CN110476063B - 亲水化着色纤维素微粒 - Google Patents
亲水化着色纤维素微粒 Download PDFInfo
- Publication number
- CN110476063B CN110476063B CN201880023303.1A CN201880023303A CN110476063B CN 110476063 B CN110476063 B CN 110476063B CN 201880023303 A CN201880023303 A CN 201880023303A CN 110476063 B CN110476063 B CN 110476063B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- fine particles
- amount
- microparticles
- colored cellulose
- particles
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/544—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being organic
- G01N33/548—Carbohydrates, e.g. dextran
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
- G01N33/585—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with a particulate label, e.g. coloured latex
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
- G01N33/54346—Nanoparticles
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
- G01N33/54386—Analytical elements
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
- G01N33/585—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with a particulate label, e.g. coloured latex
- G01N33/587—Nanoparticles
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B82—NANOTECHNOLOGY
- B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
- B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2458/00—Labels used in chemical analysis of biological material
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
- G01N33/54386—Analytical elements
- G01N33/54387—Immunochromatographic test strips
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Nanotechnology (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
本发明提供能够维持高的检测灵敏度、并且大幅减少假阳性的着色纤维素微粒、使用其的免疫层析诊断试剂盒。着色纤维素微粒、在该着色纤维素微粒的羧基上以共价键结合有配体的结构体、及包含该结构体的免疫层析诊断试剂盒,所述的着色纤维素微粒的特征在于,平均粒径为60~900nm,显色强度为1.0~10.0,在微粒表面具有亲水层、并且在微粒表面借助间隔基团导入有羧基。
Description
技术领域
本发明涉及在微粒表面具有亲水层、并且借助间隔基团导入有羧基的着色纤维素微粒、以及使用其的诊断药试剂盒及体外诊断药。
背景技术
近年来,医疗领域、食品领域中期望能够简便并且迅速地判断疾病、病原菌等的有无的技术。为了应对这些需要,开发了各种各样的技术。目前,能够简便并且迅速地进行流感等病原体感染的有无、妊娠的有无、癌标记物、心肌标记物的有无、食品中的过敏物质、成为食物中毒原因的物质的有无等各种各样的检查。作为所述技术,开发了免疫层析测定法、荧光免疫层析测定法、酶免疫测定法、胶乳凝集测定法、化学发光测定法等许多测定方法。其中,能够通过目视进行判断的免疫层析测定法具有下述特征:不需要特别的装置、专业的知识,任何人都能简便地迅速诊断,因此被广泛使用。例如,作为免疫层析测定法的一种的妊娠检查药等在一般药房中就能获得,对于消费者而言通用性高。
免疫层析测定法(以下,称为“免疫层析”)利用抗原抗体反应,有夹心法、竞争法等方法。测定方法大致分为使检测物相对于膜在水平方向展开的侧流(Lateral Flow)式、在垂直方向展开的流通(Flow Through)式。从简便性的观点出发,大多采用以侧流式使用夹心法来用抗体捕捉抗原的方法。测定步骤如下:
(i)在硝基纤维素等的膜上,将与作为检测对象的抗原等反应的抗体固定于特定部位(测试线);
(ii)制作被称为显色颗粒的标记物质上负载有与检测对象反应的抗体的检测试剂,涂布于结合垫上后使其干燥,将前述膜、样品垫、吸收垫组合而制作免疫层析试剂盒;
(iii)将混合有想要检查抗原有无的待检体的显影液滴加到样品垫上,通过目视(或简易的免疫层析读取仪)观察测试线(TL)的显色的有无,判断抗原的有无。待检体中有抗原的情况下,在测试线上线显色。
通常,通过目视判定的情况大多作为仅判断有无作为检测对象的抗原的定性分析而使用。
作为免疫层析中使用的显色颗粒,例如,以下的专利文献1中公开了金胶体,而且以下的专利文献2中公开了着色胶乳。这些显色颗粒的问题在于,由于微粒表面是疏水性的,因此会引起蛋白质等生物分子吸附的非特异性吸附这样的现象。若引起非特异性吸附,则有作为免疫层析中最大问题之一的假阳性产生的担心。假阳性是指,尽管在待检体中不存在检测对象,但在测试线上线显色。若产生假阳性,则会导致误诊,因此市售免疫层析试剂盒的情况下,不使其产生假阳性是必不可少的。作为假阳性的产生机制之一,可以认为是,借助非特异性吸附于显色颗粒的物质,显色颗粒吸附于涂布于测试线的抗体。因此,以下的专利文献3中公开了通过使亲水性的聚乙二醇 (PEG)结合于疏水性的金胶体表面的方法来抑制非特异性吸附、减少假阳性。但是,该方法中有抗体抗原反应被微粒表面的PEG链的立体结构所阻碍、检测灵敏度降低的担心。像这样,通常在进行假阳性减少对策时检测灵敏度会降低的情况是常见的。
该状况下,以下的专利文献4中公开了通过使着色纤维素微粒与抗体化学结合来达成非常高的检测灵敏度。由于该微粒源自纤维素,因此与金胶体等相比,虽然表面有呈若干亲水性,但还是疏水性,有引起非特异性吸附的可能性,与目前为止的显色颗粒同样地尚有产生假阳性的风险。
如上所述,尚需要提供维持高的检测灵敏度、并且减少假阳性的技术,作为其中之一,强烈期望开发能够在不阻碍抗体抗原反应的情况下大幅抑制非特异性吸附的显色颗粒。
现有文献
专利文献
专利文献1:国际公开第2015/163384A1号
专利文献2:日本特开2009-168495号公报
专利文献3:国际公开第2013/141122A1号
专利文献4:国际公开第2011/062157A1号
发明内容
发明要解决的问题
鉴于前述现有技术的现状,本发明要解决的问题在于,提供能维持高的检测灵敏度、并且大幅减少假阳性的显色颗粒。
用于解决问题的方案
本发明人等为了解决前述问题而进行了深入研究并反复实验,结果发现,通过在微粒表面赋予亲水层、并且借助间隔基团导入羧基,可得到令人惊讶地减少了蛋白质等生物分子的非特异性吸附的纤维素微粒,确认使用其作为显色颗粒的免疫层析能够维持高的检测灵敏度、并且大幅减少假阳性,从而完成了本发明。
即,本发明如下。
[1]一种显色纤维素微粒,其特征在于,平均粒径为60~900nm,显色强度为1.0~10.0,在微粒表面具有亲水层,并且借助间隔基团导入有羧基。
[2]根据前述[1]所述的显色纤维素微粒,其中,前述羧基的导入量在每 1g前述显色纤维素微粒中为0.20~3.00mmol。
[3]根据前述[1]或[2]所述的显色纤维素微粒,其中,前述亲水层为硅烷层、聚乙二醇层(PEG)、或硅烷层与聚乙二醇(PEG)层的混合层中的任意者。
[4]根据前述[1]~[3]中任一项所述的显色纤维素微粒,其中,前述间隔基团为烃系的结构体。
[5]一种结构体,其在前述[1]~[4]中任一项所述的显色纤维素微粒的前述羧基上以共价键结合有配体。
[6]一种免疫层析诊断试剂盒,其包含前述[5]所述的结构体。
发明的效果
本发明的着色纤维素微粒减少了生物分子的非特异性吸附,因此使用其作为免疫层析的显色颗粒时,能够维持高的检测灵敏度、并且大幅减少假阳性。
附图说明
图1为用于求出亲水化度的、对弛豫时间的变化比例(Rsp值)和微粒的总表面积值(TSA值)进行标绘而成的图。
图2为示出免疫层析诊断试剂盒的测定中测试线(TL)的显色强度(0-10 这11个级别的目视等级)的照片。
具体实施方式
本发明人等发现,通过在着色纤维素微粒中组合规定的亲水层和规定的间隔基团,令人出乎意料地能够实现大幅减少假阳性的效果、能够维持高的检测灵敏度。
如专利文献4中公开那样,明确了通过使粒径大、并且颜色深的着色纤维素微粒与抗体化学结合,检测灵敏度会提高。但是,由于所述微粒表面的亲水性不充分,因此有蛋白质等生物分子容易非特异性吸附、用于免疫层析时会产生假阳性的担心。因此,在进行向显影液中添加表面活性剂等添加剂等假阳性减少对策的同时,灵敏度也会降低。本发明人等考虑,可能是通过使微粒其本身不易非特异性吸附、并且能将抗体大量导入微粒表面,从而能够维持高的检测灵敏度、并且减少假阳性。在所述假说下反复进行了实验,结果发现,通过使得对着色纤维素微粒表面赋予亲水层、并且借助烃系的间隔基团导入大量羧基、来减少蛋白质等生物分子对微粒表面的非特异性吸附、并且将大量的抗体导入到微粒成为可能,从而能够实现假阳性的大幅减少、并且能维持高的检测灵敏度。
