WO2019059182A1 - 有機着色微粒子、診断薬キット、及びインビトロ診断方法 - Google Patents

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cellulose
particle
colored
fine particles
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厚志 堀井
祥之 塩見
信之 美村
謙 村岡
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旭化成株式会社
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    • G01N33/585—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with a particulate label, e.g. coloured latex

Definitions

  • the present invention relates to organic colored microparticles derived from organic polymers, and a diagnostic agent kit and in vitro diagnostic method using the same.
  • the immunochromatographic assay method is very simple because it requires no special equipment, equipment, knowledge, is simple and inexpensive to operate, and a large number of tests are performed because of its ability to make a quick diagnosis.
  • pregnancy test drugs and the like are marketed at general pharmacies and can be measured by general consumers, and it is also possible to perform not only qualitative tests to check the presence or absence of substances to be tested but also quantitative tests to measure the amount. ing.
  • a sandwich method As a measurement principle of the immunochromatographic measurement method, there is a method called a sandwich method and a method called a competition method. Further, as a measurement format, there is a method called flow-through type or lateral flow type.
  • a typical example is a measurement of detecting an antigen by a sandwich method, and the following operations are sequentially performed. However, it is not limited to this operation.
  • An antibody that specifically binds to an antigen to be tested is immobilized on a predetermined site of a chromatographic medium such as a nitrocellulose membrane, and a test line (hereinafter referred to as “TL”) is placed at an arbitrary position on the chromatographic medium.
  • TL test line
  • a detection reagent in which a ligand (for example, an antibody) that specifically binds to a substance to be tested is supported on a labeling substance such as an enzyme, chromogenic particle, fluorescent chromogenic particle, magnetic particle, etc.
  • the detection reagent is applied and dried to form a detection reagent-containing portion, and combined with the chromatograph medium to form an immunochromatographic diagnostic kit.
  • ligand as used herein specifically binds to a substance to be tested, and examples thereof include antibodies, antigens, organic molecules and proteins.
  • Analytical sensitivity is an important factor because it improves the sensitivity of analysis and enables quick diagnosis.
  • the inventors of the present invention report in Patent Document 3 below that analysis sensitivity can be improved by using cellulose particles having a large color and a large particle size as colored particles capable of physically adsorbing an antibody. .
  • the background is a phenomenon that occurs when the coloring matter particles are clogged in the pores of the nitrocellulose membrane or nonspecifically adsorbed, whereby the nitrocellulose membrane is colored.
  • the background is poor, the contrast between the nitrocellulose membrane and the TL is deteriorated, and it becomes difficult to see the colored line of the TL, which makes it difficult to judge at the medical site.
  • the background is bad, it will be difficult to judge a negative TL (ie, no color development). These phenomena can cause misdiagnosis.
  • Patent Document 3 makes no mention of such background problems.
  • Patent No. 4514233 gazette JP 2004-184295 A International Publication No. 2011/062157
  • the problem to be solved by the present invention is to provide organic colored fine particles for an immunochromatographic diagnostic kit having a sufficient detection sensitivity and a good background and reproducibility of test results. .
  • organic colored fine particles in which the sphericity of the organic colored particles and the amount of coarse particles having a particle diameter of 700 nm or more are precisely controlled. It can be developed without clogging in the nitrocellulose membrane, which is a gram medium, and as a result, immunochromatography using such organic colored fine particles as coloring particles is expected to have high detection sensitivity and excellent reproducibility of test results. It finds out outside and came to complete the present invention.
  • the present invention is as follows.
  • the average particle diameter is 100 to 650 nm
  • the coloring intensity is 1.0 to 10.0
  • a total number of particles of 100,000 in the particle diameter range of 400 nm to 12000 nm is detected.
  • Organic colored fine particles characterized in that the abundance ratio of coarse particles is 5% or less and the sphericity represented by major axis (L) / short axis (D) is 1.0 to 2.5.
  • the organic colored fine particles according to the above [1] wherein 10 to 90% by weight of the weight of the organic colored fine particles is a coloring component.
  • Immunochromatography using the organic colored fine particles of the present invention as coloring particles has a good background and reproducibility of test results, and has sufficient detection sensitivity.
  • the present invention by controlling the sphericity of the organic colored fine particles and the coarse particles having a particle diameter of 700 nm or more in a precise manner, high detection sensitivity is maintained, the background is good, and the reproducibility of the test results is excellent.
  • the invention is an invention completed based on this.
  • Patent Document 3 discloses that detection sensitivity is improved by using organic colored fine particles having a large particle diameter and a dark color as colored particles for immunochromatography.
  • the sensitivity may also be lowered.
  • the present inventors develop without coloring in the nitrocellulose membrane, if the shape of the particles is closer to a true sphere and coarse particles which are easily clogged in the pores of the nitrocellulose membrane can be reduced, in other words, I thought that the background would be good.
  • the particles dyed with a reactive dye having a pyrimidine structure or a triazine structure have a particle shape closer to a true sphere, and It has been found that coarse particles having a particle diameter of 700 nm or more can be reduced.
  • the contrast with TL is also improved and it is easy to judge the presence or absence of coloring.
  • the reproducibility is also improved.
  • the detection sensitivity for the reduction of coarse particles is improved, and the test reproducibility is also significantly improved.
  • FIG. 2 is a cross-sectional view of a lateral flow immunochromatography diagnostic kit according to an embodiment of the present invention. It is explanatory drawing of how to obtain
  • 5 is an electron microscope image of the colored cellulose fine particles obtained in Example 1.
  • the organic colored fine particles according to this embodiment had an average particle diameter of 100 to 650 nm, a coloring intensity of 1.0 to 10.0, and detected a total number of 100,000 particles in the particle diameter range of 400 nm to 12000 nm.
  • the abundance ratio of coarse particles having a particle diameter of 700 nm or more is 5% or less, and the sphericity represented by long diameter (L) / short diameter (D) is 1.0 to 2.5, It features.
  • the “organic colored particles” in the present embodiment refers to particulate matter which is insoluble in water, buffer solution and the like and on which a dye, a dye and the like are carried.
  • the material constituting the particles is not particularly limited, but as such organic colored fine particles, for example, colored latex particles obtained by coloring a styrene latex such as polystyrene latex or acrylic latex, etc., and silicon atoms and oxygen atoms 3
  • examples include colored silica particles obtained by coloring silica composed of a dimensional structure, and colored particles obtained by forming colored components such as colored cellulose particles obtained by coloring cellulose directly into particles.
  • the organic colored fine particles may be fluorescent particles.
  • Colored cellulose particles are preferred from the viewpoint of ease of adjustment of particle characteristics such as adjustment of particle diameter, adjustment of color density, adjustment of color type, and adjustment of particle surface state. Since cellulose has a large amount of hydroxyl groups, it has high hydrophilicity and excellent dispersion stability, and can contain a large amount of coloring components.
  • the "method of producing organic colored particles” is not particularly limited. Method of forming organic particles first and supporting colored components such as dyes and dyes, method of forming particles and supporting smaller colored particles such as metal colloids and pigments, forming particles when forming dyes, dyes, pigments, metals
  • molding etc. is mentioned. Among them, particles are first shaped to facilitate adjustment of particle characteristics such as adjustment of particle diameter, adjustment of color density, adjustment of color type, adjustment of particle surface condition, etc., and coloring components such as dyes and dyes.
  • the method of supporting is preferred. Moreover, as a coloring component to be supported, a dye is preferable from the easiness of supporting.
  • a dye When a dye is used as a coloring component, reactive dyes are preferred. When dyes such as direct dyes, metal-containing dyes, acid dyes, basic dyes, disperse dyes, sulfur dyes, plant dyes, naphthol dyes and fluorescent dyes are used, high coloring intensity can not be obtained, and strong dyeing is possible. There is also a risk of discoloration. However, when a reactive dye is used, dyes such as direct dyes, metal-containing dyes, acid dyes, basic dyes, disperse dyes, sulfur dyes, plant dyes, naphthol dyes, and fluorescent dyes may be used in combination.
  • the reactive dye preferably has a pyrimidine structure or a triazine structure.
  • the reactive dye is not particularly limited as long as it has a pyrimidine structure or a triazine structure, and Sumifix series, Sumifix HF series, Sumifix Supra series (above, registered trademark, manufactured by Sumitomo Chemical Co., Ltd.), Levafix series (registered) Trademarks, manufactured by Dystar, etc. can be suitably used. These reactive dyes can be suitably dyed even when using a high concentration of sodium hydroxide.
  • the entire particle is uniformly dyed by using a high concentration of sodium hydroxide and a reactive dye having a pyrimidine structure or a triazine structure as a reaction site, so that the entire particle is uniformly dyed, and the particle diameter is It becomes uniform and the below-mentioned hydrophilicity is achieved.
  • the “method of forming the cellulose particles” is not particularly limited.
  • the derivatized cellulose may be dissolved and shaped into particles, and the derivatized substituent may be returned to a hydroxyl group to prepare cellulose particles.
  • those forming methods may be combined.
  • type of cellulose is not particularly limited, and regenerated cellulose, purified cellulose, natural cellulose, cellulose derivatized with the above, cellulose in which a derivatized substituent is returned to hydroxyl group, and the like can be used. .
  • a method of once dissolving in a good solvent and forming into particles is preferable, and as a type of cellulose, regenerated cellulose is preferable.
  • type of good solvent for dissolving cellulose is not particularly limited, and copper ammonia solution, viscose solution, N-methylmorpholine, various types Various good solvents capable of dissolving cellulose, such as ionic liquids, can be used. Among them, a copper ammonia solution is preferable in terms of adjustment of particle diameter, adjustment of particle shape and the like. Further, the method of forming the dissolved cellulose into particles is not particularly limited, and in the present embodiment, the method of phase separation was selected.
  • the “average particle diameter” of the organic colored fine particles refers to the volume average median diameter as measured by the dynamic light scattering method, and the volume average median diameter is in the range of 100 to 650 nm.
  • the average particle size is in this range, TL is thicker when used as an immunochromatographic diagnostic kit due to the large surface area of the particles, that is, the analytical sensitivity is increased. If the average particle size is too small, the surface area may be reduced to lower the analytical sensitivity or cause particle aggregation. Therefore, the average particle size is preferably 150 nm or more, more preferably 200 nm or more.
  • the average particle size is preferably 600 nm or less, more preferably 550 nm or less.
  • the average particle diameter described here is an average value to the last, and a part of particle diameter distribution may deviate from the said range.
  • volume average As a reason for using volume average for evaluation of particle size, too large particles are packed in a chromatographic medium such as nitrocellulose in the immunochromatographic diagnostic kit, but even if only a few particles with large volume average are present, the effect is reflected In order to As a method of evaluating the particle diameter, there are various methods such as a number average and an area average other than the volume average, and when the evaluation method is different, the value of the particle diameter will naturally be different.
  • the CV value of the average particle diameter of the organic colored fine particles of the present embodiment is not particularly defined. However, when used as a diagnostic agent, 30% or less is preferable. If the CV value of the average particle size exceeds 30%, the diagnostic accuracy as a diagnostic agent is adversely affected, so it is preferably 25% or less, more preferably 20% or less. In general, the smaller the CV value of the average particle size, the more accurate the diagnosis, but if the CV value is too small, the labor and cost of manufacturing will increase, so 1% or more considering the balance between cost and accuracy Is preferred.
  • the "coloring intensity” is a value that defines the color intensity of particles.
  • the reason for performing visible absorbance measurement using an integrating sphere for the measurement of color intensity of particles is that the color intensity of particles dispersed in liquid can be most accurately measured.
  • a method of measuring the color density of particles there is also a method of measuring a solid obtained by drying particles with a colorimeter or the like, but such a method can not accurately measure the color density of particles.
  • metal colloids and the like differ in color tone and maximum wavelength depending on the particle size, and the dried aggregation state can not accurately reflect the color intensity of the dispersed state in the liquid. Also, even if the particles are dispersed in the liquid at the same particle concentration, the color density will be reduced if aggregation occurs.
  • the reason for using an integrating sphere when performing visible absorbance measurement is to eliminate the influence of scattering of the particles themselves.
  • the usual visible absorbance measurement is a method of measuring transmitted light, and it reflects not only the absorption by the coloring component but also the influence of scattering of the particles themselves to the incident light.
  • gold colloids generally used for immunochromatography may have particle sizes of 40 nm to 60 nm, and sometimes 100 nm, but they are hardly affected by scattered light because they have small particle sizes.
  • polystyrene latex particles have a large particle size and are clearly affected by scattered light.
  • the “coloring intensity” of the organic colored fine particles of the present embodiment is 1.0 to 10.0.
  • the larger the value the better, using a dye of greater color, increasing the number of times of dyeing, linking through some compounds as a spacer, increasing the amorphous area of the particle and making it easier for the dye to enter, making the particle porous.
  • the upper limit is preferably 7.0 or less, more preferably 5.0 or less.
  • the lower the value, the lower the analytical sensitivity when used as an immunochromatographic diagnostic kit so the lower limit is preferably 1.5 or more, more preferably 2.0 or more.
  • the “sphericity” of the organic colored fine particles of the present embodiment is a value represented by the major axis (L) / minor axis (D) of the particle, and the lengths of the major axis (L) and the minor axis (D) are
  • the near shape is a structure close to a sphere.
  • the “sphericity” (that is, the L / D ratio represented by L ⁇ D) of the organic colored fine particles of the present embodiment is 1.0 to 2.5. If the sphericity is out of this range, the shape of the colored particles will be distorted, and the particles will get stuck when passing through the pores of the nitrocellulose membrane, thereby deteriorating the background.
  • the sphericity is more preferably 1.0 to 2.2, still more preferably 1.0 to 2.0, and most preferably 1.0 to 1.5.
  • an electron microscope image of the particle is taken, the major axis (L) and the minor axis (D) of 100 particles are measured, and the average value of the 100 particles is calculated.
  • the abundance ratio of coarse particles having a particle diameter of 700 nm or more is 5% or less.
  • coarse particles refers to particles having a particle diameter of 700 nm or more among particles having a constant distribution.
  • the abundance ratio of the coarse particles exceeds 5%, the background is significantly deteriorated, and as a result, the contrast with the TL is deteriorated, which may lead to misdiagnosis.
  • the abundance ratio of coarse particles is preferably 4.5% or less, more preferably 4.0% or less.
  • Patent Document 3 refers to% CV, which is a value calculated by observing the state of brown motion of particles as fluctuation of scattered light intensity by a dynamic light scattering equation. In other words, the average value of the particle size distribution is measured.
  • the ratio of coarse particles at this time is measured by Coulter counter type. This measures the change in electrical resistance between the electrodes as the particles pass through the pores, ie Coulter counter equation allows direct calculation of the actual particle size.
  • the inventors of the present invention evaluated by the Coulter counter equation and found that even particles having a seemingly narrow distribution (small CV) have a ratio of coarse particles exceeding 5% depending on the particles.
  • the dynamic light scattering type apparatus used in Patent Document 3 could not accurately measure the distribution bias, so in the present embodiment, the coarse particles were measured using a Coulter counter type apparatus.
  • the "proportion of the coloring component of the organic colored fine particles” refers to the proportion of the coloring component in the total weight of the organic colored fine particles.
  • the ratio of the coloring component is 80% by weight.
  • the proportion of the coloring component of the organic colored fine particles is preferably 10 to 90% by weight. Within this range, the analytical sensitivity is high when used as an immunochromatographic diagnostic kit.
