 각종 이온성 액체 등 셀룰로오스를 용해할 수 있는 여러가지 양용매를 이용할 수 있다. 그 중에서도 입자 직경의 조정, 입자 형상의 조정 등의 점에서 구리 암모니아 용액이 바람직하다. 또한, 용해시킨 셀룰로오스를 입자로 성형하는 방법도 특별히 한정되는 것은 아니다. 본 실시형태에서는, 상분리에 의한 방법을 이용했다.
용어「리간드」란, 특정의 검사 대상 물질에 선택적이고 또한 특이적으로 결합하는 성질을 갖는 물질이다. 그 종류는 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예컨대, 항체, 효소, 유전자, 호르몬, 핵산, 펩티드, 단백질 등을 들 수 있다.
용어「면역크로마토 진단 키트」란, 여러가지 검체 중의 검사 대상 물질의 유무를 간편하게 검출하기 위한 항원 항체 반응을 이용한 물품이다. 면역크로마토 진단 키트의 종류로서는, 래터럴 플로우식이나 플로우 스루식이 있다. 발색 입자나 샘플 패드를 이용하는 것이면 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 래터럴 플로우식이다. 또한, 래터럴 플로우식 중에서도, 딥스틱 타입과 카세트 타입이 있지만, 이러한 타입은 특별히 한정되지 않는다. 면역크로마토 진단 키트의 구성은, 특별히 한정되는 것은 아니고, 당해 분야에서 일반적으로 이용되는 구성이면 어느 것이든 상관없다. 발색 입자와 샘플 패드 이외의 부재의 종류는, 그 분야에서 이용되는 것이면 특별히 한정되지 않고, 예컨대, 컨쥬게이트 패드(항체 감작 발색 입자를 포함함), 니트로셀룰로오스 등의 멤브레인, 흡수 패드, 및 대지(臺紙)를 들 수 있다. 또한, 필요에 따라 이러한 부재를 일부 생략하고 있어도 된다.
면역크로마토 진단 키트를 사용하는 「진단 방법」이란, 면역크로마토 진단 키트를 이용하여 행해지는 여러가지 진단을 가리킨다. 진단 대상은 특별히 한정되는 것은 아니고, 사람용, 동물용, 식품용, 식물용, 기타 환경 검사 등 여러가지 진단 대상일 수 있다. 일반적인 진단의 순서로서는, 검사 대상으로부터 검체 시료를 채취하고, 필요하면 그것을 추출이나 여과 등의 전처리를 행하여, 샘플 패드에 적하하고, 검사 개시로부터 소정 시간 기다려, 검사 대상 물질의 유무에 따라 다른 발색으로 진단 결과를 판단한다. 물론 이 순서에 한정되지 않고, 동일한 순서, 원리의 진단에도 이용할 수 있다. 바람직한 것은, 검체 시료를 미리 여과해 둠으로써 여분인 이물이나 협잡물을 제거할 수 있고, 그것에 의하여 한층 더 진단 시간의 단축화나, 진단 정밀도의 향상을 기대할 수 있다.
면역크로마토 진단 키트로 진단할 수 있는 대상은 특별히 한정되는 것은 아니지만, 구체예로서는 이하의 것을 들 수 있다: 암 마커, 호르몬, 감염증, 자기 면역, 혈장 단백, TDM, 응고·선용, 아미노산, 펩티드, 단백, 유전자, 세포. 보다 구체적으로는, CEA, AFP, 페리티린, β2 마이크로, PSA, CA19-9, CA125, BFP, 엘라스타제 1, 펩시노겐 1·2, 변 잠혈, 뇨중 β2 마이크로, PIVKA-2, 뇨중 BTA, 인슐린, E3, HCG, HPL, LH, HCV 항원, HBs 항원, HBs 항체, HBc 항체, HBe 항원, HBe 항체, HTLV-1 항체, HIV 항체, 톡소플라즈마 항체, 매독, ASO, A형 인플루엔자 항원, A형 인플루엔자 항체, B형 인플루엔자 항원, B형 인플루엔자 항체, 로타 항원, 아데노바이러스 항원, 로타·아데노바이러스 항원, A군 렌사 구균, B군 렌사 구균, 칸디다 항원, CD균, 크립토로쿠스 항원, 콜레라균, 수막염균 항원, 과립균 엘라스타제, 헬리코박터 파일로리 항체, O157 항체, O157 항원, 렙토스피라 항체, 아스페르길루스 항원, MRSA, RF, 총 IgE, LE 테스트, CRP, IgG, A, M, IgD, 트랜스페린, 뇨중 알부민, 뇨중 트랜스페린, 미오글로빈, C3·C4, SAA, LP(a), α1-AC, α1-M, 합토글로빈, 마이크로트랜스페린, APR 스코어, FDP, D 다이머, 플라스미노겐, AT3, α2PI, PIC, PAI-1, 프로테인 C, 응고 제X3 인자, IV형 콜라겐, 히알루론산, GHbA1c, 그 밖의 각종 항원, 각종 항체, 각종 바이러스, 각종 균, 각종 아미노산, 각종 펩티드, 각종 단백질, 각종 DNA, 각종 세포, 각종 알레르겐, 각종 잔류 농약, 각종 유해물.
이하, 셀룰로오스 미립자의 제작 방법, 셀룰로오스 미립자의 착색 방법, 착색 셀룰로오스 미립자의 친수화 방법, 카르복실기의 도입 방법, 면역크로마토 진단 키트의 제작 방법 등의 일례를 기재한다, 물론, 본 실시형태는, 이들에 의해 한정되어서는 안된다.
〔셀룰로오스 미립자의 제작 방법〕
셀룰로오스 린터를 셀룰로오스의 양용매에 용해시킨다. 양용매로서 공지의 방법으로 조제한 구리 암모니아 용액을 이용한다. 그리고 응고액으로서는 유기 용매+ 물+ 암모니아 혼합계를 주로 이용한다. 이 응고액을 교반하면서, 조제해 둔 구리 암모니아 셀룰로오스 용액을 첨가하여 응고를 행한다. 또한 황산을 첨가하여 중화, 재생을 행함으로써 원하는 셀룰로오스 미립자를 함유한 슬러리를 얻을 수 있다. 이 때 슬러리는 재생에 이용한 산의 잔류에 의해 산성이며, 또한 중화로 발생한 암모늄염 등의 불순물을 포함하고 있기 때문에, 셀룰로오스 미립자와 매체로 이루어지는 셀룰로오스 분산액으로 정제하는 조작이 필요해진다. 이 정제 조작으로서 원심 분리-디켄테이션 분산매 액체에 의한 희석의 처리의 반복을 이용한다. 얻어진 셀룰로오스 미립자 분산액 중의 셀룰로오스 미립자는, 정제 조작의 과정에 있어서 응집하는 경우도 있기 때문에, 이 경우는 전단 등에 의한 분산 처리를 행할 수 있다. 전단을 부여하는 수단으로서는 고압 호모게나이저를 이용한다.
〔셀룰로오스 미립자의 착색 방법〕
얻어진 셀룰로오스 미립자의 수분산체에 대하여, 황산나트륨, 반응성 염료를 첨가하고, 마그네틱 스터러로 교반하면서 항온조에서 적온으로 승온한다. 승온 후에 알칼리로서 탄산나트륨을 첨가하여 염색을 개시한다. 소정 시간 경과 후에 원하는 착색 셀룰로오스 미립자를 함유한 슬러리를 얻을 수 있다. 이 때 슬러리는 알칼리성이며, 또한 황산나트륨, 미반응의 염료 등을 포함하고 있기 때문에, 착색 셀룰로오스 미립자와 매체로 이루어지는 착색 셀룰로오스 미립자 분산액으로 정제하는 조작이 필요해진다. 상기 마찬가지로 원심 분리에 의한 정제를 행하여, 착색 셀룰로오스 미립자 분산액을 얻는다. 얻어진 착색 셀룰로오스 미립자 분산액 중의 착색 셀룰로오스 미립자는, 정제 조작의 과정에 있어서 응집하는 경우도 있기 때문에, 이 경우는 전단 등에 의한 분산 처리를 행할 수 있다. 전단을 부여하는 수단으로서는 고압 호모게나이저를 이용한다.