如专利文献3公开那样,明确了通过对微粒表面赋予亲水层能够减少假阳性。另一方面,通常对于烃系的化合物而言,可以说成为假阳性原因的蛋白质等生物分子容易吸附。该状况下,本发明人等意外地发现,通过在亲水层赋予的基础上组合烃系的疏水性间隔基团,能够大幅减少假阳性。虽然不意图受特定理论拘束,但本发明人等认为,烃系的间隔基团与亲水层排斥而在微粒表面呈立起状态,并且通过间隔基团彼此的疏水性相互作用而密集地被导入到微粒表面,因此成为假阳性原因的蛋白质等生物分子会进入微粒表面的间隙消失,非特异性吸附得以抑制时,换言之线状的烃系间隔基团的侧面与该间隔基团彼此大致平行地排列在微粒表面而配置,因此虽然在其侧面成为假阳性原因的蛋白质不能吸附,但抗体能够以共价键结合于位于间隔基团的前端的羧基,因此成功地大幅减少假阳性。
以下,对实施方式进行详细说明。
本实施方式的着色纤维素微粒的特征在于,平均粒径为60~900nm,显色强度为1.0~10.0,在微粒表面具有亲水层、并且借助间隔基团导入有羧基。
用语“平均粒径”是指通过动态光散射法测定时的体积平均中值粒径。本实施方式中,平均粒径处于60~900nm的范围。平均粒径处于该范围时,微粒的表面积大,作为免疫层析使用的情况下测试线变得更浓、即检测灵敏度变高。平均粒径不足60nm时,表面积小,因此每一个微粒的显色强度降低,因此有时检测灵敏度降低,另外,有时也引起微粒的聚集。从以上的观点出发,粒径的下限优选为70nm、更优选为80nm。另一方面,微粒直径大于900nm时,膜的孔会堵塞,因此有时诊断时间变长、或在检查后膜表面着色、给检查结果的判断带来不良影响、或检测灵敏度变差。从以上的观点出发,粒径的上限优选为800nm、更优选为700nm。需要说明的是,此处所述的平均粒径只是平均值,一部分粒径分布可以不在上述范围内。
对于作为粒径使用体积平均的理由,是因为,免疫层析中,太大的微粒会堵塞膜,为体积平均时,微粒越大则影响越大,因此即使仅存在少量大的颗粒也会反映出其影响。作为粒径,除了体积平均以外,也有数均、面积平均等各种各样的表示方法。当然表示方法不同,则粒径的值也会变化。
用语“显色强度”是对导入反应性基团后、抗体结合前的微粒的颜色深浅进行定义的值,本实施方式中,处于1.0~10.0的范围。该值越大,微粒的颜色深浅越深,用作免疫层析的情况下检测灵敏度越高。当然值越大越好,可以采用:利用颜色深的染料、增加染色次数、借助某些化合物作为间隔基团而连结、增加微粒的非晶区域使得染料容易进入、使微粒为多孔性而使得染料容易进入等方法。但是,若考虑经济性,则上限优选为7.0、更优选为5.0。另外,值越小,用作免疫层析的情况下检测灵敏度越降低,因此下限优选为 1.5、更优选为2.0。
对于显色强度的测定方法,制备浓度已知的微粒的纯水分散液,光路长度设为10mm,在400~800nm的范围进行使用了积分球的可见吸光度测定,测定所得吸光度曲线的峰值(ABS),将得到的值以显色颗粒的重量百分比进行折算,以换算成相对于每0.01wt%显色颗粒的吸光度的值来定义。例如,制备的微粒的浓度为0.0045wt%、吸光度曲线的峰值为1.0时,其显色强度为(1×0.01)÷0.0045=2.2。
关于微粒的颜色深浅的测定进行使用了积分球的可见吸光度测定的理由,是因为能够最准确地测定分散于液体的状态的微粒的颜色深浅。作为测定微粒的颜色深浅的方法,也有用色度计等对将微粒干燥而得到的固体进行测定的方法,但这样的方法不能准确地测定微粒的颜色深浅。例如,金属胶体等因粒径不同而色调、最大波长不同,干燥的聚集状态无法准确反映分散于液体的状态的颜色深浅。另外,即使在液体中以相同颗粒浓度分散,若发生聚集,则颜色深浅也会变浅。进而,进行可见吸光度测定时使用积分球的理由是为了去除由颗粒自身的散射所产生的影响。通常的可见吸光度测定为测定透射光的方法,不仅反映了着色成分对入射光的吸收,还反映了微粒自身的散射对入射光所产生的影响。例如,免疫层析中通常使用的金胶体有时也使用粒径为40nm~60nm者,偶尔为100nm者,但粒径均小,因此基本不存在散射光的影响。与此相对,胶乳颗粒的粒径大,散射光的影响明显大。基于如上所述的理由,为了在粒径、颗粒原材料不同的情况下也会更准确地反映微粒自身的颜色深浅,利用使用了积分球的可见吸光度测定。
用语“亲水层”是指,如字面意思为由亲水性高的结构体构成的层,是与微粒的羟基化学结合的层。高亲水层的结构没有特别限定,可以使用硅烷层、聚乙二醇(PEG)层、磷酰胆碱层等。根据情况,可以为前述层中的2个层的混合体。例如,也可以形成以1:1的比例包含硅烷层和PEG层的层。此处所说的硅烷层是指包含Si基的结构体与颗粒的羟基结合而成的层。同样地, PEG层、磷酰胆碱层也分别是指包含PEG基、磷酰胆碱基的结构体与颗粒的羟基结合而成的层。从与其后的反应剂的结合性的方面出发,优选形成亲水层的结构体中的1者包含氨基。对于是否形成有亲水层,通过红外分光法、显微镜观察、元素分析等来判断。
需要说明的是,本说明书中,“间隔基团”从与“亲水层”中的反应基团结合这点来看,与“亲水层”是不同的。
作为用于赋予亲水层的亲水化剂,没有特别限定,作为具体例,可列举出以下的物质:乙烯基三甲氧基硅烷、乙烯基三乙氧基硅烷、2-(3,4-环氧环己基)乙基三甲氧基硅烷、3-环氧丙氧基丙基甲基二甲氧基硅烷、3-环氧丙氧基丙基甲基二乙氧基硅烷、3-环氧丙氧基丙基三乙氧基硅烷、对苯乙烯基三甲氧基硅烷、3-甲基丙烯酰氧基丙基甲基二甲氧基硅烷、3-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷、3-甲基丙烯酰氧基丙基甲基二乙氧基硅烷、3-甲基丙烯酰氧基丙基三乙氧基硅烷、3-丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷、N-2-(氨基乙基)-3-氨基丙基甲基二甲氧基硅烷、N-2-(氨基乙基)-3-氨基丙基三甲氧基硅烷、3-氨基丙基三甲氧基硅烷、3-氨基丙基三乙氧基硅烷、3-三乙氧基甲硅烷基-N-(1,3-二甲基丁叉基)丙胺、N-苯基-3-氨基丙基三甲氧基硅烷、 3-巯基丙基甲基二甲氧基硅烷、3-巯基丙基三甲氧基硅烷、3-异氰酸酯基丙基三甲氧基硅烷、聚乙二醇三甲氧基硅烷、聚乙二醇三乙氧基硅烷、氨基 -PEG12-丙酸、氨基-PEG8-丙酸、氨基-PEG4-丙酸、聚(乙二醇)2-氨基乙基乙酸、FMOC-PEG 5k-琥珀酰亚胺丁酸酯、HO-PEG 5k-NHS、O-〔2-(Fmoc- 氨基)-乙基〕-O’-2-羧基乙基)聚乙二醇、聚乙二醇双胺、1-O-十八烷基-2-O- 甲基-sn-甘油-3-磷酰胆碱。其中优选为N-2-(氨基乙基)-3-氨基丙基甲基二甲氧基硅烷、N-2-(氨基乙基)-3-氨基丙基三甲氧基硅烷、3-氨基丙基三甲氧基硅烷、3-氨基丙基三乙氧基硅烷、3-三乙氧基甲硅烷基-N-(1,3-二甲基丁叉基)丙胺、氨基-PEG12-丙酸、氨基-PEG8-丙酸、氨基-PEG4-丙酸、聚 (乙二醇)2-氨基乙基乙酸、聚乙二醇双胺,更优选为N-2-(氨基乙基)-3- 氨基丙基甲基二甲氧基硅烷、N-2-(氨基乙基)-3-氨基丙基三甲氧基硅烷、 3-氨基丙基三甲氧基硅烷、3-氨基丙基三乙氧基硅烷、3-三乙氧基甲硅烷基 -N-(1,3-二甲基丁叉基)丙胺。
使用具有氨基的亲水层的情况下,导入羧基后的残留反应性氨基量理想的是每1g着色纤维素微粒中不足0.20mmol。通过处于该范围,从而不仅能够抑制疏水性物质的吸附,还能够抑制离子性物质、氢键性物质的吸附,因此能够飞跃性地减少生物分子的吸附量。导入羧基后的残留反应性氨基量在每 1g着色纤维素微粒中为0.20mmol以上时,特别是基于氢键的吸附增大,因此假阳性的减少效果变小。从以上的观点出发,残留反应性氨基量的上限优选为0.15mmol、更优选为0.10mmol。
作为残留反应性氨基量的测定方法,使用荧光测定。使用仅在与氨基反应的情况下会发光的荧光试剂。首先,用氨基量已知的样品针对氨基量与发光强度的关系制作标准曲线。其后,使荧光试剂与微粒反应。测定该微粒的荧光强度,得到发光强度。将所得发光强度代入标准曲线,算出氨基量。
作为表示亲水层的亲水化的程度的指标,定义“亲水化度”。本说明书中,“亲水化度”是指表示微粒表面的润湿容易性、即与水的亲和性的指标。亲水化度通过脉冲NMR法来测定。脉冲NMR法为对微粒分散液照射无线电波而使水分子的质子激发后,测定其返回到基底状态为止的时间(弛豫时间)的分析手法。吸附于微粒表面的水分子的运动性受到限制,因此弛豫时间短,本体水分子(未与微粒表面吸附的水分子)的运动性的限制少,能够自由地运动,因此弛豫时间长。因此,通过脉冲NMR法得到的微粒分散液的弛豫时间根据吸附于微粒表面的水分子与本体水分子的比率而发生变化。即,微粒表面的亲水性越高,越能够吸附更多的水分子,因此弛豫时间短。
脉冲NMR的测定使用Bruker公司制的Minispec mq20装置。将浓度1% (wt/vol)的微粒分散液搅拌后,移取0.5mL到外径10mm的玻璃制NMR管中,设置在设定为30℃的脉冲NMR装置上,如下地设定各种参数来测定。
·观测核:1H
·测定的弛豫时间:横向弛豫时间T2(ms)
·测定模式:CPMG法
·累积次数:32次
·循环延迟(Recycle Delay):10(s)
·90°-180°脉冲间隔(Pulse Separation)(τ):2(ms)
·获得的回声总数(Total Number of Acquired Echoes):2000点。
对得到的磁化衰减曲线(表示磁化强度的经时变化的曲线),使用 MicrosoftExcel的指数近似功能通过最小二乘法拟合为下述式(1):
M(t)=M0·exp(-t/T2)···式(1)
{式中,M(t):某一时间t的信号强度、M0:信号强度的初始值、T2:弛豫时间。}。
为了由测定的弛豫时间算出亲水化度,准备以弛豫时间的变化比例(Rsp 值)为纵轴、以微粒的总表面积值(TSA值)为横轴而标绘的图,通过最小二乘法制作近似直线,将其斜率定义为亲水化度。
·Rsp值的计算方法
Rsp值=Rav÷Rb-1
{式中,Rav:平均弛豫时间常数(试样的弛豫时间倒数)、Rb:本体水分子的弛豫时间常数(空白水的弛豫时间倒数)。}、
·TSA值(m2)的计算方法
TSA值=SA×V×Ψp×ρ
{式中,SA:微粒的比表面积(m2/g)=6÷(ρ×d)、此处,ρ:微粒密度(g/cm3)(微粒密度:1.4g/cm3、胶乳颗粒密度:1.0g/cm3、金胶体颗粒密度:19.3g/cm3)、d:微粒直径(μm)、V:照射无线电波的部分的NMR 管体积(cm3)(≈试样量)、Ψp:微粒体积比、此处,微粒体积(i)=微粒浓度(wt%)÷100÷微粒密度、水的体积(ii)=(1-微粒体积(i))÷水的密度(0.997g/cm3)、Ψp(微粒体积比)=微粒体积(i)÷水的体积(ii)、ρ:同上。}。