  • bonded specifically with a to-be-detected thing may also increase by increasing the ratio of a coloring component.
  • the lower limit of the ratio of the coloring component of the organic colored fine particles is preferably 20% by weight or more, and more preferably 30% by weight or more. There is no particular problem even if the proportion of the coloring component exceeds 90% by weight, but from the economical point of view it is preferably 85% by weight or less, more preferably 80% by weight or less.
  • the “method of calculating the ratio of the coloring component of the organic colored fine particles” can be calculated from the weight change before and after coloring.
  • the coloring component can be separated from the particles to isolate and calculate the coloring component or the particles.
  • the cellulose particles are dyed with a reactive dye
  • it can be calculated by cleaving the covalent bond of the cellulose and the dye with an acid or an alkali and recovering the cellulose particles by centrifugation.
  • it can be calculated by decomposing only cellulose using cellulase.
  • the proportion of the cellulose-derived component of the organic colored fine particles is preferably 90 to 10% by weight. Within this range, the dispersion stability of the cellulose particles can be maintained. Further, the lower limit of the cellulose-derived component of the organic colored fine particles is more preferably 15% by weight or more, particularly preferably 20% by weight or more, and the upper limit is 80% by weight or less because of the reason described in the ratio of the coloring component. Preferably, it is 70% by weight or less.
  • hydrophilicity was measured as an index indicating the degree of hydrophobic hydrophilicity of the organic colored fine particles of the present embodiment.
  • hydrophilicity is an index indicating the wettability of the surface of the fine particle, ie, the affinity to water.
  • the hydrophilicity of the organic colored fine particles of the present embodiment is preferably in the range of 1.0 to 30.0. When the degree of hydrophilicity is in this range, the particle surface is hydrophobic, and the amount of adsorption of proteins, antibodies, etc. on the surface of the organic colored fine particles is increased.
  • the hydrophobicity becomes too strong, and it is adsorbed to the nitrocellulose membrane, resulting in deterioration of the background.
  • the upper limit of the degree of hydrophilicity is more preferably 27.0, and still more preferably 25.0.
  • the lower limit of the degree of hydrophilicity is more preferably 1.5, and still more preferably 2.0.
  • the relative element concentration of the F element on the particle surface calculated by the measurement by X-ray photoelectric spectroscopy (XPS) is preferably 0.1 atomic% or more.
  • XPS X-ray photoelectric spectroscopy
  • the lower limit of the relative element concentration of the F element on the surface of the organic colored fine particles of the present embodiment is preferably 0.2 atomic% or more, more preferably 0.3 atomic% or more.
  • the “immunochromatographic diagnosis kit” containing the organic colored fine particles of the present embodiment as an element is a device for simply detecting the presence or absence of the test target substance in various samples using an antigen-antibody reaction.
  • the types of the diagnostic kit include lateral flow and flow through. The type is not particularly limited as long as it uses colored particles (organic colored fine particles) or a sample pad, but is preferably of the lateral flow type. Further, among the lateral flow type, there are a dipstick type and a cassette type, but the type is not particularly limited.
  • the configuration of the diagnostic kit is not particularly limited, and any configuration generally used in the relevant field may be used.
  • the types of members other than the conjugate pad (b) containing the antibody-sensitized colored particles and the sample pad (a) are not particularly limited as long as they are used in the relevant field, and for example, (e) chromatography shown in FIG. Graph media, (f) absorbent pads, and (g) mounts. In addition, some of these members may be omitted as needed.
  • a structure the structure as described in FIG. 1 of patent document 1 is mentioned.
  • FIG. 1 attached to the present specification is merely an example, and the present embodiment is not limited at all.
  • the “sa) in FIG. 1, the “sample pad” is a portion that first receives an analyte to be measured in immunochromatography.
  • Common sample pads include cellulose filter paper, paper, glass fibers, glass fibers, acrylic fibers, nylon fibers, various fabrics, and the like.
  • Various chemicals or non-woven fabrics composed of regenerated cellulose-based fibers can be used so long as they do not adversely affect the above physical properties and do not affect the antigen-antibody reaction or antibody stability for controlling the hydrophilicity / water repellency and water absorption capacity of the sample pad.
  • Powders may be included, or part of the cellulose may be derivatized.
  • the agent to be impregnated include surfactants, proteins, antibodies, resins, water-soluble polymers, antibacterial agents, preservatives, antioxidants, and the like.
  • the sample pad may be pretreated as needed.
  • a buffer solution, a surfactant, a protein, a reagent for trapping contaminants in a sample, an antiseptic agent, an antibacterial agent, an antioxidant, a hygroscopic agent, and the like may be contained in advance.
  • the shape of the sample pad is not particularly limited.
  • the length (flowing length of the liquid) is about 10 to 25 mm in consideration of the bonding property from the sample liquid and the diagnosis time
  • the width perpendicular to the liquid flow
  • the width is too narrow, there is a possibility that the test solution may get around from the end of the sample pad.
  • the “conjugate pad” is a pad containing a conjugate containing colored particles (organic colored microparticles), and for example, contains colored particles bound to an antibody that binds to the substance to be tested.
  • a conjugate pad General glass fiber or resin fiber etc.
  • resin fibers resin fibers of polyolefins such as polyethylene, polyesters, polyamides, acrylics, etc., and composite fibers of these resin fibers can be suitably used, but it is not limited thereto Absent.
  • resin fiber is preferable.
  • the material is a hydrophobic material to a certain extent, from the viewpoint of the ease of release of colored particles. When the hydrophobicity is too high, it may be pretreated with a surfactant or the like. It is more preferred that the polyethylene fiber conjugate pad be pretreated with a surfactant.
  • the “diagnostic method” using the immunochromatographic diagnosis kit of the present embodiment refers to various diagnoses performed using the immunochromatographic diagnostic kit.
  • the diagnostic target is not particularly limited, and can be used for various diagnostic targets such as human, animal, food, plant and other environmental tests.
  • a sample sample is collected from the test target, and if necessary, it is pretreated such as extraction or filtration, dropped on a sample pad, and waited for a predetermined time from the start of the test.
  • the diagnostic result is judged from the coloration that differs depending on the presence or absence.
  • it is not limited to this procedure, but can be used for diagnosis of the same procedure and principle. It is preferable that the extraneous substances and contaminants can be removed by filtering the sample sample in advance, whereby further speeding up of diagnosis and improvement of diagnostic accuracy can be expected.
  • the present embodiment in addition to the method of dropping the sample directly onto the sample pad, it is also possible to drop a sample obtained by diluting the sample to an arbitrary magnification with a sample processing solution previously adjusted to a predetermined composition.
  • a sample processing solution previously adjusted to a predetermined composition.
  • the components include a component that facilitates the flow of colored particles, and a component that appropriately aggregates the colored particles and improves the visibility when captured on a test line.
  • a buffer, surfactant, protein, inorganic salt, water-soluble polymer, reducing agent, chelating agent, etc. may be added.
  • a nonionic surfactant various water-soluble amino acids, proteins, inorganic salts, water-soluble polymers, etc.
  • the type and amount of the specific component vary depending on the test object and the type of antibody used, examples of the nonionic surfactant include poly (oxyethylene) alkyl ether, poly (oxyethylene) octyl phenyl ether, Poly (oxyethylene) nonylphenyl ether etc. are mentioned.
  • water-soluble amino acids examples include asparagine, aspartic acid, alanine, arginine, isoleucine, glycine, glutamine, glutamic acid, cysteine, serine, tyrosine, tryptophan, threonine, valine, histidine, proline, phenylalanine, methionine, lysine, leucine, etc. It can be mentioned.
  • proteins include casein, skimmed milk, casein hydrolysates, bovine serum albumin, fish gelatin and the like.
  • As the inorganic salt a compound that generates an alkali metal ion such as sodium, potassium, lithium and the like is preferable.
  • water-soluble polymer polyethylene glycol, polyvinyl alcohol, polyvinyl pyrrolidone, carboxymethyl cellulose, and other cellulose derivatives are preferable. These components may not only be added to the sample treatment liquid, but may be previously added to a sample pad, a conjugate pad, a chromatograph medium (nitrocellulose membrane) and the like.
  • the target that can be diagnosed with the immunochromatographic diagnostic kit is not particularly limited, but specific examples include the following: cancer markers, hormones, infections, autoimmunity, plasma proteins, TDM, coagulation / fibrinolysis, amino acids , Peptides, proteins, genes, cells, etc.
  • CEA CEA, AFP, ferricyline, ⁇ 2 micro, PSA, CA19-9, CA125, BFP, elastase 1, pepsinogen 1 ⁇ 2, fecal occult blood, urinary ⁇ 2 micro, PIVKA-2, urinary BTA, insulin , E3, HCG, HPL, LH, HCV antigen, HBs antigen, HBs antibody, HBc antibody, HBe antibody, HBe antigen, HBe antibody, HTLV-1 antibody, HIV antibody, HIV antigen, HIV virus gene, toxoplasma antibody, syphilis, ASO, A Influenza A, Influenza A, Influenza B, Influenza B, Rota, Adenovirus Antigens, Rota Adenovirus Antigens, Group A Streptococcus, Group B Streptococcus, Candida Antigens, CD Fungus, Cryptolocus Antigens , Cholera, meningococcal antigen, granulosa Eras , Helico
  • the colored particles need to carry a substance that specifically binds to an object to be detected such as an antibody, but the carrying method is not particularly limited.
  • a substance that specifically binds to an object to be detected such as an antibody
  • the carrying method is not particularly limited.
  • support by physical adsorption, support by covalent bond, support by a combination thereof and the like can be mentioned.
  • the type and amount of the substance to be carried are not particularly limited.
  • Antibodies are the most common and preferred types of substances to be carried.
  • supporting by covalent bond is preferable.
  • the chromatographic medium used for the immunochromatographic diagnostic kit is not particularly limited, and various chromatographic media generally used can be used. More specifically, nitrocellulose membrane can be mentioned. Commercially available nitrocellulose membranes are classified according to the time required to travel a fixed distance, called flow rate, and membranes with earlier flow rates have larger pore sizes. In the present invention, a membrane having a large pore diameter is preferable because the movement of the sample is fast and the coloring particles are not easily clogged. As a specific flow rate, a membrane faster than 180 sec / 4 cm is preferable.
  • the cellulose linter is dissolved in a good solvent of cellulose.
  • a copper ammonia solution prepared by a known method as a good solvent is used.
  • an organic solvent + water + ammonia mixed system is mainly used. While stirring this coagulating solution, coagulation is performed by adding the prepared copper ammonia cellulose solution.
  • the average degree of polymerization (DP) of cellulose in the copper ammonia cellulose solution is adjusted to 50 to 400.
  • the average degree of polymerization is less than 50, it is difficult to form a particle shape and the target sphericity can not be achieved.
  • the lower limit of the average polymerization degree (DP) is preferably 60 or more, more preferably 70 or more from the viewpoint of particle formation. From the viewpoint of coarse particle generation suppression, the upper limit is preferably 350 or less, more preferably 300 or less.
  • the average degree of polymerization of cellulose is the specific viscosity of a dilute cellulose solution in which cellulose fine particles are dissolved in kadoxene, which is measured with an Ubbelohde viscometer, and from the limiting viscosity number [ ⁇ ], reference: Eur. Polym. J., 1 , 1 (1996), which is a value calculated by the following viscosity equation and conversion equation.
  • Viscosity formula: [ ⁇ ] 3.85 ⁇ 10 ⁇ 2 ⁇ M W 0.76
  • Conversion formula: DP M W / 162
  • a reactive dye having a pyrimidine structure or a triazine structure is added to a high concentration aqueous solution of sodium hydroxide added to the obtained slurry of cellulose particles, and the temperature is raised to a predetermined temperature in a thermostat while stirring with a magnetic stirrer. Do. After a predetermined time has elapsed, it is possible to obtain a slurry containing the desired dyed cellulose particles. Since the individual particles can be uniformly dyed by following this process, the particles obtained in Patent Document 3 have irregular contours or jagged surfaces, The particles obtained in this embodiment are greatly improved in irregular contours and surface jaggedness, and the sphericity is significantly improved.
  • the particles can be uniformly dyed with a dye, and the sphericity of the particles is significantly improved, the hydrophilicity can be reduced, and coarse particles can be reduced.
  • the particles can be uniformly dyed and the degree of hydrophilicity is greatly reduced by dyeing a reactive dye having a high reactivity and an alkali resistant dye having a pyrimidine structure or a triazine structure in the presence of a high concentration of sodium hydroxide. It can be done.
  • a dyed cellulose particle dispersion obtained by centrifugation is performed to obtain a dyed cellulose particle dispersion.
  • the cellulose particles in the obtained dyed cellulose particle dispersion may be aggregated in the course of the purification operation, and in this case, dispersion treatment by shearing or the like can be performed.
  • a high pressure homogenizer is used as a means for applying shear. Thereafter, various physical properties of the obtained colored cellulose particles are measured.
  • a dispersion of colored cellulose particles adjusted to a predetermined concentration is prepared, a buffer solution and an antibody are added, stirring is performed for a fixed time while temperature adjustment is performed, and the colored cellulose particles are adsorbed with the antibody. After stirring for a certain period of time, the blocking agent is further added, and the colored cellulose particles are blocked by stirring for a certain period while adjusting the temperature.
  • the blocking referred to herein is an operation of coating a single particle or a particle carrying an antibody or an antigen.
  • various blocking agents can be used according to the composition of the substance to be tested, the sample, or the solution for diluting it. Casein is particularly preferred for blocking colored cellulose particles.
  • casein coats the surface of the antibody and the colored cellulose particles in the colored cellulose particles supporting the antibody.
  • centrifugation is performed to separate the supernatant fluid containing excess antibody and blocking agent from the precipitated particles, and the supernatant fluid is removed by decantation.
  • a liquid such as a buffer solution is added to the precipitated particles, and dispersion treatment is performed by ultrasonic waves as necessary.
  • the washing by a series of operations such as sedimentation by centrifugation, removal of the supernatant, and addition of liquid is performed as many times as necessary to prepare a dispersion containing particles subjected to antibody adsorption and blocking at a predetermined concentration.
  • Proteins, surfactants, and sugars such as sucrose and trehalose are added to the dispersion as required, and the resulting solution is applied in a fixed amount to a polyethylene conjugate pad and dried to adjust the detection reagent-containing portion. If necessary, apply a buffer solution, surfactant, protein, reagent that traps foreign substances in the sample, antiseptic agent, antibacterial agent, antioxidant, hygroscopic agent, etc. to the regenerated cellulose continuous long-fiber non-woven fabric, if necessary. Allow to dry and prepare the sample pad. Further, a chromatography medium made of nitrocellulose porous membrane in which an antibody is immobilized at a predetermined position, and an absorption pad made of cellulose filter paper for absorbing a sample are prepared. They are immobilized on a backing having an adhesion site called a backing sheet and cut into a predetermined size to prepare an immunochromatographic diagnostic kit.