〔착색 셀룰로오스 미립자의 친수화 방법〕
얻어진 착색 셀룰로오스 미립자의 수분산체에 대하여, 유기 용매, 물을 첨가하고, 마그네틱 스터러로 교반하면서 항온조에서 적온으로 승온한다. 승온 후에 시판의 친수화제를 첨가하여 반응을 개시한다. 소정 시간 경과 후에 원하는 친수화 착색 셀룰로오스 미립자를 함유한 슬러리를 얻을 수 있다. 이 때 슬러리는 알칼리성이며, 또한 유기 용매, 미반응의 친수화제 등을 포함하고 있기 때문에, 친수화 착색 셀룰로오스 미립자와 매체로 이루어지는 친수화 착색 셀룰로오스 미립자 분산액으로 정제하는 조작이 필요해진다. 상기 마찬가지로 원심 분리에 의한 정제를 행하여, 친수화 착색 셀룰로오스 미립자 분산액을 얻는다. 얻어진 친수화 착색 셀룰로오스 미립자 분산액 중의 친수화 착색 셀룰로오스 미립자는, 정제 조작의 과정에 있어서 응집하는 경우도 있기 때문에, 이 경우는 전단 등에 의한 분산 처리를 행할 수 있다. 전단을 부여하는 수단으로서는 고압 호모게나이를 이용한다.
〔친수화 착색 셀룰로오스 미립자로의 카르복실기 도입 방법〕
얻어진 친수화 착색 셀룰로오스 미립자의 수분산체에 대하여, 유기 용매, 염기를 첨가하고, 마그네틱 스터러로 교반하면서 항온조에서 적온으로 승온한다. 승온 후에 카르복실기를 갖는 반응제를 첨가하여 반응을 개시한다. 소정 시간 경과 후에 원하는 카르복실기 도입 친수화 착색 셀룰로오스 미립자를 함유한 슬러리를 얻을 수 있다. 이 때 슬러리는, 유기 용매, 염기, 미반응의 반응제 등을 포함하고 있기 때문에, 카르복실기 도입 친수화 착색 셀룰로오스 미립자와 매체로 이루어지는 카르복실기 도입 친수화 착색 셀룰로오스 미립자 분산액으로 정제하는 조작이 필요해진다. 상기 마찬가지로 원심 분리에 의한 정제를 행하여, 카르복실기 도입 친수화 착색 셀룰로오스 미립자 분산액을 얻는다. 얻어진 카르복실기 도입 친수화 착색 셀룰로오스 미립자 분산액 중의 카르복실기 도입 친수화 착색 셀룰로오스 미립자는, 정제 조작의 과정에 있어서 응집하는 경우도 있기 때문에, 이 경우는 전단 등에 의한 분산 처리를 행할 수 있다. 전단을 부여하는 수단으로서는 고압 호모게나이저를 이용한다.
〔면역크로마토 진단 키트의 제작 방법〕
소정의 농도로 조정한 카르복실기 도입 친수화 착색 셀룰로오스 미립자의 분산액을 준비하고, 완충액, 항체를 첨가하고, 온도 조정을 행하면서 일정 시간 교반하고, 카르복실기 도입 친수화 착색 셀룰로오스 미립자에 항체를 결합시킨다. 일정 시간 교반 후, 블로킹제를 더 첨가하고 온도 조정을 행하면서 일정 시간 교반함으로써, 카르복실기 도입 친수화 착색 셀룰로오스 미립자의 블로킹을 행한다. 블로킹제로서는, 검사 대상 물질이나 검체 또는 그것을 희석하는 용액의 조성 등에 따라 여러가지 블로킹제를 이용할 수 있다. 카제인은, 카르복실기 도입 친수화 착색 셀룰로오스 미립자의 블로킹에 특히 바람직하다. 항체 결합&블로킹 후의 카르복실기 도입 친수화 착색 셀룰로오스 미립자를 세정하기 위해서, 원심 분리를 행하고, 잉여인 항체와 블로킹제가 포함된 상청액과 침강한 미립자를 분리하고, 상청액을 디켄테이션으로 제거한다. 침강한 미립자에 완충액 등의 액체를 첨가하고, 필요에 따라 초음파 등으로 분산 처리를 행한다. 이 원심 분리에 의한 침강, 상청의 제거, 액체의 첨가라는 일련의 조작에 의한 세정을 필요 횟수 행하고, 항체 흡착&블로킹을 행한 미립자를 소정의 농도 함유한 분산액을 조정한다. 이 분산액에 필요에 따라 단백질, 계면활성제, 수크로오스나 트레할로오스 등의 당을 첨가하고, 얻어진 용액을 유리 섬유제의 컨쥬게이트 패드에 일정량 도포하고, 건조시켜, 검출 시약 함유부를 조정한다. 또한, 재생 셀룰로오스 연속 장섬유 부직포에 필요에 따라 완충액, 계면활성제, 단백, 검체 시료 중의 협잡물을 트랩하는 시약, 방부제, 항균제, 산화방지제, 흡습제, 등을 도포하고, 건조시켜, 샘플 패드를 조제한다. 또한 소정의 위치에 항체를 고정화한 니트로셀룰로오스 다공막제의 멤브레인, 검체를 흡수하기 위한 셀룰로오스 여과지제의 흡수 패드를 조제한다. 이들을 배킹 시트라고 불리는 접착 부위를 갖는 시트에 고정화하고, 소정의 사이즈로 재단함으로써 면역크로마토 진단 키트를 제작한다.
실시예
이하, 본 발명을 실시예에 의해 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이러한 실시예에만 한정되는 것은 아니다. 또한, 특별히 기재가 없는 모든 조작은 온도 23℃, 상대 습도 55% RH의 환경 하에서 행했다.
우선, 이용한 각종 물성 등의 측정 방법 등에 관해서 설명한다.
〔미립자의 평균 입자 직경〕
장치로서는 니키소사 제조의 나노트랙 입도 분포 측정 장치 UPA-EX150(동적 광산란식)을 이용했다. 측정 샘플로서, 미립자가 0.01 wt%, 순수 99.99 wt%의 샘플을 이용했다. 측정 조건으로서는 적산 횟수를 30회, 1측정당 측정 시간을 30초로 하고, 체적 평균의 입자 직경 분포를 이용하여 그 메디안 직경을 평균 입자 직경으로 했다.
〔미립자의 발색 강도〕
장치로서는 니혼분코사 제조의 자외 가시 근적외 분광 광도계 JASCO V-650에 동사 제조의 적분구 유닛 ISV-722을 부착한 장치를 이용했다. 측정하는 샘플로서 미립자가 0.01 wt%, 순수 99.99 wt%의 샘플을 이용하여, 광로 길이 10 mm의 석영 셀에 샘플을 넣어 측정했다. 얻어진 흡광도 피크 중, 400∼800 ㎚ 가시광 범위에서의 최대치(ABS)를 발색 강도로 했다.
〔미립자의 L/D(진구도)〕
장치로서는 니혼덴시사 제조의 주사형 전자 현미경 JSM-6700을 이용했다. 미립자가 0.01 wt%, 순수 99.99 wt%인 샘플을 운모판에 적하하고, 10초 경과시킴으로써 미립자를 운모판 상에 흡착시키고, 킴와이프(KimWipes)로 여분의 액체를 흡수하여 건조시켰다. 얻어진 운모판을 백금으로 코팅하고, 전자 현미경 측정용의 샘플을 조제했다. 가속 전압 1.6 kV, 측정 배율 5만배로 관측을 행하고, 미립자 화상이 100개 이상이 되도록 필요 매수의 화상을 촬영하고, 각각의 미립자의 장직경(L)과 단직경(D)을 측정하여, 미립자 100개의 L/D의 평균치를 산출했다.
〔스페이서 구조의 동정〕
장치로서는 브루커사 제조의 핵자기 공명 장치(AVANCE II400)를 이용했다. 스페이서를 도입한 미립자의 1.0 wt% 분산액에, 0.1 ㎖, 1.0 M의 수산화나트륨 수용액(와코쥰야쿠사 제조, 72082100), 또는 1.0 M의 염산 수용액(와코쥰야쿠사 제조, 080-10035) 10.0 ㎖를 첨가하고, 60℃에서 5시간 가열 교반한다. 그 후, 원심 분리에 의해 상청액을 채취하고, 미립자로부터 절단된 스페이서가 용해 또는 분산된 용액을 얻었다. 이 용액을 최적의 중용매로 희석하고, 핵자기 공명 장치에 의해 NMR 측정할 수 있었던 스펙트럼으로부터 구조물을 동정했다.