例如,如图1所示,在图中标绘出A微粒(TSA值0.5、Rsp值10)和 B微粒(TSA值1、Rsp值5)的数值,通过最小二乘法制作各自的近似直线。A微粒的情况下Y=20x、B微粒的情况下Y=5x。将近似直线的斜率(亲水化度)大者、即A微粒判定为亲水化度大。
本实施方式中,亲水化度优选为30.0~200.0的范围。亲水化度处于该范围时,颗粒表面是亲水的,因此不仅在膜中容易移动,而且微粒表面上的蛋白质等的吸附量减少。其结果,用于免疫层析时假阳性减少。而且令人惊讶的是,处于该范围的微粒的亲水层作为保护层而发挥功能,因此在导入羧基时不易引起显色强度的降低。因此,成为能耐受严酷的反应条件的微粒,因此能够使羧基的导入量为多量。其结果,抗体也能够大量负载于微粒上,因此能够成为维持了高的检测灵敏度的微粒。亲水化度不足30.0时,微粒表面变为疏水的,因此蛋白质等吸附在微粒表面,容易产生假阳性。而且,在膜中流动变差、诊断时间也变长。另外,不足30.0时,变得在进行羧基导入反应时容易引起微粒的显色强度的降低,因此检测灵敏度降低。从以上的观点出发,亲水化度的下限更优选为35.0、进一步优选为40.0。另一方面,亲水化度大于200.0时,氢键成为主导,因此有蛋白质等生物分子的吸附量增加,产生假阳性的担心,因此亲水化度的上限更优选为190.0、进一步优选为180.0。
用语“间隔基团”是指借助“亲水层”将微粒和羧基连接的化学基团。本实施方式中,“间隔基团”与“亲水层”的反应性基团结合,另一方面“亲水层”与微粒的羟基结合。例如,借助与微粒结合的硅烷层使18-溴硬脂酸反应的情况下,亲水层为硅烷层、间隔基团为(CH2)17。间隔基团的结构没有特别限定,可以使用烷基、烯基、烷烃基、及苯环等烃系等的疏水性的结构体。对于碳数也没有特别限定,从能够在不受颗粒表面的双电层的影响的情况下期待灵敏度提高的方面出发,优选3以上。通常亲水性的结构体对生物分子的吸附抑制有效,因此微粒表面为疏水的金胶体、胶乳颗粒、二氧化硅颗粒等常常使用PEG等亲水性的间隔基团。例如,长崎等报告了通过向金表面导入长度不同的PEG链,能够大幅减少非特异性吸附(参照长崎等、高分子61 卷2号2012年)。这是因为,认为烃系等疏水性的间隔基团通过疏水性相互作用,间隔基团吸附在微粒表面。因此,有如下的担心:羧基与抗体的反应性差,微粒上不能固定所需量抗体,检测灵敏度降低。另外,通常疏水性的结构体容易与蛋白质等发生疏水性相互作用。即若用于间隔基团,则蛋白质等生物分子会吸附,产生假阳性可能性高。与此相对,本发明等推翻该常识,通过将微粒表面的亲水层和烃系等疏水性的间隔基团组合,令人惊讶的是成功地大幅减少成为假阳性原因的生物分子的吸附量,确认了能够维持检测灵敏度、并且假阳性大幅减少。认为间隔基团为亲水性时,在微粒表面存在亲水层,因此与亲水层发生氢键等相互作用。因此,间隔基团吸附于亲水层,抗体不能以所需量固定于微粒,检测灵敏度降低,而且还不能减少生物分子的吸附量,也不能达成假阳性的抑制。另一方面,认为使用烃系等疏水性的间隔基团的实施方式中,不仅间隔基团不吸附于亲水层,间隔基团彼此还通过疏水性相互作用整齐地排列,没有间隙地紧密地导入到微粒上,因此生物分子接近微粒表面和/或间隔基团的间隙消失,能够大幅减少吸附量、也能够大幅减少假阳性。
例如,如以下的表1所示,使用了PEG链的实施例15的假阳性发生率为1%,而使用了疏水性间隔基团的实施例2的假阳性发生率为0%,使用了 PEG链的实施例17的假阳性发生率为1%,而使用了疏水性间隔基团的实施例1的假阳性发生率为0%,使用了PEG链的实施例18的假阳性发生率为 2%,而使用了疏水性间隔基团的实施例16的假阳性发生率为1%,而且使用了PEG链的实施例20的假阳性发生率为2%,而使用了疏水性间隔基团的实施例19的假阳性发生率为1%。
间隔基团的鉴定方法可以使用红外分光法、元素分析、核磁共振法 (NMR)、质量分析(MS)法等。例如,使导入有羧基的微粒在高温下与强酸或强碱反应,使间隔基团部从微粒脱离。其后,通过离心分离等将微粒分离,对上清液进行NMR、MS测定,由此能够鉴定间隔基团的结构。
用语“羧基的导入量”是指每1g着色纤维素微粒中导入的羧基的量。所述导入量优选为0.20~3.00mmol/g。通过处于该范围,从而抗体、封闭剂(blocking agent)中使用的蛋白质等能够与微粒牢固地且大量地化学结合,因此能够兼顾高灵敏度化和假阳性减少。导入量不足0.20mmol/g时,抗体等蛋白质的结合量不充分,因此有进行加入添加剂等假阳性减少对策时,检测灵敏度降低的担心。进而,不足0.20mmol/g时,所导入的羧基彼此的距离远,因此未与抗体等反应的羧基不在分子内,而使容易诱发分子间的氢键合。即有蛋白质等借助氢键而吸附,产生假阳性的担心。因此,羧基的导入量的下限优选为 0.25mmol/g、更优选为0.30mmol/g。另一方面,导入量超过3.00mmol/g时,平均1个颗粒的重量变重,因此平均1个微粒的显色强度降低。显色强度降低时,有用于免疫层析时检测灵敏度降低的担心,因此上限优选为2.50mmol/g、更优选为2.00mmol/g。
作为导入量的算出方法,可列举出荧光测定法、中和滴定法、红外分光法等。本实施方式中,为了准确测定能与抗体、蛋白质反应的羧基量,主要使用荧光测定法。使用仅在与羧基反应的情况下会发光的荧光试剂。首先,用羧基量已知的样品针对羧基量与发光强度的关系制作标准曲线。其后,使荧光试剂与微粒反应。测定该微粒的荧光强度,得到发光强度。将所得发光强度代入标准曲线,算出羧基量。
作为导入羧基时的羧基化剂,没有特别限定,作为具体例,可列举出以下物质:2-溴乙酸、3-溴丙酸、4-溴丁酸、5-溴戊酸、6-溴己酸、7-溴庚酸、 8-溴辛酸、11-溴十一烷酸、18-溴硬脂酸、16-十七碳烯酸、5-己烯酸、环氧氯丙烷、4-氨基丁酸、3-氨基丙酸、5-氨基戊酸、6-氨基己酸、7-氨基庚酸、 8-氨基辛酸、己二酸、二十烷二酸、1,8-辛烷二羧酸、1,4-丁烷二羧酸、1,6- 己烷二羧酸、2-氯乙酸、3-氯丙酸、4-氯丁酸、5-氯戊酸、6-氯己酸、7-氯庚酸、8-氯辛酸、11-氯十一烷酸、18-氯硬脂酸、氨基-PEG12-丙酸、氨基-PEG8- 丙酸、氨基-PEG4-丙酸、α,w-双[2-{(3-羧基-1-氧丙基)氨基}乙基]聚乙二醇、HO-PEG12-COOH、HO-PEG12-丙酸、HO-PEG8-丙酸、O-(2-羧基乙基)聚乙二醇、COOH-PEG12-COOH、聚(乙二醇)双(羧基甲基)醚、丙酸-PEG12-丙酸、丙酸-PEG8-丙酸、丙酸-PEG4-丙酸。其中优选为3-溴丙酸、 4-溴丁酸、5-溴戊酸、6-溴己酸、7-溴庚酸、8-溴辛酸、11-溴十一烷酸、18- 溴硬脂酸、己二酸、二十烷二酸、1,8-辛烷二羧酸、1,4-丁烷二羧酸、1,6-己烷二羧酸,更优选为8-溴辛酸、11-溴十一烷酸、18-溴硬脂酸、己二酸、二十烷二酸、1,8-辛烷二羧酸。
本说明书中,“微粒”是指长径(L)与短径(D)的长度接近、形状接近于球的结构体。具体而言,是指L÷D表示的L/D比为1.0~3.0的结构体。L/D处于该范围时,作为免疫层析诊断试剂盒使用时不易引起堵塞,更优选为 1.0~2.0、进一步优选为1.0~1.5、最优选为1.0~1.3。作为测定方法,拍摄颗粒的电子显微镜图像,测定100个颗粒的长径(L)和短径(D),算出该100 个的平均值。
着色纤维素微粒的制造方法没有特别限定。可列举出:首先将微粒成形并使其负载色素、染料等着色成分的方法;将微粒成形并使其负载金属胶体、颜料等更小的显色微粒的方法;在微粒的成形时一起加入色素、染料、颜料、金属胶体等着色成分而进行成形的方法等。其中从粒径的调整、颜色深浅的调整、颜色种类的调整、微粒表面状态的调整等微粒的特征调整的容易性的方面出发,优选先将微粒成形再使其负载色素、染料等着色成分的方法。另外,作为负载的着色成分,从负载的容易性出发,优选染料。
使用染料作为着色成分的情况下,染料的种类没有特别限定。可以使用反应染料、直接染料、含金染料、酸性染料、碱性染料、分散染料、硫化染料、植物染料、萘酚染料、荧光染料等染料。当然可以组合任意染料。其中从能够大量保持染料的方面、稳定性的方面出发,特别优选与纤维素的羟基以共价键结合的反应性染料。
首先将纤维素微粒成形、其后使其负载着色成分的情况下,纤维素微粒的成形方法没有特别限定。可列举出:对天然的纤维素利用球磨机、高压均质机以物理方式进行微细化的方法;用酸、碱等以化学方式进行处理而进行微细化的方法;使纤维素暂时溶解于其良溶剂并成形为颗粒状的方法等。另外,也可以将被衍生化的纤维素溶解并成形为颗粒状、并使被衍生化的取代基恢复成羟基,从而制备纤维素微粒。进而可以将这些成形方法组合。另外,纤维素的种类也没有特别限定,可以使用再生纤维素、纯化纤维素、天然纤维素、将被衍生化的取代基恢复成羟基的纤维素等。其中从粒径的调整、颗粒形状的调整等方面出发,优选暂时溶解于良溶剂并成形为颗粒状的方法,作为纤维素的种类,优选再生纤维素。
使纤维素暂时溶解于其良溶剂并成形为颗粒状的情况下,使纤维素溶解的良溶剂的种类也没有特别限定,可以使用铜氨溶液、胶粘纤维溶液、N- 甲基吗啉、各种离子性液体等能够将纤维素溶解的各种各样的良溶剂。其中从粒径的调整、颗粒形状的调整等方面出发,优选铜氨溶液。另外,将溶解的纤维素成形为颗粒的方法也没有特别限定。本实施方式中,使用利用相分离的方法。
用语“配体”是指具有与特定的检查对象物质选择性并且特异性地结合的性质的物质。其种类没有特别限定,例如,可列举出抗体、酶、基因、激素、核酸、肽、蛋白质等。
用语“免疫层析诊断试剂盒”是指利用了用于简便地检测各种各样的待检体中的检查对象物质有无的抗原抗体反应的物品。作为免疫层析诊断试剂盒的种类,有侧流式、流通式。只要使用显色颗粒、样品垫就没有特别限定,优选为侧流式。另外,侧流式中有试纸条型和盒型,但对它们的类型没有特别限定。免疫层析诊断试剂盒的构成没有特别限定,只要是该领域中通常使用的构成即可。对于显色颗粒和样品垫以外的构件的种类,只要是该领域中使用的构件就没有特别限定,例如,可列举出结合垫(包含抗体致敏显色颗粒)、硝基纤维素等膜、吸收垫、及衬纸。另外,也可以根据需要省略这些构件的一部分。
使用免疫层析诊断试剂盒的“诊断方法”是指使用免疫层析诊断试剂盒进行的各种各样的诊断。诊断对象没有特别限定,可以为人用、动物用、食品用、植物用、其他环境检查等各种各样的诊断对象。通常的诊断步骤中,从检查对象采取待检体试样,必要时对其进行提取、过滤等前处理,滴加至样品垫,从检查开始起等待规定时间,通过由检查对象物质的有无引起的不同的显色来判断诊断结果。当然不限定于该步骤,也可以用于同样的步骤、原理的诊断。优选的是,通过预先过滤待检体试样而能够去除多余的异物、污染物,由此能够期待诊断时间的进一步缩短化、诊断精度的提高。