  • Nanotrac particle size distribution measuring device UPA-EX150 dynamic light scattering type manufactured by Nikkiso Co., Ltd. was used. A sample containing 0.01% by weight of colored organic fine particles (coloring particles) and 99.99% by weight of pure water was used as a measurement sample. As measurement conditions, the number of integrations was 30 times, the measurement time per measurement was 30 seconds, and the median particle size was used as the average particle size using the volume average particle size distribution. Moreover, CV value was computed using the standard deviation and the average particle diameter of the particle size distribution obtained by integrating
  • UV visible near infrared spectrophotometer JASCO V-650 optical system: single monochrometer, Zernita mount, double beam system light source made by JASCO Corporation, light source: deuterium lamp (190 to 350 nm), halogen lamp (330 A device with an integrating sphere unit ISV-722 manufactured by the same company was used.
  • the sample to be measured is adjusted to have a concentration of 0.01% by weight of colored particles and 99.99% by weight of pure water using an aqueous dispersion or dried particles of colored particles of any concentration and distilled water as a dispersion medium. I used what I did.
  • Coloring particles are further added to this beaker so that the concentration of coloring particles in the diluted solution of Isoton II-PC is about 5%.
  • the measurement was performed while stirring with a stirrer attached to Multisizer 4.
  • the abundance ratio (X) of coarse particles is calculated from the number (A) of particles having a particle diameter of 700 nm or more when the total number of particles is 100.000 in the range of 400 nm to 12000 nm.
  • Abundance ratio of coarse particles (X) (%) ⁇ Number of particles having a particle diameter of 700 nm or more (A) / 100000 ⁇ ⁇ 100 For example, in the case where 7000 particles having a particle diameter of 700 nm or more exist out of 100,000, it is 7.0%.
  • the degree of hydrophilicity is measured by pulse NMR method.
  • the pulsed NMR method is an analytical method of measuring the time (relaxation time) to return to the ground state after exciting the protons of water molecules by irradiating the fine particle dispersion with radio waves.
  • the relaxation time is short because the water molecules adsorbed on the fine particle surface have limited mobility, and the relaxation time is short because the bulk water molecules (water molecules not adsorbed on the fine particle surface) are less restricted in mobility and can move freely. Is long. Therefore, the relaxation time of the fine particle dispersion obtained by the pulse NMR method changes depending on the ratio of water molecules and bulk water molecules adsorbed on the fine particle surface.
  • a Bruker Minispec mq 20 apparatus is used for measurement of pulse NMR. After stirring the fine particle dispersion with a concentration of 1% (wt / vol), transfer 0.5 mL to a glass NMR tube with an outer diameter of 10 mm, install it in a pulse NMR apparatus set at 30 ° C, and set various parameters as below. Set to and measure.
  • TSA value SA ⁇ V ⁇ ⁇ p ⁇ ⁇ ⁇
  • ⁇ fine particle density (g / cm 3 ) (where, cellulose fine particle density: 1.4 g / g) cm 3 , latex particle density: 1.0 g / cm 3 , gold colloid particle density: 19.3 g / cm 3 )
  • d fine particle diameter ( ⁇ m)
  • V NMR tube volume of the part irradiated with radio waves (cm) 3 ) ( ⁇ sample amount)
  • the numerical values of A particles (TSA value 0.5, Rsp value 10) and B particles (TSA value 1, Rsp value 5) are plotted on a graph, and each approximate straight line is obtained by the least squares method.
  • each approximate straight line is obtained by the least squares method.
  • Y 20x
  • the relative element concentration of the F element on the particle surface of the coloring particle is measured by XPS.
  • the colored particles were placed on a 1.5 mm ⁇ 0.2 mm t dish type sample table, and the XPS measurement was performed under the following conditions.
  • the XPS measurement was performed using Thermo Fisher ESCALAB 250 under the following conditions.
  • Excitation source monochromized A1 K ⁇ 15 kV ⁇ 10 mA Analysis size: about 1 mm (shape is oval) Photoelectron uptake angle: 0 ° (spectrometer axis and sample plane are perpendicular) Capture area Survey scan: 0 to 1,100 eV Narrow Scan: C1s, N1s, S2p, O1s, Na1s, F1s, Si2p, Cl2p Pass Energy Survey Scan: 100 eV Narrow Scan: 20 eV
  • the immunochromatographic diagnostic kit cut to 5 mm width was placed in a plastic housing.
  • the obtained housing-containing diagnostic kit was measured using an immunochromator C10066-10 manufactured by Hamamatsu Photonics.
  • the device settings were made according to the color of the particles used.
  • the substance to be tested is human chorionic gonadotropin (hereinafter referred to as "hCG")
  • hCG is a phosphate buffer solution of 66 mM pH 7.4 containing 1% by weight of bovine serum albumin (hereinafter referred to as "BSA"). It diluted with (following "PBS”.), And hCG concentration prepared the positive sample of 10 mIU / ml.
  • a negative sample was prepared by adjusting 66 mM, pH 7.4 PBS containing 1% by weight BSA. 120 ⁇ l of a negative sample was dropped on the sample dropping portion of the diagnostic kit, and after 15 minutes, the color development intensity of TL was measured by an immunochromato reader. This measurement was performed 5 times, and it was judged that there was no false positive if the average value of the obtained values was 5 mABS or less.
  • 5 mABS is used is that although there are individual differences, the presence of TL can not be confirmed visually if it is less than 5 mABS.
  • the hCG concentration is 3.20 mIU / ml, 1.60 mIU / ml, 0.80 mIU / ml, 0.40 mIU / ml, 0.20 mIU / ml, 0.10 mIU / ml, 0.05 mIU / ml, 0.025 mIU / ml
  • a positive sample was prepared which was gradually diluted. In the same manner as above, 120 ⁇ l was dropped into the sample dropping portion of the diagnostic kit, and the color development intensity of TL after 15 minutes was measured by an immunochromato reader.
  • Example 1 A copper ammonia cellulose solution having a cellulose concentration of 0.37 wt%, a copper concentration of 0.13 wt%, and an ammonia concentration of 1.00 wt% was prepared by a conventionally known method. The resulting copper ammonia cellulose solution was slowly stirred in the presence of air, and the degree of polymerization was adjusted over 12 hours. Furthermore, a coagulating solution having a tetrahydrofuran concentration of 89.00 wt% and a water concentration of 11.00 wt% was prepared. While slowly stirring 5000 g of the coagulating solution using a magnetic stirrer, 500 g of the prepared copper ammonia cellulose solution was added.
  • the cellulose fine particles prepared as described above were stained.
  • 30 g of sodium sulfate and 1.00 g of a reactive dye having a triazine structure (Levafix Red CA GR. (Registered trademark) manufactured by Dystar Co., Ltd.) are added to 100 g of a cellulose fine particle dispersion adjusted to a fine particle concentration of 1.00 wt%
  • the temperature was raised to 60 ° C. using a thermostat while stirring. After raising the temperature to 60 ° C., 10 g of sodium hydroxide was added and staining was performed for 2 hours.
  • the resulting coarsely colored particles are washed with deionized water, collected by centrifugation, and then collected by centrifugation. This series of operations is one cycle, and the same operation is performed up to a total of 5 cycles to obtain colored cellulose particles. Obtained.
  • the fine particles had an average particle size of 352 nm, a CV value of 21%, a coloring intensity of 2.9 ABS, a ratio of colored components of 49%, an sphericity of 1.2, and coarse particles of 1.4%.
  • An electron microscope image of the obtained colored cellulose fine particles is shown in FIG.
  • a blocking solution 100 mM boric acid, pH 8.5
  • casein manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd., 030-01505
  • 10,000 g of centrifugation is performed for 15 minutes using a centrifuge (manufactured by Kubota Corporation, 6200) and a centrifugal separation rotor (manufactured by Kubota Corporation, AF-5008C), and after sedimentation of the sensitized particles, the supernatant is used. Removed.
  • borate buffer 50 mM boric acid, pH 10.0
  • an ultrasonic disperser manufactured by SMT Co., Ltd., UH-50
  • 10,000 g of centrifugation was carried out for 15 minutes to remove the supernatant after settling of the sensitized particles.
  • sucrose sucrose
  • borate buffer 50 mM boric acid, pH 10.0
  • the weight of the dispersion of the sensitized particles is adjusted to 1.58 g using a buffer solution obtained by dissolving it in the solution, and an antibody-sensitized colored cellulose particle dispersion of 0.038% by weight is prepared, and an ultrasonic dispersion machine Processed for 10 seconds.
  • sample pad pre-processing A cellulose sample pad (Millipore, C083) prepared by a known method contains a large excess of 2.0% by weight BSA (Sigma-Aldrich, A7906) and 2.0% by weight Tween-20 It was impregnated with PBS buffer (66 mM, PH 7.4), dried after removing excess solution for 60 minutes at 50 ° C., and cut into a shape of 20 mm high and 300 mm long.
  • BSA Sigma-Aldrich, A7906
  • Tween-20 Tween-20 It was impregnated with PBS buffer (66 mM, PH 7.4), dried after removing excess solution for 60 minutes at 50 ° C., and cut into a shape of 20 mm high and 300 mm long.
  • a nitrocellulose membrane (manufactured by Millipore, SHF0900425) was cut into a shape of 25 mm in height and 300 mm in length.
  • 0.1 ⁇ l / mm PBS solution (66 mM, pH 7.4) containing 0.1 wt% anti-hCG- ⁇ mouse antibody (Medix Biochemica 6601) using a liquid applicator (Musashi Engineering, 300 DS) It apply
  • a PBS solution (66 mM, pH 7.4) containing 0.1% by weight of anti-mouse-rabbit antibody (Daco, Z0259) is applied to a 12 mm high area at a rate of 0.1 ⁇ l / mm, and then Dried at 37 ° C. for 30 minutes.
  • Example 2 to 6 Coloring particles were prepared in the same manner as in Example 1 except that the cellulose fine particles were adjusted to the degree of polymerization described in Table 1 below, and an immunochromatographic diagnosis kit was prepared and its performance was evaluated. The results are shown in Table 1 below.
  • a cellulose fine particle is a reactive dye having a pyrimidine structure (Levafix Rubine CA GR. (Example 7, registered trademark) manufactured by Dystar Co., Ltd., Levafix Navy Blue E-BNA CA GR. Manufactured by Daistar Co., Ltd. (Example 8 registered trademark) ), Except that the dye is stained with Levafix Navy CA GR. (Example 9, registered trademark) manufactured by Dister Co., Ltd., to prepare a colored particle by the same method as Example 1, prepare an immunochromatographic diagnostic kit, The performance was evaluated. The results are shown in Table 1 below.
  • Example 10 to 13 An immunochromatographic diagnosis kit was prepared and its performance was evaluated in the same manner as in Example 1, except that the preparation conditions of cellulose fine particles were adjusted to manufacture colored particles having the particle sizes shown in Table 1 below. The results are shown in Table 1 below.
  • Example 14 to 18 An immunochromatographic diagnostic kit was prepared and its performance was evaluated in the same manner as in Example 1 except that the colored particle of the coloring intensity shown in Table 1 below was prepared by adjusting the production conditions of the colored particle. The results are shown in Table 1 below.
  • Example 19 to 22 An immunochromatographic diagnostic kit was prepared and its performance was evaluated in the same manner as in Example 1 except that the colored particles were mixed to produce colored particles in the ratio of coarse particles described in Table 1 below. The results are shown in Table 1 below.
  • Example 23 An immunochromatographic diagnostic kit was prepared and its performance was evaluated in the same manner as in Example 1 except that the colored particles were mixed to produce colored particles having the CV values and the ratio of coarse particles described in Table 1 below. . The results are shown in Table 1 below.
  • Example 1 was prepared except that cellulose fine particles were adjusted to the degree of polymerization described in Table 2 below, and the concentration of tetrahydrofuran in the coagulating solution was further adjusted to produce colored particles of sphericity described in Table 2 below.
  • An immunochromatographic diagnostic kit was prepared and its performance was evaluated in the same manner as in. The results are shown in Table 2 below.
  • Comparative Example 3 An immunochromatographic diagnostic kit was prepared in the same manner as Example 1, except that the cellulose fine particles were adjusted to the degree of polymerization shown in Table 2 below, and colored particles with sphericity listed in Table 2 below were produced, The performance was evaluated. The results are shown in Table 2 below.
  • Comparative Example 7 An immunochromatographic diagnostic kit was prepared in the same manner as in Example 1 except that staining was performed by adding 12 g of sodium carbonate instead of sodium hydroxide for staining, and its performance was evaluated. The results are shown in Table 2 below.
  • Comparative Example 12 An immunochromatographic diagnosis kit was prepared and its performance was evaluated in the same manner as in Example 1 except that the color-producing particles of the color intensity described in Table 2 below were produced by adjusting the production conditions of the color-producing particles. The results are shown in Table 2 below.
  • Example 13 to 15 An immunochromatographic method was carried out in the same manner as in Example 1, except that the colored particles of Example 20 and Comparative Example 3 were mixed and adjusted at a predetermined ratio to produce colored particles in the amount of coarse particles described in Table 2 below. A diagnostic kit was prepared and its performance was evaluated. The results are shown in Table 2 below.
  • the immunochromatographic diagnosis kit using the organic colored fine particles according to the present invention has good background and reproducibility of test results, and can be suitably used as a diagnostic agent having sufficient detection sensitivity.