〔카르복실기의 도입량〕
장치로서는 니혼분코사 제조의 분광 형광 광도계 FP-8300을 이용했다. 카르복실기와 반응한 경우만 형광을 발하는 시약을 미립자에 결합시키고, 그 형광 강도로부터 도입량을 측정했다. 이하에, 측정예를 나타낸다. 도입량을 측정하고 싶은 미립자의 1.0 wt% 분산액 0.1 ㎖, 형광 시약 ADAM(KAK사 제조, FK-101)의 2.3 mM의 에탄올 용액 4.0 ㎖, 에탄올(간토가가꾸사 제조, 14033-70) 3.9 ㎖를 용기에 넣고, 60℃에서 5분 반응시킨다. 그 후, 얻어진 반응액 10.0 ㎕에 에탄올 2.0 ㎖를 첨가하고, FP-8300으로 365 ㎚의 여기광을 조사하고, 410 ㎚의 형광 강도를 측정했다. 검량선에는 옥탄산(도쿄가세이사 제조, O 0027)을 사용했다.
〔잔존 반응성 아미노기량〕
장치로서는 니혼분코사 제조의 분광 형광 광도계 FP-8300을 이용했다. 아미노기와 반응한 경우만 형광을 발하는 시약을 미립자에 결합시키고, 그 형광 강도로부터 도입량을 측정했다. 이하에 측정예를 나타낸다. 잔존 반응성 아미노기량을 측정하고 싶은 미립자의 1.0 wt% 분산액 0.1 ㎖, 형광 시약 NBD-F(도진가가꾸사 제조)의 2.5 mM의 에탄올 용액 4.0 ㎖, 에탄올(간토가가꾸사 제조, 14033-70) 3.9 ㎖를 용기에 넣고 30℃에서 60분 반응시킨다. 그 후, 얻어진 반응액 10.0 ㎕에 에탄올 2.0 ㎖을 첨가하고 FP-8300으로 480 ㎚의 여기광을 조사하고, 530 ㎚의 형광 강도를 측정했다. 검량선에는, 옥틸아민(도쿄가세이사 제조, O 0045)을 사용했다.
〔미립자의 친수화도〕
미립자 분산액을 농도 1%(wt/vol)로 조제하여 시료 용액으로 했다. 시료 용액을 교반 후, 0.5 ㎖을 외직경 10 mm의 유리제 NMR관으로 옮기고, 30℃로 설정된 펄스 NMR 장치에 설치했다. 펄스 NMR 장치는 브루커사 제조의 Minispec mq 20 장치를 이용했다. 각종 파라미터를 이하와 같이 설정하여 측정했다.
·관측핵: 1H
·측정하는 완화 시간: 가로 완화 시간 T2(ms)
·측정 모드: CPMG법
·적산 횟수: 32회
·리사이클 지연:10(s)
·90°-180° 펄스 분리(τ) : 2(ms).
얻어진 자화 감쇠 곡선(자화 강도의 경시간 변화를 나타내는 곡선)을, Microsoft Excel의 지수 근사 기능을 이용하여 최소 제곱법에 의해 하기 식(1)에 피팅했다.
M(t)=M0·exp(-t/T2)···(식 1)
{식 중, M(t): 일정 시간 t에서의 신호 강도, M0: 신호 강도의 초기값, T2: 완화 시간.}.
다음으로, 도 1에 나타내는 바와 같이, 세로축에 완화 시간의 변화 비율(Rsp값)을, 가로축에 미립자의 총표면적값(TSA값)을 플롯한 그래프를 작성했다. 최소 제곱법에 의해 근사 직선을 작성하고, 그 기울기를 친수화도로 정의하여, 미립자의 친수화도를 비교했다. Rsp값과 TSA값의 계산 방법은 이하와 같다.
·Rsp값의 계산 방법
Rsp값=Rav÷Rb-1
{식 중, Rav: 평균 완화 시상수(시료의 완화 시간 역수), Rb:벌크 수분자의 완화 시상수(블랭크수의 완화 시간 역수).}.
·TSA값(㎡)의 계산 방법
TSA값=SA×V×Ψp×ρ
{식 중, SA: 미립자의 비표면적(㎡/g)=6÷(ρ×d), 여기서, ρ: 미립자 밀도(g/㎤)(미립자 밀도: 1.4 g/㎤, 라텍스 입자 밀도: 1.0 g/㎤, 금 콜로이드 입자 밀도: 19.3 g/㎤), d: 미립자 직경(μm), V: 라디오파가 조사되는 부분의 NMR관 체적(㎤)(≒시료량), Ψp: 미립자 체적비, 여기서, 미립자 체적(i)=미립자 농도(wt%)÷100÷미립자 밀도, 물의 체적(ii)=(1-미립자 체적(i))÷물의 밀도(0.997 g/㎤),Ψp(미립자 체적비)=미립자 체적(i)÷물의 체적(ii), ρ:상동.}.
〔단백질 흡착량〕
장치로서는 니혼분코사 제조의 자외 가시 근적외선 분광 광도계 JASCO V-650를 이용했다. 단백질의 일례로서 소혈청 알부민(이하, 「BSA)라고 함, 시그마알드리치사 제조, A7906)의 흡착량의 산출 방법을 나타낸다. 흡착량을 측정하고 싶은 미립자의 1.0 wt% 분산액을 30.0 ㎕, pH=5.0 농도 100 mM의 인산 완충액(키시다가가꾸사 제조) 270.0 ㎕, 1.0 wt%의 BSA 용액 3.0 ㎕를, 37℃에서 2시간 반응시키고, 그 후 원심 분리에 의해 상청액을 채취한다. 이 상청액을 시판의 BCA 시약(와코쥰야쿠사 제조, 297-73101)과 반응시키고, V-650에 의해 562 ㎚의 흡광도를 측정하여, 상청액 중의 BSA량을 산출한다. 그 후 주입한 BSA량으로부터 상청액 중의 BSA량을 빼고, 사용한 미립자량을 나누어 얼마만큼 흡착했는지를 산출했다.
〔카르복실기가 도입된 친수화 셀룰로오스 미립자와 항체의 결합 방법〕
2-모르폴리노에탄술폰산(이하, 「MES」라고 함, 도쿄가세이사 제조, M0606),가성 소다, 순수를 이용하여 pH=6.0, 농도가 100 mM인 MES 완충액을 조제했다. 얻어진 MES 완충액 63.0 ㎕, 카르복실기 도입 친수화 착색 셀룰로오스 미립자 1.0 wt% 분산액 7.0 ㎕, 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드염산염(이하, 「EDC」라고 함, 도쿄가세이사 제조, D1601)의 1.0 wt% 용액 3.5 ㎕, N-히드록시숙신이미드(이하, 「NHS」라고 함, 도쿄가세이사 제조, B0249)의 1.0 wt% 용액 7.0 ㎕를, 용기에 넣고, 실온에서 15분간 했다. 그 후, 원심 분리에 의해 상청액을 버려 미반응의 EDC, NHS를 제거했다. MES 완충액 70.0 ㎕를 넣고, 미립자를 분산시킨 후, 카르복실기 도입 친수화 착색 셀룰로오스 미립자에 대하여 10.0 wt %가 되도록 항 hCG 항체(Fitzgelardh 제조, ＃5014)를 스피츠관에 첨가하고, 37℃에서 2시간 반응시켰다. 그 후, 1.0 wt% 카제인(와코쥰야쿠고교사 제조, 030-01505)을 함유하는 블로킹 용액(100 mM 붕산 완충액, PH=8.5) 840.0 ㎕를 스피츠관에 첨가하고, 37℃의 건조기 내에서 1시간 정치했다. 1시간 후, 원심 분리기(구보타 쇼지사 제조, 6200)와 원심 분리 로터(구보타 쇼지사 제조, AF-5008C)를 이용하여, 14000 g의 원심을 30분간 행하고, 항체 결합 카르복실기 도입 친수화 착색 셀룰로오스 미립자를 침강시킨 후, 상청액을 폐기했다. 계속해서, 붕산 완충액(50 mM, PH=10.0) 840.0 ㎕를 스피츠관에 첨가하고, 초음파 분산기(에스엠티사 제조, UH-50)로 10초간 처리하고, 항체 결합 카르복실기 도입 친수화 착색 셀룰로오스 미립자를 분산시켰다. 충분히 분산시킨 후, 14000 g의 원심을 20분간 행하고, 상청액을 폐기했다. 항체 결합 카르복실기 도입 친수화 착색 셀룰로오스 미립자의 농도가 0.04 wt %가 되도록 붕산 완충액(50 mM, PH=10.0)을 첨가하고, 초음파 분산기에 의해 충분히 분산시켰다. 이상의 방법에 의해, 항체 결합 카르복실기 도입 친수화 착색 셀룰로오스 미립자(이하, 「검출 시약」이라고도 함)를 얻었다.