能够以免疫层析诊断试剂盒诊断的对象没有特别限定,作为具体例,可列举出以下物质:癌标记物、激素、感染症、自身免疫、血浆蛋白、TDM、凝血·纤溶、氨基酸、肽、蛋白、基因、细胞。更具体而言,可以举出CEA、 AFP、铁蛋白、β2微球蛋白、PSA、CA19-9、CA125、BFP、弹性蛋白酶1、胃蛋白酶原1·2、便潜血、尿β2微球蛋白、PIVKA-2、尿BTA、胰岛素、E3、 HCG、HPL、LH、HCV抗原、HBs抗原、HBs抗体、HBc抗体、HBe抗原、 HBe抗体、HTLV-1抗体、HIV抗体、弓形虫抗体、梅毒、ASO、甲型流感抗原、甲型流感抗体、乙型流感抗原、乙型流感抗体、轮状病毒抗原、腺病毒抗原、轮状病毒·腺病毒抗原、A族链球菌、B族链球菌、念珠菌抗原、CD 菌、隐球菌抗原、霍乱菌、脑膜炎菌抗原、粒细胞弹性蛋白酶、幽门螺杆菌抗体、O157抗体、O157抗原、钩端螺旋体抗体、曲霉菌抗原、MRSA、RF、总IgE、LE检测(lupus erythematosus test,红斑狼疮检测)、CRP、IgG,A,M、 IgD、转铁蛋白、尿白蛋白、尿转铁蛋白、肌红蛋白、C3·C4、SAA、LP(a)、α1-AC、α1-M、触珠蛋白、微量转铁蛋白、APR评分(Acute Phase ReactantScore,急性期反应物评分)、FDP、D-二聚体、纤溶酶原、AT3、α2PI、PIC、PAI-1、蛋白C、凝血因子XIII、IV型胶原、透明质酸、GHbA1c、其它各种抗原、各种抗体、各种病毒、各种菌、各种氨基酸、各种肽、各种蛋白质、各种DNA、各种细胞、各种过敏原、各种残留农药、各种有害物质。
以下,记载了纤维素微粒的制作方法、纤维素微粒的着色方法、着色纤维素微粒的亲水化方法、羧基的导入方法、免疫层析诊断试剂盒的制作方法等的一例,当然,本实施方式不应受这些示例的任何限定。
〔纤维素微粒的制作方法〕
将纤维素棉绒溶解于纤维素的良溶剂中。作为良溶剂,使用通过公知的方法制备的铜氨溶液。而且,作为凝固液,主要使用有机溶剂+水+氨混合体系。一边搅拌该凝固液一边加入预先制备的铜氨纤维素溶液进行凝固。进而加入硫酸进行中和、再生,由此能够得到含有目标纤维素微粒的浆料。此时,浆料因再生中使用的酸的残留而为酸性,进而由于含有中和中产生的铵盐等杂质,因此需要纯化成包含纤维素微粒和介质的纤维素分散液的操作。作为该纯化操作,反复进行离心分离-倾析-利用分散介质液体的稀释的处理。得到的纤维素微粒分散液中的纤维素微粒在纯化操作的过程中有时也发生聚集,因此该情况下可以进行利用剪切等的分散处理。作为提供剪切的手段,使用高压均质机。
〔纤维素微粒的着色方法〕
对于得到的纤维素微粒的水分散体,加入硫酸钠、反应性染料,一边用磁力搅拌器进行搅拌一边用恒温槽升温至适当温度。升温后加入作为碱的碳酸钠,开始染色。经过规定时间后,能够得到含有目标着色纤维素微粒的浆料。此时浆料为碱性,进而含有硫酸钠、未反应的染料等,因此需要纯化成包含着色纤维素微粒和介质的着色纤维素微粒分散液的操作。与前述同样地进行基于离心分离的纯化,得到着色纤维素微粒分散液。所得着色纤维素微粒分散液中的着色纤维素微粒在纯化操作的过程中有时也发生聚集,因此该情况下可以进行基于剪切等的分散处理。作为提供剪切的手段,使用高压均质机。
〔着色纤维素微粒的亲水化方法〕
对于得到的着色纤维素微粒的水分散体,加入有机溶剂、水,一边用磁力搅拌器进行搅拌一边用恒温槽升温至适当温度。升温后加入市售的亲水化剂开始反应。经过规定时间后能够得到含有目标亲水化着色纤维素微粒的浆料。此时浆料为碱性,进而含有有机溶剂、未反应的亲水化剂等,因此需要纯化为包含亲水化着色纤维素微粒和介质的亲水化着色纤维素微粒分散液的操作。与前述同样地进行基于离心分离的纯化,得到亲水化着色纤维素微粒分散液。得到的亲水化着色纤维素微粒分散液中的亲水化着色纤维素微粒在纯化操作的过程中有时也发生聚集,因此该情况下可以进行基于剪切等的分散处理。作为提供剪切的手段,使用高压均质机。
〔羧基向亲水化着色纤维素微粒中的导入方法〕
对于得到的亲水化着色纤维素微粒的水分散体,加入有机溶剂、碱,一边用磁力搅拌器进行搅拌,一边用恒温槽升温至适当温度。升温后加入具有羧基的反应剂开始反应。经过规定时间后能够得到含有目标羧基导入亲水化着色纤维素微粒的浆料。此时,浆料含有有机溶剂、碱、未反应的反应剂等,因此需要纯化为包含羧基导入亲水化着色纤维素微粒和介质的羧基导入亲水化着色纤维素微粒分散液的操作。与前述同样地进行基于离心分离的纯化,得到羧基导入亲水化着色纤维素微粒分散液。得到的羧基导入亲水化着色纤维素微粒分散液中的羧基导入亲水化着色纤维素微粒在纯化操作的过程中有时也会发生聚集,因此该情况下可以进行基于剪切等的分散处理。作为提供剪切的手段,使用高压均质机。
〔免疫层析诊断试剂盒的制作方法〕
准备调整为规定的浓度的羧基导入亲水化着色纤维素微粒的分散液,加入缓冲液、抗体,一边进行温度调整一边搅拌一定时间,使抗体与羧基导入亲水化着色纤维素微粒结合。搅拌一定时间后,进而加入封闭剂,一边进行温度调整一边搅拌一定时间,由此进行羧基导入亲水化着色纤维素微粒的封闭。作为封闭剂,可以根据检查对象物质、待检体或对它们进行稀释的溶液的组成等而使用各种各样的封闭剂。酪蛋白对羧基导入亲水化着色纤维素微粒的封闭是特别优选的。对了对抗体结合&封闭后的羧基导入亲水化着色纤维素微粒进行清洗,进行离心分离,将含有剩余抗体和封闭剂的上清液与沉降的微粒分离,通过倾析将上清液去除。向沉降的微粒中加入缓冲液等液体,根据需要利用超声波等进行分散处理。通过利用该离心分离的沉降、上清液的去除、液体的添加这一系列操作而以所需次数进行清洗,制备含有规定浓度的进行了抗体吸附&封闭的微粒的分散液。根据需要向该分散液中加入蛋白质、表面活性剂、蔗糖、海藻糖等糖,将得到的溶液以一定量涂布于玻璃纤维制的结合垫并使其干燥,制备含检测试剂部。另外,根据需要在再生纤维素连续长纤维无纺布上涂布缓冲液、表面活性剂、蛋白、捕捉待检体试样中的污染物的试剂、防腐剂、抗菌剂、抗氧化剂、吸湿剂等并使其干燥,制备样品垫。进而制备将抗体固定于规定位置的硝基纤维素多孔膜制的膜、用于吸收待检体的纤维素滤纸制的吸收垫。将它们固定于被称为衬板(backing sheet)的具有粘接部位的片,裁切成规定的尺寸,由此制作免疫层析诊断试剂盒。
实施例
以下,通过实施例更具体地对本发明进行说明,但本发明不仅限定于这些实施例。另外,如果没有特别记载,所有操作均在温度23℃、相对湿度 55%RH的环境下进行。
首先,对使用的各种物性等的测定方法等进行说明。
〔微粒的平均粒径〕
作为装置,使用日机装公司制的Nanotrac粒度分布测定装置UPA-EX150 (动态光散射式)。作为测定样品,使用微粒为0.01wt%、纯水为99.99wt%的样品。作为测定条件,将累积次数设为30次、将每1测定的测定时间设为30秒,使用体积平均的粒径分布,将其中值粒径作为平均粒径。
〔微粒的显色强度〕
作为装置,使用在日本分光株式会社制的紫外可见近红外分光光度计 JASCOV-650上安装有该公司制的积分球单元ISV-722的装置。作为测定的样品,使用微粒为0.01wt%、纯水为99.99wt%的样品,将样品放入到光路长度10mm的石英皿中进行测定。在得到的吸光度峰中,将400~800nm可见光范围内的最大值(ABS)作为显色强度。
〔微粒的L/D(球度)〕
作为装置,使用日本电子株式会社制的扫描型电子显微镜JSM-6700。将微粒为0.01wt%、纯水为99.99wt%的样品滴加到云母板上,经过10秒,由此使微粒吸附于云母板上,用无尘纸(KimWipe)吸取多余的液体使其干燥。用铂包覆得到的云母板,制备电子显微镜测定用的样品。以加速电压 1.6kV、测定倍率5万倍进行观测,以微粒图像成为100个以上的方式拍摄所需张数的图像,测定各个微粒的长径(L)和短径(D),算出100个微粒的L/D的平均值。
〔间隔基团结构的鉴定〕
作为装置,使用Bruker公司制的核磁共振装置(AVANCE II400)。在导入有间隔基团的微粒的1.0wt%分散液中加入0.1mL、1.0M的氢氧化钠水溶液(和光纯药株式会社制、72082100)、或1.0M的盐酸水溶液(和光纯药株式会社制、080-10035)10.0mL,在60℃下进行5小时加热搅拌。其后,通过离心分离采取上清液,得到溶解或分散有从微粒切断的间隔基团的溶液。以最适的氘代溶剂将该溶液稀释,利用核磁共振装置进行NMR测定,根据得到的图谱对结构物进行鉴定。
〔羧基的导入量〕
作为装置,使用日本分光株式会社制的分光荧光光度计FP-8300。使仅在与羧基反应的情况下会发出荧光的试剂与微粒结合,根据其荧光强度测定导入量。以下示出测定例。将测定了导入量的微粒的1.0wt%分散液0.1mL、荧光试剂ADAM(KAK公司制、FK-101)的2.3mM的乙醇溶液4.0mL、乙醇(关东化学株式会社制、14033-70)3.9mL放入容器中,在60℃下反应5 分钟。其后,在得到的反应液10.0μL中添加乙醇2.0mL,用FP-8300照射 365nm的激发光,测定410nm的荧光强度。标准曲线使用辛酸(东京化成株式会社制、O0027)。
〔残留反应性氨基量〕
作为装置,使用日本分光株式会社制的分光荧光光度计FP-8300。使仅在与氨基反应的情况下会发出荧光的试剂与微粒结合,根据其荧光强度测定导入量。以下示出测定例。将想要测定残留反应性氨基量的微粒的1.0wt%分散液0.1mL、荧光试剂NBD-F(同仁化学株式会社制)的2.5mM的乙醇溶液4.0mL、乙醇(关东化学株式会社制、14033-70)3.9mL放入容器中,在30℃下反应60分钟。其后,在得到的反应液10.0μL中添加乙醇2.0mL,用FP-8300照射480nm的激发光,测定530nm的荧光强度。标准曲线使用辛胺(东京化成株式会社制、O0045)。
〔微粒的亲水化度〕
将微粒分散液调制成浓度1%(wt/vol),作为试样溶液。将试样溶液搅拌后,移取0.5mL至外径10mm的玻璃制NMR管,并设置在设定为30℃的脉冲NMR装置中。脉冲NMR装置使用Bruker公司制的Minispec mq20装置。如下地设定各种参数进行测定。
·观测核:1H
·测定的弛豫时间:横向弛豫时间T2(ms)
·测定模式:CPMG法
·累积次数:32次
·循环延迟:10(s)
·90°-180°脉冲间隔(τ):2(ms)。
对得到的磁化衰减曲线(表示磁化强度的经时变化的曲线),使用 MicrosoftExcel的指数近似功能通过最小二乘法拟合为下述式(1)。