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Abstract

良好なバックグラウンド及び検査結果の再現性を有し、十分な検出感度を持つイムノクロマト診断キットに用いる有機着色微粒子の提供。本発明の有機着色微粒子は、平均粒子径が１００～６５０ｎｍであり、発色強度が１．０～１０．０であり、粒子径４００ｎｍ～１２０００ｎｍの範囲で、総個数１０００００個の粒子を検知したとき、粒子径７００ｎｍ以上の粗大粒子の存在率が５％以下であり、かつ、長径（Ｌ）／短径（Ｄ）で表される真球度が１．０～２．５であることを特徴とする。

Description

有機着色微粒子、診断薬キット、及びインビトロ診断方法
　本発明は、有機高分子由来の有機着色微粒子、並びにそれを用いた診断薬キット及びインビトロ診断方法に関する。
　近年、ウィルス、細菌等の病原体感染の有無、妊娠の有無、癌マーカーの有無、食品中の特定原材料や残留農薬などの有害物質の有無などの様々な検査を短時間で行う簡易検査試薬、診断薬、診断キットが開発されている。これらはそれぞれの検査対象物質と、検査対象物質に特異的に反応する物質による特異的反応が利用される。特に、抗原と抗体による抗原抗体反応を用いる免疫学的測定法は、イムノクロマト測定法、比濁免疫測定法、酵素免疫測定法、化学発光測定法、放射免疫測定法、表面プラズモン共鳴を用いる測定法など、多くの測定法が開発されている。そしてこれらの測定法は病院、診療所などでの病気などの検査や、食品会社などでの食物検査などに利用されている。中でもイムノクロマト測定法は、特別な設備、機器、知識を必要とせず操作も簡便で安価であり、迅速な診断が可能であるという特徴から非常に多くの検査が実施されている。近年では妊娠検査薬などは一般薬局で市販され一般消費者でも測定できるようになり、更には検査対象物質の有無を検査する定性検査だけでなく量を測定する定量検査などもできるようになってきている。
　イムノクロマト測定法の測定原理としては、サンドイッチ法と呼ばれる方法や競合法と呼ばれる方法がある。また、測定形式としては、フロースルー型やラテラルフロー型と呼ばれる方法がある。検体中の検査対象物質としては様々な物質を検出することができるが、典型的な例としてはサンドイッチ法により抗原を検出する測定があり、以下のような操作順次実行される。ただし、この操作に限定されるものではない。
　（１）検査対象物質である抗原に特異的に結合する抗体をニトロセルロース膜などのクロマトグラフ媒体の所定の部位に固定化し、クロマトグラフ媒体の任意の位置にテストライン（以下、「ＴＬ」ともいう。）と呼ばれる反応部位を形成する。
　（２）酵素、発色粒子、蛍光発色粒子、磁性粒子などの標識物質に、検査対象物質と特異的に結合するリガンド（例えば、抗体）を担持させた検出試薬を調製し、コンジュゲートパッドなどにかかる検出試薬を塗布乾燥し、検出試薬含有部を形成させ、前記クロマトグラフ媒体と組み合わせてイムノクロマト診断キットを形成する。ここでいうリガンドとは、検査対象物質と特異的に結合するものであり、抗体や抗原、有機分子、タンパク質が例として挙げられる。
　（３）抗原を含む検体そのもの、又はそれを任意の液体で希釈した溶液を、前記イムノクロマト診断キットの所定の位置に、例えば、サンプルパッドに滴下し、抗原と検出試薬をクロマトグラフ媒体上に展開させる。
　これらの操作によって、反応部位においてクロマトグラフ媒体上に固定化された抗体に、抗原を介して標識物質が捕捉され、標識物質の信号を検出することでイムノクロマト診断キットによる診断を行う。一般的な診断は抗原の有無のみを検査する定性診断だが、近年ではその信号の強度を目視あるいは機械で検出することで定量診断を行うこともできる。
　ここで、標識物質に抗体を担持させる方法として、大きく二つある。一つは、化学結合により担持させる方法、もう一つは、物理的に標識物質表面に吸着させて担持させる方法である。化学結合により担持させる方法は、効果的に抗体を配向させることができる可能性があることが知られている。ただし、一般論として、抗体によっては、化学結合し難いものがあること、また取扱い操作の簡便性から、幅広い検査対象に対応するためには、物理的に抗体を吸着できる粒子の方がよりニーズがある。その中で、物理的に抗体を吸着させることができる粒子として、以下の特許文献１には、金コロイド、以下の特許文献２では着色ラテックスが報告されている。
　イムノクロマト測定法で求められているニーズの一つとして、分析感度の向上がある。これは、より少ない検査対象物質でも検出できることを意味する。分析感度が向上することで、迅速診断が可能になるため、分析感度は重要な要因となる。本願発明者らは、以下の特許文献３において、物理的に抗体を吸着可能な発色粒子として色が濃く粒子径の大きいセルロース粒子を用いることで分析感度の向上が可能なことを報告している。
　他方、別のニーズとして、イムノクロマト展開後のニトロセルロース膜のバックグラウンドの改善がある。ここで「バックグラウンド」とは、発色粒子が、ニトロセルロース膜の細孔に詰まったり、非特異吸着したりすることで、ニトロセルロース膜が着色してしまい発生する現象である。バックグラウンドが悪いと、ニトロセルロース膜とＴＬとのコントラストが悪くなり、ＴＬの発色したラインが見えづらくなってしまい、医療現場で判定しにくくなる。更に、バックグラウンドが悪いと、陰性のＴＬ（即ち、発色無し）の判断が困難になってしまう。これら現象は、誤診を引き起こしてしまう可能性がある。特許文献３には、このようなバックグラウンドの問題については何ら言及されていない。
特許第４５１４２３３号公報 特開２００４－１８４２９５号公報 国際公開第２０１１／０６２１５７号
　かかる従来技術に鑑み、本発明が解決しようとする課題は、良好なバックグラウンド及び検査結果の再現性を有し、十分な検出感度を持つイムノクロマト診断キット用の有機着色微粒子を提供することである。
　本発明者らは、かかる課題を解決すべく鋭意検討し実験を重ねた結果、有機着色粒子の真球度及び粒子径７００ｎｍ以上の粗大粒子量を緻密にコントロールした有機着色微粒子であれば、クロマトグラム媒体であるニトロセルロース膜に目詰まりせずに展開することができ、その結果、かかる有機着色微粒子を発色粒子として使用したイムノクロマトは、検出感度が高く、検査結果の再現性に優れることを予想外に見出し、本発明を完成するに至ったものである。
　すなわち、本発明は以下の通りのものである。
　［１］平均粒子径が１００～６５０ｎｍであり、発色強度が１．０～１０．０であり、粒子径４００ｎｍ～１２０００ｎｍの範囲で総個数１０００００個の粒子を検知したとき、粒子径７００ｎｍ以上の粗大粒子の存在率が５％以下であり、かつ、長径（Ｌ）／短径（Ｄ）で表される真球度が１．０～２．５であることを特徴とする有機着色微粒子。
　［２］前記有機着色微粒子の重量の１０～９０重量％が着色成分である、前記［１］に記載の有機着色微粒子。
　［３］前記着色成分が反応性染料である、前記［２］に記載の有機着色微粒子。
　［４］前記反応性染料が、ピリミジン構造又はトリアジン構造を有する、前記［３］に記載の有機着色微粒子。
　［５］前記有機着色微粒子の親水度は、１．０～３０．０である、前記［１］～［４］のいずれかに記載の有機着色微粒子。
　［６］物理吸着によりリガンドが結合されている、前記［１］～［５］のいずれかに記載の有機着色微粒子。
　［７］前記リガンドがカゼインによりコーティングされている、前記［６］に記載の有機着色微粒子。
　［８］前記［１］～［７］のいずれかに記載の有機着色微粒子を含む診断薬キット。
　［９］イムノクロマトグラフキットである、前記［８］に記載の診断薬キット。
　［１０］前記［１］～［７］のいずれかに記載の有機着色微粒子を使用する工程を含むインビトロ診断方法。
　［１１］イムノクロマトグラフ方法である、前記［１０］に記載のインビトロ診断方法。
　本発明の有機着色微粒子を発色粒子として使用したイムノクロマトは、良好なバックグラウンド及び検査結果の再現性を有し、十分な検出感度を持つ。
　本発明は、有機着色微粒子の真球度及び粒子径７００ｎｍ以上の粗大粒子を緻密にコントロールすることで、高い検出感度を維持しつつ、バックグランドが良好で、検査結果の再現性に優れることを見出し、これに基づいて完成された発明である。
　特許文献３には、粒子径が大きく、色が濃い有機着色微粒子をイムノクロマトの発色粒子として使用することで、検出感度が向上することが開示されている。しかしながら、かかる微粒子は、真球度が低く、球形が歪であるために、ニトロセルロース膜に展開するとき、細孔中でひっかかってしまうため、バックグラウンド悪化に繋がるおそれがある。
　他方、本願発明者らは、イムノクロマト用の発色粒子として展開する際に、粒子径が７００ｎｍ以上の粗大粒子がバックグラウンド悪化の主原因であることを見出し粒子径が７００ｎｍ以上の粒子を粗大粒子とした。特許文献３では、７００ｎｍ以上の粗大粒子について何ら言及されておらず、当該文献中に示されているパラメータ（例えば、ＣＶ値）だけを管理していると、バックグランドが悪くなってしまう。バックグランドを改善する方法としては、展開液に界面活性剤、アミノ酸等の添加剤を加える手法もあるが、これらの手法では感度も低下させてしまうおそれがある。
　本発明者らは、粒子の形状がより真球に近くなり、かつ、ニトロセルロース膜の細孔に詰まり易い粗大な粒子を減じることができれば、ニトロセルロース膜に着色せず展開する、換言すればバックグランドが良好になるのではないかと考えた。かかる仮説の下、実験を検討した結果、重合度を精密にコントロールして、ピリミジン構造又はトリアジン構造を有する反応性染料を用いて染色した粒子は、粒子の形状がより真球に近くなり、かつ、粒子径７００ｎｍ以上の粗大粒子を減少させることができることを発見した。このような有機着色微粒子をイムノクロマトの発色粒子として使用すると、これまでの高い検出感度を維持しつつ、良好なバックグラウンドが得られる結果、ＴＬとのコントラストも良くなり、発色の有無の判断もし易くなり、更には再現性も向上する。また、粒子表面の親疎水性を精密にコントロールすることで、粗大粒子が減じた分の検出感度が向上し、検査の再現性も大幅に向上する。
本発明の一実施形態としてのラテラルフロー式のイムノクロマト診断キットの断面図である。 親水度の求め方の説明図である。 実施例１で得られた着色セルロース微粒子の電子顕微鏡画像である。
　以下、本発明の実施形態について詳細に説明する。
　本実施形態に係る有機着色微粒子は、平均粒子径が１００～６５０ｎｍであり、発色強度が１．０～１０．０であり、粒子径４００ｎｍ～１２０００ｎｍの範囲で総個数１０００００個の粒子を検知したとき、粒子径７００ｎｍ以上の粗大粒子の存在率が５％以下であり、かつ、長径（Ｌ）／短径（Ｄ）で表される真球度が１．０～２．５であることを特徴とする。
　本実施形態における「有機着色粒子」とは、水、緩衝液などに不溶性であり、色素、染料等が担持された粒子状物質を指す。粒子を構成する素材は特に限定されないが、このような有機着色微粒子としては、例えば、ポリスチレンラテックス等のスチレン系ラテックスやアクリル酸系ラテックス等を着色した着色ラテックス粒子、ケイ素原子及び酸素原子からなる３次元構造体からなるシリカを着色した着色シリカ粒子、セルロースを着色した着色セルロース粒子などの着色成分をそのまま粒子化した発色粒子などが挙げられる。また、前記有機着色微粒子は蛍光発光性粒子でもかまわない。粒子径の調整、色の濃さの調整、色の種類の調整、粒子表面状態の調整などの粒子の特徴の調整のしやすさから、着色セルロース粒子が好ましい。セルロースは大量の水酸基を有するため、親水性が高く分散安定性に優れ、着色成分を大量に含有することができる。
　「有機着色粒子の製造方法」は特に限定されない。有機粒子をまず成形し、色素、染料などの着色成分を担持させる方法、粒子を成形し、金属コロイドや顔料などのより小さい発色粒子を担持させる方法、粒子の成形時に色素、染料、顔料、金属コロイドなどの着色成分も一緒に加えて成形する方法などが挙げられる。中でも粒子径の調整、色の濃さの調整、色の種類の調整、粒子表面状態の調整などの粒子の特徴の調整のしやすさから、粒子をまず成形し、色素、染料などの着色成分を担持させる方法が好ましい。また、担持させる着色成分としては、担持の容易さから染料が好ましい。
　着色成分として染料を用いる場合、反応性染料が好ましい。直接染料、含金染料、酸性染料、塩基性染料、分散染料、硫化染料、植物染料、ナフトール染料、蛍光染料などの染料を用いた場合では、高い発色強度が得られず、強く染色できたとしても脱色等のおそれがある。ただし、反応性染料を使用する場合、直接染料、含金染料、酸性染料、塩基性染料、分散染料、硫化染料、植物染料、ナフトール染料、蛍光染料等の染料を組み合わせても構わない。
　反応性染料は、ピリミジン構造又はトリアジン構造を有することが好ましい。ここで、ピリミジン構造又はトリアジン構造が、粒子を疎水化し、後述する親水度に大きく影響することがわかった。反応性染料としては、ピリミジン構造又はトリアジン構造を持っているものであれば特に制限はなく、Ｓｕｍｉｆｉｘシリーズ、Ｓｕｍｉｆｉｘ　ＨＦシリーズ、Ｓｕｍｉｆｉｘ　Ｓｕｐｒａシリーズ（以上、登録商標、住友化学社製）、Ｌｅｖａｆｉｘシリーズ（登録商標、ダイスター社製）等が好適に使用できる。これらの反応性染料は、高濃度の水酸化ナトリウムを用いた場合でも、好適に染色することができる。ピリミジン構造又はトリアジン構造を反応部位としていない反応性染料では、高濃度の水酸化ナトリウムを使用すると、セルロースの水酸基と反応する前に、反応部位が失活してしまい、所望の発色強度や親水度に達しない。本実施形態では、高濃度の水酸化ナトリウムと、ピリミジン構造又はトリアジン構造を反応部位とする反応性染料とを用いて有機粒子をうぃ染色することで、粒子全体が均一に染色され、粒子径が均一になり、かつ、後述の親水度が達成される。
　セルロース粒子をまず成形しその後着色成分を担持させる場合、「セルロース粒子の成形方法」は特に限定されない。天然のセルロースをボールミルや高圧ホモジナイザーで物理的に微細化する方法、酸やアルカリなどで化学的に処理し微細化する方法、セルロースをその良溶媒に一度溶解させ粒子状に成形する方法などが挙げられる。また誘導体化されたセルロースを溶解、粒子状に成形し、誘導体化された置換基を水酸基に戻してセルロース粒子を調製してもよい。更にそれらの成形方法を組み合わせてもよい。また「セルロースの種類」も特に限定されるものではなく、再生セルロース、精製セルロース、天然セルロース、前記が誘導体化されたセルロース、誘導体化された置換基を水酸基に戻したセルロースなどを用いることができる。中でも粒子径の調整、粒子形状の調整などの点から良溶媒に一度溶解させ粒子状に成形する方法が好ましく、セルロースの種類としては再生セルロースが好ましい。
　セルロースをその良溶媒に一度溶解させ粒子状に成形する場合、「セルロースを溶解させる良溶媒の種類」も特に限定されるものではなく、銅アンモニア溶液、ビスコース溶液、Ｎ－メチルモルホリン、各種のイオン性液体などセルロースを溶解することのできる様々な良溶媒を用いることができる。中でも粒子径の調整、粒子形状の調整などの点から銅アンモニア溶液が好ましい。また、溶解させたセルロースを粒子に成形する方法も特に限定されるものではなく、本実施形態では相分離による方法を選択した。
　有機着色微粒子の「平均粒子径」とは、動的光散乱法で測定した場合の体積平均メジアン径を指し、体積平均メジアン径が１００～６５０ｎｍの範囲にある。平均粒子径がこの範囲にあると、粒子の表面積が大きいためにイムノクロマト診断キットとして用いる場合にＴＬがより濃くなる、すなわち分析感度が高くなる。平均粒子径が小さすぎると表面積が小さくなり分析感度が下がったり、粒子の凝集が起こったりする場合がある。それゆえ、平均粒子径は１５０ｎｍ以上が好ましく、より好ましくは２００ｎｍ以上である。粒子径が大きすぎるとニトロセルロースなどのクロマトグラフ媒体の孔に詰まることで本来検査後には白くなるはずの部分が着色し検査結果の判断に悪影響を及ぼしたり、検出限界が悪くなったりする場合がある。それゆえ、平均粒子径は６００ｎｍ以下が好ましく、より好ましくは５５０ｎｍ以下である。なお、ここで述べている平均粒子径はあくまで平均値であり、粒子径分布の一部が上記範囲から外れていても構わない。
　粒子径の評価に体積平均を用いる理由として、イムノクロマト診断キットにおいてあまりに大きな粒子はニトロセルロースなどのクロマトグラフ媒体に詰まってしまうが、体積平均が大きい粒子が僅かに存在するだけでも、その影響が反映されるためである。粒子径の評価方法としては体積平均以外にも、数平均、面積平均など様々なものがあり、評価方法が異なると当然に粒子径の値も異なることになる。
　本実施形態の有機着色微粒子の平均粒子径のＣＶ値は特に規定しない。ただし、診断薬として用いる場合は３０％以下が好ましい。平均粒子径のＣＶ値が３０％を超えると、診断薬としての診断の正確性に悪影響が出るため、より好ましくは２５％以下であり、更に好ましくは２０％以下である。一般に平均粒子径のＣＶ値が小さければ診断の正確性は向上するが、ＣＶ値が小さくなりすぎると製造の手間やコストが大きくなってしまうため、コストと正確性のバランスを考えると１％以上が好ましい。
　「発色強度」とは、粒子の色の濃さを定義した値である。発色強度の測定方法は以下のとおりである。
　濃度既知の有機着色微粒子の純水分散液を調製し、光路長１０ｍｍとして、４００～８００ｎｍの範囲で積分球を用いた可視吸光度測定を行い、得られた吸光度曲線のピーク値（ＡＢＳ）を測定し、得られた値を有機着色微粒子の重量パーセントで割り返し、発色粒子０．０１重量％辺りの吸光度に換算した値を求め、これを発色強度と定義する。例えば、調製した有機着色微粒子の濃度が０．００４５％であり、吸光度曲線のピーク値が１．０であった場合、その発色強度は（１×０．０１）÷０．００４５＝２．２となる。
　粒子の色の濃さの測定に積分球を用いた可視吸光度測定を行う理由としては、液体に分散した状態の粒子の色の濃さを最も正確に測定できるためである。粒子の色の濃さを測る方法としては、粒子を乾燥させて得られた固体を測色計などで測定する方法もあるが、このような方法では粒子の色の濃さを正確に測定できない。例えば、金属コロイドなどは粒子径に応じて色調や最大波長が異なり、乾燥した凝集状態は液体に分散した状態の色の濃さを正確に反映できない。また、液体中に同じ粒子濃度で分散させても凝集が発生すると色の濃さは薄くなる。更に、可視吸光度測定を行う際に積分球を用いる理由は、粒子自体の散乱による影響を除去するためである。通常の可視吸光度測定は透過光を測定する方法であり、入射光に対し着色成分による吸収だけでなく粒子自体の散乱による影響も反映されてしまう。例えば、イムノクロマトに一般的に使われる金コロイドは、粒子径が４０ｎｍ～６０ｎｍ、時には１００ｎｍのものが用いられる場合もあるがいずれも粒子径が小さいため散乱光の影響はほとんどない。それに対しポリスチレンラテックス粒子は粒子径が大きく明らかに散乱光の影響が大きい。上記のような理由から、粒子径や粒子素材が違う場合に粒子自体の色の濃さをより正確に反映するために、本実施形態では、積分球を用いた可視吸光度測定を採用する。
　本実施形態の有機着色微粒子の「発色強度」は１．０～１０．０である。この値が大きいほど粒子の色の濃さが濃く、イムノクロマト診断キットとして用いる場合に分析感度が高い。もちろん値が大きければ大きいほどよく、色の濃い染料を利用する、染色回数を増やす、スペーサーとして何らかの化合物を介して連結させる、粒子の非晶領域を増やし染料が入り込みやすくする、粒子を多孔性にして染料が入り込みやすくする、などの方法を採用することができる。しかしながら、経済性を考慮すると上限は７．０以下が好ましく、より好ましくは５．０以下である。また、値が小さいほどイムノクロマト診断キットとして用いた場合に分析感度が低下するため、下限は１．５以上が好ましく、より好ましくは２．０以上である。
　本実施形態の有機着色微粒子の「真球度」とは、粒子の長径（Ｌ）／短径（Ｄ）で表される値であり、長径（Ｌ）と短径（Ｄ）の長さが近い形状は球に近い構造体である。本実施形態の有機着色微粒子の「真球度」（すなわち、Ｌ÷Ｄで表されるＬ／Ｄ比）は、１．０～２．５である。真球度がこの範囲外であると、発色粒子の形がいびつなため、ニトロセルロース膜の細孔を通過する際、粒子がひっかかってしまうために、バックグラウンドが悪化する。その結果、ＴＬとのコントラストが悪化してしまうため、誤診に繋がるおそれがある。また当然ながら、検査の再現性も悪くなる。真球度は、より好ましくは１．０～２．２、更に好ましくは１．０～２．０、最も好ましくは１．０～１．５である。測定方法としては粒子の電子顕微鏡画像を撮影し、１００個の粒子の長径（Ｌ）と短径（Ｄ）を測定し、その１００個の平均値を算出する。
　本実施形態の有機着色微粒子は、粒子径４００ｎｍ～１２０００ｎｍの範囲で総個数１０００００個の粒子を検知したとき、粒子径７００ｎｍ以上の粗大粒子の存在率が５％以下である。
　ここで、「粗大粒子」とは、一定の分布をもつ粒子のうち、粒子径７００ｎｍ以上の粒子を指す。本願発明者らは、イムノクロマト診断キットにおける発色粒子を鋭意検討した結果、この粒子径７００ｎｍ以上の粗大粒子が、ニトロセルロース膜のバックグランドを悪化させる要因の一つであることを突き止めた。理由としては単純に、粒子径７００ｎｍ以上の粒子がニトロセルロース膜の細孔に詰まってしまうため、バックグラウンドを悪化させる。この粗大粒子の存在率が５％を超えると、著しくバックグランドを悪化させてしまい、その結果、ＴＬとのコントラストが悪化してしまうため、誤診に繋がるおそれがある。イムノクロマト診断キットに展開させるという観点から、粗大粒子の存在率は、好ましくは４．５％以下であり、より好ましくは４．０％以下である。
　ここで、粗大粒子の割合と、平均粒子径の％ＣＶとは一見関連しているようにみえるが、リンクしないことが判明した。特許文献３では、％ＣＶについて言及しているが、これは動的光散乱式により粒子のブラウン運動の様子を散乱光強度の揺らぎとして観測し、算出された値である。言い換えれば、粒径分布の平均値を計測するものである。一方、今回の粗大粒子の割合はコールターカウンター式で測定している。これは、粒子が細孔を通過する際に生じる電極間の電気抵抗の変化を測定している、即ちコールターカウンター式では、実際の粒子のサイズを直接的に算出できる。本願発明者らは、このコールターカウンター式により評価を行ったところ、一見分布が狭い（％ＣＶが小さい）粒子でも、粒子によっては粗大粒子の割合が５％を超えるものがあることを発見した。特許文献３で使用している動的光散乱式の装置では、分布の偏りについて正確に測定できなかったため、本実施形態では、コールターカウンター式による装置を用いて、この粗大粒子を測定した。
　「有機着色微粒子の着色成分の割合」とは、有機着色微粒子の全重量における着色成分の割合を指す。例えば、有機着色微粒子１．０ｇが０．２ｇのセルロースと０．８ｇの着色成分から構成される場合、その着色成分の割合は８０重量％である。有機着色微粒子の着色成分の割合は１０～９０重量％が好ましい。この範囲にあるとイムノクロマト診断キットとして用いる場合に分析感度が高い。また、発色粒子としてセルロースを染料で染色した粒子を用いる場合、セルロースにこの範囲の染料を保持させることでセルロースに適度な疎水性を付与することができ、抗体などの被検出物に特異的に結合する物質を吸着により保持することができる。もちろん吸着による保持だけでなく、着色セルロース粒子にカルボキシル基やアミノ基などを導入し、共有結合により被検出物に特異的に結合する物質を保持することも可能である。着色成分の割合が少ない場合は、十分な発色強度を有することができず、イムノクロマト診断キットとして用いる場合に分析感度が低くなる。また、有機着色微粒子としてセルロースを染料で染色した粒子を用いる場合、着色成分の割合を増やすことで被検出物に特異的に結合する物質も増える場合もある。この観点から、有機着色微粒子の着色成分の割合の下限は２０重量％以上が好ましく、より好ましくは３０重量％以上である。着色成分の割合が９０重量％を超えても特に問題はないが、経済的な面から考えると８５重量％以下が好ましく、より好ましくは８０重量％以下である。
　「有機着色微粒子の着色成分の割合の算出方法」としては、着色前後の重量変化から算出することができる。また、重量変化からの算出が困難な場合は、着色成分を粒子から分離する操作を行い着色成分又は粒子を単離し算出することができる。例えば、セルロース粒子を反応性染料で染色した場合、酸やアルカリなどでセルロースと染料の共有結合を切断し、遠心分離によりセルロース粒子を回収することで算出することができる。また、セルラーゼを用いセルロースだけを分解することで算出することもできる。
　「有機着色微粒子のセルロース由来成分の算出方法」は、前記の有機着色微粒子の着色成分の割合から計算できる。すなわち、「有機着色微粒子のセルロース由来成分の割合」＝１００％－（有機着色微粒子の着色成分の割合）の計算式によって計算できる。有機着色微粒子のセルロース由来成分の割合は９０～１０重量％が好ましい。この範囲にあると、セルロース粒子の分散安定性が維持できる。また、前記着色成分の割合で記載した理由により、有機着色微粒子のセルロース由来成分の下限としては１５重量％以上がより好ましく、特に好ましくは２０重量％以上であり、上限は８０重量％以下がより好ましく、特に好ましくは７０重量％以下である。
　本実施形態の有機着色微粒子の疎水性親水性の程度を表す指標として、本実施形態では「親水度」を測定した。本明細書中、「親水度」とは、微粒子表面の濡れやすさ、すなわち水との親和性を表す指標である。
　本実施形態の有機着色微粒子の親水度は１．０～３０．０の範囲であることが好ましい。親水度がこの範囲にあると、粒子表面が疎水的なために、有機着色微粒子表面へのタンパク質、抗体等の吸着量が増加する。セルロースは親水性であり、タンパク質や抗体は一般的に吸着しにくいため、タンパク質や抗体を吸着させるためには、粒子の表面を疎水化することが必要となる。逆に言えば、疎水化の程度をこの指標でコントロールすることで、吸着量についても同様にコントロールすることができる。つまり、イムノクロマト診断キットにおいて、再現性に優れた有機着色微粒子を作製することができる。特許文献３では、この指標について何ら管理されておらず、再現性に欠けるデータを示すことがあった。親水度が３０．０以上であると微粒子表面は親水的となるため、微粒子表面にタンパク質や抗体等の吸着が阻害されてしまい、感度が低下したり、再現性に乏しい結果になってしまったりする。また、１．０未満であると、疎水性が強くなりすぎてしまい、ニトロセルロース膜に吸着し、バックグランドを悪化させてしまう。以上の点から、親水度の上限は、より好ましくは２７．０が好ましく、さらにより好ましくは２５．０である。他方また、親水度の下限はより好ましくは１．５が好ましく、さらにより好ましくは２．０である。
　微粒子の着色に使用した反応性染料がＦ元素を含有する場合、本実施形態の有機着色微粒子表面には、Ｆ元素が残存する。本実施形態の有機着色微粒子においては、Ｘ線光電分光法（ＸＰＳ）による測定により算出された粒子表面のＦ元素の相対元素濃度は０．１ａｔｏｍｉｃ％以上であることが好ましい。Ｆ元素の相対元素濃度がこの範囲にあると、有機着色微粒子表面のタンパク質や抗体の吸着した際、驚くべきことに感度及び再現性が向上する。本実施形態の有機着色微粒子表面のＦ元素の相対元素濃度の下限は、好ましくは０．２ａｔｏｍｉｃ％以上、更に好ましくは０．３ａｔｏｍｉｃ％以上である。
　本実施形態の有機着色微粒子を要素として含む「イムノクロマト診断キット」とは、抗原抗体反応を利用して様々な検体中の検査対象物質の有無を簡便に検出するものである。当該診断キットの種類としては、ラテラルフロー式やフロースルー式がある。発色粒子（有機着色微粒子）やサンプルパッドを用いるものであれば特に限定されないが、好ましくはラテラルフロー式である。また、ラテラルフロー式の中でも、ディップスティックタイプとカセットタイプがあるが、それらのタイプは特に限定されない。診断キットの構成は、特に限定されるものではなく、当該分野で一般的に用いられる構成であればいずれでも構わない。抗体感作発色粒子を含むコンジュゲートパッド（ｂ）とサンプルパッド（ａ）以外の部材の種類は、当該分野で用いられるものであれば特に限定されず、例えば、図１に示す（ｅ）クロマトグラフ媒体、（ｆ）吸収パッド、及び（ｇ）台紙が挙げられる。また、必要に応じそれら部材を一部省いていてもかまわない。構造の例としては特許文献１の図１に記載されているような構造が挙げられる。本明細書に添付する図１はあくまで例であり、本実施形態を何ら限定するものではない。
　図１中（ａ）で示すように、「サンプルパッド」とは、イムノクロマトにおいて測定対象である検体を最初に受け取る部分である。一般的なサンプルパッドとしては、セルロース濾紙、紙、ガラス繊維、グラスファイバー、アクリル繊維、ナイロン繊維、各種織物、などが挙げられる。
　サンプルパッドの親水／撥水性、吸水倍率のコントロールのため、上記物性に悪影響を及ぼさず、抗原抗体反応や抗体の安定性に影響しない範囲であれば、再生セルロース系繊維からなる不織布に各種薬剤や紛体を含有させたり、セルロースの一部を誘導体化したりしてもよい。含浸させる薬剤の一例としては、界面活性剤、タンパク質、抗体、樹脂、水溶性高分子、抗菌剤、防腐剤、酸化防止剤、などが挙げられる。また、セルロースの誘導体化の一例としては、カルボキシメチル化、カルボキシエチル化、１級アミノ化、２級アミノ化、３級アミノ化、４級アミノ化、オキシ化、などが挙げられる。
　サンプルパッドは、必要に応じて前処理を行っても構わない。例えば、緩衝液、界面活性剤、タンパク、検体試料中の夾雑物をトラップする試薬、防腐剤、抗菌剤、酸化防止剤、吸湿剤、などを予め含ませるなどの処理を行っても構わない。また、サンプルパッドの形状は特に限定されないが、例えば、サンプルパッドのサイズとして、長さ（液が流れる長さ）は、検体液からの結びつき性や診断時間を考慮すると１０～２５ｍｍ程度であることが好ましく、幅（液の流れに対して垂直）は、コンジュゲートパッドの巾より大きければ問題はない。幅が狭すぎるとサンプルパッドの端部より検査液が回り込んでしまう可能性がある。
　「コンジュゲートパッド」とは、発色粒子（有機着色微粒子）を含むコンジュゲートを含有するパッドであり、例えば、検査対象物質に結合する抗体と結合した発色粒子を含有するものである。コンジュゲートパッドの素材としては特に限定されないが、一般的なガラス繊維又は樹脂繊維等を用いることができる。樹脂繊維としては、ポリエチレン等のポリオレフィン系や、ポリエステル系、ポリアミド系、アクリル系などの樹脂繊維、及びこれらの樹脂繊維の複合繊維を好適に使用することができるが、これらに限定されるものではない。作業環境から考えると樹脂繊維製が好ましい。樹脂繊維製の中でも、発色粒子のリリースのしやすさの観点から考えると、ある程度疎水性の素材であることがより好ましい。疎水性が高すぎる場合は界面活性剤などで前処理して用いても構わない。ポリエチレン繊維製のコンジュゲートパッドを界面活性剤で前処理したものがより好ましい。
　本実施形態のイムノクロマト診断キットを使用する「診断方法」とは、イムノクロマト診断キットを用いて行われる様々な診断を指す。診断対象は特に限定されるものではなく、人用、動物用、食品用、植物用、その他環境検査など様々な診断対象の検査に用いることができる。一般的な診断の手順では、検査対象から検体試料を採取し、必要であればそれを抽出やろ過などの前処理を行い、サンプルパッドに滴下し、検査開始から所定時間待ち、検査対象物質の有無によって異なる発色より診断結果を判断する。もちろんこの手順に限定されず、同じような手順、原理の診断にも用いることができる。好ましいのは、検体試料を予めろ過しておくことで余分な異物や夾雑物を除去でき、それによりより一層の診断の迅速化や、診断精度の向上が期待できる。
　本実施形態においては、検体を直接サンプルパッドに滴下する方法以外に、予め所定の組成に調整しておいた検体処理液で検体を任意の倍率に希釈処理したものを滴下してもかまわない。検体処理液を使う目的としては、検体中の抗原等と反応しやすくするための成分、検体中の夾雑物を分解する成分、検体中の夾雑物をトラップする成分、非特異的な反応を抑える成分、発色粒子を流れやすくする成分、発色粒子を適度に凝集させテストラインに捕捉された際の視認性を向上させる成分、などの添加が挙げられる。一例としては、緩衝液、界面活性剤、タンパク質、無機塩、水溶性高分子、還元剤、キレート剤、等を添加してもよい。特に本願発明のような発色粒子を用いる場合、非イオン性界面活性剤や、各種水溶性アミノ酸、タンパク質、無機塩、水溶性高分子、などの添加が好ましい。具体的な成分の種類や添加量は検査対象や用いる抗体の種類によっても異なるが、非イオン性界面活性剤の一例としては、ポリ（オキシエチレン）アルキルエーテル、ポリ（オキシエチレン）オクチルフェニルエーテル、ポリ（オキシエチレン）ノニルフェニルエーテルなどが挙げられる。水溶性アミノ酸の一例としては、アスパラギン、アスパラギン酸、アラニン、アルギニン、イソロイシン、グリシン、グルタミン、グルタミン酸、システイン、セリン、チロシン、トリプトファン、トレオニン、バリン、ヒスチジン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、リシン、ロイシンなどが挙げられる。タンパク質の一例としては、カゼイン、スキムミルク、カゼイン分解物、牛血清アルブミン、フィッシュゼラチン、などが挙げられる。無機塩としては、ナトリウム、カリウム、リチウム、などのアルカリ金属イオンを生じる化合物が好ましい。水溶性高分子としては、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロース、その他セルロース誘導体などが好ましい。またこれらの成分は検体処理液に加えておくだけでなく、サンプルパッド、コンジュゲートパッド、クロマトグラフ媒体（ニトロセルロース膜）などに予め加えておいても構わない。
　イムノクロマト診断キットで診断できる対象は特に限定されるものではないが、具体例としては以下のものが挙げられる：癌マーカー、ホルモン、感染症、自己免疫、血漿蛋白、ＴＤＭ、凝固・線溶、アミノ酸、ペプチド、蛋白、遺伝子、細胞、などが挙げられる。より具体的には、ＣＥＡ、ＡＦＰ、フェリチリン、β２マイクロ、ＰＳＡ、ＣＡ１９－９、ＣＡ１２５、ＢＦＰ、エラスターゼ１、ペプシノーゲン１・２、便潜血、尿中β２マイクロ、ＰＩＶＫＡ－２、尿中ＢＴＡ、インスリン、Ｅ３、ＨＣＧ、ＨＰＬ、ＬＨ、ＨＣＶ抗原、ＨＢｓ抗原、ＨＢｓ抗体、ＨＢｃ抗体、ＨＢｅ抗原、ＨＢｅ抗体、ＨＴＬＶ－１抗体、ＨＩＶ抗体、ＨＩＶ抗原、ＨＩＶウィルス遺伝子、トキソプラズマ抗体、梅毒、ＡＳＯ、Ａ型インフルエンザ抗原、Ａ型インフルエンザ抗体、Ｂ型インフルエンザ抗原、Ｂ型インフルエンザ抗体、ロタ抗原、アデノウィルス抗原、ロタ・アデノウィルス抗原、Ａ群レンサ球菌、Ｂ群レンサ球菌、カンジダ抗原、ＣＤ菌、クリプトロッカス抗原、コレラ菌、髄膜炎菌抗原、顆粒菌エラスターゼ、ヘリコバクターピロリ抗体、Ｏ１５７抗体、Ｏ１５７抗原、レプトスピラ抗体、アスペルギルス抗原、ＭＲＳＡ、ＲＦ、総ＩｇＥ、ＬＥテスト、ＣＲＰ、ＩｇＧ，Ａ，Ｍ、ＩｇＤ、トランスフェリン、尿中アルブミン、尿中トランスフェリン、ミオグロビン、Ｃ３・Ｃ４、ＳＡＡ、ＬＰ（ａ）、α１－ＡＣ、α１－Ｍ、ハプトグロビン、マイクロトランスフェリン、ＡＰＲスコア、ＦＤＰ、Ｄダイマー、プラスミノーゲン、ＡＴ３、α２ＰＩ、ＰＩＣ、ＰＡＩ－１、プロテインＣ、凝固第Ｘ３因子、ＩＶ型コラーゲン、ヒアルロン酸、ＧＨｂＡ１ｃ、その他の各種抗原、各種抗体、各種ウィルス、各種菌、各種アミノ酸、各種ペプチド、各種蛋白質、各種ＤＮＡ、各種細胞、各種アレルゲン、各種残留農薬、各種有害物。
　発色粒子（有機着色微粒子）は、抗体などの被検出物に特異的に結合する物質を担持する必要があるが、その担持方法は特に限定されない。例えば、物理的な吸着による担持、共有結合による担持、それらの組み合わせによる担持などが挙げられる。担持する物質の種類や量も特に限定されない。担持する物質の種類としては抗体が最も一般的であり好ましい。また、担持する方法としては、容易さの観点からは物理的な吸着による担持が、安定性や性能などの観点からは共有結合による担持が好ましい。
　イムノクロマト診断キットに用いられるクロマトグラフ媒体は特に限定されるものではなく、一般的に用いられる様々なクロマトグラフ媒体を用いることができる。より具体的にはニトロセルロース膜が挙げられる。市販品のニトロセルロース膜はフローレートと呼ばれる一定距離を移動するために必要な時間によって分類されるが、このフローレートが早い膜ほど孔径が大きい。本発明では孔径が大きい膜のほうが検体の移動が速く発色粒子も詰まりにくいために好ましい。具体的なフローレートとしては１８０ｓｅｃ／４ｃｍより速い膜が好ましい。
　以下、有機着色微粒子としての、セルロース粒子の作製方法、セルロース粒子の着色方法、イムノクロマト診断キットの作製方法、などの一例を記載する、もちろん、本発明はそれらによって何ら限定されるべきではない。
〔セルロース粒子の作製方法〕
　セルロースリンターをセルロースの良溶媒に溶解させる。本発明では良溶媒として公知の方法で調製した銅アンモニア溶液を用いる。そして凝固液としては有機溶媒＋水＋アンモニア混合系を主に用いる。この凝固液を攪拌しながら、調製しておいた銅アンモニアセルロ－ス溶液を加えて凝固を行う。
　ここで、銅アンモニアセルロース溶液を予め空気存在下でインキュベートさせて、銅アンモニアセルロース溶液中のセルロースの平均重合度を調整することがポイントとなってくる。セルロースの平均重合度（ＤＰ）が調整されていないと、粒子径７００ｎｍ以上の粗大粒子の割合が５％以下にならない。そのため、本実施形態では銅アンモニアセルロース溶液中のセルロースの平均重合度（ＤＰ）は５０～４００に調整する。平均重合度が５０未満であると、粒子形状を形成しにくくなり、目標の真球度にならない。一方、平均重合度（ＤＰ）が４００を超えると、粗大粒子量が多くなってしまい、イムノクロマトで使用した時に、展開不良が起こり、バックグラウンドが悪くなる。その結果、ＴＬとのコントラストが悪化してしまうため、誤診に繋がる可能性がある。平均重合度（ＤＰ）の下限としては、粒子形成の観点から６０以上が好ましく、更に好ましくは７０以上である。粗大粒子発生抑制の観点から、上限としては、３５０以下が好ましく、より好ましくは３００以下である。
　セルロースの平均重合度とは、セルロース微粒子をカドキセンに溶解した希薄セルロース溶液の比粘度をウベローデ型粘度計で測定し、その極限粘度数［η］から、参考文献：Ｅｕｒ.Ｐｏｌｙｍ.Ｊ.,１,１（１９９６）に記載される以下の粘度式及び換算式により算出した値である。
　　　粘度式：［η］＝３．８５×１０－２×ＭＷ ０．７６
　　　換算式：ＤＰ＝ＭＷ／１６２
　凝固後、硫酸を加え中和、再生を行うことで、目的のセルロ－ス粒子を含有したスラリーを得ることができる。この際スラリーは再生に用いた酸の残留により酸性であり、さらに中和で発生したアンモニウム塩などの不純物を含んでいるため、セルロース粒子と媒体からなるセルロース分散液へと精製する操作が必要となる。本実施形態ではこの精製操作として遠心分離－デカンテーション－分散媒液体による希釈の処理の繰り返しを用いる。得られたセルロース粒子分散液中のセルロース粒子は、精製操作の過程において凝集する場合もあるので、この場合は剪断などによる分散処理を行うことができる。本実施形態では剪断を与える手段としては高圧ホモジナイザーを用いる。
［セルロース粒子の着色方法］
　得られたセルロース粒子のスラリーに、高濃度の水酸化ナトリウム水溶液を加えたところに、ピリミジン構造又はトリアジン構造を有する反応性染料を加え、マグネティックスターラーで撹拌しながら恒温槽で所定の温度に昇温する。所定時間経過後に目的の染色セルロース粒子を含有したスラリーを得ることができる。この工程を踏むことで、個々の粒子を各々均一に染色することができるため、特許文献３で得られた粒子は、不規則な輪郭を有していたり、表面がぎざぎざでなっていたが、本実施形態で得られる粒子は、不規則な輪郭や表面のぎざぎざは大きく改善され、真球度が格段に良くなる。前記した反応性染料による染色方法で、染色すると、粒子全体をまるで表面コーティングの様に染色できることを見出した。また同時に、この方法では、個々の粒子が均一にコーティングされるためか、均一に粒子径が大きくなる、即ち極端に粒子径が大きい粒子の発生を抑制できることがわかった。また、粒子表面にＦ元素も残存することが分かった。これに反し、特許文献３では、高濃度の水酸化ナトリウムではなく、炭酸ナトリウムを用いて染色を行っていたが、水酸化ナトリウムと比べて炭酸ナトリウムは、セルロースの膨潤させる力が弱いため、膨潤しやすい粒子の最表面だけが膨潤し、反応性染料と反応してしまうために、粒子全体からみて均一な反応が起こっていなかった。また、特許文献３では、一度染色した後に、水酸化ナトリウムで洗浄するために、一部染料の脱離反応が見られ、表面の均一性を余計に失っていた。このように、特許文献３では、先に述べた染料の表面コーティングが均一になされておらず、満足できる真球度が得られておらず、また、親水性のセルロースも表面に露出していたため、親水度を下げることができていなかった。更に、炭酸ナトリウムを用いて染色すると、不均一で表面積の大きい即ち粒子径の大きい粒子から染色されてしまうせいか、粗大粒子の量も増えてしまうことが分かった。また、度々アルカリで洗浄するために粒子表面のＦ元素も脱離してしまう。それゆえ、本願発明者らは、粒子の芯から表面まで、個々の粒子全体を均一に染色することができる高濃度の水酸化ナトリウムを用いる染色方法を採用した。その結果、粒子を染料で均一に染色することができ、粒子の真球度が格段に改善し、親水度を低下させ、粗大粒子を減少させることができた。
　さらに、反応性が高く、耐アルカリ性染料であるピリミジン構造又はトリアジン構造を有する反応性染料を、高濃度の水酸化ナトリウム存在下で染色することで、粒子を均一に染色でき、親水度を大きく低下させることができる。
　続いて遠心分離による精製を行い、染色セルロース粒子分散液を得る。得られた染色セルロース粒子分散液中のセルロース粒子は、精製操作の過程において凝集する場合もあるので、この場合は剪断などによる分散処理を行うことができる。本実施形態では剪断を与える手段としては高圧ホモジナイザーを用いる。その後、得られた着色セルロース粒子の各種物性を測定する。
［イムノクロマト診断キットの作製方法］
　所定の濃度に調整した着色セルロース粒子の分散液を準備し、緩衝液、抗体を加え、温度調整を行いながら一定時間撹拌し、着色セルロース粒子に抗体を吸着させる。一定時間撹拌後、更にブロッキング剤を加え温度調整を行いながら一定時間撹拌することで、着色セルロース粒子のブロッキングを行う。ここでいうブロッキングとは、粒子単体、または抗体や抗原を担持させた粒子等をコーティングする操作である。ブロッキング剤としては、検査対象物質や検体又はそれを希釈する溶液の組成などに応じ様々なブロッキング剤を用いることができる。カゼインは、着色セルロース粒子のブロッキングに特に好ましい。この場合、カゼインが、抗体を担持した着色セルロース粒子中の抗体及び着色セルロース粒子の表面をコーティングしている。抗体吸着とブロッキング後の着色セルロース粒子を洗浄するため、遠心分離を行い、余剰な抗体とブロッキング剤が含まれた上澄み液と沈降した粒子を分離し、上澄み液をデカンテーションにて除去する。沈降した粒子に緩衝液などの液体を加え、必要に応じ超音波などで分散処理を行う。この遠心分離による沈降、上澄みの除去、液体の添加という一連の操作による洗浄を必要回数行い、抗体吸着とブロッキングを行った粒子を所定の濃度含有した分散液を調整する。この分散液に必要に応じタンパク質、界面活性剤、スクロースやトレハロースなどの糖を加え、得られた溶液をポリエチレン製のコンジュゲートパッドに一定量塗布し、乾燥させ、検出試薬含有部を調整する。また、再生セルロース連続長繊維不織布に必要に応じ緩衝液、界面活性剤、タンパク、検体試料中の夾雑物をトラップする試薬、防腐剤、抗菌剤、酸化防止剤、吸湿剤、などを塗布し、乾燥させ、サンプルパッドを調製する。更に所定の位置に抗体を固定化したニトロセルロース多孔膜製のクロマトグラフ媒体、検体を吸収するためのセルロース濾紙製の吸収パッドを調製する。それらをバッキングシートと呼ばれる接着部位を有する台紙に固定化し、所定のサイズに裁断することでイムノクロマト診断キットを作製する。
　以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例のみに限定されるものではない。また、特に記載のない全ての操作は温度２３℃、相対湿度５５％ＲＨの環境下で行った。実施例では、以下の測定、算出方法を用いた。
〔セルロース微粒子の平均重合度の測定〕
　セルロースの平均重合度（ＤＰ）とは、前記したように、セルロース微粒子をカドキセンに溶解した希薄セルロース溶液の比粘度をウベローデ型粘度計で測定し、その極限粘度数［η］から、参考文献：Ｅｕｒ.Ｐｏｌｙｍ.Ｊ.,１,１（１９９６）に記載される以下の粘度式と換算式により算出した値である。
　　　［η］＝３．８５×１０－２×ＭＷ ０．７６
　　　ＤＰ＝ＭＷ／１６２
［発色粒子の平均粒子径の測定］
　装置としては日機装社製のナノトラック粒度分布測定装置ＵＰＡ－ＥＸ１５０（動的光散乱式）を用いた。測定サンプルとして、着色有機微粒子（発色粒子）が０．０１重量％、純水９９．９９重量％のサンプルを用いた。測定条件としては積算回数を３０回、１測定辺りの測定時間を３０秒とし、体積平均の粒子径分布を用いそのメジアン径を平均粒子径とした。また、３０回の積算によって得られた粒度分布の標準偏差と平均粒子径を用いＣＶ値を算出した。
［発色粒子の発色強度の測定］
　装置としては日本分光社製の紫外可視近赤外分光光度計ＪＡＳＣＯ　Ｖ－６５０（光学系：シングルモノクロメータ、ツェルニターナマウント、ダブルビーム方式　光源：重水素ランプ（１９０～３５０ｎｍ）、ハロゲンランプ（３３０～９００ｎｍ））に同社製の積分球ユニットＩＳＶ－７２２を取り付けた装置を用いた。測定するサンプルは、任意の濃度の発色粒子の水分散液又は乾燥粒子を、分散媒として蒸留水を用いて発色粒子が０．０１重量％、純水９９．９９重量％になるよう濃度を調整したものを使用した。この濃度調整した水分散液を、光路長１０ｍｍの石英セル（容量：３．５ｍＬ　光路幅：１０ｍｍ）に２．５ｍＬ加え、この石英セルを紫外可視近赤外分光光度計のサンプルフォルダにセットし、その後、測定を実施した。得られた吸光度ピークのうち、４００～８００ｎｍ可視光範囲での最大値（ＡＢＳ）を発色強度とした。
［発色粒子の着色成分の割合の算出］
　所定回数の着色操作を行った後の発色粒子の重量と、着色前の粒子の重量から計算し算出した。例えば、１．０ｇのセルロース粒子を着色し、２．５ｇの着色セルロース粒子を得た場合の着色成分は２．５ｇ－１．０ｇ＝１．５ｇとして計算した。この場合の着色成分の割合は１．５ｇ÷２．５ｇ×１００＝６０．０重量％となる。
〔発色粒子のセルロース由来成分の割合の算出〕
　前記の通り、「発色粒子のセルロース由来成分の割合」＝１００％－（発色粒子の着色成分の割合）の計算式によって計算した。
［発色粒子の真球度の測定］
　装置としては日本電子株式社製の走査型電子顕微鏡ＪＳＭ-６７００を用いた。発色粒子が０．０１重量％、純水９９．９９重量％のサンプルを雲母板に滴下し、１０秒経過させることで発色粒子を雲母板上に吸着させ、キムワイプで余分な液体を吸い取り乾燥させた。得られた雲母板をプラチナでコーティングし、電子顕微鏡測定用のサンプルを調製した。加速電圧１．６ｋＶ、測定倍率５万倍で観測を行い、粒子画像が１００個以上になるように必要枚数の画像を撮影し、それぞれの粒子の長径（Ｌ）と短径（Ｄ）を測定し、粒子１００個のＬ／Ｄの平均値を算出した。
［発色粒子中の粗大粒子の割合の算出］
　装置はＢＥＣＨＭＡＮ　ＣＯＵＬＴＥＲ社製のＭｕｌｔｉｓｉｚｅｒ４（コールターカウンター式）で、アパチャーはＡＰ２０を用いて測定を行った。尚、電解液は、同じくＢＥＣＨＭＡＮ　ＣＯＵＬＴＥＲ社製のアイソトンII－ＰＣ希釈液（塩化ナトリウム７．９３ｇ／Ｌ、フッ化ナトリウム０．３０ｇ／Ｌ、商品番号：８５４６７１９）を使用した。測定サンプルとして、発色粒子が１．００重量％、純水９９．００重量％のサンプルを用いた。まず、２００ｍＬビーカーに１００ｍＬのアイソトンII希釈液を加える。このビーカーに、更にアイソトンII－ＰＣ希釈液中の発色粒子濃度が５％程度になるように、発色粒子を加える。Ｍｕｌｔｉｓｉｚｅｒ４付属のスターラーで攪拌しながら、測定を行った。測定条件としては、４００ｎｍ～１２０００ｎｍの範囲で、粒子の総個数が１０００００個の粒子を検知した時の粒子径７００ｎｍ以上の粒子の個数（Ａ）から粗大粒子の存在率（Ｘ）を以下の式から算出する。
　　　粗大粒子の存在率（Ｘ）（％）＝｛粒子径７００ｎｍ以上の粒子の個数（Ａ）／１０００００｝×１００
　例えば、１０００００個のうち、粒子径７００ｎｍ以上の粒子が７０００個存在した場合は、７．０％となる。　操作条件の詳細を以下に示す。
　　・アパチャー電流値：８００μＡ
　　・校正係数Ｋｄ：２９．７６４
　　・増幅率：４
　　・測定粒子径範囲：４００ｎｍ～１２０００ｎｍ
　　・測定粒子個数：１０００００個
　　・測定時におけるアイソトンII－ＰＣ希釈液中の発色粒子濃度：５％
［発色粒子の親水度の測定］
　親水度はパルスＮＭＲ法により測定する。パルスＮＭＲ法は、微粒子分散液にラジオ波を照射して水分子のプロトンを励起させた後、基底状態に戻るまでの時間（緩和時間）を測定する分析手法である。微粒子表面に吸着している水分子は運動性が制限されるため緩和時間が短く、バルク水分子（微粒子表面と吸着していない水分子）は運動性に制限が少なく自由に運動できるため緩和時間が長い。したがって、パルスＮＭＲ法により得られる微粒子分散液の緩和時間は、微粒子表面に吸着している水分子とバルク水分子の比率により変化する。すなわち、微粒子表面の親水性が高いほど、より多くの水分子を吸着できるため緩和時間は短くなる。
　パルスＮＭＲの測定には、ブルカー社製のＭｉｎｉｓｐｅｃ　ｍｑ２０装置を用いる。濃度１％（ｗｔ／ｖｏｌ）の微粒子分散液を撹拌後、０．５ｍＬを外径１０ｍｍのガラス製ＮＭＲ管に移し、３０℃に設定されたパルスＮＭＲ装置に設置し、各種パラメータを以下の通りに設定し測定する。
　　・観測核：１Ｈ
　　・測定する緩和時間：横緩和時間Ｔ２（ｍｓ）
　　・測定モード：ＣＰＭＧ法
　　・積算回数：３２回
　　・Ｒｅｃｙｃｌｅ　Ｄｅｌａｙ：１０（ｓ）
　　・９０°－１８０°Ｐｕｌｓｅ　Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ（τ）：２（ｍｓ）
　　・Ｔｏｔａｌ　Ｎｕｍｂｅｒ　ｏｆ　Ａｃｑｕｉｒｅｄ　Ｅｃｈｏｅｓ：２０００点。
　得られた磁化減衰曲線（磁化強度の経時変化を示す曲線）を、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ　Ｅｘｃｅｌの指数近似機能を用いて最小二乗法により下記式（１）：
　　　Ｍ（ｔ）＝Ｍ０・ｅｘｐ（－ｔ／Ｔ２）・・・式（１）
｛式中、Ｍ（ｔ）：ある時間ｔにおける信号強度、Ｍ０：信号強度の初期値、Ｔ２：緩和時間。｝によりフィッティングした。式（１）のＴ２が緩和時間である。
　測定した緩和時間（Ｔ２）から親水度を算出するためには、縦軸に緩和時間の変化割合（Ｒｓｐ値）を、横軸に微粒子の総表面積値（ＴＳＡ値）をプロットしたグラフを用意し、最小二乗法により近似直線を作成し、その傾きとして親水度を求める。
　　・Ｒｓｐ値の計算方法
　　　Ｒｓｐ値＝Ｒａｖ÷Ｒｂ－１
｛式中、Ｒａｖ：平均緩和時定数（試料の緩和時間逆数）、Ｒｂ：バルク水分子の緩和時定数（ブランク水の緩和時間逆数）。｝。
　　・ＴＳＡ値（ｍ２）の計算方法
　　　ＴＳＡ値＝ＳＡ×Ｖ×Ψｐ×ρ
｛式中、ＳＡ：微粒子の比表面積（ｍ２／ｇ）＝６÷（ρ×ｄ）、ここで、ρ：微粒子密度（ｇ／ｃｍ３）（ここで、セルロース微粒子密度：１．４ｇ／ｃｍ３、ラテックス粒子密度：１．０ｇ／ｃｍ３、金コロイド粒子密度：１９．３ｇ／ｃｍ３）、ｄ：微粒子直径（μｍ）、Ｖ：ラジオ波が照射される部分のＮＭＲ管体積（ｃｍ３）（≒試料量）、Ψｐ：微粒子体積比（ここで、微粒子体積（ｉ）＝微粒子濃度（ｗｔ％）÷１００÷微粒子密度（ρ：同上）、水の体積（ｉｉ）＝（１－微粒子体積（ｉ））÷水の密度（０．９９７ｇ／ｃｍ３）、Ψｐ（微粒子体積比）＝微粒子体積（ｉ）÷水の体積（ｉｉ）｝。
　例えば、図２に示すように、Ａ微粒子（ＴＳＡ値０．５、Ｒｓｐ値１０）とＢ微粒子（ＴＳＡ値１、Ｒｓｐ値５）の数値をグラフにプロットし、最小二乗法により各々の近似直線を作成する。Ａ微粒子の場合はＹ＝２０ｘ、Ｂ微粒子の場合はＹ＝５ｘとなる。近似直線の傾き（親水度）が大きい方、すなわちＡ微粒子の方を親水度が大きいと判定する。
［発色粒子の粒子表面のＦ元素の相対元素濃度の測定］
　発色粒子の粒子表面のＦ元素の相対元素濃度はＸＰＳにより測定する。発色粒子を、１．５ｍｍΦ×０．２ｍｍｔの皿型試料台に載せて、以下条件によりＸＰＳ測定を実施した。ＸＰＳ測定には、サーモフィッシャー ＥＳＣＡＬＡＢ２５０を用いて以下条件により実施した。
　　励起源：単色化Ａ１Ｋα　１５ｋＶ×１０ｍＡ
　　分析サイズ：約１ｍｍ　(形状は楕円)
　　光電子取込み角：０°(分光器の軸と試料面が垂直)
　　取込領域
　　　Ｓｕｒｖｅｙ　ｓｃａｎ：０～１,１００ｅＶ
　　　Ｎａｒｒｏｗ　Ｓｃａｎ：Ｃ１ｓ、Ｎ１ｓ、Ｓ２ｐ、Ｏ１ｓ、Ｎａ１ｓ、Ｆ１ｓ、Ｓｉ２ｐ、Ｃｌ２ｐ
　　Ｐａｓｓ　Ｅｎｅｒｇｙ
　　　Ｓｕｒｖｅｙ　Ｓｃａｎ：１００ｅＶ
　　　Ｎａｒｒｏｗ　Ｓｃａｎ：２０ｅＶ
　本測定により得られたＣ１ｓ、Ｎ１ｓ、Ｓ２ｐ、Ｏ１ｓ、Ｎａ１ｓ、Ｆ１ｓ、Ｓｉ２ｐ、Ｃｌ２ｐの面積強度、及び各ピークの相対感度係数(Ｃ１ｓ:１．００、Ｎ１ｓ:１．６８、Ｓ２ｐ:１．９８、Ｏ１ｓ:２．７２、Ｎａ１ｓ:１０．２、Ｆ１ｓ:４．６７、Ｓｉ２ｐ:０．９３、Ｃｌ２ｐ:２．２８５)から、以下の式：
　　　[Ｆ]（ａｔｏｍｉｃ％）＝１００× (ＩＦ１ｓ／ＲＳＦＦ１ｓ)／（ΣＩｊ／ＲＳＦｊ）
｛式中、ＩＦ１ｓ:Ｆ１ｓの面積強度（ｅＶ・ｃｐｓ）、ＲＳＦＦ１ｓ：Ｆ１ｓの相対感度係数、Ｉｊ：Ｃ１ｓ、Ｎ１ｓ、Ｓ２ｐ、Ｏ１ｓ、Ｎａ１ｓ、Ｆ１ｓ、Ｓｉ２ｐ、Ｃｌ２ｐの面積強度（ｅＶ・ｃｐｓ）、ＲＳＦｊ：Ｃ１ｓ、Ｎ１ｓ、Ｓ２ｐ、Ｏ１ｓ、Ｎａ１ｓ、Ｆ１ｓ、Ｓｉ２ｐ、Ｃｌ２ｐの相対感度係数。｝を用いてＦ元素の相対元素濃度([Ｆ])を求める。
［イムノクロマト診断キットの診断時間と再現性の測定］
　５ｍｍ幅にカットしたイムノクロマト診断キットをプラスチックのハウジングに入れた。得られたハウジング入りの診断キットを、浜松ホトニクス社製のイムノクロマトリーダーＣ１００６６－１０を用い測定した。用いる粒子の色に応じて装置の設定を行った。検査対象物質にはヒト絨毛性ゴナドトロピン（以下「ｈＣＧ」という。）を用い、ｈＣＧを、１重量％の牛血清アルブミン（以下「ＢＳＡ」という。）を含む６６ｍＭ、ＰＨ７．４のリン酸緩衝液（以下「ＰＢＳ」という。）で希釈し、ｈＣＧ濃度が１０ｍＩＵ／ｍｌの陽性検体を調製した。この陽性検体１２０μｌを診断キットのサンプル滴下部に滴下し、以降２０秒毎にイムノクロマトリーダーで測定を行い、ＴＬの発色時間の測定を行った。ここで２０秒毎とした理由は、測定１回につき２０秒弱が必要なためである。イムノクロマトリーダーで得られるＴＬの発色強度（単位はｍＡＢＳ）が２０ｍＡＢＳ以上になった時間を測定した。ここで２０ｍＡＢＳとした理由は、個人差もあるが２０ｍＡＢＳ以上になれば目視でもＴＬの存在を確認できるからである。この測定を２０回行い、得られた値の平均値を診断時間、その標準偏差を診断時間標準偏差とした。再現性を表す指標％ＣＶは下記式：
　　　％ＣＶ＝｛診断時間標準偏差／診断時間｝×１００
により算出した：
［イムノクロマト診断キットの感度と再現性の測定］
　同様に１２０μｌの陽性検体を診断キットのサンプル滴下部に滴下し、１５分経過後のＴＬの発色強度をイムノクロマトリーダーで測定した。この測定を２０回行い、得られた値の平均値をＴＬ強度、その標準偏差をＴＬ強度標準偏差とした。再現性を表す指標％ＣＶは、下記式：
　　　％ＣＶ＝｛ＴＬ強度標準偏差／ＴＬ強度｝×１００
により算出した。
［イムノクロマト診断キットのバックグラウンドの判定］
　同様に１２０μｌの陽性検体を診断キットのサンプル滴下部に滴下し、１５分経過後のＴＬの２ｍｍ上流側のバックグラウンド強度と２ｍｍ下流側のバックグランウンド強度をイムノクロマトリーダーで測定した。その平均値をバックグラウンド強度とした。
［イムノクロマト診断キットの偽陽性の測定］
　１重量％ＢＳＡを含む６６ｍＭ、ｐＨ７．４のＰＢＳを調整し陰性検体を調製した。１２０μｌの陰性検体を診断キットのサンプル滴下部に滴下し、１５分経過後のＴＬの発色強度をイムノクロマトリーダーで測定した。この測定を５回行い、得られた値の平均値が５ｍＡＢＳ以下であれば偽陽性はないと判断した。ここで５ｍＡＢＳとした理由は、個人差もあるが５ｍＡＢＳ以下であれば目視ではＴＬの存在が確認できないからである。
［イムノクロマト診断キットの検出限界の測定］
　ｈＣＧ濃度を３．２０ｍＩＵ／ｍｌ、１．６０ｍＩＵ／ｍｌ、０．８０ｍＩＵ／ｍｌ、０．４０ｍＩＵ／ｍｌ、０．２０ｍＩＵ／ｍｌ、０．１０ｍＩＵ／ｍｌ、０．０５ｍＩＵ／ｍｌ、０．０２５ｍＩＵ／ｍｌと段階的に薄くしていった陽性検体を調製した。前記同様に１２０μｌを診断キットのサンプル滴下部に滴下し、１５分経過後のＴＬの発色強度をイムノクロマトリーダーで測定した。この測定を各濃度で５回行い、得られた値の平均値が陰性検体を測定した時の値＋２０ｍＡＢＳ以上の場合は陽性判定、以下の場合は検出限界以下と見なした。この陽性判定が得られる下限のｈＣＧ濃度を検出限界とした。
［実施例１］
　従来公知の方法で、セルロース濃度０．３７ｗｔ％、銅濃度０．１３ｗｔ％、アンモニア濃度１．００ｗｔ％の銅アンモニアセルロース溶液を調製した。得られた銅アンモニアセルロース溶液を空気存在下でゆっくり撹拌し、１２時間かけて重合度を調整した。さらにテトラヒドロフラン濃度８９．００ｗｔ％、水濃度１１．００ｗｔ％、の凝固液を調製した。マグネティックスターラーを用い凝固液５０００ｇをゆっくり攪拌しながら、調製しておいた銅アンモニアセルロース溶液５００ｇを添加した。５秒程度攪拌を継続した後、１０ｗｔ％の硫酸１０００ｇを加え中和、再生を行い、セルロース微粒子を含有したスラリー６５００ｇを得た。
　得られたスラリーを１００００ｒｐｍの速度で１０分間遠心分離した。沈殿物をデカンテーションにより取り出し、蒸留水を注入して攪拌し、再び遠心分離した。ｐＨが６．０～７．０になるまでこの操作を数回繰り返し、その後、高圧ホモジナイザーによる分散処理を行い、セルロース微粒子分散液１５０ｇを得た。得られたセルロース微粒子の平均粒径を測定した結果、２６１ｎｍであった。尚、当該微粒子の重合度を測定したところ、１１０だった。
　次に、前記のようにして調製したセルロース微粒子の染色を行った。微粒子濃度を１．００ｗｔ％に調整したセルロース微粒子分散体１００ｇに対し、硫酸ナトリウム３０ｇ、トリアジン構造を有する反応性染料（ダイスター株式会社製Ｌｅｖａｆｉｘ Ｒｅｄ ＣＡ ＧＲ．（登録商標））１．００ｇ、を加え攪拌させながら恒温槽を用いて６０℃まで昇温した。６０℃に昇温後に水酸化ナトリウム１０ｇを加え、２時間染色を行った。得られた粗着色微粒子を脱イオン水で洗浄し、遠心分離で回収し、その後遠心分離で回収するという一連の操作を１サイクルとし、同様の操作を計５サイクルまで実施し、着色セルロース微粒子を得た。当該微粒子の平均粒径は３５２ｎｍ、ＣＶ値は２１％、発色強度は２．９ＡＢＳ、着色成分の割合は４９％、真球度は１．２で、粗大粒子は１．４％だった。得られた着色セルロース微粒子の電子顕微鏡画像を図３に示す。
［抗体感作着色セルロース粒子の調製］
　既知の方法で調製した１．０重量％の着色セルロース粒子１（平均粒子径３５２ｎｍ、発色強度２．９ＡＢＳ、着色成分の割合４９％、真球度は１．２、粗大粒子の割合１．４％）６０μｌを１５ｍｌの遠心管に入れ、更にトリス緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ７．０）を５４０μｌ、０．１％の抗ｈＣＧ-αマウス抗体（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ社製、１０-Ｃ２５Ｃ）を６０μｌ加え、ボルテックスで１０秒撹拌した。続いて３７℃に調整した乾燥機内に入れ１２０分間静置した。続いて１．０重量％のカゼイン（和光純薬工業社製、０３０－０１５０５）を含有するブロッキング液（１００ｍＭホウ酸、ｐＨ８．５）を７．２ｍｌ加え、更に３７℃の乾燥機内で６０分間静置した。続いて遠心分離機（クボタ商事社製、６２００）と遠心分離ローター（クボタ商事社製、ＡＦ－５００８Ｃ）を用い、１０，０００ｇの遠心を１５分間行い、感作粒子を沈降させた後に上澄みを除去した。続いてホウ酸緩衝液（５０ｍＭホウ酸、ｐＨ１０．０）を７．２ｍｌ加え、超音波分散機（エスエムテー社製、ＵＨ－５０）で１０秒間処理した。続いて１０，０００ｇの遠心を１５分間行い、感作粒子を沈降させた後に上澄みを除去した。また、別途スクロース（和光純薬工業社製、１９６－０００１５）１．８ｇと１．０重量％のカゼインブロッキング液２．４ｇを、ホウ酸緩衝液（５０ｍＭホウ酸、ＰＨ１０．０）７．２ｍｌに溶解させて得た緩衝液を用いて、感作粒子の分散液の重量を１．５８ｇに調整し、０．０３８重量％の抗体感作着色セルロース粒子分散液を調整し、超音波分散機で１０秒間処理した。
［コンジュゲートパッドへの抗体感作着色セルロース粒子の含浸、乾燥］
　ポリエチレン製コンジュゲートパッド（Ｐａｌｌ社製、６６１３）を大過剰の０．０５重量％のＴｗｅｅｎ－２０（登録商標、シグマアルドリッチ社製、Ｔ２７００）に浸漬し、余分な液を取り除いた後に５０℃で６０分乾燥させた。続いて高さ１０ｍｍ、長さ３００ｍｍの形状にカットした。続いてマイクロピペットを用い０．０３８重量％の抗体感作着色セルロース粒子分散液７８０μｌを均等に塗布し、５０℃で６０分乾燥させた。
［サンプルパッドの前処理］
　既知の方法で調整したセルロース製サンプルパッド（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製、Ｃ０８３）を、大過剰の２．０重量％のＢＳＡ（シグマアルドリッチ社製、Ａ７９０６）と２．０重量％のＴｗｅｅｎ－２０を含有するＰＢＳ緩衝液（６６ｍＭ、ＰＨ７．４）に含浸し、余分な液を取り除いた後に５０℃で６０分乾燥させ、これを高さ２０ｍｍ、長さ３００ｍｍの形状にカットした。
［捕捉抗体塗布ニトロセルロース膜の調製］
　ニトロセルロース膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製、ＳＨＦ０９００４２５）を高さ２５ｍｍ、長さ３００ｍｍの形状にカットした。液体塗布装置（武蔵エンジニアリング社製、３００ＤＳ）を用い、０．１重量％抗ｈＣＧ-βマウス抗体（ＭｅｄｉｘＢｉｏｃｈｅｍｉｃａ社製、６６０１）を含むＰＢＳ溶液（６６ｍＭ、ｐＨ７．４）を０．１μｌ／ｍｍの割合で高さ７ｍｍの部分に塗布した。続いて０．１重量％の抗マウス-ウサギ抗体（Ｄａｃｏ社製、Ｚ０２５９）を含むＰＢＳ溶液（６６ｍＭ、ｐＨ７．４）を０．１μｌ／ｍｍの割合で高さ１２ｍｍの部分に塗布し、続いて３７℃で３０分乾燥させた。
［イムノクロマト診断キットの調製］
　バッキングカード（Ａｄｈｅｓｉｖｅｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製、ＡＲ９０２０）に、調整した捕捉抗体塗布ニトロセルロース膜、吸収パッド（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製、Ｃ０８３）、抗体感作着色セルロース粒子を含有したコンジュゲートパッド、再生セルロース連続長繊維不織布サンプルパッドを、図１に示すレイアウトで貼り合わせ、続いて裁断機にて５ｍｍの幅にカットし、幅５ｍｍ、高さ６０ｍｍのイムノクロマト診断キットを得た。
［イムノクロマト診断キットの性能評価］
　得られたイムノクロマト診断キットの性能を評価した。結果を以下の表１に示す。
［実施例２～６］
　セルロース微粒子を以下の表１に記載の重合度に調整した以外は、実施例１と同様の方法で発色粒子を作製し、イムノクロマト診断キットを調製し、その性能を評価した。結果を以下の表１に示す。
［実施例７～９］
　セルロース微粒子を、ピリミジン構造を有する反応性染料（ダイスター株式会社製Ｌｅｖａｆｉｘ　Ｒｕｂｉｎｅ　ＣＡ ＧＲ．（実施例７、登録商標）、ダイスター株式会社製Ｌｅｖａｆｉｘ　Ｎａｖｙ　Ｂｌｕｅ　Ｅ－ＢＮＡ　ＣＡ ＧＲ．（実施例８、登録商標）、ダイスター株式会社製Ｌｅｖａｆｉｘ　Ｎａｖｙ　ＣＡ ＧＲ．（実施例９、登録商標））を用いて染色した以外は、実施例１と同様の方法で発色粒子を作製し、イムノクロマト診断キットを調製し、その性能を評価した。結果を以下の表１に示す。
［実施例１０～１３］
　セルロース微粒子の製造条件を調整して以下の表１に記載の粒径の発色粒子を製造した以外は、実施例１と同様の方法で、イムノクロマト診断キットを調製し、その性能を評価した。結果を以下の表１に示す。
［実施例１４～１８］
　発色粒子の製造条件を調整して、以下の表１に記載の発色強度の発色粒子を製造した以外は、実施例１と同様の方法で、イムノクロマト診断キットを調製し、その性能を評価した。結果を以下の表１に示す。
［実施例１９～２２］
　発色粒子を混合して、以下の表１に記載の粗大粒子割合の発色粒子を作製した以外は、実施例１と同様の方法で、イムノクロマト診断キットを調製し、その性能を評価した。結果を以下の表１に示す。
［実施例２３、２４］
　発色粒子を混合して、以下の表１に記載のＣＶ値と粗大粒子割合の発色粒子を作製した以外は、実施例１と同様の方法で、イムノクロマト診断キットを調製し、その性能を評価した。結果を以下の表１に示す。
［比較例１、２］
　セルロース微粒子を以下の表２に記載の重合度に調整し、更に凝固液のテトラヒドロフランの濃度を調整して、以下の表２に記載の真球度の発色粒子を作製した以外は、実施例１と同様の方法で、イムノクロマト診断キットを調製し、その性能を評価した。結果を以下の表２に示す。
［比較例３］
　セルロース微粒子を以下の表２に記載の重合度に調整し、以下の表２記載の真球度の発色粒子を作製した以外は、実施例１と同様の方法で、イムノクロマト診断キットを調製し、その性能を評価した。結果を以下の表２に示す。
［比較例４～６］
　染色時に、特許文献３と同様の方法で、かつ使用する染料量を調整して発色強度を調整しながら染色した以外は、実施例１と同様の方法で、イムノクロマト診断キットを調製し、その性能を評価した。結果を以下の表２に示す。
［比較例７］
　染色時に、水酸化ナトリウムの代わりに１２ｇの炭酸ナトリウムを加えて染色した以外は、実施例１と同様の方法で、イムノクロマト診断キットを調製し、その性能を評価した。結果を以下の表２に示す。
［比較例８、９］
　染色時に、染料をピリミジン構造又はトリアジン構造を有していない反応性染料（Ｃ．Ｉ．Ｒｅａｃｔｉｖｅ　Ｏｒａｎｇｅ１６（実施例８）、Ｃ．Ｉ．Ｒｅａｃｔｉｖｅ　Ｂｌｕｅ１９（実施例９））を使用した以外は、実施例１と同様の方法で、イムノクロマト診断キットを調製し、その性能を評価した。結果を以下の表２に示す。
［比較例１０、１１］
　セルロース粒子の作製時、凝固液のテトラヒドロフランの濃度を調整して、以下の表２に記載の平均粒径の発色粒子を製造した以外は、実施例１と同様の方法で、イムノクロマト診断キットを調製し、その性能を評価した。結果を以下の表２に示す。
［比較例１２］
　発色粒子の製造条件を調整して、以下の表２に記載の発色強度の発色粒子を製造した以外は、実施例１と同様の方法で、イムノクロマト診断キットを調製し、その性能を評価した。結果を以下の表２に示す。
［比較例１３～１５］
　実施例２０と比較例３の発色粒子を所定の比率で混合、調整して、以下の表２に記載の粗大粒子量の発色粒子を製造した以外は、実施例１と同様の方法で、イムノクロマト診断キットを調製し、その性能を評価した。結果を以下の表２に示す。
［比較例１６、１７］
　発色粒子として、金コロイド（比較例１６）、ラテックス（比較例１７）を用いた以外は、実施例１と同様の方法で、イムノクロマト診断キットを調製し、その性能を評価した。結果を以下の表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　本発明に係る有機着色微粒子を用いたイムノクロマト診断キットは、良好なバックグラウンドと検査結果の再現性を有し、十分な検出感度を有する診断薬として好適に利用可能である。
　（ａ）　　サンプルパッド
　（ｂ）　　抗体感作発色粒子を含むコンジュゲートパッド
　（ｃ）　　検出部Ａ（ＴＬ）
　（ｄ）　　検出部Ｂ（コントロールライン）
　（ｅ）　　クロマトグラフ媒体
　（ｆ）　　吸収パッド
　（ｇ）　　台紙

Claims (11)

  1. 　平均粒子径が１００～６５０ｎｍであり、発色強度が１．０～１０．０であり、粒子径４００ｎｍ～１２０００ｎｍの範囲で、総個数１０００００個の粒子を検知したとき、粒子径７００ｎｍ以上の粗大粒子の存在率が５％以下であり、かつ、長径（Ｌ）／短径（Ｄ）で表される真球度が１．０～２．５であることを特徴とする有機着色微粒子。
  2. 　前記有機着色微粒子の重量の１０～９０重量％が着色成分である、請求項１に記載の有機着色微粒子。
  3. 　前記着色成分が反応性染料である、請求項２に記載の有機着色微粒子。
  4. 　前記反応性染料が、ピリミジン構造又はトリアジン構造を有する、請求項３に記載の有機着色微粒子。
  5. 　前記有機着色微粒子の親水度は、１．０～３０．０である、請求項１～４のいずれか１項に記載の有機着色微粒子。
  6. 　物理吸着によりリガンドが結合されている、請求項１～５のいずれか１項に記載の有機着色微粒子。
  7. 　前記リガンドがカゼインによりコーティングされている、請求項６に記載の有機着色微粒子。
  8. 　請求項１～７のいずれか１項に記載の有機着色微粒子を含む診断薬キット。
  9. 　イムノクロマトグラフキットである、請求項８に記載の診断薬キット。
  10. 　請求項１～７のいずれか１項に記載の有機着色微粒子を使用する工程を含むインビトロ診断方法。
  11. 　イムノクロマトグラフ方法である、請求項１０に記載のインビトロ診断方法。
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