〔컨쥬게이트 패드로의 검출 시약의 함침과 건조〕
폴리에틸렌테레프탈레이트제 컨쥬게이트 패드(Ah제조, 6615)를 0.05 wt%의 Tween-20(시그마알드리치사 제조, T2700)에 침지하고, 여분의 액을 제거한 후에 50℃에서 60분 건조시켰다. 계속해서, 높이 10 mm, 길이 300 mm의 형상으로 커트했다. 계속해서, 마이크로피펫을 이용하여, 검출 시약을 272 ㎕/800 m㎡가 되도록 균등하게 도포하고, 37℃에서 30분 건조시켰다.
〔샘플 패드의 전처리〕
재생 셀룰로오스 연속 장섬유 부직포를, 대과잉의 2.0 wt%의 BSA(시그마알드리치사 제조, A 7906)와 2.0 wt%의 Tween-20을 함유하는 PBS 완충액(66 mM, PH 7.4)에 함침하고, 여분의 액을 제거한 후, 50℃에서 60분 건조시켰다. 계속해서, 높이 20 mm, 길이 300 mm의 형상으로 커트했다.
〔포착 항체 도포 멤브레인의 조제〕
니트로셀룰로오스막(Millipore사 제조, SHF0900425)을 폭 25 mm, 길이 300 mm의 형상으로 커트했다. 액체 도포 장치(무사시 엔지니어링사 제조, 300DS)를 이용하여, 0.1 wt% 항 hCG-β 마우스 항체(MedixBiochemica사 제조, 6601)를 포함하는 PBS 용액(66 mM, PH7.4)을 0.1 ㎕/mm의 비율로 높이 12 mm의 부분에 도포했다. 계속해서, 37℃에서 30분간 건조시켰다.
〔면역크로마토 진단 키트의 조제〕
배킹 카드(Adhesive Reserch사 제조, AR9020)에, 상기와 같이 하여 얻은 포착 항체 도포 멤브레인, 흡수 패드(Millipore사 제조, C083), 검출 시약을 함유한 컨쥬게이트 패드, 및 샘플 패드를 접합하였다. 계속해서, 재단기로 5 mm의 폭으로 커트하고, 폭 5 mm, 높이 60 mm의 면역크로마토 진단 키트를 얻었다.
〔면역크로마토 진단 키트의 위양성 판정〕
임신하고 있지 않은 100인분의 소변을 이용하여 위양성 측정을 실시했다. 15분 경과 후의 테스트 라인(TL)의 발색 강도를 0-10의 11단계의 등급 평가를 육안으로 행했다. 도 2에 나타내는 바와 같이, 육안 등급은 값이 클수록 TL의 선의 색이 짙은 것을 나타내고, 0은 선이 보이지 않는 것을 나타낸다. 이 측정을 5회 행하고, 얻어진 값의 평균치로 육안 등급이 0이면 위양성은 없다고 판단했다. 100 검체 중, 위양성이 발생한 검체수를 세어, 100으로 나누어 위양성의 발생률로 했다. 또한, 위양성이 발생한 검체에 관해서는, 육안 등급을 기록했다.
〔면역크로마토 진단 키트의 진단 시간〕
5 mm 폭으로 커트한 면역크로마토 진단 키트를 플라스틱의 하우징에 넣었다. 얻어진 하우징에 들어있는 진단 키트를, 0-10의 11단계의 육안 등급으로 판정했다. 검사 대상 물질에는 항 hCG-β 마우스 항체를 이용했다. 상기 hCG 항체를 1.0 wt%의 BSA를 포함하는 66 mM, PH7.4의 인산 완충액(이하「PBS」라고 함)으로 희석하고, 상기 hCG 항체가 10.0 mIU/㎖인 양성 검체를 조제했다. 이 양성 검체 120.0 ㎕를 진단 키트의 샘플 적하부에 적하하고, 이후 20초마다 육안으로 측정을 행하여, TL의 경시적 변화를 측정했다. 면역크로마토 리더로 얻어지는 TL의 발색 강도가 1.0 이상이 된 시간을 측정했다. 여기서 1.0 이상으로 한 이유는, 개인차도 있지만 1.0 이상이 되면 육안으로도 TL의 존재를 확인할 수 있기 때문이다. 이 측정을 5회 행하여, 평균의 시간을 진단 시간으로 했다.
〔면역크로마토 진단 키트의 검출 한계〕
5 mm 폭으로 커트한 면역크로마토 진단 키트를 플라스틱의 하우징에 넣었다. 얻어진 하우징에 들어있는 진단 키트를, 0-10의 11단계의 육안 등급으로 판정했다. 검사 대상 물질에는 인간 융모성 고나도트로핀(이하「hCG」라고 함)을 이용했다. hCG를 1.0 wt%의 BSA를 포함하는 66 mM, PH7.4의 인산 완충액(이하「PBS」라고 함)으로 희석하여, 상기 hCG 농도가 1.600 mIU/㎖, 0.800 mIU/㎖, 0.400 mIU/㎖, 0.200 mIU/㎖, 0.100 mIU/㎖, 0.050 mIU/㎖, 0.025 mIU/㎖, 0.013 mIU/㎖, 0.007 mIU/㎖, 0.0025 mIU/㎖로 단계적으로 옅게 해나간 양성 검체를 조제했다. 이 양성 검체 120.0 ㎕를 진단 키트의 샘플 적하부에 적하하고, 15분 경과 후의 TL의 발색 강도를 육안으로 판정했다. 이 측정을 각 농도에서 5회 행하여, 얻어진 값의 평균치가 1.0 이상인 경우는 양성이라고 판정하고, 1.0 미만인 경우는 검출 한계 이하라고 간주했다. 이 양성 판정이 얻어지는 하한의 hCG 농도를 검출 한계로 했다.
〔실시예 1〕
종래 공지의 방법으로, 셀룰로오스 농도 0.37 wt%, 구리 농도 0.13 wt%, 암모니아 농도 1.00 wt%인 구리 암모니아 셀룰로오스 용액을 조제했다. 또한 테트라히드로푸란 농도 89.00 wt%, 물 농도 11.00 wt%인 응고액을 조제했다.
마그네틱 스터러를 이용하여 응고액 5000 g을 천천히 교반하면서, 조제해 둔 구리 암모니아 셀룰로오스 용액 500 g을 첨가했다. 5초 정도 교반을 계속한 후, 10 wt%의 황산 1000 g을 첨가하여 중화, 재생을 행하고, 셀룰로오스 미립자를 함유한 슬러리 6500 g을 얻었다.
얻어진 슬러리를 10000 rpm의 속도로 10분간 원심 분리했다. 침전물을 디켄테이션에 의해 추출하고, 탈이온수를 주입하여 교반하고, 다시 원심 분리했다. pH가 6.0∼7.0이 될 때까지 이 조작을 수회 반복하고, 그 후, 고압 호모게나이저에 의한 분산 처리를 행하여, 셀룰로오스 미립자 분산액 150 g을 얻었다. 얻어진 셀룰로오스 미립자의 평균 입경을 측정한 결과, 261 ㎚였다.
다음으로, 상기와 같이 하여 조제한 셀룰로오스 미립자의 염색을 행했다. 미립자 농도를 1.00 wt%로 조정한 셀룰로오스 미립자 분산체 100 g에 대하여, 황산나트륨 30 g, 반응성 염료(다이스타 가부시키가시야 제조 Levafix Red CA GR.(등록상표)) 1.00 g을 첨가하여 교반시키면서 항온조를 이용하여 60℃까지 승온했다. 60℃로 승온 후에 탄산나트륨 4 g을 첨가하고, 2시간 염색을 행했다. 얻어진 조착색 미립자를 수산화나트륨 5% 수용액으로 세정하고, 원심 분리로 회수, 순수로 수세한 후 원심 분리로 회수한다는 일련의 조작을 1사이클로 하고, 동일한 조작을 계 3사이클까지 실시하여, 착색 셀룰로오스 미립자를 얻었다.
다음으로, 상기와 같이 하여 조제한 착색 셀룰로오스 미립자의 표면 친수화 반응을 행했다. 10.0 wt%로 조정한 착색 셀룰로오스 미립자 분산액 10.0 ㎖에 대하여, 친수화제로서 N-2-(아미노에틸)-3-아미노프로필트리메톡시실란(도쿄가세이사 제조, A0774) 10.0 ㎖, N,N-디메틸포름아미드(도쿄가세이사 제조, D0939) 50.0 ㎖를 첨가하고, 교반시키면서 항온조를 이용하여 50℃까지 승온하고, 4시간 반응시켰다. 반응 후, 원심 분리로 회수, 순수로 수세한 후 원심 분리로 회수했다. pH가 11.00 이하가 될 때까지 상기 수세를 반복하고, 친수화 착색 셀룰로오스 미립자 분산액을 얻었다. 친수화도 등의 입자 물성을 이하의 표 1에 나타낸다.