M(t)=M0·exp(-t/T2)···(式1)
{式中,M(t):某一时间t的信号强度、M0:信号强度的初始值、T2:弛豫时间。}。
接着,如图1所示,制作以弛豫时间的变化比例(Rsp值)为纵轴、以微粒的总表面积值(TSA值)为横轴而标绘的图。通过最小二乘法制作近似直线,将其斜率定义为亲水化度,并比较微粒的亲水化度。Rsp值和TSA值的计算方法如下。
·Rsp值的计算方法
Rsp值=Rav÷Rb-1
{式中,Rav:平均弛豫时间常数(试样的弛豫时间倒数)、Rb:本体水分子的弛豫时间常数(空白水的弛豫时间倒数)。}。
·TSA值(m2)的计算方法
TSA值=SA×V×Ψp×ρ
{式中,SA:微粒的比表面积(m2/g)=6÷(ρ×d)、此处,ρ:微粒密度(g/cm3)(微粒密度:1.4g/cm3、胶乳颗粒密度:1.0g/cm3、金胶体颗粒密度:19.3g/cm3)、d:微粒直径(μm)、V:照射无线电波的部分的NMR 管体积(cm3)(≈试样量)、Ψp:微粒体积比、此处,微粒体积(i)=微粒浓度(wt%)÷100÷微粒密度、水的体积(ii)=(1-微粒体积(i))÷水的密度(0.997g/cm3)、Ψp(微粒体积比)=微粒体积(i)÷水的体积(ii)、ρ:同上。}。
〔蛋白质吸附量〕
作为装置,使用日本分光株式会社制的紫外可见近红外分光光度计 JASCOV-650。示出作为蛋白质的一例的牛血清白蛋白(以下,称为“BSA”、 Sigma-Aldrich公司制、A7906)的吸附量的算出方法。使想要测定吸附量的微粒的1.0wt%分散液30.0μL、pH=5.0浓度100mM的磷酸缓冲液(KISHIDA CHEMICAL Co.,Ltd.制)270.0μL、1.0wt%的BSA溶液3.0μL在37℃下反应 2小时,其后通过离心分离采取上清液。使该上清液与市售的BCA试剂(和光纯药株式会社制、297-73101)反应,通过V-650测定562nm的吸光度,算出上清液中的BSA量。其后从投入的BSA量中减去上清液中的BSA量,除以使用的微粒量,算出进行了怎样程度的吸附。
〔导入有羧基的亲水化纤维素微粒与抗体的结合方法〕
使用2-吗啉乙磺酸(以下,称为“MES”、东京化成株式会社制、M0606)、苛性钠、纯水来制备pH=6.0、浓度为100mM的MES缓冲液。将得到的MES 缓冲液63.0μL、羧基导入亲水化着色纤维素微粒1.0wt%分散液7.0μL、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(以下,称为“EDC”、东京化成株式会社制、D1601)的1.0wt%溶液3.5μL、N-羟基琥珀酰亚胺(以下,称为“NHS”、东京化成株式会社制、B0249)的1.0wt%溶液7.0μL放入到容器中,室温下放置15分钟。其后,通过离心分离弃掉上清液而去除未反应的 EDC、NHS。放入MES缓冲液70.0μL,使微粒分散后,以相对于羧基导入亲水化着色纤维素微粒成为10.0wt%的方式将抗hCG抗体(Fitzgelardh制、 #5014)添加到离心管(Spitz tube)中,在37℃下反应2小时。其后,将含有1.0wt%酪蛋白(和光纯药工业株式会社制、030-01505)的封闭溶液(100mM 硼酸缓冲液、PH=8.5)840.0μL添加到离心管中,在37℃的干燥机器内静置 1小时。1小时后,使用离心分离机(久保田商事株式会社制、6200)和离心分离转子(久保田商事株式会社制、AF-5008C),进行30分钟14000g 的离心,使抗体结合羧基导入亲水化着色纤维素微粒沉降后,废弃上清液。接着,将硼酸缓冲液(50mM、PH=10.0)840.0μL加入到离心管中,用超声波分散机(SMT公司制、UH-50)进行10秒钟处理,使抗体结合羧基导入亲水化着色纤维素微粒分散。充分分散后,进行20分钟14000g的离心,废弃上清液。以抗体结合羧基导入亲水化着色纤维素微粒的浓度成为0.04wt%的方式添加硼酸缓冲液(50mM、PH=10.0),利用超声波分散机使其充分分散。通过以上的方法,得到抗体结合羧基导入亲水化着色纤维素微粒(以下,也称为“检测试剂”。)。
〔检测试剂向结合垫的浸渗和干燥〕
将聚对苯二甲酸乙二醇酯制结合垫(Ah制、6615)浸渍于0.05wt%的 Tween-20(Sigma-Aldrich公司制、T2700),去除多余的液体后,在50℃下干燥60分钟。接着,切割成高度10mm、长度300mm的形状。接着,用微量移液管,将检测试剂以成为272μL/800mm2的方式均等地涂布,在37℃下干燥30分钟。
〔样品垫的前处理〕
将再生纤维素连续长纤维无纺布浸渗于含有大量过剩的2.0wt%的BSA (Sigma-Aldrich公司制、A7906)和2.0wt%的Tween-20的PBS缓冲液(66mM、 PH7.4),去除多余的液体后,在50℃下干燥60分钟。接着,切割成高度 20mm、长度300mm的形状。
〔捕捉抗体涂布膜的制备〕
将硝基纤维素膜(Millipore公司制、SHF0900425)切割成宽度25mm、长度300mm的形状。使用液体涂布装置(Musashi engineering CO.,LTD制、 300DS),将包含0.1wt%抗hCG-β小鼠抗体(MedixBiochemica公司制、6601) 的PBS溶液(66mM、PH7.4)以0.1μL/mm的比例涂布于高度12mm的部分。接着,在37℃下干燥30分钟。
〔免疫层析诊断试剂盒的制备〕
将如前所述那样得到的捕捉抗体涂布膜、吸收垫(Millipore公司制、 C083)、含有检测试剂的结合垫、及样品垫贴合于包装卡(packing card、 Adhesives Reserch公司制、AR9020)。接着,用裁切机切割成5mm的宽度,得到宽度5mm、高度60mm的免疫层析诊断试剂盒。
〔免疫层析诊断试剂盒的假阳性判定〕
用未妊娠的100人的尿实施假阳性测定。对经过15分钟后的测试线(TL) 的显色强度以目视进行0-10这11个级别的等级评价。如图2所示,目视等级的值越大,显示TL的线的颜色越深,0表示未看到线。进行5次该测定,以得到的值的平均值计目视等级为0时,判断为没有假阳性。数出100个待检体中产生假阳性的待检体数,除以100,作为假阳性的发生率。另外,对产生了假阳性的待检体记录目视等级。
〔免疫层析诊断试剂盒的诊断时间〕
将切割成5mm宽度的免疫层析诊断试剂盒放入塑料的外壳中。对得到的带有外壳的诊断试剂盒以0-10这11个级别的目视等级进行判定。检查对象物质使用抗hCG-β小鼠抗体。将前述hCG抗体用包含1.0wt%的BSA的 66mM、PH7.4的磷酸缓冲液(以下称为“PBS”)进行稀释,制备前述hCG 抗体为10.0mIU/mL的阳性待检体。将该阳性待检体120.0μL滴加至诊断试剂盒的样品滴加部,以后每20秒通过目视进行测定,测定TL的经时变化。测定通过免疫层析读取仪得到的TL的显色强度达到1.0以上的时间。此处采用1.0以上的理由是因为,虽然存在个体差,但为1.0以上时,均能够以目视均确认TL的存在。进行5次该测定,将平均的时间作为诊断时间。
〔免疫层析诊断试剂盒的检测限〕
将切割成5mm宽度的免疫层析诊断试剂盒放入塑料的外壳中。对得到的带有外壳的诊断试剂盒以0-10这11个级别的目视等级进行判定。检查对象物质使用人绒毛膜促性腺激素(以下称为“hCG”)。将hCG用包含1.0wt%的BSA的66mM、PH7.4的磷酸缓冲液(以下称为“PBS”)进行稀释,制备前述hCG浓度为1.600mIU/mL、0.800mIU/mL、0.400mIU/mL、0.200mIU/mL、 0.100mIU/mL、0.050mIU/mL、0.025mIU/mL、0.013mIU/mL、0.007mIU/mL、 0.0025mIU/mL的逐级减小的阳性待检体。将该阳性待检体120.0μL滴加至诊断试剂盒的样品滴加部,目视判定经过15分钟后的TL的显色强度。在各浓度下进行5次该测定,得到的值的平均值为1.0以上时判定为阳性,不足 1.0不足时视为检测限以下。将可获得该阳性判定的下限的hCG浓度设为检测限。
〔实施例1〕
通过以往公知的方法,制备纤维素浓度0.37wt%、铜浓度0.13wt%、氨浓度1.00wt%的铜氨纤维素溶液。进而制备四氢呋喃浓度89.00wt%、水浓度 11.00wt%的凝固液。
一边用磁力搅拌器缓慢搅拌凝固液5000g,一边添加制备的铜氨纤维素溶液500g。继续搅拌5秒钟左右后,加入10wt%的硫酸1000g进行中和、再生,得到含有纤维素微粒的浆料6500g。
将得到的浆料以10000rpm的速度进行10分钟离心分离。通过倾析取出沉淀物,注入去离子水并搅拌,再次进行离心分离。重复多次该操作直到pH 变为6.0~7.0,其后,进行利用高压均质机的分散处理,得到纤维素微粒分散液150g。对得到的纤维素微粒的平均粒径进行测定,结果为261nm。
接着,进行前述制备的纤维素微粒的染色。对将微粒浓度调整为1.00wt%的纤维素微粒分散体100g,加入硫酸钠30g、反应性染料(DyStar公司制 LevafixRedCAGR.(注册商标))1.00g,一边搅拌一边用恒温槽升温至60℃。升温至60℃后加入碳酸钠4g,进行2小时染色。将得到的粗着色微粒用氢氧化钠5%水溶液清洗,通过离心分离进行回收,用纯水进行水洗后通过离心分离进行回收,将该一系列的操作设为1个循环,实施同样的操作总计3个循环,得到着色纤维素微粒。
接着,进行前述制备的着色纤维素微粒的表面亲水化反应。对调整为 10.0wt%的着色纤维素微粒分散液10.0mL,加入作为亲水化剂的N-2-(氨基乙基)-3-氨基丙基三甲氧基硅烷(东京化成株式会社制、A0774)10.0mL、 N,N-二甲基甲酰胺(东京化成株式会社制、D0939)50.0mL,一边搅拌一边用恒温槽升温至50℃,反应4小时。反应后,通过离心分离进行回收,用纯水进行水洗后通过离心分离进行回收。反复进行上述水洗直到pH达到11.00 以下,得到亲水化着色纤维素微粒分散液。将亲水化度等颗粒物性示于以下的表1。