다음으로, 상기와 같이 하여 조제한 친수화 착색 셀룰로오스 미립자로의 카르복실기 도입 반응을 행했다. 5.0 wt%로 조정한 친수화 착색 셀룰로오스 미립자 분산액 10.0 ㎖에 대하여, 반응제로서 6-브로모헥산산(도쿄가세이사 제조, B1290) 6.0 g, N,N-디메틸포름아미드(도쿄가세이사 제조, D0939) 50.0 ㎖, 염기로서 탄산나트륨(키시다가가꾸사 제조, 000-71245) 0.1 g을 첨가하고, 교반시키면서 항온조를 이용하여 50℃까지 승온하여, 6시간 반응시켰다. 반응 후, 원심 분리로 회수, 2-프로판올(도쿄가세이사 제조, I0277)로 3회 원심 분리에 의한 세정 후, 순수로 3회 원심 분리에 의한 세정을 행하고, 카르복실기 도입 표면 친수화 착색 셀룰로오스 미립자를 얻었다. 얻어진 미립자는 카르복시산나트륨형이기 때문에, 0.1M HCl 용액(와코쥰야쿠사 제조, 083-01115) 15.0 ㎖, 순수 35.0 ㎖ 첨가하고, 실온에서 2시간 반응시켰다. 그 후, 원심 분리로 회수, 순수로 수세한 후 원심 분리로 회수했다. pH가 4.0 이상이 될 때까지 수세를 실시하고, 카르복실기 도입 친수화 착색 셀룰로오스 미립자 분산액을 얻었다. 카르복실기의 도입량 등의 물성, 및 이 미립자를 발색 입자로서 사용했을 때의 면역크로마토 성능을 이하의 표 1에 나타낸다. 친수층과 스페이서의 효과에 의해, 단백질의 흡착을 대폭으로 저감할 수 있었다. 그 결과, 위양성 발생률이 0%가 되었다. 검출 감도에 관해서는, 카르복실기량이 많은 것으로, 미립자 표면에 항체가 충분량 고정되었기 때문에, 높은 검출 감도를 유지했다. 또한, 친수층의 영향으로 미립자가 멤브레인에 흡착하는 일없이 신속하게 이동할 수 있었기 때문에, 진단 시간을 단축할 수 있었다.
〔실시예 2〕
카르복실기 도입 반응에 있어서, 탄산나트륨의 양을 9.9 g으로 변경한 것 이외에는, 실시예 1과 동일한 방법으로 카르복실기 도입 친수화 착색 셀룰로오스 미립자를 제작했다. 이 미립자의 물성, 및 발색 입자로서 사용했을 때의 면역크로마토 성능을 이하의 표 1에 나타낸다. 실시예 1과 동일하게, 친수층에 의한 친수화, 소수성의 스페이서 및 카르복실기가 다량으로 도입된 것으로, 단백질의 흡착을 대폭으로 저감할 수 있었다. 그 결과, 위양성 발생률이 0%가 되었다. 검출 감도에 관해서는, 카르복실기량이 많은 것으로, 미립자 표면에 항체가 충분량 고정되었기 때문에, 높은 검출 감도를 유지했다. 또한, 친수층의 영향으로 미립자가 멤브레인에 흡착하는 일없이 신속하게 이동할 수 있기 때문에, 진단 시간을 단축할 수 있었다.
〔실시예 3〕
카르복실기 도입 반응에 있어서, 탄산나트륨의 양을 29.7 g으로 변경한 것 이외에는, 실시예 1과 동일한 방법으로 카르복실기 도입 친수화 착색 셀룰로오스 미립자를 제작했다. 이 미립자의 물성, 및 발색 입자로서 사용했을 때의 면역크로마토 성능을 이하의 표 1에 나타낸다. 실시예 1과 동일하게, 친수층에 의한 친수화, 소수성의 스페이서 및 카르복실기가 다량으로 도입된 것으로, 단백질의 흡착을 대폭으로 저감할 수 있었다. 그 결과, 위양성 발생률이 0%가 되었다. 검출 감도에 관해서는, 카르복실기량이 많은 것으로, 미립자 표면에 항체가 충분량 고정되었기 때문에, 높은 검출 감도를 유지했다. 또한, 친수층의 영향으로 미립자가 멤브레인에 흡착하는 일없이 신속하게 이동할 수 있기 때문에, 진단 시간을 단축할 수 있었다.
〔실시예 4〕
염색 반응을 5사이클, 카르복실기 도입 반응에 있어서, 탄산나트륨의 양을 9.9 g으로 변경한 것 이외에는, 실시예 1과 동일한 방법으로 카르복실기 도입 친수화 착색 셀룰로오스 미립자를 제작했다. 이 미립자의 물성, 및 발색 입자로서 사용했을 때의 면역크로마토 성능을 이하의 표 1에 나타낸다. 실시예 1과 동일하게, 친수층에 의한 친수화, 소수성의 스페이서 및 카르복실기가 다량으로 도입된 것으로, 단백질의 흡착을 대폭으로 저감할 수 있었다. 그 결과, 위양성 발생률이 0%가 되었다. 검출 감도에 관해서는, 카르복실기량이 많은 것으로, 미립자 표면에 항체가 충분량 고정되었기 때문에, 높은 검출 감도를 유지했다. 또한, 친수층의 영향으로 미립자가 멤브레인에 흡착하는 일없이 신속하게 이동할 수 있기 때문에, 진단 시간을 단축할 수 있었다.
〔실시예 5〕
카르복실기 도입 반응에 있어서, 반응제를 11-브로모운데칸산(도쿄가세이사제조, B0389) 7.2 g, 탄산나트륨의 양을 9.9 g으로 변경한 조건으로 변경한 것 이외에는, 실시예 1과 동일한 방법으로 카르복실기 도입 친수화 착색 셀룰로오스 미립자를 제작했다. 이 미립자의 물성, 및 발색 입자로서 사용했을 때의 면역크로마토 성능을 이하의 표 1에 나타낸다. 실시예 1과 동일하게, 친수층에 의한 친수화, 소수성의 스페이서 및 카르복실기가 다량으로 도입된 것으로, 단백질의 흡착을 대폭으로 저감할 수 있었다. 그 결과, 위양성 발생률이 0%가 되었다. 검출 감도에 관해서는, 카르복실기량이 많은 것으로, 미립자 표면에 항체가 충분량 고정되었기 때문에, 높은 검출 감도를 유지했다. 또한, 친수층의 영향으로 미립자가 멤브레인에 흡착하는 일없이 신속하게 이동할 수 있기 때문에, 진단 시간을 단축할 수 있었다.
〔실시예 6〕
카르복실기 도입 반응에 있어서, 반응제를 에이코산2산(도쿄가세이사 제조, E0320) 10.0 g, 탄산나트륨의 양을 9.9 g으로 변경한 것 이외에는, 실시예 1과 동일한 방법으로 카르복실기 도입 친수화 착색 셀룰로오스 미립자를 제작했다. 이 미립자의 물성, 및 발색 입자로서 사용했을 때의 면역크로마토 성능을 이하의 표 1에 나타낸다. 실시예 1과 동일하게, 친수층에 의한 친수화, 소수성의 스페이서 및 카르복실기가 다량으로 도입된 것으로, 단백질의 흡착을 대폭으로 저감할 수 있었다. 그 결과, 위양성 발생률이 0%가 되었다. 검출 감도에 관해서는, 카르복실기량이 많은 것으로, 미립자 표면에 항체가 충분량 고정되었기 때문에, 높은 검출 감도를 유지했다. 또한, 친수층의 영향으로 미립자가 멤브레인에 흡착하는 일없이 신속하게 이동할 수 있기 때문에, 진단 시간을 단축할 수 있었다.
〔실시예 7〕
카르복실기 도입 반응에 있어서, 반응제를 테레프탈산(도쿄가세이사 제조, T0166) 6.5 g, 탄산나트륨의 양을 9.9 g으로 변경한 것 이외에는, 실시예 1과 동일한 방법으로 카르복실기 도입 친수화 착색 셀룰로오스 미립자를 제작했다. 이 미립자의 물성, 및 발색 입자로서 사용했을 때의 면역크로마토 성능을 이하의 표 1에 나타낸다. 실시예 1과 동일하게, 친수층에 의한 친수화, 소수성의 스페이서 및 카르복실기가 다량으로 도입된 것으로, 단백질의 흡착을 대폭으로 저감할 수 있었다. 그 결과, 위양성 발생률이 0%가 되었다. 검출 감도에 관해서는, 카르복실기량이 많은 것으로, 미립자 표면에 항체가 충분량 고정되었기 때문에, 높은 검출 감도를 유지했다. 또한, 친수층의 영향으로 미립자가 멤브레인에 흡착하는 일없이 신속하게 이동할 수 있기 때문에, 진단 시간을 단축할 수 있었다.