接着,进行羧基向前述制备的亲水化着色纤维素微粒中的导入反应。对调整为5.0wt%的亲水化着色纤维素微粒分散液10.0mL,加入作为反应剂的6- 溴己酸(东京化成株式会社制,B1290)6.0g、N,N-二甲基甲酰胺(东京化成株式会社制、D0939)50.0mL、作为碱的碳酸钠(KISHIDA CHEMICAL Co.,Ltd.制,000-71245)0.1g,一边搅拌一边用恒温槽升温至50℃,反应6小时。反应后,通过离心分离进行回收,用2-丙醇(东京化成株式会社制、I0277) 进行3次基于离心分离的清洗后,用纯水进行3次基于离心分离的清洗,得到羧基导入表面亲水化着色纤维素微粒。得到的微粒为羧酸钠型,因此添加 0.1M HCl溶液(和光纯药株式会社制、083-01115)15.0mL、纯水35.0mL,在室温下反应2小时。其后,通过离心分离进行回收,用纯水进行水洗后通过离心分离进行回收。实施水洗直到pH达到4.0以上,得到羧基导入亲水化着色纤维素微粒分散液。将羧基的导入量等物性、及使用该微粒作为显色颗粒时的免疫层析性能示于以下的表1。因亲水层与间隔基团的效果,能够大幅减少蛋白质的吸附。其结果,假阳性发生率为0%。关于检测灵敏度,由于羧基量多,从而足够量的抗体被固定在微粒表面上,因此维持了高的检测灵敏度。另外,微粒因亲水层的影响而不会吸附于膜上,能够迅速地移动,因此能够缩短诊断时间。
〔实施例2〕
羧基导入反应中,将碳酸钠的量变更为9.9g,除此以外,通过与实施例 1同样的方法制作羧基导入亲水化着色纤维素微粒。将该微粒的物性、及用作显色颗粒时的免疫层析性能示于以下的表1。与实施例1同样地进行基于亲水层的亲水化、大量导入疏水性的间隔基团及羧基,由此能够大幅减少蛋白质的吸附。其结果,假阳性发生率为0%。关于检测灵敏度,由于羧基量多,从而足够量的抗体被固定在微粒表面上,因此维持了高的检测灵敏度。另外,微粒因亲水层的影响而不会吸附于膜上,能够迅速地移动,因此能够缩短诊断时间。
〔实施例3〕
羧基导入反应中,将碳酸钠的量变更为29.7g,除此以外,通过与实施例1同样的方法制作羧基导入亲水化着色纤维素微粒。将该微粒的物性、及用作显色颗粒时的免疫层析性能示于以下的表1。与实施例1同样地进行基于亲水层的亲水化、大量导入疏水性的间隔基团及羧基,由此能够大幅减少蛋白质的吸附。其结果,假阳性发生率为0%。关于检测灵敏度,由于羧基量多,从而足够量的抗体被固定在微粒表面上,因此维持了高的检测灵敏度。另外,微粒因亲水层的影响而不会吸附于膜上,能够迅速地移动,因此能够缩短诊断时间。
〔实施例4〕
将染色反应变更为5个循环,羧基导入反应中,将碳酸钠的量变更为9.9g,除此以外,通过与实施例1同样的方法制作羧基导入亲水化着色纤维素微粒。将该微粒的物性、及用作显色颗粒时的免疫层析性能示于以下的表1。与实施例1同样地进行基于亲水层的亲水化、大量导入疏水性的间隔基团及羧基,由此能够大幅减少蛋白质的吸附。其结果,假阳性发生率为0%。关于检测灵敏度,由于羧基量多,从而足够量的抗体被固定在微粒表面上,因此维持了高的检测灵敏度。另外,微粒因亲水层的影响而不会吸附于膜上,能够迅速地移动,因此能够缩短诊断时间。
〔实施例5〕
羧基导入反应中,变更为将反应剂变更为11-溴十一烷酸(东京化成株式会社制、B0389)7.2g、将碳酸钠的量变更为9.9g的条件,除此以外,通过与实施例1同样的方法制作羧基导入亲水化着色纤维素微粒。将该微粒的物性、及用作显色颗粒时的免疫层析性能示于以下的表1。与实施例1同样地进行基于亲水层的亲水化、大量导入疏水性的间隔基团及羧基,由此能够大幅减少蛋白质的吸附。其结果,假阳性发生率为0%。关于检测灵敏度,由于羧基量多,从而足够量的抗体被固定在微粒表面上,因此维持了高的检测灵敏度。另外,微粒因亲水层的影响而不会吸附于膜上,能够迅速地移动,因此能够缩短诊断时间。
〔实施例6〕
羧基导入反应中,将反应剂变更为二十烷二酸(东京化成株式会社制、 E0320)10.0g、将碳酸钠的量变更为9.9g,除此以外,通过与实施例1同样的方法制作羧基导入亲水化着色纤维素微粒。将该微粒的物性、及用作显色颗粒时的免疫层析性能示于以下的表1。与实施例1同样地进行基于亲水层的亲水化、大量导入疏水性的间隔基团及羧基,由此能够大幅减少蛋白质的吸附。其结果,假阳性发生率为0%。关于检测灵敏度,由于羧基量多,从而足够量的抗体被固定在微粒表面上,因此维持了高的检测灵敏度。另外,微粒因亲水层的影响而不会吸附于膜上,能够迅速地移动,因此能够缩短诊断时间。
〔实施例7〕
羧基导入反应中,将反应剂变更为对苯二甲酸(东京化成株式会社制、 T0166)6.5g、将碳酸钠的量变更为9.9g,除此以外,通过与实施例1同样的方法制作羧基导入亲水化着色纤维素微粒。将该微粒的物性、及用作显色颗粒时的免疫层析性能示于以下的表1。与实施例1同样地进行基于亲水层的亲水化、大量导入疏水性的间隔基团及羧基,由此能够大幅减少蛋白质的吸附。其结果,假阳性发生率为0%。关于检测灵敏度,由于羧基量多,从而足够量的抗体被固定在微粒表面上,因此维持了高的检测灵敏度。另外,微粒因亲水层的影响而不会吸附于膜上,能够迅速地移动,因此能够缩短诊断时间。
〔实施例8〕
纤维素微粒的凝固反应中,将凝固液变更为乙酸乙酯(东京化成株式会社制、Q0040)浓度94.0wt%、水浓度6.0wt%,羧基导入反应中,将碳酸钠的量变更为9.9g,除此以外,通过与实施例1同样的方法制作羧基导入亲水化着色纤维素微粒。将该微粒的物性、及用作显色颗粒时的免疫层析性能示于以下的表1。与实施例1同样地进行基于亲水层的亲水化、大量导入疏水性的间隔基团及羧基,由此能够大幅减少蛋白质的吸附。其结果,假阳性发生率为0%。关于检测灵敏度,由于羧基量多,从而足够量的抗体被固定在微粒表面上,因此维持了高的检测灵敏度。另外,微粒因亲水层的影响而不会吸附于膜上,能够迅速地移动,因此能够缩短诊断时间。
〔实施例9〕
纤维素微粒的凝固反应中,将凝固液变更为丙酮浓度27.0wt%、水浓度 0.2wt%、氨浓度72.8wt%,羧基导入反应中,将碳酸钠的量变更为9.90g,除此以外,通过与实施例1同样的方法制作羧基导入亲水化着色纤维素微粒。将该微粒的物性、及用作显色颗粒时的免疫层析性能示于以下的表1。与实施例1同样地进行基于亲水层的亲水化、大量导入疏水性的间隔基团及羧基,由此能够大幅减少蛋白质的吸附。其结果,假阳性发生率为0%。关于检测灵敏度,由于羧基量多,从而足够量的抗体被固定在微粒表面上,因此维持了高的检测灵敏度。另外,微粒因亲水层的影响而不会吸附于膜上,能够迅速地移动,因此能够缩短诊断时间。
〔实施例10〕
羧基导入反应中,将碳酸钠的量变更为9.9g、将反应剂变更为3-溴丙酸 (东京化成株式会社制、B0645)4.2g,除此以外,通过与实施例1同样的方法制作羧基导入亲水化着色纤维素微粒。将该微粒的物性、及用作显色颗粒时的免疫层析性能示于以下的表1。与实施例1同样地进行基于亲水层的亲水化、大量导入疏水性的间隔基团及羧基,由此能够大幅减少蛋白质的吸附。其结果,假阳性发生率为0%。关于检测灵敏度,由于羧基量多,从而足够量的抗体被固定在微粒表面上,因此维持了高的检测灵敏度。另外,微粒因亲水层的影响而不会吸附于膜上,能够迅速地移动,因此能够缩短诊断时间。
〔实施例11〕
表面亲水化反应中,将亲水化剂变更为N-2-(氨基乙基)-3-氨基丙基三甲氧基硅烷(东京化成株式会社制、A0774)10.0mL、及聚乙二醇硅烷 Mw2000(Creative PEG Works公司制、PLS-2012)10.0mL的混合体,羧基导入反应中,将反应剂变更为11-溴十一烷酸7.2g,除此以外,通过与实施例1同样的方法制作羧基导入亲水化着色纤维素微粒。将该微粒的物性、及用作显色颗粒时的免疫层析性能示于以下的表1。与实施例1同样地进行基于亲水层的亲水化、大量导入疏水性的间隔基团及羧基,由此能够大幅减少蛋白质的吸附。其结果,假阳性发生率为0%。关于检测灵敏度,由于羧基量多,从而足够量的抗体被固定在微粒表面上,因此维持了高的检测灵敏度。另外,微粒因亲水层的影响而不会吸附于膜上,能够迅速地移动,因此能够缩短诊断时间。
〔实施例12〕
表面亲水化反应中,将亲水化剂变更为氨基-PEG12-丙酸(Sigma- Aldrich公司制、JKA12006)10.0mL,羧基导入反应中,将反应剂变更为11- 溴十一烷酸7.2g、将碳酸钠变更为9.9g,除此以外,通过与实施例1同样的方法制作羧基导入亲水化着色纤维素微粒。将该微粒的物性、及用作显色颗粒时的免疫层析性能示于以下的表1。与实施例1同样地进行基于亲水层的亲水化、大量导入疏水性的间隔基团及羧基,由此能够大幅减少蛋白质的吸附。其结果,假阳性发生率为0%。关于检测灵敏度,由于羧基量多,从而足够量的抗体被固定在微粒表面上,因此维持了高的检测灵敏度。另外,微粒因亲水层的影响而不会吸附于膜上,能够迅速地移动,因此能够缩短诊断时间。
〔实施例13〕
羧基导入反应中,将反应剂变更为Br-(CH2)30-COOH 11.0g、将碳酸钠的量变更为9.9g,除此以外,通过与实施例1同样的方法制作羧基导入亲水化着色纤维素微粒。将该微粒的物性、及用作显色颗粒时的免疫层析性能示于以下的表1。与实施例1同样地进行基于亲水层的亲水化、大量导入疏水性的间隔基团及羧基,由此能够大幅减少蛋白质的吸附。其结果,假阳性发生率为0%。关于检测灵敏度,由于羧基量多,从而足够量的抗体被固定在微粒表面上,因此维持了高的检测灵敏度。另外,微粒因亲水层的影响而不会吸附于膜上,能够迅速地移动,因此能够缩短诊断时间。
〔实施例14〕
羧基导入反应中,将碳酸钠量变更为0.01g,除此以外,通过与实施例1 同样的方法制作羧基导入亲水化着色纤维素微粒。将该微粒的物性、及用作显色颗粒时的免疫层析性能示于以下的表1。因亲水层及疏水性间隔基团的效果,蛋白质的吸附量相比于以下的比较例1等能够减少,也可观察到假阳性减少效果。
〔实施例15〕
羧基导入反应中,将反应剂变更为聚(乙二醇)双(羧基甲基)醚Mw600 (CreativePEG Works公司制、PSB-362)16.4g,除此以外,通过与实施例 1同样的方法制作羧基导入亲水化着色纤维素微粒。将该微粒的物性、及用作显色颗粒时的免疫层析性能示于以下的表1。蛋白质的吸附量相比于以下的比较例1等能够减少若干,有假阳性减少效果。
〔实施例16〕
表面亲水化反应中,将亲水化剂的量变更为40.0mL,羧基导入反应中,将反应剂变更为11-溴十一烷酸7.2g,除此以外,通过与实施例1同样的方法制作羧基导入亲水化着色纤维素微粒。将该微粒的物性、及用作显色颗粒时的免疫层析性能示于以下的表1。由于亲水层及疏水性间隔基团的影响,与以下的比较例1相比,蛋白质的吸附量能够减少,有假阳性减少效果。
〔实施例17〕
表面亲水化反应中,将亲水化剂的量变更为8.0mL,羧基导入反应中,将反应剂变更为聚(乙二醇)双(羧基甲基)醚Mw600(Creative PEG Works 公司制、PSB-362)16.4g、将碳酸钠的量变更为0.01g,除此以外,通过与实施例1同样的方法制作羧基导入亲水化着色纤维素微粒。将该微粒的物性、及用作显色颗粒时的免疫层析性能示于以下的表1。蛋白质的吸附量相比于以下的比较例1等能够减少若干,可观察到假阳性减少效果。