〔실시예 8〕
셀룰로오스 미립자의 응고 반응에 있어서, 응고액을 아세트산에틸(도쿄가세이사 제조, Q0040) 농도 94.0 wt%, 물 농도 6.0 wt%로 변경하고, 카르복실기 도입 반응에 있어서, 탄산나트륨의 양을 9.9 g으로 변경한 것 이외에는 실시예 1과 동일한 방법으로 카르복실기 도입 친수화 착색 셀룰로오스 미립자를 제작했다. 이 미립자의 물성, 및 발색 입자로서 사용했을 때의 면역크로마토 성능을 이하의 표 1에 나타낸다. 실시예 1과 동일하게, 친수층에 의한 친수화, 소수성의 스페이서 및 카르복실기가 다량으로 도입된 것으로, 단백질의 흡착을 대폭으로 저감할 수 있었다. 그 결과, 위양성 발생률이 0%가 되었다. 검출 감도에 관해서는, 카르복실기량이 많은 것으로, 미립자 표면에 항체가 충분량 고정되었기 때문에, 높은 검출 감도를 유지했다. 또한, 친수층의 영향으로 미립자가 멤브레인에 흡착하는 일없이 신속하게 이동할 수 있기 때문에, 진단 시간을 단축할 수 있었다.
〔실시예 9〕
셀룰로오스 미립자의 응고 반응에 있어서, 응고액을 아세톤 농도 27.0 wt%, 물 농도 0.2 wt%, 암모니아 농도 72.8 wt%로 변경하고, 카르복실기 도입 반응에 있어서, 탄산나트륨의 양을 9.90 g으로 변경한 것 이외에는 실시예 1과 동일한 방법으로 카르복실기 도입 친수화 착색 셀룰로오스 미립자를 제작했다. 이 미립자의 물성, 및 발색 입자로서 사용했을 때의 면역크로마토 성능을 이하의 표 1에 나타낸다. 실시예 1과 동일하게, 친수층에 의한 친수화, 소수성의 스페이서 및 카르복실기가 다량으로 도입된 것으로, 단백질의 흡착을 대폭으로 저감할 수 있었다. 그 결과, 위양성 발생률이 0%가 되었다. 검출 감도에 관해서는, 카르복실기량이 많은 것으로, 미립자 표면에 항체가 충분량 고정되었기 때문에, 높은 검출 감도를 유지했다. 또한, 친수층의 영향으로 미립자가 멤브레인에 흡착하는 일없이 신속하게 이동할 수 있기 때문에, 진단 시간을 단축할 수 있었다.
〔실시예 10〕
카르복실기 도입 반응에 있어서, 탄산나트륨의 양을 9.9 g, 반응제를 3-브로모프로피온산(도쿄가세이사 제조, B0645) 4.2 g으로 변경한 것 이외에는, 실시예 1과 동일한 방법으로 카르복실기 도입 친수화 착색 셀룰로오스 미립자를 제작했다. 이 미립자의 물성, 및 발색 입자로서 사용했을 때의 면역크로마토 성능을 이하의 표 1에 나타낸다. 실시예 1과 동일하게, 친수층에 의한 친수화, 소수성의 스페이서 및 카르복실기가 다량으로 도입된 것으로, 단백질의 흡착을 대폭으로 저감할 수 있었다. 그 결과, 위양성 발생률이 0%가 되었다. 검출 감도에 관해서는, 카르복실기량이 많은 것으로, 미립자 표면에 항체가 충분량 고정되었기 때문에, 높은 검출 감도를 유지했다. 또한, 친수층의 영향으로 미립자가 멤브레인에 흡착하는 일없이 신속하게 이동할 수 있기 때문에, 진단 시간을 단축할 수 있었다.
〔실시예 11〕
표면 친수화 반응에 있어서, 친수화제를 N-2-(아미노에틸)-3-아미노프로필트리메톡시실란(도쿄가세이사 제조, A0774) 10.0 ㎖, 및 폴리에틸렌글리콜실란 Mw2000(Creative PEG Works사 제조, PLS-2012) 10.0 ㎖의 혼합체로 변경하고, 카르복실기 도입 반응에 있어서, 반응제를 11-브로모운데칸산 7.2 g으로 변경한 것 이외는, 실시예 1과 동일한 방법으로 카르복실기 도입 친수화 착색 셀룰로오스 미립자를 제작했다. 이 미립자의 물성, 및 발색 입자로서 사용했을 때의 면역크로마토 성능을 이하의 표 1에 나타낸다. 실시예 1과 동일하게, 친수층에 의한 친수화, 소수성의 스페이서 및 카르복실기가 다량으로 도입된 것으로, 단백질의 흡착을 대폭으로 저감할 수 있었다. 그 결과, 위양성 발생률이 0%가 되었다. 검출 감도에 관해서는, 카르복실기량이 많은 것으로, 미립자 표면에 항체가 충분량 고정되었기 때문에, 높은 검출 감도를 유지했다. 또한, 친수층의 영향으로 미립자가 멤브레인에 흡착하는 일없이 신속하게 이동할 수 있기 때문에, 진단 시간을 단축할 수 있었다.
〔실시예 12〕
표면 친수화 반응에 있어서, 친수화제를 아미노-PEG12-프로피온산(시그마알드리치사 제조, JKA12006) 10.0 ㎖, 카르복실기 도입 반응에 있어서, 반응제를 11-브로모운데칸산 7.2 g, 탄산나트륨을 9.9 g으로 변경한 것 이외에는, 실시예 1과 동일한 방법으로 카르복실기 도입 친수화 착색 셀룰로오스 미립자를 제작했다. 이 미립자의 물성, 및 발색 입자로서 사용했을 때의 면역크로마토 성능을 이하의 표 1에 나타낸다. 실시예 1과 동일하게, 친수층에 의한 친수화, 소수성의 스페이서 및 카르복실기가 다량으로 도입된 것으로, 단백질의 흡착을 대폭 저감할 수 있었다. 그 결과, 위양성 발생률이 0%가 되었다. 검출 감도에 관해서는, 카르복실기량이 많은 것으로, 미립자 표면에 항체가 충분량 고정되었기 때문에, 높은 검출 감도를 유지했다. 또한, 친수층의 영향으로 미립자가 멤브레인에 흡착하는 일없이 신속하게 이동할 수 있기 때문에, 진단 시간을 단축할 수 있었다.
〔실시예 13〕
카르복실기 도입 반응에 있어서, 반응제를 Br-(CH2)30-COOH 11.0 g, 탄산나트륨의 양을 9.9 g으로 변경한 것 이외에는, 실시예 1과 동일한 방법으로 카르복실기 도입 친수화 착색 셀룰로오스 미립자를 제작했다. 이 미립자의 물성, 및 발색 입자로서 사용했을 때의 면역크로마토 성능을 이하의 표 1에 나타낸다. 실시예 1과 동일하게, 친수층에 의한 친수화, 소수성의 스페이서 및 카르복실기가 다량으로 도입된 것으로, 단백질의 흡착을 대폭으로 저감할 수 있었다. 그 결과, 위양성 발생률이 0%가 되었다. 검출 감도에 관해서는, 카르복실기량이 많은 것으로, 미립자 표면에 항체가 충분량 고정되었기 때문에, 높은 검출 감도를 유지했다. 또한, 친수층의 영향으로 미립자가 멤브레인에 흡착하는 일없이 신속하게 이동할 수 있기 때문에, 진단 시간을 단축할 수 있었다.
〔실시예 14〕
카르복실기 도입 반응에 있어서, 탄산나트륨량을 0.01 g으로 변경한 것 이외에는, 실시예 1과 동일한 방법으로 카르복실기 도입 친수화 착색 셀룰로오스 미립자를 제작했다. 이 미립자의 물성, 및 발색 입자로서 사용했을 때의 면역크로마토 성능을 이하의 표 1에 나타낸다. 친수층 및 소수성 스페이서의 효과에 의해, 단백질의 흡착량은, 이하의 비교예 1 등과 비교하면 저감할 수 있고, 위양성 저감 효과도 확인되었다.