〔实施例18〕
表面亲水化反应中,将亲水化剂的量变更为40.0mL,羧基导入反应中,将反应剂变更为聚(乙二醇)双(羧基甲基)醚Mw600(Creative PEG Works 公司制、PSB-362)16.4g、将碳酸钠量变更为9.9g,除此以外,通过与实施例1同样的方法制作羧基导入亲水化着色纤维素微粒。将该微粒的物性、及用作显色颗粒时的免疫层析性能示于以下的表1。蛋白质的吸附量与以下的比较例1相比得到了若干改善。其结果,虽然仅有若干,但也可观察到假阳性减少效果。
〔实施例19〕
将反应剂变更为11-溴十一烷酸7.2g、将碳酸钠量变更为0.01g,除此以外,通过与实施例1同样的方法制作羧基导入亲水化着色纤维素微粒。将该微粒的物性、及用作显色颗粒时的免疫层析性能示于以下的表1。因亲水层及疏水性间隔基团的效果,与以下的比较例1相比,蛋白质的吸附量减少了。其结果也可观察到假阳性减少效果。
〔实施例20〕
羧基导入反应中,将反应剂变更为聚(乙二醇)双(羧基甲基)醚Mw600 (CreativePEG Works公司制、PSB-362)16.4g、将碳酸钠量变更为0.01g,除此以外,通过与实施例1同样的方法制作羧基导入亲水化着色纤维素微粒。将该微粒的物性、及用作显色颗粒时的免疫层析性能示于以下的表1。蛋白质的吸附量与以下的比较例1相比得到了若干改善。其结果,可观察到假阳性减少效果。
〔实施例21〕
羧基导入反应中,将反应剂变更为聚(乙二醇)双(羧基甲基)醚Mw5000 (CreativePEG Works公司制、PSB-366)65.6g、将碳酸钠量变更为9.9g,除此以外,通过与实施例1同样的方法制作羧基导入亲水化着色纤维素微粒。将该微粒的物性、及用作显色颗粒时的免疫层析性能示于以下的表1。间隔基团为PEG,但由于长度长,因此发挥排除体积效应(excluded volume effect),蛋白质的吸附量为0。其结果,有假阳性减少效果。
对于实施例1~21中制作的微粒,可能是由于亲水层作为保护层而起作用,因此结合抗体前的阶段中的微粒的显色强度也不会因反应活性基团的导入而降低。
〔比较例1〕
不进行表面亲水化反应和羧基导入反应,除此以外,通过与实施例1同样的方法制作着色纤维素微粒。将该微粒的物性、及用作显色颗粒时的免疫层析性能示于以下的表2。认为由于微粒表面为疏水的,因此蛋白质容易大量吸附于微粒表面。其结果,引起非特异性吸附,假阳性发生率为3%。
〔比较例2〕
通过专利文献4中记载的方法制作间隔基团为(CH2)16的羧基导入着色纤维素微粒。将该微粒的物性、及用作显色颗粒时的免疫层析性能示于以下的表2。由于抗体的用量与专利文献4不同,因此灵敏度比专利文献4有飞跃性的提高,由于微粒表面为疏水的,因此蛋白质大量吸附于微粒表面,引起非特异性吸附,假阳性发生率为3%。
〔比较例3〕
不进行表面亲水化,除此以外,通过与实施例1同样的方法制作羧基导入着色纤维素微粒。将该微粒的物性、及用作显色颗粒时的免疫层析性能示于以下的表2。可能是因为导入了稍微大量的羧基,因此蛋白质的吸附量与比较例1或2相比得到了若干改善。但是,由于不存在亲水层,因此亲水化度低,蛋白质会吸附,基本没有假阳性的减少效果。
〔比较例4〕
不进行表面亲水化,通过专利文献4中记载的方法在微粒表面导入氨基。其后,通过与实施例1同样的方法制作羧基导入着色纤维素微粒。将该微粒的物性、及用作显色颗粒时的免疫层析性能示于以下的表2。残留反应性氨基量多、并且也不存在亲水层,因此未看到蛋白质的吸附量减少效果。其结果,也未观察到假阳性减少效果。
〔比较例5〕
不进行表面亲水化,羧基导入反应中,将反应剂变更为聚(乙二醇)双(羧基甲基)醚Mw600(Creative PEG Works公司制、PSB-362)16.40g,除此以外,通过与实施例1同样的方法制作羧基导入着色纤维素微粒。将该微粒的物性、及用作显色颗粒时的免疫层析性能示于以下的表2。不存在亲水层,间隔基团也为PEG,因此微粒表面与间隔基团通过电相互作用而发生吸附,而且微粒表面的亲水性也不充分,因此蛋白质发生吸附,未看到吸附量的减少效果。其结果,也未观察到假阳性减少效果。
〔比较例6〕
不进行表面亲水化,通过与比较例4同样的方法向微粒导入氨基。其后,羧基导入反应中,将反应剂变更为11-溴十一烷酸、将碳酸钠的量变更为0.01g,除此以外,通过与实施例1同样的方法制作羧基导入着色纤维素微粒。将该微粒的物性、及用作显色颗粒时的免疫层析性能示于以下的表2。不存在亲水层,残留反应性氨基量多,因此微粒表面的亲水性不充分,未看到蛋白质的吸附减少效果。其结果,也未观察到假阳性减少效果。
〔比较例7〕
不进行表面亲水化,通过与比较例4同样的方法向微粒导入氨基。其后,羧基导入反应中,将反应剂变更为聚(乙二醇)双(羧基甲基)醚Mw600 (Creative PEG Works公司制、PSB-362)16.4g,除此以外,通过与实施例 1同样的方法制作羧基导入着色纤维素微粒。将该微粒的物性、及用作显色颗粒时的免疫层析性能示于以下的表2。不存在亲水层,残留反应性氨基量多,因此微粒表面的亲水性不充分、而且间隔基团也为PEG,因此未看到蛋白质的吸附减少效果。其结果,也未观察到假阳性减少效果。
〔比较例8〕
不进行表面亲水化,通过与比较例4同样的方法向微粒导入氨基。其后,羧基导入反应中,将反应剂变更为聚(乙二醇)双(羧基甲基)醚Mw600 (Creative PEG Works公司制、PSB-362)16.4g、将碳酸钠量变更为0.01g,除此以外,通过与实施例1同样的方法制作羧基导入着色纤维素微粒。将该微粒的物性、及用作显色颗粒时的免疫层析性能示于以下的表2。不存在亲水层,残留反应性氨基量多,因此微粒表面的亲水性不充分、而且间隔基团也为PEG,因此未看到蛋白质的吸附减少效果。其结果,也未观察到假阳性减少效果。
〔比较例9〕
将染色反应设为1循环,除此以外,通过与实施例1同样的方法制作羧基导入亲水化着色纤维素微粒。将该微粒的物性、及用作显色颗粒时的免疫层析性能示于以下的表2。显色强度低,因此检测灵敏度比实施例差,随之诊断时间也变长。
〔比较例10〕
将凝固液变更为二甲基亚砜(东京化成株式会社制、D0798)50.00wt%、水50.00wt%,除此以外,通过与实施例1同样的方法制作羧基导入亲水化着色纤维素微粒。将该微粒的物性、及用作显色颗粒时的免疫层析性能示于以下的表2。由于粒径小,因此检测灵敏度比实施例差,随之诊断时间也变长。
〔比较例11〕
表面亲水化反应中,将亲水化剂的量变更为1.0mL,除此以外,通过与实施例1同样的方法制作羧基导入亲水化着色纤维素微粒。将该微粒的物性、及用作显色颗粒时的免疫层析性能示于以下的表2。由于亲水层过少,因此在羧基导入反应时微粒的显色强度显著降低。
〔比较例12〕
纤维素微粒的凝固反应中,将凝固液变更为四氢呋喃浓度97.0wt%、水浓度3.0wt%,羧基导入反应中,将碳酸钠的量变更为9.9g、将反应剂变更为11-溴十一烷酸7.2g,除此以外,通过与实施例1同样的方法制作羧基导入亲水化着色纤维素微粒。将该微粒的物性、及用作显色颗粒时的免疫层析性能示于以下的表2。由于微粒的粒径过大,因此在膜中无法展开。
〔比较例13〕
使用粒径为50nm并且导入有羧基的羧基修饰金纳米颗粒2000Da PEG 连接体(CTD公司制)作为显色颗粒,对免疫层析性能进行评价。将结果示于以下的表2。由于微粒表面为疏水的,因此在膜中移动时耗费时间,显色时间变慢。另外,由于微粒表面为疏水的,因此蛋白质也容易吸附于微粒表面,也容易引起假阳性。
〔比较例14〕
使用粒径为470nm、显色强度为0.5并且导入有羧基的胶乳颗粒(Bangs 公司制)作为显色颗粒,对免疫层析性能进行评价。将结果示于以下的表2。由于微粒表面为疏水的,因此蛋白质也容易吸附于微粒表面,也容易引起假阳性。
〔比较例15〕
通过与实施例1同样的方法制作亲水化着色纤维素微粒。其后不进行羧基导入反应,直接用作显色颗粒。将颗粒物性和免疫层析性能示于表2。颗粒无论亲水性怎样,都不存在与抗体的结合部位,因此抗体不能负载在颗粒上,灵敏度非常低。
[表1]
[表2]
产业上的可利用性
本发明的亲水化着色纤维素微粒能维持高的检测灵敏度、并且进行迅速的诊断,可适合作为假阳性的产生风险惊人地减少了的免疫层析诊断试剂盒的显色颗粒来利用。
Claims (5)
1.一种着色纤维素微粒,其特征在于,平均粒径为60~900nm,显色强度为1.0~10.0,在微粒表面具有与该微粒的羟基化学结合的亲水层,并且借助与该亲水层的反应基团结合的间隔基团导入有羧基,
所述亲水层的亲水化度为30.0~200.0的范围,
所述间隔基团为烃系的结构体。
2.根据权利要求1所述的着色纤维素微粒,其中,所述羧基的导入量在每1g所述着色纤维素微粒中为0.20~3.00mmol。
3.根据权利要求1或2所述的着色纤维素微粒,其中,所述亲水层为硅烷层、聚乙二醇层(PEG)、或硅烷层与聚乙二醇(PEG)层的混合层中的任意者。
4.一种结构体,其在权利要求1~3中任一项所述的着色纤维素微粒的所述羧基上以共价键结合有配体。
5.一种免疫层析诊断试剂盒,其包含权利要求4所述的结构体。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2017076162 | 2017-04-06 | ||
JP2017-076162 | 2017-04-06 | ||
PCT/JP2018/012938 WO2018186267A1 (ja) | 2017-04-06 | 2018-03-28 | 親水化着色セルロース微粒子 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN110476063A CN110476063A (zh) | 2019-11-19 |
CN110476063B true CN110476063B (zh) | 2022-11-15 |
Family
ID=63712147
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201880023303.1A Active CN110476063B (zh) | 2017-04-06 | 2018-03-28 | 亲水化着色纤维素微粒 |
Country Status (9)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US11353453B2 (zh) |
EP (1) | EP3608670B1 (zh) |
JP (1) | JP6865813B2 (zh) |