〔실시예 15〕
카르복실기 도입 반응에 있어서, 반응제를 폴리(에틸렌글리콜)비스(카르복시메틸)에테르 Mw600(Creative PEG Works사 제조, PSB-362) 16.4 g으로 변경한 것 이외에는, 실시예 1과 동일한 방법으로 카르복실기 도입 친수화 착색 셀룰로오스 미립자를 제작했다. 이 미립자의 물성, 및 발색 입자로서 사용했을 때의 면역크로마토 성능을 이하의 표 1에 나타낸다. 단백질의 흡착량은, 이하의 비교예 1 등과 비교하면 약간 저감할 수 있고, 위양성 저감 효과가 있었다.
〔실시예 16〕
표면 친수화 반응에 있어서 친수화제의 양을 40.0 ㎖, 카르복실기 도입 반응에 있어서, 반응제를 11-브로모운데칸산 7.2 g으로 변경한 것 이외에는, 실시예 1과 동일한 방법으로 카르복실기 도입 친수화 착색 셀룰로오스 미립자를 제작했다. 이 미립자의 물성, 및 발색 입자로서 사용했을 때의 면역크로마토 성능을 이하의 표 1에 나타낸다. 친수층 및 소수성 스페이서의 영향으로, 이하의 비교예 1과 비교하면 단백질의 흡착량은 저감할 수 있고, 위양성 저감 효과가 있었다.
〔실시예 17〕
표면 친수화 반응에 있어서, 친수화제의 양을 8.0 ㎖, 카르복실기 도입 반응에 있어서, 반응제를 폴리(에틸렌글리콜)비스(카르복시메틸)에테르 Mw600(Creative PEG Works사 제조, PSB-362) 16.4 g, 탄산나트륨의 양을 0.01 g으로 변경한 것 이외에는, 실시예 1과 동일한 방법으로 카르복실기 도입 친수화 착색 셀룰로오스 미립자를 제작했다. 이 미립자의 물성, 및 발색 입자로서 사용했을 때의 면역크로마토 성능을 이하의 표 1에 나타낸다. 단백질의 흡착량은, 이하의 비교예 1 등과 비교하면 약간 저감할 수 있고, 위양성 저감 효과가 확인되었다.
〔실시예 18〕
표면 친수화 반응에 있어서 친수화제의 양을 40.0 ㎖, 카르복실기 도입 반응에 있어서, 반응제를 폴리(에틸렌글리콜)비스(카르복시메틸)에테르 Mw600(Creative PEG Works사 제조, PSB-362) 16.4 g, 탄산나트륨량을 9.9 g으로 변경한 것 이외에는, 실시예 1과 동일한 방법으로 카르복실기 도입 친수화 착색 셀룰로오스 미립자를 제작했다. 이 미립자의 물성, 및 발색 입자로서 사용했을 때의 면역크로마토 성능을 이하의 표 1에 나타낸다. 단백질의 흡착량은, 이하의 비교예 1과 비교하면 약간 개선되었다. 그 결과, 약간이기는 하지만 위양성 저감 효과도 발견되었다.
〔실시예 19〕
반응제를 11-브로모운데칸산 7.2 g, 탄산나트륨량을 0.01 g으로 변경한 것 이외에는, 실시예 1과 동일한 방법으로 카르복실기 도입 친수화 착색 셀룰로오스 미립자를 제작했다. 이 미립자의 물성, 및 발색 입자로서 사용했을 때의 면역크로마토 성능을 이하의 표 1에 나타낸다. 친수층 및 소수성 스페이서의 효과에 의해, 이하의 비교예 1과 비교하면 단백질의 흡착량은 저감했다. 그 결과, 위양성 저감 효과도 확인되었다.
〔실시예 20〕
카르복실기 도입 반응에 있어서, 반응제를 폴리(에틸렌글리콜)비스(카르복시메틸)에테르 Mw600(Creative PEG Works사 제조, PSB-362) 16.4 g, 탄산나트륨량을 0.01 g으로 변경한 것 이외에는, 실시예 1과 동일한 방법으로 카르복실기 도입 친수화 착색 셀룰로오스 미립자를 제작했다. 이 미립자의 물성, 및 발색 입자로서 사용했을 때의 면역크로마토 성능을 이하의 표 1에 나타낸다. 단백질의 흡착량은, 이하의 비교예 1과 비교하면 약간 개선되었다. 그 결과, 위양성 저감 효과가 확인되었다.
〔실시예 21〕
카르복실기 도입 반응에 있어서, 반응제를 폴리(에틸렌글리콜)비스(카르복시메틸)에테르 Mw5000(Creative PEG Works사 제조, PSB-366) 65.6 g, 탄산나트륨량을 9.9 g으로 변경한 것 이외는, 실시예 1과 동일한 방법으로 카르복실기 도입 친수화 착색 셀룰로오스 미립자를 제작했다. 이 미립자의 물성, 및 발색 입자로서 사용했을 때의 면역크로마토 성능을 이하의 표 1에 나타낸다. 스페이서는 PEG이었지만, 길이가 길기 때문에 배제 체적 효과가 작용하여, 단백질의 흡착량은 0이 되었다. 그 결과, 위양성 저감 효과가 있었다.
실시예 1∼21에서 제작한 미립자에 대해서는 친수층이 보호층으로서 기능했기 때문인지 항체를 결합시키기 전의 단계에서의 미립자의 발색 강도는, 반응 활성기의 도입에 의해서도 저하되지 않았다.
〔비교예 1〕
표면 친수화 반응과 카르복실기 도입 반응을 행하지 않는 것 이외는, 실시예 1과 동일한 방법으로 착색 셀룰로오스 미립자를 제작했다. 이 미립자의 물성, 및 발색 입자로서 사용했을 때의 면역크로마토 성능을 이하의 표 2에 나타낸다. 미립자 표면은 소수적이기 때문에, 미립자 표면에 단백질이 다량으로 흡착하기 쉬었다고 생각된다. 그 결과, 비특이 흡착이 발생하고 위양성 발생률은 3%였다.
〔비교예 2〕
특허문헌 4에 기재된 방법으로 스페이서가 (CH2)16인 카르복실기 도입 착색 셀룰로오스 미립자를 제작했다. 이 미립자의 물성, 및 발색 입자로서 사용했을 때의 면역크로마토 성능을 이하의 표 2에 나타낸다. 특허문헌 4와는 항체의 사용량이 상이하기 때문에, 특허문헌 4보다 감도가 비약적으로 향상되었지만, 미립자 표면은 소수적이기 때문에, 미립자 표면에 단백질이 다량으로 흡착했기 때문에, 비특이 흡착이 발생하고 위양성 발생률은 3%였다.
〔비교예 3〕
표면 친수화를 행하지 않는 것 이외에는, 실시예 1과 동일한 방법으로 카르복실기 도입 착색 셀룰로오스 미립자를 제작했다. 이 미립자의 물성, 및 발색 입자로서 사용했을 때의 면역크로마토 성능을 이하의 표 2에 나타낸다. 카르복실기가 약간 다량으로 도입되었기 때문인지, 단백질의 흡착량이 비교예 1 또는 2와 비교하면 약간 개선되었다. 그러나, 친수층이 존재하지 않기 때문에, 친수화도가 낮고, 단백질이 흡착해버려, 위양성의 저감 효과는 거의 없었다.
〔비교예 4〕
표면 친수화를 행하지 않고, 특허문헌 4에 기재된 방법으로 미립자 표면에 아미노기를 도입했다. 그 후, 실시예 1과 동일한 방법으로 카르복실기 도입 착색 셀룰로오스 미립자를 제작했다. 이 미립자의 물성, 및 발색 입자로서 사용했을 때의 면역크로마토 성능을 이하의 표 2에 나타낸다. 잔존 반응성 아미노기량이 많고 친수층도 존재하지 않기 때문에, 단백질의 흡착량 저감 효과는 보이지 않았다. 그 결과, 위양성 저감 효과도 확인되지 않았다.
〔비교예 5〕
표면 친수화를 행하지 않고, 카르복실기 도입 반응에 있어서, 반응제를 폴리(에틸렌글리콜)비스(카르복시메틸)에테르 Mw600(Creative PEG Works사 제조, PSB-362) 16.40 g으로 변경한 것 이외에는, 실시예 1과 동일한 방법으로 카르복실기 도입 착색 셀룰로오스 미립자를 제작했다. 이 미립자의 물성, 및 발색 입자로서 사용했을 때의 면역크로마토 성능을 이하의 표 2에 나타낸다. 친수층이 존재하지 않고, 스페이서도 PEG이기 때문에, 미립자 표면과 스페이서가 전기적인 상호 작용으로 흡착해 버리는 것에 더하여, 미립자 표면의 친수성도 충분하지 않기 때문에 단백질이 흡착해버려, 흡착량의 저감 효과는 보이지 않았다. 그 결과, 위양성 저감 효과도 확인되지 않았다.
〔비교예 6〕
표면 친수화는 행하지 않고, 비교예 4와 동일한 방법으로 미립자에 아미노기를 도입했다. 그 후, 카르복실기 도입 반응에 있어서, 반응제에 11-브로모운데칸산, 탄산나트륨의 양을 0.01 g으로 변경한 것 이외에는, 실시예 1과 동일한 방법으로 카르복실기 도입 착색 셀룰로오스 미립자를 제작했다. 이 미립자의 물성, 및 발색 입자로서 사용했을 때의 면역크로마토 성능을 이하의 표 2에 나타낸다. 친수층이 존재하지 않고, 잔존 반응성 아미노기량이 많기 때문에, 미립자 표면의 친수성이 충분하지 않고 단백질의 흡착 저감 효과는 보이지 않았다. 그 결과, 위양성 저감 효과도 발견되지 않았다.
〔비교예 7〕
표면 친수화를 행하지 않고, 비교예 4와 동일한 방법으로 미립자에 아미노기를 도입했다. 그 후, 카르복실기 도입 반응에 있어서, 반응제를 폴리(에틸렌글리콜)비스(카르복시메틸)에테르 Mw600(Creative PEG Works사 제조, PSB-362) 16.4 g으로 변경한 것 이외에는, 실시예 1과 동일한 방법으로 카르복실기 도입 착색 셀룰로오스 미립자를 제작했다. 이 미립자의 물성, 및 발색 입자로서 사용했을 때의 면역크로마토 성능을 이하의 표 2에 나타낸다. 친수층이 존재하지 않고, 잔존 반응성 아미노기량이 많기 때문에, 미립자 표면의 친수성이 충분하지 않고, 스페이서도 PEG이기 때문에, 단백질의 흡착 저감 효과는 보이지 않았다. 그 결과, 위양성 저감 효과도 발견되지 않았다.
〔비교예 8〕
표면 친수화를 행하지 않고, 비교예 4와 동일한 방법으로 미립자에 아미노기를 도입했다. 그 후, 카르복실기 도입 반응에 있어서, 반응제를 폴리(에틸렌글리콜)비스(카르복시메틸)에테르 Mw600(Creative PEG Works사 제조, PSB-362) 16.4 g, 탄산나트륨량을 0.01 g으로 변경한 것 이외에는, 실시예 1과 동일한 방법으로 카르복실기 도입 착색 셀룰로오스 미립자를 제작했다. 이 미립자의 물성, 및 발색 입자로서 사용했을 때의 면역크로마토 성능을 이하의 표 2에 나타낸다. 친수층이 존재하지 않고, 잔존 반응성 아미노기량이 많기 때문에, 미립자 표면의 친수성이 충분하지 않고, 스페이서도 PEG이기 때문에, 단백질의 흡착 저감 효과는 보이지 않았다. 그 결과, 위양성 저감 효과도 확인되지 않았다.
〔비교예 9〕
염색 반응을 1사이클로 한 것 이외에는, 실시예 1과 동일한 방법으로 카르복실기 도입 친수화 착색 셀룰로오스 미립자를 제작했다. 이 미립자의 물성, 및 발색 입자로서 사용했을 때의 면역크로마토 성능을 이하의 표 2에 나타낸다. 발색 강도가 낮기 때문에, 실시예보다 검출 감도는 뒤떨어지고, 그것에 수반하여 진단 시간도 길어져 버렸다.
〔비교예 10〕
응고액을 디메틸술폭시드(도쿄가세이사 제조, D0798) 50.00 wt%, 물 50.00 wt%로 변경한 것 이외에는, 실시예 1과 동일한 방법으로 카르복실기 도입 친수화 착색 셀룰로오스 미립자를 제작했다. 이 미립자의 물성, 및 발색 입자로서 사용했을 때의 면역크로마토 성능을 이하의 표 2에 나타낸다. 입자 직경이 작기 때문에, 실시예보다 검출 감도는 뒤떨어지고, 그것에 수반하여 진단 시간도 길어져 버렸다.
〔비교예 11〕
표면 친수화 반응에 있어서 친수화제의 양을 1.0 ㎖로 변경한 것 이외에는, 실시예 1과 동일한 방법으로 카르복실기 도입 친수화 착색 셀룰로오스 미립자를 제작했다. 이 미립자의 물성, 및 발색 입자로서 사용했을 때의 면역크로마토 성능을 이하의 표 2에 나타낸다. 친수층이 지나치게 적기 때문에, 카르복실기 도입 반응시에 미립자의 발색 강도가 현저히 저하되어 버렸다.
〔비교예 12〕
셀룰로오스 미립자의 응고 반응에 있어서, 응고액을 테트라히드로푸란 농도97.0 wt%, 물 농도 3.0 wt%로 변경하고, 카르복실기 도입 반응에 있어서, 탄산나트륨의 양을 9.9 g, 반응제를 11-브로모운데칸산 7.2 g으로 변경한 것 이외에는 실시예 1과 동일한 방법으로 카르복실기 도입 친수화 착색 셀룰로오스 미립자를 제작했다. 이 미립자의 물성, 및 발색 입자로서 사용했을 때의 면역크로마토 성능을 이하의 표 2에 나타낸다. 미립자의 입경이 지나치게 크기 때문에, 멤브레인 안을 전개할 수 없었다.
〔비교예 13〕
입경이 50 ㎚이고 그리고 카르복실기가 도입된 카르복실기 수식 금나노 입자2000 Da PEG 린커(CTD 사 제조)를 발색 입자로서 사용하고, 면역크로마토 성능을 평가했다. 결과를 이하의 표 2에 나타낸다. 미립자 표면이 소수적이기 때문에, 멤브레인 안을 이동할 때에 시간이 걸리고 발색 시간은 느렸다. 또한, 미립자 표면이 소수적이기 때문에, 단백질도 미립자 표면에 흡착하기 쉽고, 위양성도 발생하기 쉬웠다.
〔비교예 14〕
입경이 470 ㎚, 발색 강도가 0.5이고 그리고 카르복실기가 도입된 라텍스 입자(Bangs사 제조)를 발색 입자로서 사용하고, 면역크로마토 성능을 평가했다. 결과를 이하의 표 2에 나타낸다. 미립자 표면이 소수적이기 때문에, 단백질도 미립자 표면에 흡착하기 쉽고, 위양성도 발생하기 쉬웠다.
〔비교예 15〕
실시예 1과 동일한 방법으로, 친수화 착색 셀룰로오스 미립자를 제작했다. 그 후 카르복실기 도입 반응은 행하지 않고, 그대로 발색 입자로서 사용했다. 입자물성과 면역크로마토 성능을 표 2에 나타낸다. 입자가 친수성에도 불구하고, 항체와의 결합 부위가 존재하지 않기 때문에, 항체가 입자상에 담지할 수 없었기 때문에 감도가 매우 낮은 것으로 되었다.
Figure pct00001
Figure pct00002
산업상의 이용가능성
본 발명에 따른 친수화 착색 셀룰로오스 미립자는, 높은 검출 감도를 유지하면서, 신속한 진단도 가능하고, 위양성의 발생 리스크가 놀라울 정도로 저감된 면역크로마토 진단 키트의 발색 입자로서 적합하게 이용 가능하다.

Claims (6)

  1. 평균 입자 직경이 60∼900 ㎚이고, 발색 강도가 1.0∼10.0이며, 미립자 표면에 친수층을 갖고, 또한, 스페이서를 개재하여 카르복실기가 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 착색 셀룰로오스 미립자.
  2. 제1항에 있어서, 상기 카르복실기의 도입량이, 상기 착색 셀룰로오스 미립자 1 g당 0.20∼3.00 mmol인, 착색 셀룰로오스 미립자.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 친수층이 실란층, 폴리에틸렌글리콜층(PEG), 또는 실란층과 폴리에틸렌글리콜(PEG)층의 혼합층의 어느 하나인, 착색 셀룰로오스 미립자.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 스페이서가 탄화수소계의 구조체인, 착색 셀룰로오스 미립자.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 기재된 착색 셀룰로오스 미립자의 상기 카르복실기에 리간드가 공유 결합되어 있는 구조체.
  6. 제5항에 기재된 구조체를 포함하는 면역크로마토 진단 키트.
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