KR (1) | KR102300483B1 (zh) |
CN (1) | CN110476063B (zh) |
CA (1) | CA3058871C (zh) |
ES (1) | ES2909503T3 (zh) |
TW (1) | TWI682174B (zh) |
WO (1) | WO2018186267A1 (zh) |
Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20210080455A1 (en) * | 2017-09-25 | 2021-03-18 | Asahi Kasei Kabushiki Kaisha | Organic Colored Microparticles, Diagnostic Reagent Kit, and In Vitro Diagnosis Method |
JP6886668B2 (ja) * | 2019-04-23 | 2021-06-16 | 住友ゴム工業株式会社 | 医療用検査装置及び細胞検査方法 |
WO2023089972A1 (ja) * | 2021-11-18 | 2023-05-25 | 旭化成株式会社 | 蛍光セルロース粒子 |
Family Cites Families (19)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4143203A (en) * | 1976-03-19 | 1979-03-06 | Amicon Corporation | Particulate support material |
WO1990015666A1 (en) * | 1989-06-16 | 1990-12-27 | Omni Quest Corporation | Coated magnetic particles for use in separations |
GB0123278D0 (en) * | 2001-09-27 | 2001-11-21 | Ucb Sa | Labelled articles and uses thereof |
SE526038C2 (sv) * | 2002-07-08 | 2005-06-21 | Gambro Lundia Ab | Polymeraffinitetsmatris, förfarande för framställning därav och anvädning därav |
EP1890148B1 (en) | 2005-11-01 | 2010-12-15 | JSR Corporation | Organic polymer particles and process for producing the same, magnetic particles for diagnostics, carboxyl group-containing particles and process for producing the same, and probe-bound particles and process for producing the same |
JP4985916B2 (ja) * | 2006-03-27 | 2012-07-25 | Jsr株式会社 | カルボキシル基含有粒子の製造方法 |
JP5035622B2 (ja) | 2008-01-11 | 2012-09-26 | 積水化学工業株式会社 | 着色ラテックス |
WO2009123148A1 (ja) * | 2008-03-31 | 2009-10-08 | 旭化成せんい株式会社 | セルロース誘導体微粒子、その分散液、その分散体及び診断薬 |
ES2596323T3 (es) * | 2009-11-17 | 2017-01-05 | Asahi Kasei Kabushiki Kaisha | Micropartículas orgánicas coloreadas y kit de reactivo diagnóstico que contiene las mismas |
TWI386778B (zh) * | 2009-12-23 | 2013-02-21 | Giga Byte Tech Co Ltd | 筆記型電腦支撐架 |
JP5866880B2 (ja) | 2011-02-10 | 2016-02-24 | 住友ベークライト株式会社 | 生理活性物質固定化用粒子、生理活性物質固定粒子及び糖親和性物質捕捉粒子 |
CN102604305A (zh) | 2012-02-21 | 2012-07-25 | 苏州纳诺康生物技术有限公司 | 一种纳米荧光微球,其制备方法及其用作免疫层析方法的标记物的用途 |
JP5992703B2 (ja) | 2012-03-22 | 2016-09-14 | 田中貴金属工業株式会社 | イムノクロマトグラフィー検出方法 |
JP6148033B2 (ja) | 2013-02-22 | 2017-06-14 | 旭化成株式会社 | 蛍光色素化合物を含むセルロース微粒子 |
KR101822727B1 (ko) | 2013-06-10 | 2018-01-26 | 아사히 가세이 셍이 가부시키가이샤 | 이뮤노크로마토 진단 키트 |
US20170102380A1 (en) * | 2014-03-05 | 2017-04-13 | Commissariat A L'energie Atomique Et Aux Energies Alternatives (Cea) | Method for photo-immobilizing biomolecules on a non-functionalized carrier |
JP5767362B1 (ja) | 2014-04-25 | 2015-08-19 | 田中貴金属工業株式会社 | 免疫クロマト分析装置、免疫クロマト分析方法及び免疫クロマト分析キット |
KR101555861B1 (ko) * | 2014-08-08 | 2015-09-30 | 재단법인대구경북과학기술원 | 진단 시약용 셀룰로오스 아세테이트 착색 미립자 비드의 제조 방법 및 이로부터 제조되는 진단 시약용 셀룰로오스 아세테이트 착색 미립자 비드 |
JP6523020B2 (ja) | 2015-03-31 | 2019-05-29 | 古河電気工業株式会社 | 生体分子の検出又は定量方法、及び生体分子の検出又は定量用標識試薬粒子 |
-
2018
- 2018-03-28 JP JP2019511188A patent/JP6865813B2/ja active Active
- 2018-03-28 US US16/498,736 patent/US11353453B2/en active Active
- 2018-03-28 WO PCT/JP2018/012938 patent/WO2018186267A1/ja unknown
- 2018-03-28 EP EP18781015.5A patent/EP3608670B1/en active Active
- 2018-03-28 KR KR1020197027219A patent/KR102300483B1/ko active IP Right Grant
- 2018-03-28 ES ES18781015T patent/ES2909503T3/es active Active
- 2018-03-28 CA CA3058871A patent/CA3058871C/en active Active
- 2018-03-28 CN CN201880023303.1A patent/CN110476063B/zh active Active
- 2018-04-02 TW TW107111557A patent/TWI682174B/zh active
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP3608670A1 (en) | 2020-02-12 |
US11353453B2 (en) | 2022-06-07 |
CN110476063A (zh) | 2019-11-19 |
EP3608670B1 (en) | 2022-02-23 |
JPWO2018186267A1 (ja) | 2019-11-21 |
US20210109093A1 (en) | 2021-04-15 |
TW201842334A (zh) | 2018-12-01 |
KR102300483B1 (ko) | 2021-09-10 |
KR20190117678A (ko) | 2019-10-16 |
WO2018186267A1 (ja) | 2018-10-11 |
EP3608670A4 (en) | 2020-03-25 |
CA3058871C (en) | 2022-11-22 |
ES2909503T3 (es) | 2022-05-06 |
JP6865813B2 (ja) | 2021-04-28 |
TWI682174B (zh) | 2020-01-11 |
CA3058871A1 (en) | 2018-10-11 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP5788330B2 (ja) | 有機着色微粒子、それを含む診断薬キット及びインビトロ診断方法 | |
EP3009840B1 (en) | Immunochromatographic diagnosis kit | |
JP6800275B2 (ja) | 樹脂−白金複合体及びその利用 | |
CN110476063B (zh) | 亲水化着色纤维素微粒 | |
JP2020177035A (ja) | 標識物質、免疫学的測定法、免疫学的測定用試薬、アナライトの測定方法、アナライト測定用キット、及び、ラテラルフロー型クロマト用テストストリップ | |
JP6877564B2 (ja) | 有機着色微粒子、診断薬キット、及びインビトロ診断方法 | |
JP2019174336A (ja) | 懸濁性に優れ、迅速診断が可能な着色セルロース微粒子 | |
JP2017138271A (ja) | グラフト化された着色セルロース微粒子 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |