TW201842334A

TW201842334A - 親水化著色纖維素微粒子

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Publication number: TW201842334A
Application number: TW107111557A
Authority: TW
Inventors: 塩見祥之; 堀井厚志; 松瀬武志; 村岡謙
Original assignee: 日商旭化成股份有限公司
Priority date: 2017-04-06
Filing date: 2018-04-02
Publication date: 2018-12-01
Also published as: JPWO2018186267A1; WO2018186267A1; EP3608670A1; CA3058871C; US11353453B2; KR102300483B1; TWI682174B; CA3058871A1; EP3608670A4; ES2909503T3; EP3608670B1; US20210109093A1; CN110476063A; CN110476063B; JP6865813B2; KR20190117678A

Abstract

本發明提供一種可維持較高之檢測感度並且大幅地降低偽陽性之著色纖維素微粒子、使用其之免疫層析診斷套組。本發明係一種著色纖維素微粒子、於該著色纖維素微粒子之羧基上共價鍵結有配位基之結構體及包含該結構體之免疫層析診斷套組，該著色纖維素微粒子之特徵在於：其平均粒徑為60～900 nm，顯色強度為1.0～10.0，於微粒子表面具有親水層，且於微粒子表面經由間隔基導入有羧基。

Description

親水化著色纖維素微粒子

本發明係關於一種於微粒子表面具有親水層且經由間隔基導入有羧基之著色纖維素微粒子、以及使用其之診斷劑套組及體外診斷劑。

近年來，於醫療領域或食品領域，期望一種可簡便且迅速地判斷有無疾病或病原菌等之技術。為了應對該等需求，開發出各種技術。目前，能夠簡便且迅速地進行流行性感冒等病原體感染之有無、妊娠之有無、癌腫標記或心肌標記之有無、食品中之過敏物質或成為食物中毒之原因的物質之有無等各種檢查。作為該等技術，開發出免疫層析測定法、螢光免疫層析測定法、酵素免疫測定法、乳膠凝集測定法、化學發光測定法等較多測定方法。其中，就無需特殊之裝置或專業知識，任何人均可簡便地進行迅速之診斷之特徵而言，廣泛使用可以目視判斷之免疫層析測定法。例如作為免疫層析測定法之一種之妊娠檢查劑等為能夠於普通藥房獲取之程度，成為對於消費者而言通用性較高者。免疫層析測定法(以下稱為「免疫層析」)係利用抗原抗體反應者，有稱為夾層法或競爭法之方法。測定方法大致分為使檢測物相對於膜片於水平方向上展開之側流式與於垂直方向上展開之順流式。就簡便性之觀點而言，多數情況下採用以側流式使用夾層法，利用抗體捕捉抗原之方法。測定順序如下： (i)於硝化纖維素等之膜片，將與成為檢測對象之抗原等進行反應之抗體固定化於特定部位(測試線)； (ii)製作於稱為顯色粒子之標識物質擔載有與檢測對象進行反應之抗體的檢測試劑，塗佈於共軛墊上後使其乾燥，將上述膜片、樣品墊、吸收墊加以組合而製作免疫層析套組； (iii)將混合有欲檢查有無抗原之檢體之展開液滴加至樣品墊上，以目視(或簡易之免疫層析讀取器)觀察測試線(TL)有無顯色，判斷有無抗原。於檢體中具有抗原之情形時，線於測試線上顯色。一般而言，以目視進行判定之多數情形係用作僅判斷有無成為檢測對象之抗原之定性分析。作為用於免疫層析之顯色粒子，例如於以下之專利文獻1中揭示有金膠體，並且於以下之專利文獻2中揭示有著色乳膠。該等顯色粒子之問題在於，由於微粒子表面為疏水性，故而產生吸附蛋白質等生物分子之稱為非特異吸附之現象。若產生非特異吸附，則有於免疫層析中產生作為最大問題之一的偽陽性之虞。所謂偽陽性係指儘管於檢體中不存在檢測對象，但線於測試線上顯色。若產生偽陽性，則會導致誤診，因此於市售免疫層析套組之情形時必須不產生偽陽性。作為偽陽性之產生機制之一，認為經由非特異吸附於顯色粒子之物質，顯色粒子會吸附至塗佈於測試線之抗體。因此，於以下之專利文獻3中，揭示有藉由使親水性聚乙二醇(PEG)鍵結於疏水性之金膠體表面之方法而抑制非特異吸附，從而降低偽陽性。然而，該方法有因微粒子表面之PEG鏈之立體結構而阻礙抗體抗原反應，降低檢測感度之虞。如此，一般而言，發現多數情況下若進行偽陽性之降低對策，則會降低檢測感度。於該狀況下，於以下之專利文獻4中揭示有藉由使著色纖維素微粒子與抗體進行化學鍵結而達成非常高之檢測感度。該微粒子由於來自纖維素，故而與金膠體等相比，表面成為略親水性，但仍為疏水性，因此有產生非特異吸附之可能性，與此前之顯色粒子同樣地仍有產生偽陽性之風險。如以上所述，仍必須提供一種維持較高之檢測感度並且降低偽陽性之技術，作為其一，強烈期望開發一種不阻礙抗體抗原反應且可大幅地抑制非特異吸附的顯色粒子。 [先前技術文獻] [專利文獻] [專利文獻1]國際公開第2015/163384A1號 [專利文獻2]日本專利特開2009-168495號公報 [專利文獻3]國際公開第2013/141122A1號 [專利文獻4]國際公開第2011/062157A1號

[發明所欲解決之問題] 鑒於上述先前技術之現狀，本發明所欲解決之問題在於提供一種可維持較高之檢測感度並且大幅地降低偽陽性之顯色粒子。 [解決問題之技術手段] 本發明者等人為了解決上述問題而銳意研究並反覆進行實驗，結果發現，藉由對微粒子表面賦予親水層且經由間隔基導入羧基，可獲得顯著減少蛋白質等生物分子之非特異吸附之纖維素微粒子，並確認到使用其作為顯色粒子之免疫層析可維持較高之檢測感度並且大幅地降低偽陽性，從而完成本發明。即，本發明如以下所述。 [1]一種顯色纖維素微粒子，其特徵在於：其平均粒徑為60～900 nm，顯色強度為1.0～10.0，於微粒子表面具有親水層且經由間隔基導入有羧基。 [2]如上述[1]所記載之顯色纖維素微粒子，其中上述羧基之導入量相對於上述顯色纖維素微粒子每1 g為0.20～3.00 mmol。 [3]如上述[1]或[2]所記載之顯色纖維素微粒子，其中上述親水層為矽烷層、聚乙二醇層(PEG)、或矽烷層與聚乙二醇(PEG)層之混合層之任一者。 [4]如上述[1]至[3]中任一項所記載之顯色纖維素微粒子，其中上述間隔基為烴系結構體。 [5]一種結構體，其於如上述[1]至[4]中任一項所記載之顯色纖維素微粒子之上述羧基上共價鍵結有配位基。 [6]一種免疫層析診斷套組，其包含如上述[5]所記載之結構體。 [發明之效果] 本發明之著色纖維素微粒子由於減少生物分子之非特異吸附，故而若將其用作免疫層析之顯色粒子，則可維持較高之檢測感度並且大幅地降低偽陽性。

本發明者等人發現，藉由對著色纖維素微粒子組合特定之親水層與特定之間隔基，預想之外令人驚訝的是可實現偽陽性之大幅之降低效果與較高之檢測感度之維持。如專利文獻4所揭示，判明藉由使粒徑較大且顏色較深之著色纖維素微粒子與抗體進行化學鍵結，而檢測感度提高。然而，由於該微粒子表面之親水性不充分，故而容易非特異吸附蛋白質等生物分子，有於用於免疫層析時產生偽陽性之虞。因此，雖然進行於展開液中添加界面活性劑等添加劑等偽陽性降低對策，但同時亦降低感度。本發明者等人考慮藉由使微粒子本身變得不易非特異吸附，且能夠使抗體大量地導入至微粒子表面，可否維持較高之檢測感度並且降低偽陽性。於該假設下反覆進行實驗，結果發現，對著色纖維素微粒子表面賦予親水層，且經由烴系間隔基大量地導入羧基，使蛋白質等生物分子對微粒子表面之非特異吸附減少，並且能夠使大量之抗體導入至微粒子，藉此可達成偽陽性之大幅之降低並且維持較高之檢測感度。如專利文獻3所揭示，判明可藉由對微粒子表面賦予親水層而降低偽陽性。另一方面，一般而言，已知烴系化合物容易吸附成為偽陽性之原因之蛋白質等生物分子。於該狀況下，本發明者等人意外地發現，藉由除賦予親水層以外，亦組合烴系疏水性間隔基，可大幅地降低偽陽性。不宜拘泥於特定之理論，本發明者等人認為，烴系間隔基對親水層排斥而成為於微粒子表面豎立之狀態，且藉由間隔基彼此之疏水性相互作用而較密地導入至微粒子表面，因此成為偽陽性之原因之蛋白質等生物分子進入至微粒子表面之間隙消失，而抑制非特異吸附，換言之，關於線狀之烴系間隔基之側面，由於該間隔基彼此大致平行地排列配置於微粒子表面，因此於該側面無法吸附成為偽陽性之原因之蛋白質，但抗體可與位於間隔基之前端之羧基進行共價鍵結，因此成功地大幅降低偽陽性。以下，對實施形態進行詳細說明。本實施形態之著色纖維素微粒子之特徵在於：其平均粒徑為60～900 nm，顯色強度為1.0～10.0，於微粒子表面具有親水層，且經由間隔基而導入有羧基。用語「平均粒徑」係指藉由動態光散射法進行測定之情形時之體積平均中值粒徑。於本實施形態中，平均粒徑位於60～900 nm之範圍。若平均粒徑位於該範圍，則微粒子之表面積較大，因此於用於免疫層析之情形時，測試線變得更濃，即檢測感度變高。若平均粒徑未達60 nm，則表面積變小，因此每一個微粒子之顯色強度降低，因此有檢測感度降低之情形，又，亦有產生微粒子之凝集之情形。就以上之方面而言，粒徑之下限較佳為70 nm，更佳為80 nm。另一方面，若微粒徑變得大於900 nm，則會堵住於膜片之孔，因此有診斷時間變長、或於檢查後膜片表面著色而對檢查結果之判斷造成不良影響、檢測感度變差之情形。就以上之方面而言，粒徑之上限較佳為800 nm，更佳為700 nm。再者，此處描述之平均粒徑只不過為平均值，亦可粒徑分佈之一部分偏離上述範圍。使用體積平均值作為粒徑之原因在於，於免疫層析中，過大之微粒子會於膜片中造成堵塞，但若為體積平均值，則微粒子越大則影響變得越大，因此即便僅存在少許較大之粒子亦會反映出其影響。作為粒徑，除體積平均值以外，有數量平均值、面積平均值等各種表示方法。當然，若表示方法不同，則粒徑值亦發生變化。用語「顯色強度」係定義導入反應性基後抗體鍵結前之微粒子之顏色濃度的值，於本實施形態中，處於1.0～10.0之範圍。該值越大，則微粒子之顏色濃度越濃，於用於免疫層析之情形時檢測感度越高。當然，值越大越佳，可採用利用顏色較深之染料、增加染色次數、經由作為間隔基之某些化合物進行連結、增加微粒子之非晶區域而使染料容易進入、使微粒子為多孔性而使染料容易進入等方法。然而，若考慮經濟性，則上限較佳為7.0，更佳為5.0。又，值越小，則於用於免疫層析之情形時，檢測感度越降低，因此下限較佳為1.5，更佳為2.0。顯色強度之測定方法係定義為如下值，即，製備濃度已知之微粒子之純水分散液，設為光程長度10 mm，於400～800 nm之範圍進行使用積分球之可見吸光度測定，測定所獲得之吸光度曲線之峰值(ABS)，將所獲得之值除以顯色粒子之重量百分比，並換算成顯色粒子0.01 wt%左右之吸光度。例如於所製備之微粒子之濃度為0.0045 wt%，吸光度曲線之峰值為1.0時，其顯色強度成為(1×0.01)÷0.0045＝2.2。微粒子之顏色濃度之測定時進行使用積分球之可見吸光度測定之原因在於，可最準確地測定出分散至液體中之狀態之微粒子之顏色濃度。作為測定微粒子之顏色濃度之方法，亦有利用測色計等測定使微粒子進行乾燥而獲得之固體之方法，但此種方法無法準確地測定微粒子之顏色濃度。例如金屬膠體等之色調或最大波長對應於粒徑而不同，乾燥之凝集狀態無法準確地反映出分散於液體中之狀態之顏色濃度。又，即便以相同之粒子濃度分散於液體中，若產生凝集，則顏色濃度亦變淺。進而，進行可見吸光度測定時使用積分球之原因在於消除由粒子自身之散射所產生之影響。通常之可見吸光度測定係測定透過光之方法，不僅反映出著色成分對入射光之吸收，而且亦反映出由微粒子自身之散射所產生之影響。例如一般用於免疫層析之金膠體係使用粒徑為40 nm～60 nm者，有時亦使用100 nm者，但粒徑均較小，因此幾乎無散射光之影響。與此相反，乳膠粒子之粒徑較大，顯然散射光之影響較大。就如上所述之原因而言，為了即便於粒徑或粒子素材不同之情形時亦更準確地反映出微粒子自身之顏色濃度，採用使用積分球之可見吸光度測定。用語「親水層」係如文字所述包含親水性較高之結構體之層，且係與微粒子之羥基進行化學鍵結之層。該親水層之結構並無特別限定，可使用矽烷層、聚乙二醇(PEG)層、磷酸膽鹼層等。視情形亦可為上述層中之2層之混合體。例如亦可形成以1：1之比例含有矽烷層與PEG層之層。此處所謂之矽烷層係指含有Si基之結構體與粒子之羥基進行鍵結而形成之層。同樣地，PEG層、磷酸膽鹼層亦分別為含有PEG基、磷酸膽鹼基之結構體與粒子之羥基進行鍵結而形成之層。就其後與反應劑之鍵結性之方面而言，較佳為形成親水層之1個結構體含有胺基。是否形成有親水層係藉由紅外分光法、顯微鏡觀察、元素分析等進行判斷。再者，本說明書中，「間隔基」於與「親水層」中之反應基鍵結之方面與「親水層」不同。作為用以賦予親水層之親水化劑，並無特別限定，作為具體例，可列舉以下者：乙烯基三甲氧基矽烷、乙烯基三乙氧基矽烷、2-(3,4-環氧環己基)乙基三甲氧基矽烷、3-縮水甘油氧基丙基甲基二甲氧基矽烷、3-縮水甘油氧基丙基甲基二乙氧基矽烷、3-縮水甘油氧基丙基三乙氧基矽烷、對苯乙烯基三甲氧基矽烷、3-甲基丙烯醯氧基丙基甲基二甲氧基矽烷、3-甲基丙烯醯氧基丙基三甲氧基矽烷、3-甲基丙烯醯氧基丙基甲基二乙氧基矽烷、3-甲基丙烯醯氧基丙基三乙氧基矽烷、3-丙烯醯氧基丙基三甲氧基矽烷、N-2-(胺基乙基)-3-胺基丙基甲基二甲氧基矽烷、N-2-(胺基乙基)-3-胺基丙基三甲氧基矽烷、3-胺基丙基三甲氧基矽烷、3-胺基丙基三乙氧基矽烷、3-三乙氧基矽烷基-N-(1,3-二甲基-亞丁基)丙基胺、N-苯基-3-胺基丙基三甲氧基矽烷、3-巰基丙基甲基二甲氧基矽烷、3-巰基丙基三甲氧基矽烷、3-異氰酸基丙基三甲氧基矽烷、聚乙二醇三甲氧基矽烷、聚乙二醇三乙氧基矽烷、胺基-PEG12-丙酸、胺基-PEG8-丙酸、胺基-PEG4-丙酸、聚(乙二醇)2-胺基乙基乙酸、FMOC-PEG 5k-琥珀醯亞胺丁酸酯、HO-PEG 5k-NHS、O-[2-(Fmoc-胺基)-乙基]-O'-2-羧乙基)聚乙二醇、聚乙二醇二胺、1-O-十八烷基-2-O-甲基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼。其中較佳為N-2-(胺基乙基)-3-胺基丙基甲基二甲氧基矽烷、N-2-(胺基乙基)-3-胺基丙基三甲氧基矽烷、3-胺基丙基三甲氧基矽烷、3-胺基丙基三乙氧基矽烷、3-三乙氧基矽烷基-N-(1,3-二甲基-亞丁基)丙基胺、胺基-PEG12-丙酸、胺基-PEG8-丙酸、胺基-PEG4-丙酸、聚(乙二醇)2-胺基乙基乙酸、聚乙二醇二胺，更佳為N-2-(胺基乙基)-3-胺基丙基甲基二甲氧基矽烷、N-2-(胺基乙基)-3-胺基丙基三甲氧基矽烷、3-胺基丙基三甲氧基矽烷、3-胺基丙基三乙氧基矽烷、3-三乙氧基矽烷基-N-(1,3-二甲基-亞丁基)丙基胺。於使用具有胺基之親水層之情形時，導入羧基後之殘存反應性胺基量較理想為相對於著色纖維素微粒子每1 g未達0.20 mmol。藉由處於該範圍，不僅可抑制疏水性物質之吸附，而且亦可抑制離子性物質、氫鍵性物質之吸附，因此可使生物分子之吸附量飛躍性地減少。若導入羧基後之殘存反應性胺基量相對於著色纖維素微粒子每1 g為0.20 mmol以上，則尤其由氫鍵所產生之吸附增大，因此偽陽性之降低效果變小。就以上之方面而言，殘存反應性胺基量之上限較佳為0.15 mmol，更佳為0.10 mmol。作為殘存反應性胺基量之測定方法，使用螢光測定。使用僅於與胺基反應之情形時發光之螢光試劑。首先，對於胺基量已知之樣品，關於胺基量與發光強度之關係製作校準曲線。其後，使螢光試劑與微粒子進行反應。測定該微粒子之螢光強度，獲得發光強度。將所獲得之發光強度代入校準曲線中，算出胺基量。作為表示親水層之親水化程度之指標，定義「親水化度」。本說明書中，所謂「親水化度」係表示微粒子表面之潤濕容易性、即與水之親和性之指標。親水化度係藉由脈衝NMR法進行測定。脈衝NMR法係於對微粒子分散液照射射頻波而使水分子之質子激發後，測定至恢復至基態為止之時間(弛豫時間)之分析方法。吸附於微粒子表面之水分子由於運動性受到限制，故而弛豫時間較短，塊體水分子(不與微粒子表面進行吸附之水分子)之運動性受到之限制較少而可自由地運動，因此弛豫時間較長。因此，藉由脈衝NMR法所獲得之微粒子分散液之弛豫時間因吸附於微粒子表面之水分子與塊體水分子之比率而發生變化。即，微粒子表面之親水性越高，可吸附越多之水分子，因此弛豫時間變短。於脈衝NMR之測定中使用Bruker公司製造之Minispec mq20裝置。於對濃度1%(wt/vol)之微粒子分散液進行攪拌後，將0.5 mL移至外徑10 mm之玻璃製NMR管，設置於設定為30℃之脈衝NMR裝置中，如以下所述設定各種參數並進行測定。・觀測核：¹ H ・測定之弛豫時間：橫向弛豫時間T2(ms) ・測定模式：CPMG(Carr-Purcell-Meiboom-Gill)法・累計次數：32次・循環延遲(Recycle Delay)：10(s) ・90°-180°脈衝間隔(Pulse Separation)(τ)：2(ms) ・所獲得之回波之總數(Total Number of Acquired Echoes)：2000點。對於所獲得之磁化衰減曲線(表示磁化強度之經時變化之曲線)，使用Microsoft Excel之指數近似功能藉由最小平方法擬合為下述式(1)： M(t)＝M₀ ・exp(-t/T2)・・・式(1) {式中，M(t)：某時間t之信號強度，M₀ ：信號強度之初始值，T2：弛豫時間}。為了由所測得之弛豫時間算出親水化度，準備以縱軸為弛豫時間之變化比率(Rsp值)、以橫軸為微粒子之總表面積值(TSA值)進行繪圖而成之圖，藉由最小平方法製作近似直線，將其斜率定義為親水化度。・Rsp值之計算方法 Rsp值＝Rav÷Rb－1 {式中，Rav：平均弛豫時間常數(試樣之弛豫時間倒數)，Rb：塊體水分子之弛豫時間常數(空白水之弛豫時間倒數)} ・TSA值(m² )之計算方法 TSA值＝SA×V×Ψ_p ×ρ {式中，SA：微粒子之比表面積(m² /g)＝6÷(ρ×d)，此處，ρ：微粒子密度(g/cm³ )(微粒子密度：1.4 g/cm³ ，乳膠粒子密度：1.0 g/cm³ ，金膠體粒子密度：19.3 g/cm³ )，d：微粒子直徑(μm)，V：經射頻波照射之部分之NMR管體積(cm³ )(≒試樣量)，Ψ_p ：微粒子體積比，此處，微粒子體積(i)＝微粒子濃度(wt%)÷100÷微粒子密度，水之體積(ii)＝(1－微粒子體積(i))÷水之密度(0.997 g/cm³ )，Ψ_p (微粒子體積比)＝微粒子體積(i)÷水之體積(ii)，ρ：同上} 例如，如圖1所示，將A微粒子(TSA值0.5，Rsp值10)與B微粒子(TSA值1，Rsp值5)之數值繪製成圖，藉由最小平方法製作各者之近似直線。於A微粒子之情形時，Y＝20x，於B微粒子之情形時，Y＝5x。將近似直線之斜率(親水化度)較大者、即A微粒子判定為親水化度較大。於本實施形態中，親水化度較佳為30.0～200.0之範圍。若親水化度處於該範圍，則粒子表面為親水性，因此容易於膜片中移動，而且蛋白質等對微粒子表面之吸附量降低。其結果為，於用於免疫層析時偽陽性降低。除此以外，令人驚訝的是，處於該範圍之微粒子由於親水層作為保護層發揮功能，故而於羧基之導入時不易產生顯色強度之降低。因此，成為可耐受苛刻之反應條件之微粒子，因此可使羧基之導入量變多。其結果為，抗體亦可大量地擔載於微粒子，因此可成為維持較高之檢測感度之微粒子。若親水化度未達30.0，則微粒子表面成為疏水性，因此蛋白質等吸附於微粒子表面，容易產生偽陽性。而且，於膜片中之流動變差，診斷時間亦變長。又，若未達30.0，則於進行羧基導入反應時容易產生微粒子之顯色強度之降低，因此檢測感度降低。就以上之方面而言，親水化度之下限更佳為35.0，進而較佳為40.0。另一方面，若親水化度大於200.0，則氫鍵成為支配性，因此蛋白質等生物分子之吸附量增加，有產生偽陽性之虞，因此親水化度之上限更佳為190.0，進而較佳為180.0。用語「間隔基」係指經由「親水層」而將微粒子與羧基連接之化學基。本實施形態中，「間隔基」與「親水層」之反應性基進行鍵結，另一方面，「親水層」與微粒子之羥基進行鍵結。例如，於經由鍵結於微粒子之矽烷層而使18-溴硬脂酸進行反應之情形時，親水層成為矽烷層，間隔基成為(CH₂ )₁₇ 。間隔基之結構並無特別限定，可使用烷基、烯烴基、烷烴基、及苯環之類的烴系等疏水性結構體。關於碳數亦無特別限定，就不受粒子表面之電雙層之影響而可期待感度提高之方面而言，較佳為3以上。一般而言，由於親水性結構體對抑制生物分子之吸附有效，故而微粒子表面為疏水性之金膠體、乳膠粒子、二氧化矽粒子等經常使用PEG等親水性間隔基。例如長崎等人報告有藉由對金表面導入長度不同之PEG鏈，可大幅地降低非特異吸附(長崎等人，參照高分子 61卷2號 2012年)。其原因在於，認為若為烴系等疏水性間隔基，則藉由疏水性相互作用，間隔基會吸附至微粒子表面。因此，羧基與抗體之反應性變差，抗體無法以所需量固定於微粒子，有檢測感度降低之虞。又，一般而言，疏水性結構體容易與蛋白質等產生疏水性相互作用。即，若用於間隔基，則會吸附蛋白質等生物分子，產生偽陽性之可能性較高。與此相反，本發明者等人係推翻該常識，藉由將微粒子表面之親水層與烴系等疏水性間隔基進行組合，令人驚訝的是，成功大幅地降低成為偽陽性之原因之生物分子之吸附量，確認到可維持檢測感度並且大幅地降低偽陽性。認為若間隔基為親水性，則由於在微粒子表面存在親水層，故而產生親水層與氫鍵等之相互作用。因此，間隔基吸附至親水層，抗體無法以所需量固定化於微粒子，檢測感度降低，而且亦無法降低生物分子之吸附量，亦無法達成偽陽性之抑制。另一方面，於使用烴系等疏水性間隔基之實施形態中，認為不僅間隔基不會吸附至親水層，而且間隔基彼此藉由疏水性相互作用而美觀地整齊排列，無間隙且牢固地導入至微粒子上，因此生物分子接近微粒子表面或間隔基之間隙消失，可大幅地降低吸附量，亦可大幅地降低偽陽性。例如，如以下之表1所示，使用PEG鏈之實施例15之偽陽性產生率為1%，與此相對，使用疏水性間隔基之實施例2之偽陽性產生率為0%，使用PEG鏈之實施例17之偽陽性產生率為1%，與此相對，使用疏水性間隔基之實施例1之偽陽性產生率為0%，使用PEG鏈之實施例18之偽陽性產生率為2%，與此相對，使用疏水性間隔基之實施例16之偽陽性產生率為1%，而且，使用PEG鏈之實施例20之偽陽性產生率為2%，與此相對，使用疏水性間隔基之實施例19之偽陽性產生率為1%。間隔基之鑑定方法可使用紅外分光法、元素分析、核磁共振法(NMR)、質譜(MS)法等。例如使強酸或強鹼與導入羧基之微粒子於高溫下進行反應，使間隔基部自微粒子脫離。其後，可藉由離心分離等將微粒子分離，並藉由對上清液進行NMR或MS測定而鑑定間隔基之結構。用語「羧基之導入量」係指相對於著色纖維素微粒子每1 g而導入之羧基之量。該導入量較佳為0.20～3.00 mmol/g。藉由處於該範圍，抗體或阻斷劑所使用之蛋白質等可與微粒子化學性地強固且大量地鍵結，因此可同時實現高感度化與偽陽性降低。若導入量未達0.20 mmol/g，則抗體等蛋白質之鍵結量不充分，因此若進行添加添加劑等偽陽性降低對策，則有檢測感度降低之虞。進而，若未達0.20 mmol/g，則由於導入之羧基彼此之距離較遠，故而未與抗體等反應之羧基容易誘發分子間之氫鍵而非分子內之氫鍵。即，蛋白質等經由氫鍵而吸附，有產生偽陽性之虞。因此，羧基之導入量之下限較佳為0.25 mmol/g，更佳為0.30 mmol/g。另一方面，若導入量超過3.00 mmol/g，則每1個粒子之重量變重，因此每1個微粒子之顯色強度降低。若顯色強度降低，則於用於免疫層析時有檢測感度降低之虞，因此上限較佳為2.50 mmol/g，更佳為2.00 mmol/g。作為導入量之算出方法，可列舉螢光測定法、中和滴定法、紅外分光法等。本實施形態中，為了準確地測定能夠與抗體或蛋白質進行反應之羧基量，主要使用螢光測定法。使用僅於與羧基反應之情形時發光之螢光試劑。首先，對於羧基量已知之樣品，關於羧基量與發光強度之關係製作校準曲線。其後，使螢光試劑與微粒子進行反應。測定該微粒子之螢光強度，獲得發光強度。將所獲得之發光強度代入校準曲線中，算出羧基量。作為導入羧基時之羧基化劑，並無特別限定，作為具體例，可列舉以下者：2-溴乙酸、3-溴丙酸、4-溴丁酸、5-溴戊酸、6-溴己酸、7-溴庚酸、8-溴辛酸、11-溴十一烷酸、18-溴硬脂酸、16-十七碳烯酸、5-己烯酸、表氯醇、4-胺基丁酸、3-胺基丙酸、5-胺基戊酸、6-胺基己酸、7-胺基庚酸、8-胺基辛酸、己二酸、二十烷二酸、1,8-辛烷二羧酸、1,4-丁烷二羧酸、1,6-己烷二羧酸、2-氯乙酸、3-氯丙酸、4-氯丁酸、5-氯戊酸、6-氯己酸、7-氯庚酸、8-氯辛酸、11-氯十一烷酸、18-氯硬脂酸、胺基-PEG12-丙酸、胺基-PEG8-丙酸、胺基-PEG4-丙酸、α,w-雙[2-{(3-羧基-1-氧基丙基)胺基}乙基]聚乙二醇、HO-PEG12-COOH,HO-PEG12-丙酸、HO-PEG8-丙酸、O-(2-羧基乙基)聚乙二醇、COOH-PEG12-COOH、聚(乙二醇)雙(羧基甲基)醚、丙酸-PEG12-丙酸、丙酸-PEG8-丙酸、丙酸-PEG4-丙酸。其中較佳為3-溴丙酸、4-溴丁酸、5-溴戊酸、6-溴己酸、7-溴庚酸、8-溴辛酸、11-溴十一烷酸、18-溴硬脂酸、己二酸、二十烷二酸、1,8-辛烷二羧酸、1,4-丁烷二羧酸、1,6-己烷二羧酸，更佳為8-溴辛酸、11-溴十一烷酸、18-溴硬脂酸、己二酸、二十烷二酸、1,8-辛烷二羧酸。本說明書中，「微粒子」係指長徑(L)與短徑(D)之長度相近且形狀接近於球之結構體。具體而言，係指L÷D所表示之L/D比為1.0～3.0之結構體。若L/D處於該範圍，則於用作免疫層析診斷套組之情形時不易產生堵塞，更佳為1.0～2.0，進而較佳為1.0～1.5，最佳為1.0～1.3。作為測定方法，拍攝粒子之電子顯微鏡圖像，測定100個粒子之長徑(L)與短徑(D)，算出該100個之平均值。著色纖維素微粒子之製造方法並無特別限定。可列舉：首先成形微粒子，並擔載色素、染料等著色成分之方法；成形微粒子，並擔載金屬膠體或顏料等更小之顯色微粒子之方法；於微粒子之成形時亦一起添加色素、染料、顏料、金屬膠體等著色成分而成形之方法等。其中，就粒徑之調整、顏色濃度之調整、顏色之種類之調整、微粒子表面狀態之調整等微粒子之特徵之調整容易性而言，較佳為首先成形微粒子，並擔載色素、染料等著色成分之方法。又，作為擔載之著色成分，就擔載之容易性而言，較佳為染料。於使用染料作為著色成分之情形時，染料之種類並無特別限定。可使用反應染料、直接染料、含金染料、酸性染料、鹼性染料、分散染料、硫化染料、植物染料、萘酚染料、螢光染料等染料。當然，亦可將任意之染料加以組合。其中，利用共價鍵而與纖維素之羥基進行鍵結之反應性染料就可大量地保持染料之方面或穩定性之方面而言尤佳。於首先成形纖維素微粒子，其後擔載著色成分之情形時，纖維素微粒子之成形方法並無特別限定。可列舉：利用球磨機或高壓均質機將天然之纖維素物理性地微細化之方法、利用酸或鹼等進行化學處理而將其微細化之方法、使纖維素一次溶解於其良溶劑中並成形為粒子狀之方法等。又，亦可將經衍生物化之纖維素溶解並成形為粒子狀，將經衍生物化之取代基復原為羥基，而製備纖維素微粒子。亦可進而將該等成形方法加以組合。又，纖維素之種類亦無特別限定，可使用再生纖維素、精製纖維素、天然纖維素、將經衍生物化之取代基復原為羥基之纖維素等。其中，就粒徑之調整、粒子形狀之調整等方面而言，較佳為使其一次溶解於良溶劑中並成形為粒子狀之方法，作為纖維素之種類，較佳為再生纖維素。於使纖維素一次溶解於其良溶劑中並成形為粒子狀之情形時，使纖維素溶解之良溶劑之種類亦無特別限定，可使用銅氨溶液、黏液溶液、N-甲基啉、各種離子性液體等可將纖維素溶解之各種良溶劑。其中，就粒徑之調整、粒子形狀之調整等方面而言，較佳為銅氨溶液。又，將所溶解之纖維素成形為粒子之方法亦無特別限定。本實施形態中，使用利用相分離之方法。用語「配位基」係指具有選擇性地且特異性地鍵結於特定之檢查對象物質之性質的物質。其種類並無特別限定，例如可列舉抗體、酵素、基因、激素、核酸、肽、蛋白質等。用語「免疫層析診斷套組」係指利用用以簡便地檢測各種檢體中有無檢查對象物質的抗原抗體反應之物品。作為免疫層析診斷套組之種類，有側流式或順流式。只要為使用顯色粒子或樣品墊者，則無特別限定，較佳為側流式。又，側流式有量桿型與盒型，該等類型並無特別限定。免疫層析診斷套組之構成並無特別限定，只要為於該領域通常使用之構成，則可為任意者。顯色粒子與樣品墊以外之構件之種類只要為於該領域使用者，則無特別限定，例如可列舉共軛墊(含有抗體致敏顯色粒子)、硝化纖維素等之膜片、吸收墊、及襯紙。又，視需要亦可省略一部分該等構件。使用免疫層析診斷套組之「診斷方法」係指使用免疫層析診斷套組進行之各種診斷。診斷對象並無特別限定，可為人用、動物用、食品用、植物用、其他環境檢查等各種診斷對象。通常之診斷順序係自檢查對象採集檢體試樣，視需要對其進行萃取或過濾等預處理，滴加至樣品墊，自檢查開始等待特定時間，根據因檢查對象物質之有無而不同之顯色判斷診斷結果。當然，並不限定於該順序，亦可用於相同之順序、原理之診斷。較佳為可藉由預先對檢體試樣進行過濾而去除多餘之異物或夾雜物，藉此可期待診斷時間之進一步縮短化或診斷精度之提高。可利用免疫層析診斷套組進行診斷之對象並無特別限定，作為具體例，可列舉以下者：癌腫標記、激素、傳染病、自體免疫、血漿蛋白、TDM(therapeutic drug monitoring，藥物治療監測)、凝固·纖維素溶解、胺基酸、肽、蛋白、基因、細胞。更具體而言，為CEA(carcinoembryonic antigen，癌胚抗原)、AFP(alpha fetoprotein，甲型胎兒蛋白)、鐵蛋白、β2微球蛋白、PSA(prostate specific antigen，前列腺特異性抗原)、CA(cancer antigen，癌抗原)19-9、CA125、BFP(basic fetoprotein，鹼性胎兒蛋白)、彈性蛋白酶1、胃蛋白酶原1• 2、便潛血、尿β2微球蛋白、PIVKA-2(Protein Induced by Vitamin K Absence or Antagonist II，異常凝血酶原)、尿BTA(bladder tumor antigen，膀胱腫瘤抗原)、胰島素、E3、HCG(human choionic gonadotophin，人絨毛膜促性腺激素)、HPL(human placental lactogen，人胎盤生乳素)、LH(luteinizing hormone，黃體促素)、HCV(hepatitis C virus，丙型肝炎病毒)抗原、HBs(Hepatitis B Virus，乙型肝炎病毒)抗原、HBs抗體、HBc抗體(antibodies to hepatitis B core，乙肝核心抗體)、HBe(hepatitis B e，乙型肝炎e)抗原、HBe抗體、HTLV-1(human T-lymphotropic virus type 1，人類T淋巴細胞白血病病毒I型)抗體、HIV(Human Immunodeficiency Virus，人類免疫缺乏病毒)抗體、弓形蟲抗體、梅毒、ASO(antistreptolysin O，抗鏈球菌溶血素O)、A型流行性感冒抗原、A型流行性感冒抗體、B型流行性感冒抗原、B型流行性感冒抗體、輪狀病毒抗原、腺病毒抗原、輪狀病毒/腺病毒抗原、A群鏈球菌、B群鏈球菌、念珠菌抗原、CD菌(Clostridium difficile，困難梭狀芽孢桿菌)、隱球菌抗原、霍亂菌、髓膜炎菌抗原、顆粒菌彈性蛋白酶、幽門螺桿菌抗體、O157抗體、O157抗原、鉤端螺旋體抗體、麴菌抗原、MRSA(methicillin-resistant Staphylococcus aureus，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌)、RF(rheumatoid factor，類風濕因子)、總IgE(immunoglobulin E，免疫球蛋白E)、LE試驗(lupus erythematosus test，紅斑性狼瘡試驗)、CRP(C-Reactive protein，C反應蛋白)、IgG、A、M、IgD、運鐵蛋白、尿白蛋白、尿運鐵蛋白、肌血球素、C3•C4、SAA(serum amyloid A，血清澱粉樣蛋白A)、LP(a)、α1-AC、α1-M、結合球蛋白、微量運鐵蛋白、APR評分(Acute Phase Reactant Score，急性期反應物評分)、FDP(Fibrin/Fibrinogen Degradation Products，纖維蛋白/纖維蛋白原降解產物)、D-二聚物、纖溶酶原、AT3、α2PI(α2-plasmin inhibiton，α2-纖溶酶原抑制物)、PIC(plasmin inhibitor complex，纖溶酶原抑制物複合物)、PAI-1(Plasminogen activator inhibitor-1，人纖溶酶原激活物抑制劑1)、蛋白質C、凝血因子X3、IV型膠原蛋白、玻尿酸、GHbA1c(Human Glycated hemoglobin A1c，人糖化血紅蛋白A1c)、其他各種抗原、各種抗體、各種病毒、各種菌、各種胺基酸、各種肽、各種蛋白質、各種DNA、各種細胞、各種過敏原、各種殘留農藥、各種有害物。以下，記載纖維素微粒子之製作方法、纖維素微粒子之著色方法、著色纖維素微粒子之親水化方法、羧基之導入方法、免疫層析診斷套組之製作方法等之一例，當然，本實施形態不應受該等限定。 [纖維素微粒子之製作方法] 使纖維素棉絨溶解於纖維素之良溶劑中。作為良溶劑，使用藉由公知方法所製備之銅氨溶液。而且，作為凝固液，主要使用有機溶劑＋水＋氨混合系。一面攪拌該凝固液，一面添加預先製備之銅氨纖維素溶液而進行凝固。進而，添加硫酸進行中和，並進行再生，藉此可獲得含有目標之纖維素微粒子之漿料。此時，漿料因用於再生之酸之殘留而為酸性，而且含有因中和而產生之銨鹽等雜質，因此必須進行精製成包含纖維素微粒子與介質之纖維素分散液之操作。作為該精製操作，採用離心分離-傾析-利用分散介質液體進行之稀釋之處理之重複。所獲得之纖維素微粒子分散液中之纖維素微粒子亦有於精製操作過程中凝集之情形，因此於此情形時可藉由剪切等進行分散處理。作為提供剪切之機構，使用高壓均質機。 [纖維素微粒子之著色方法] 對所獲得之纖維素微粒子之水分散體添加硫酸鈉、反應性染料，一面利用磁力攪拌器進行攪拌一面於恆溫槽中升溫至適當溫度。升溫後，添加碳酸鈉作為鹼，開始染色。於經過特定時間後，可獲得含有目標之著色纖維素微粒子之漿料。此時，漿料為鹼性，而且含有硫酸鈉、未反應之染料等，因此必須進行精製成包含著色纖維素微粒子與介質之著色纖維素微粒子分散液之操作。與上述同樣地進行利用離心分離之精製，獲得著色纖維素微粒子分散液。所獲得之著色纖維素微粒子分散液中之著色纖維素微粒子亦有於精製操作過程中凝集之情形，因此於此情形時可藉由剪切等進行分散處理。作為提供剪切之機構，使用高壓均質機。 [著色纖維素微粒子之親水化方法] 對所獲得之著色纖維素微粒子之水分散體添加有機溶劑、水，一面利用磁力攪拌器進行攪拌一面於恆溫槽中升溫至適當溫度。於升溫後添加市售之親水化劑，開始反應。於經過特定時間後可獲得含有目標之親水化著色纖維素微粒子之漿料。此時，漿料為鹼性，而且含有有機溶劑、未反應之親水化劑等，因此必須進行精製成包含親水化著色纖維素微粒子與介質之親水化著色纖維素微粒子分散液之操作。與上述同樣地進行利用離心分離之精製，獲得親水化著色纖維素微粒子分散液。所獲得之親水化著色纖維素微粒子分散液中之親水化著色纖維素微粒子亦有於精製操作過程中凝集之情形，因此於此情形時可藉由剪切等進行分散處理。作為提供剪切之機構，使用高壓均質機。 [對親水化著色纖維素微粒子之羧基導入方法] 對所獲得之親水化著色纖維素微粒子之水分散體添加有機溶劑、鹼，一面利用磁力攪拌器進行攪拌一面於恆溫槽中升溫至適當溫度。於升溫後添加具有羧基之反應劑，開始反應。於經過特定時間後，可獲得含有目標之導入羧基之親水化著色纖維素微粒子之漿料。此時，漿料含有有機溶劑、鹼、未反應之反應劑等，因此必須進行精製成包含導入羧基之親水化著色纖維素微粒子與介質的導入羧基之親水化著色纖維素微粒子分散液之操作。與上述同樣地進行利用離心分離之精製，獲得導入羧基之親水化著色纖維素微粒子分散液。所獲得之導入羧基之親水化著色纖維素微粒子分散液中的導入羧基之親水化著色纖維素微粒子亦有於精製操作過程中凝集之情形，因此於此情形時可藉由剪切等進行分散處理。作為提供剪切之機構，使用高壓均質機。 [免疫層析診斷套組之製作方法] 準備調整為特定濃度之導入羧基之親水化著色纖維素微粒子之分散液，添加緩衝液、抗體，一面進行溫度調整一面攪拌一定時間，使抗體鍵結於導入羧基之親水化著色纖維素微粒子。於攪拌一定時間後，進而添加阻斷劑，一面進行溫度調整一面攪拌一定時間，藉此進行導入羧基之親水化著色纖維素微粒子之阻斷。作為阻斷劑，可對應於檢查對象物質或檢體或將其進行稀釋之溶液之組成等而使用各種阻斷劑。酪蛋白對於導入羧基之親水化著色纖維素微粒子之阻斷尤佳。為了將抗體鍵結＆阻斷後之導入羧基之親水化著色纖維素微粒子洗淨，而進行離心分離，將含有剩餘之抗體及阻斷劑之上清液與沈澱之微粒子分離，藉由傾析去除上清液。對沈澱之微粒子添加緩衝液等液體，視需要藉由超音波等進行分散處理。將該利用離心分離之沈澱、上清液之去除、液體之添加等一系列操作所進行之洗淨進行所需次數，製備以特定濃度含有進行過抗體吸附＆阻斷之微粒子之分散液。視需要於該分散液中添加蛋白質、界面活性劑、蔗糖或海藻糖等糖，將所獲得之溶液以一定量塗佈於玻璃纖維製共軛墊並使其乾燥，製備檢測試劑含有部。又，視需要對再生纖維素連續長纖維不織布塗佈緩衝液、界面活性劑、蛋白質、捕集檢體試樣中之夾雜物之試劑、防腐劑、抗菌劑、抗氧化劑、吸濕劑等，並使其乾燥，而製備樣品墊。進而，製備將抗體固定化於特定位置之硝化纖維素多孔膜製膜片、用以吸收檢體之纖維素濾紙製吸收墊。將其等固定化於稱為背襯片材之具有接著部位之片材上，並裁斷為特定之尺寸，藉此製作免疫層析診斷套組。 [實施例] 以下，藉由實施例具體地說明本發明，但本發明並不僅限定於該等實施例。又，未作特別記載之所有的操係於溫度23℃、相對濕度55%RH之環境下進行。首先，對所使用之各種物性等之測定方法等進行說明。 [微粒子之平均粒徑] 作為裝置，使用日機裝公司製造之Nanotrac粒度分佈測定裝置UPA-EX150(動態光散射式)。作為測定樣品，使用微粒子為0.01 wt%、純水99.99 wt%之樣品。作為測定條件，將累計次數設為30次，將每一次測定之測定時間設為30秒，使用體積平均之粒徑分佈，將其中值粒徑設為平均粒徑。 [微粒子之顯色強度] 作為裝置，使用於日本分光公司製造之紫外可見近紅外分光光度計JASCO V-650安裝該公司製造之積分球單元ISV-722而成之裝置。作為進行測定之樣品，使用微粒子為0.01 wt%、純水99.99 wt%之樣品，於光程長度10 mm之石英池中投入樣品，進行測定。於所獲得之吸光度波峰中，將400～800 nm可見光範圍內之最大值(ABS)作為顯色強度。 [微粒子之L/D(真球度)] 作為裝置，使用日本電子公司製造之掃描式電子顯微鏡JSM-6700。藉由將微粒子為0.01 wt%、純水99.99 wt%之樣品滴加至雲母板，並使其經過10秒而使微粒子吸附至雲母板上，利用Kimwipe吸收多餘之液體而使其乾燥。利用鉑對所獲得之雲母板進行塗佈，製備電子顯微鏡測定用樣品。於加速電壓1.6 kV、測定倍率5萬倍下進行觀測，以微粒子圖像成為100個以上之方式拍攝所需張數之圖像，測定各微粒子之長徑(L)與短徑(D)，算出100個微粒子之L/D之平均值。 [間隔基結構之鑑定] 作為裝置，使用Bruker公司製造之核磁共振裝置(AVANCE II400)。於導入間隔基之微粒子之1.0 wt%分散液中添加0.1 mL、1.0 M之氫氧化鈉水溶液(和光純藥公司製造，72082100)、或1.0M之鹽酸水溶液(和光純藥公司製造，080-10035)10.0 mL，於60℃下加熱攪拌5小時。其後，藉由離心分離採集上清液，獲得溶解或分散有自微粒子切斷之間隔基之溶液。利用最佳之氘代溶劑將該溶液進行稀釋，藉由核磁共振裝置進行NMR測定，根據所獲得之光譜鑑定結構物。 [羧基之導入量] 作為裝置，使用日本分光公司製造之分光螢光光度計FP-8300。使僅於與羧基進行反應之情形時發出螢光之試劑鍵結於微粒子，根據其螢光強度測定導入量。以下表示測定例。將欲測定導入量之微粒子之1.0 wt%分散液0.1 mL、螢光試劑ADAM(KAK公司製造，FK-101)之2.3 mM之乙醇溶液4.0 mL、乙醇(關東化學公司製造，14033-70)3.9 mL投入至容器中，使其於60℃下反應5分鐘。其後，於所獲得之反應液10.0 μL中添加乙醇2.0 mL，利用FP-8300照射365 nm之激發光，測定410 nm之螢光強度。校準曲線係使用辛酸(東京化成公司製造，O0027)。 [殘存反應性胺基量] 作為裝置，使用日本分光公司製造之分光螢光光度計FP-8300。使僅於與胺基進行反應之情形時發出螢光之試劑鍵結於微粒子，根據其螢光強度測定導入量。以下表示測定例。將欲測定殘存反應性胺基量之微粒子之1.0 wt%分散液0.1 mL、螢光試劑NBD-F(同仁化學公司製造)之2.5 mM之乙醇溶液4.0 mL、乙醇(關東化學公司製造，14033-70)3.9 mL投入至容器中，於30℃下反應60分鐘。其後，於所獲得之反應液10.0 μL中添加乙醇2.0 mL，利用FP-8300照射480 nm之激發光，測定530 nm之螢光強度。校準曲線係使用辛基胺(東京化成公司製造，O0045)。 [微粒子之親水化度] 將微粒子分散液製備為濃度1%(wt/vol)，作為試樣溶液。於攪拌試樣溶液後，將0.5 mL移至外徑10 mm之玻璃製NMR管，設置於設定為30℃之脈衝NMR裝置中。脈衝NMR裝置係使用Bruker公司製造之Minispec mq20裝置。如以下所述設定各種參數並進行測定。・觀測核：¹ H ・測定之弛豫時間：橫向弛豫時間T2(ms) ・測定模式：CPMG法・累計次數：32次・循環延遲：10(s) ・90°-180°脈衝間隔(τ)：2(ms)。對於所獲得之磁化衰減曲線(表示磁化強度之經時變化之曲線)，使用Microsoft Excel之指數近似功能，藉由最小平方法擬合為下述式(1)。 M(t)＝M₀ ・exp(-t/T2)・・・(式1) {式中，M(t)：某一時間t時之信號強度，M₀ ：信號強度之初始值，T2：弛豫時間} 其次，如圖1所示，製作以縱軸為弛豫時間之變化比率(Rsp值)、以橫軸為微粒子之總表面積值(TSA值)進行繪圖而成之圖。藉由最小平方法製作近似直線，將其斜率定義為親水化度，比較微粒子之親水化度。Rsp值與TSA值之計算方法如以下所述。・Rsp值之計算方法 Rsp值＝Rav÷Rb－1 {式中，Rav：平均弛豫時間常數(試樣之弛豫時間倒數)，Rb：塊體水分子之弛豫時間常數(空白水之弛豫時間倒數)} ・TSA值(m² )之計算方法 TSA值＝SA×V×Ψ_p ×ρ {式中，SA：微粒子之比表面積(m² /g)＝6÷(ρ×d)，此處，ρ：微粒子密度(g/cm³ )(微粒子密度：1.4 g/cm³ ，乳膠粒子密度：1.0 g/cm³ ，金膠體粒子密度：19.3 g/cm³ )，d：微粒子直徑(μm)，V：經射頻波照射之部分之NMR管體積(cm³ )(≒試樣量)，Ψ_p ：微粒子體積比，此處，微粒子體積(i)＝微粒子濃度(wt%)÷100÷微粒子密度，水之體積(ii)＝(1－微粒子體積(i))÷水之密度(0.997 g/cm³ )，Ψ_p (微粒子體積比)＝微粒子體積(i)÷水之體積(ii)，ρ：同上} [蛋白質吸附量] 作為裝置，使用日本分光公司製造之紫外可見近紅外分光光度計JASCO V-650。作為蛋白質之一例，例示牛血清白蛋白(以下稱為「BSA」，Sigma-Aldrich公司製造，A7906)之吸附量之算出方法。使欲測定吸附量之微粒子之1.0 wt%分散液30.0 μL、pH值＝5.0之濃度100 mM之磷酸緩衝液(Kishida Chemical公司製造)270.0 μL、1.0 wt%之BSA溶液3.0 μL於37℃下反應2小時，其後藉由離心分離採集上清液。使該上清液與市售之BCA試劑(和光純藥公司製造，297-73101)進行反應，藉由V-650測定562 nm之吸光度，算出上清液中之BSA量。其後，自所添加之BSA量減去上清液中之BSA量，除以所使用之微粒子量，算出吸附了多少BSA。 [導入有羧基之親水化纖維素微粒子與抗體之鍵結方法] 使用2-啉乙磺酸(以下稱為「MES」，東京化成公司製造，M0606)、苛性鈉、純水，製備pH值＝6.0、濃度為100 mM之MES緩衝液。將所獲得之MES緩衝液63.0 μL、導入羧基之親水化著色纖維素微粒子1.0 wt%分散液7.0 μL、1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳二醯亞胺鹽酸鹽(以下稱為「EDC」，東京化成公司製造，D1601)之1.0 wt%溶液3.5 μL、N-羥基琥珀醯亞胺(以下稱為「NHS」，東京化成公司製造，B0249)之1.0 wt%溶液7.0 μL投入至容器中，於室溫下放置15分鐘。其後，藉由離心分離去除上清液，去除未反應之EDC、NHS。加入MES緩衝液70.0 μL，使微粒子分散後，以相對於導入羧基之親水化著色纖維素微粒子成為10.0 wt%之方式將抗hCG抗體(Fitzgelardh製造，#5014)添加至離心管中，於37℃下反應2小時。其後，將含有1.0 wt%酪蛋白(和光純藥工業公司製造，030-01505)之阻斷溶液(100 mM 硼酸緩衝液，PH值＝8.5)840.0 μL添加至離心管中，於37℃之乾燥機內靜置1小時。1小時後，使用離心分離機(久保田商事公司製造，6200)與離心分離轉子(久保田商事公司製造，AF-5008C)進行30分鐘14000 g之離心，使鍵結有抗體之導入羧基之親水化著色纖維素微粒子沈澱後，將上清液廢棄。繼而，將硼酸緩衝液(50 mM，PH值＝10.0)840.0 μL添加至離心管中，利用超音波分散機(SMT公司製造，UH-50)進行10秒鐘處理，使鍵結有抗體之導入羧基之親水化著色纖維素微粒子分散。於使其充分地分散後，進行20分鐘14000 g之離心，將上清液廢棄。以鍵結有抗體之導入羧基之親水化著色纖維素微粒子之濃度成為0.04 wt%之方式添加硼酸緩衝液(50 mM，PH值＝10.0)，藉由超音波分散機使其充分地分散。藉由以上之方法，獲得鍵結有抗體之導入羧基之親水化著色纖維素微粒子(以下亦稱為「檢測試劑」)。 [檢測試劑向共軛墊之含浸與乾燥] 將聚對苯二甲酸乙二酯製共軛墊(Ah製造，6615)浸漬於0.05 wt%之Tween-20(Sigma-Aldrich公司製造，T2700)中，去除多餘之液體後，於50℃下使其乾燥60分鐘。繼而，切割為高度10 mm、長度300 mm之形狀。繼而，使用微量吸管，將檢測試劑以成為272 μL/800 mm² 之方式均勻地塗佈，於37℃下使其乾燥30分鐘。 [樣品墊之預處理] 將再生纖維素連續長纖維不織布含浸於含有大過量之2.0 wt%之BSA(Sigma-Aldrich公司製造，A7906)與2.0 wt%之Tween-20之PBS緩衝液(66 mM，PH值7.4)中，去除多餘之液後，於50℃下使其乾燥60分鐘。繼而，切割為高度20 mm、長度300 mm之形狀。 [捕捉抗體塗佈膜片之製備] 將硝化纖維素膜(Millipore公司製造，SHF0900425)切割為寬度25 mm、長度300 mm之形狀。使用液體塗佈裝置(Musashi Engineering公司製造，300DS)，將含有0.1 wt%抗hCG-β小鼠抗體(MedixBiochemica公司製造，6601)之PBS溶液(66 mM，PH7.4)以0.1 μL/mm之比率塗佈於高度12 mm之部分。繼而，於37℃下使其乾燥30分鐘。 [免疫層析診斷套組之製備] 於背襯卡片(backing card)(Adhesives Reserch公司製造，AR9020)上貼合以上述方式獲得之捕捉抗體塗佈膜片、吸收墊(Millipore公司製造，CO83)、含有檢測試劑之共軛墊、及樣品墊。繼而，利用裁斷機切割為5 mm之寬度，獲得寬度5 mm、高度60 mm之免疫層析診斷套組。 [免疫層析診斷套組之偽陽性判定] 使用未妊娠之100人之尿實施偽陽性測定。以目視對經過15分鐘後之測試線(TL)之顯色強度進行0-10之11個階段之等級評價。如圖2所示，目視等級之值越大，則表示TL之線之顏色越濃，0表示看不到線。進行5次該測定，若以所獲得之值之平均值計，目視等級為0，則判斷為無偽陽性。100個檢體中，對產生偽陽性之檢體數進行計數，除以100，作為偽陽性之產生率。又，關於產生偽陽性之檢體，記錄目視等級。 [免疫層析診斷套組之診斷時間] 將切割為5 mm寬度之免疫層析診斷套組放入至塑膠之外殼中。以0-10之11個階段之目視等級對所獲得之放入外殼之診斷套組進行判定。檢查對象物質係使用抗hCG-β小鼠抗體。利用含有1.0 wt%之BSA之66 mM、PH值7.4之磷酸緩衝液(以下稱為「PBS」)對上述hCG抗體進行稀釋，製備上述hCG抗體為10.0 mIU/mL之陽性檢體。將該陽性檢體120.0 μL滴加至診斷套組之樣品滴加部，之後每20秒以目視進行測定，測定TL之經時變化。測定由免疫層析讀取器所獲得之TL之顯色強度成為1.0以上之時間。此處設為1.0以上之原因在於，雖然亦存在個人差異，但若成為1.0以上，則以目視亦可確認到TL之存在。進行5次該測定，將平均時間作為診斷時間。 [免疫層析診斷套組之檢測極限] 將切割為5 mm寬度之免疫層析診斷套組放入至塑膠之外殼中。以0-10之11個階段之目視等級對所獲得之放入外殼之診斷套組進行判定。檢查對象物質係使用人絨毛性促性腺激素(以下稱為「hCG」)。利用含有1.0 wt%之BSA之66 mM、PH值7.4之磷酸緩衝液(以下稱為「PBS」)對hCG進行稀釋，製備上述hCG濃度階段性地變薄為1.600 mIU/mL、0.800 mIU/mL、0.400 mIU/mL、0.200 mIU/mL、0.100 mIU/mL、0.050 mIU/mL、0.025 mIU/mL、0.013 mIU/mL、0.007 mIU/mL、0.0025 mIU/mL之陽性檢體。將該陽性檢體120.0 μL滴加至診斷套組之樣品滴加部，以目視判定經過15分鐘後之TL之顯色強度。以各濃度進行5次該測定，於所獲得之值之平均值為1.0以上之情形時判定為陽性，於未達1.0之情形時視為檢測極限以下。將可獲得該陽性判定之下限之hCG濃度設為檢測極限。 [實施例1] 藉由先前公知之方法，製備纖維素濃度0.37 wt%、銅濃度0.13 wt%、氨濃度1.00 wt%之銅氨纖維素溶液。進而，製備四氫呋喃濃度89.00 wt%、水濃度11.00 wt%之凝固液。一面使用磁力攪拌器慢慢地攪拌凝固液5000 g，一面添加預先製備之銅氨纖維素溶液500 g。於繼續攪拌5秒左右後，添加10 wt%之硫酸1000 g進行中和、再生，獲得含有纖維素微粒子之漿料6500 g。以10000 rpm之速度對所獲得之漿料進行10分鐘離心分離。藉由傾析取出沈澱物，注入脫離子水並進行攪拌，再次進行離心分離。重複數次該操作直至pH值成為6.0～7.0，其後，利用高壓均質機進行分散處理，獲得纖維素微粒子分散液150 g。測定所獲得之纖維素微粒子之平均粒徑，結果為261 nm。其次，進行以上述方式製備之纖維素微粒子之染色。對將微粒子濃度調整為1.00 wt%之纖維素微粒子分散體100 g，添加硫酸鈉30 g、反應性染料(Distar股份有限公司製造之Levafix Red CA GR.(註冊商標))1.00 g，一面攪拌一面使用恆溫槽升溫至60℃。於升溫至60℃後添加碳酸鈉4 g，進行2小時染色。利用氫氧化鈉5%水溶液將所獲得之粗著色微粒子洗淨，藉由離心分離進行回收，以純水進行水洗後藉由離心分離進行回收，將上述一系列操作設為1週期，實施相同之操作直至進行共計3週期，而獲得著色纖維素微粒子。其次，進行以上述方式製備之著色纖維素微粒子之表面親水化反應。對調整為10.0 wt%之著色纖維素微粒子分散液10.0 mL，添加作為親水化劑之N-2-(胺基乙基)-3-胺基丙基三甲氧基矽烷(東京化成公司製造，A0774)10.0 mL、N,N-二甲基甲醯胺(東京化成公司製造，D0939)50.0 mL，一面攪拌一面使用恆溫槽升溫至50℃，使其反應4小時。於反應後，藉由離心分離進行回收，以純水進行水洗後藉由離心分離進行回收。反覆進行上述水洗直至pH值成為11.00以下，而獲得親水化著色纖維素微粒子分散液。將親水化度等粒子物性示於以下之表1。其次，進行對以上述方式製備之親水化著色纖維素微粒子之羧基導入反應。對調整為5.0 wt%之親水化著色纖維素微粒子分散液10.0 mL，添加作為反應劑之6-溴己酸(東京化成公司製造，B1290)6.0 g、N,N-二甲基甲醯胺(東京化成公司製造，D0939)50.0 mL、作為鹼之碳酸鈉(Kishida Chemical公司製造，000-71245)0.1 g，一面攪拌一面使用恆溫槽升溫至50℃，使其反應6小時。於反應後，藉由離心分離進行回收，利用2-丙醇(東京化成公司製造，I0277)進行3次利用離心分離之洗淨後，利用純水進行3次利用離心分離之洗淨，而獲得導入羧基之表面親水化著色纖維素微粒子。由於所獲得之微粒子為羧酸鈉型，故而添加0.1 M HCl溶液(和光純藥公司製造，083-01115)15.0 mL、純水35.0 mL，於室溫下使其反應2小時。其後，藉由離心分離進行回收，利用純水進行水洗後，藉由離心分離進行回收。實施水洗至pH值成為4.0以上，而獲得導入羧基之親水化著色纖維素微粒子分散液。將羧基之導入量等物性、及使用該微粒子作為顯色粒子時之免疫層析性能示於以下之表1。藉由親水層與間隔基之效果，可大幅地減少蛋白質之吸附。其結果為，偽陽性產生率成為0%。關於檢測感度，由於羧基量較多，故而於微粒子表面固定有充分量之抗體，因此維持較高之檢測感度。又，由於微粒子因親水層之影響不會吸附至膜片，而可迅速地移動，因此可縮短診斷時間。 [實施例2] 於羧基導入反應中，將碳酸鈉之量變更為9.9 g，除此以外，藉由與實施例1相同之方法而製作導入羧基之親水化著色纖維素微粒子。將該微粒子之物性、及用作顯色粒子時之免疫層析性能示於以下之表1。與實施例1同樣地，藉由利用親水層進行之親水化及大量地導入疏水性間隔基及羧基，可大幅地減少蛋白質之吸附。其結果為，偽陽性產生率成為0%。關於檢測感度，由於羧基量較多，故而於微粒子表面固定有充分量之抗體，因此維持較高之檢測感度。又，由於微粒子因親水層之影響不會吸附至膜片，而可迅速地移動，因此可縮短診斷時間。 [實施例3] 於羧基導入反應中，將碳酸鈉之量變更為29.7 g，除此以外，藉由與實施例1相同之方法而製作導入羧基之親水化著色纖維素微粒子。將該微粒子之物性、及用作顯色粒子時之免疫層析性能示於以下之表1。與實施例1同樣地，藉由利用親水層進行之親水化及大量地導入疏水性間隔基及羧基，可大幅地減少蛋白質之吸附。其結果為，偽陽性產生率成為0%。關於檢測感度，由於羧基量較多，故而於微粒子表面固定有充分量之抗體，因此維持較高之檢測感度。又，由於微粒子因親水層之影響不會吸附至膜片，而可迅速地移動，因此可縮短診斷時間。 [實施例4] 將染色反應變更為5週期，於羧基導入反應中，將碳酸鈉之量變更為9.9 g，除此以外，藉由與實施例1相同之方法而製作導入羧基之親水化著色纖維素微粒子。將該微粒子之物性、及用作顯色粒子時之免疫層析性能示於以下之表1。與實施例1同樣地，藉由利用親水層進行之親水化及大量地導入疏水性間隔基及羧基，可大幅地減少蛋白質之吸附。其結果為，偽陽性產生率成為0%。關於檢測感度，由於羧基量較多，故而於微粒子表面固定有充分量之抗體，因此維持較高之檢測感度。又，由於微粒子因親水層之影響不會吸附至膜片，而可迅速地移動，因此可縮短診斷時間。 [實施例5] 於羧基導入反應中，變更為如下條件，即，將反應劑變更為11-溴十一烷酸(東京化成公司製造，B0389)7.2 g，將碳酸鈉之量變更為9.9 g，除此以外，藉由與實施例1相同之方法而製作導入羧基之親水化著色纖維素微粒子。將該微粒子之物性、及用作顯色粒子時之免疫層析性能示於以下之表1。與實施例1同樣地，藉由利用親水層進行之親水化及大量地導入疏水性間隔基及羧基，可大幅地減少蛋白質之吸附。其結果為，偽陽性產生率成為0%。關於檢測感度，由於羧基量較多，故而於微粒子表面固定有充分量之抗體，因此維持較高之檢測感度。又，由於微粒子因親水層之影響不會吸附至膜片，而可迅速地移動，因此可縮短診斷時間。 [實施例6] 於羧基導入反應中，將反應劑變更為二十烷二酸(東京化成公司製造，E0320)10.0 g，將碳酸鈉之量變更為9.9 g，除此以外，藉由與實施例1相同之方法而製作導入羧基之親水化著色纖維素微粒子。將該微粒子之物性、及用作顯色粒子時之免疫層析性能示於以下之表1。與實施例1同樣地，藉由利用親水層進行之親水化及大量地導入疏水性間隔基及羧基，可大幅地減少蛋白質之吸附。其結果為，偽陽性產生率成為0%。關於檢測感度，由於羧基量較多，故而於微粒子表面固定有充分量之抗體，因此維持較高之檢測感度。又，由於微粒子因親水層之影響不會吸附至膜片，而可迅速地移動，因此可縮短診斷時間。 [實施例7] 於羧基導入反應中，將反應劑變更為對苯二甲酸(東京化成公司製造，T0166)6.5g，將碳酸鈉之量變更為9.9 g，除此以外，藉由與實施例1相同之方法而製作導入羧基之親水化著色纖維素微粒子。將該微粒子之物性、及用作顯色粒子時之免疫層析性能示於以下之表1。與實施例1同樣地，藉由利用親水層進行之親水化及大量地導入疏水性間隔基及羧基，可大幅地減少蛋白質之吸附。其結果為，偽陽性產生率成為0%。關於檢測感度，由於羧基量較多，故而於微粒子表面固定有充分量之抗體，因此維持較高之檢測感度。又，由於微粒子因親水層之影響不會吸附至膜片，而可迅速地移動，因此可縮短診斷時間。 [實施例8] 於纖維素微粒子之凝固反應中，將凝固液變更為乙酸乙酯(東京化成公司製造，Q0040)濃度94.0 wt%、水濃度6.0 wt%，於羧基導入反應中，將碳酸鈉之量變更為9.9 g，除此以外，藉由與實施例1相同之方法而製作導入羧基之親水化著色纖維素微粒子。將該微粒子之物性、及用作顯色粒子時之免疫層析性能示於以下之表1。與實施例1同樣地，藉由利用親水層進行之親水化及大量地導入疏水性間隔基及羧基，可大幅地減少蛋白質之吸附。其結果為，偽陽性產生率成為0%。關於檢測感度，由於羧基量較多，故而於微粒子表面固定有充分量之抗體，因此維持較高之檢測感度。又，由於微粒子因親水層之影響不會吸附至膜片，而可迅速地移動，因此可縮短診斷時間。 [實施例9] 於纖維素微粒子之凝固反應中，將凝固液變更為丙酮濃度27.0 wt%、水濃度0.2 wt%、氨濃度72.8 wt%，於羧基導入反應中，將碳酸鈉之量變更為9.90 g，除此以外，藉由與實施例1相同之方法而製作導入羧基之親水化著色纖維素微粒子。將該微粒子之物性、及用作顯色粒子時之免疫層析性能示於以下之表1。與實施例1同樣地，藉由利用親水層進行之親水化及大量地導入疏水性間隔基及羧基，可大幅地減少蛋白質之吸附。其結果為，偽陽性產生率成為0%。關於檢測感度，由於羧基量較多，故而於微粒子表面固定有充分量之抗體，因此維持較高之檢測感度。又，由於微粒子因親水層之影響不會吸附至膜片，而可迅速地移動，因此可縮短診斷時間。 [實施例10] 於羧基導入反應中，將碳酸鈉之量變更為9.9 g，將反應劑變更為3-溴丙酸(東京化成公司製造，B0645)4.2 g，除此以外，藉由與實施例1相同之方法而製作導入羧基之親水化著色纖維素微粒子。將該微粒子之物性、及用作顯色粒子時之免疫層析性能示於以下之表1。與實施例1同樣地，藉由利用親水層進行之親水化及大量地導入疏水性間隔基及羧基，可大幅地減少蛋白質之吸附。其結果為，偽陽性產生率成為0%。關於檢測感度，由於羧基量較多，故而於微粒子表面固定有充分量之抗體，因此維持較高之檢測感度。又，由於微粒子因親水層之影響不會吸附至膜片，而可迅速地移動，因此可縮短診斷時間。 [實施例11] 於表面親水化反應中，將親水化劑變更為N-2-(胺基乙基)-3-胺基丙基三甲氧基矽烷(東京化成公司製造，A0774)10.0 mL、及聚乙二醇矽烷 Mw2000(Creative PEGWorks公司製造，PLS-2012)10.0 mL之混合體，於羧基導入反應中，將反應劑變更為11-溴十一烷酸7.2 g，除此以外，藉由與實施例1相同之方法而製作導入羧基之親水化著色纖維素微粒子。將該微粒子之物性、及用作顯色粒子時之免疫層析性能示於以下之表1。與實施例1同樣地，藉由利用親水層進行之親水化及大量地導入疏水性間隔基及羧基，可大幅地減少蛋白質之吸附。其結果為，偽陽性產生率成為0%。關於檢測感度，由於羧基量較多，故而於微粒子表面固定有充分量之抗體，因此維持較高之檢測感度。又，由於微粒子因親水層之影響不會吸附至膜片，而可迅速地移動，因此可縮短診斷時間。 [實施例12] 於表面親水化反應中，將親水化劑變更為胺基-PEG12-丙酸(Sigma-Aldrich公司製造，JKA12006)10.0 mL，於羧基導入反應中，將反應劑變更為11-溴十一烷酸7.2 g，將碳酸鈉變更為9.9 g，除此以外，藉由與實施例1相同之方法而製作導入羧基之親水化著色纖維素微粒子。將該微粒子之物性、及用作顯色粒子時之免疫層析性能示於以下之表1。與實施例1同樣地，藉由利用親水層進行之親水化及大量地導入疏水性間隔基及羧基，可大幅地減少蛋白質之吸附。其結果為，偽陽性產生率成為0%。關於檢測感度，由於羧基量較多，故而於微粒子表面固定有充分量之抗體，因此維持較高之檢測感度。又，由於微粒子因親水層之影響不會吸附至膜片，而可迅速地移動，因此可縮短診斷時間。 [實施例13] 於羧基導入反應中，將反應劑變更為Br-(CH₂ )₃₀ -COOH11.0 g，將碳酸鈉之量變更為9.9 g，除此以外，藉由與實施例1相同之方法而製作導入羧基之親水化著色纖維素微粒子。將該微粒子之物性、及用作顯色粒子時之免疫層析性能示於以下之表1。與實施例1同樣地，藉由利用親水層進行之親水化及大量地導入疏水性間隔基及羧基，可大幅地減少蛋白質之吸附。其結果為，偽陽性產生率成為0%。關於檢測感度，由於羧基量較多，故而於微粒子表面固定有充分量之抗體，因此維持較高之檢測感度。又，由於微粒子因親水層之影響不會吸附至膜片，而可迅速地移動，因此可縮短診斷時間。 [實施例14] 於羧基導入反應中，將碳酸鈉量變更為0.01 g，除此以外，藉由與實施例1相同之方法而製作導入羧基之親水化著色纖維素微粒子。將該微粒子之物性、及用作顯色粒子時之免疫層析性能示於以下之表1。藉由親水層及疏水性間隔基之效果，蛋白質之吸附量可較以下之比較例1等降低，亦確認到偽陽性降低效果。 [實施例15] 於羧基導入反應中，將反應劑變更為聚(乙二醇)雙(羧基甲基)醚 Mw600(Creative PEG Works公司製造，PSB-362)16.4 g，除此以外，藉由與實施例1相同之方法而製作導入羧基之親水化著色纖維素微粒子。將該微粒子之物性、及用作顯色粒子時之免疫層析性能示於以下之表1。蛋白質之吸附量可較以下之比較例1等略微降低，具有偽陽性降低效果。 [實施例16] 於表面親水化反應中，將親水化劑之量變更為40.0 mL，於羧基導入反應中，將反應劑變更為11-溴十一烷酸7.2 g，除此以外，藉由與實施例1相同之方法而製作導入羧基之親水化著色纖維素微粒子。將該微粒子之物性、及用作顯色粒子時之免疫層析性能示於以下之表1。因親水層及疏水性間隔基之影響，蛋白質之吸附量可較以下之比較例1降低，具有偽陽性降低效果。 [實施例17] 於表面親水化反應中，將親水化劑之量變更為8.0 mL，於羧基導入反應中，將反應劑變更為聚(乙二醇)雙(羧基甲基)醚 Mw600(Creative PEG Works公司製造，PSB-362)16.4 g，將碳酸鈉之量變更為0.01 g，除此以外，藉由與實施例1相同之方法而製作導入羧基之親水化著色纖維素微粒子。將該微粒子之物性、及用作顯色粒子時之免疫層析性能示於以下之表1。蛋白質之吸附量可較以下之比較例1等略微降低，確認到偽陽性降低效果。 [實施例18] 於表面親水化反應中，將親水化劑之量變更為40.0 mL，於羧基導入反應中，將反應劑變更為聚(乙二醇)雙(羧基甲基)醚 Mw600(Creative PEG Works公司製造，PSB-362)16.4 g，將碳酸鈉量變更為9.9 g，除此以外，藉由與實施例1相同之方法而製作導入羧基之親水化著色纖維素微粒子。將該微粒子之物性、及用作顯色粒子時之免疫層析性能示於以下之表1。蛋白質之吸附量可較以下之比較例1略微改善。其結果為，雖然為略微，但亦確認到偽陽性降低效果。 [實施例19] 將反應劑變更為11-溴十一烷酸7.2 g，將碳酸鈉量變更為0.01 g，除此以外，藉由與實施例1相同之方法而製作導入羧基之親水化著色纖維素微粒子。將該微粒子之物性、及用作顯色粒子時之免疫層析性能示於以下之表1。藉由親水層及疏水性間隔基之效果，蛋白質之吸附量較以下之比較例1降低。其結果為，亦確認到偽陽性降低效果。 [實施例20] 於羧基導入反應中，將反應劑變更為聚(乙二醇)雙(羧基甲基)醚 Mw600(Creative PEG Works公司製造，PSB-362)16.4 g，將碳酸鈉量變更為0.01 g，除此以外，藉由與實施例1相同之方法而製作導入羧基之親水化著色纖維素微粒子。將該微粒子之物性、及用作顯色粒子時之免疫層析性能示於以下之表1。蛋白質之吸附量較以下之比較例1略微改善。其結果為，確認到偽陽性降低效果。 [實施例21] 於羧基導入反應中，將反應劑變更為聚(乙二醇)雙(羧基甲基)醚 Mw5000(Creative PEG Works公司製造，PSB-366)65.6 g，將碳酸鈉量變更為9.9 g，除此以外，藉由與實施例1相同之方法而製作導入羧基之親水化著色纖維素微粒子。將該微粒子之物性、及用作顯色粒子時之免疫層析性能示於以下之表1。雖然間隔基為PEG，但由於長度較長，故而排斥體積效應發揮作用，蛋白質之吸附量成為0。其結果為，具有偽陽性降低效果。關於實施例1～21中所製作之微粒子，由於親水層作為保護層發揮功能，故而於使抗體鍵結之前的階段之微粒子之顯色強度亦未因反應活性基之導入而降低。 [比較例1] 不進行表面親水化反應與羧基導入反應，除此以外，藉由與實施例1相同之方法而製作著色纖維素微粒子。將該微粒子之物性、及用作顯色粒子時之免疫層析性能示於以下之表2。由於微粒子表面為疏水性，故而認為容易於微粒子表面大量地吸附蛋白質。其結果為，產生非特異吸附，偽陽性產生率為3%。 [比較例2] 藉由專利文獻4所記載之方法而製作間隔基為(CH₂ )₁₆ 之導入羧基之著色纖維素微粒子。將該微粒子之物性、及用作顯色粒子時之免疫層析性能示於以下之表2。由於抗體之使用量與專利文獻4不同，故而感度較專利文獻4飛躍性地提昇，但由於微粒子表面為疏水性，故而於微粒子表面大量地吸附蛋白質，因此產生非特異吸附，偽陽性產生率為3%。 [比較例3] 除不進行表面親水化以外，藉由與實施例1相同之方法而製作導入羧基之著色纖維素微粒子。將該微粒子之物性、及用作顯色粒子時之免疫層析性能示於以下之表2。由於大量地導入若干羧基，故而蛋白質之吸附量較比較例1或2略微改善。但是，由於不存在親水層，故而親水化度較低而吸附蛋白質，幾乎不具有偽陽性之降低效果。 [比較例4] 不進行表面親水化，藉由專利文獻4所記載之方法對微粒子表面導入胺基。其後，藉由與實施例1相同之方法而製作導入羧基之著色纖維素微粒子。將該微粒子之物性、及用作顯色粒子時之免疫層析性能示於以下之表2。由於殘存反應性胺基量較多，而且亦不存在親水層，故而未發現蛋白質之吸附量降低效果。其結果為，亦未確認到偽陽性降低效果。 [比較例5] 不進行表面親水化，於羧基導入反應中，將反應劑變更為聚(乙二醇)雙(羧基甲基)醚 Mw600(Creative PEG Works公司製造，PSB-362)16.40 g，除此以外，藉由與實施例1相同之方法而製作導入羧基之著色纖維素微粒子。將該微粒子之物性、及用作顯色粒子時之免疫層析性能示於以下之表2。由於不存在親水層，間隔基亦為PEG，故而微粒子表面與間隔基因電性相互作用而吸附，此外，由於微粒子表面之親水性亦不充分，故而吸附蛋白質，未發現吸附量之降低效果。其結果為，亦未確認到偽陽性降低效果。 [比較例6] 不進行表面親水化，藉由與比較例4相同之方法而對微粒子導入胺基。其後，於羧基導入反應中，將反應劑變更為11-溴十一烷酸，將碳酸鈉之量變更為0.01 g，除此以外，藉由與實施例1相同之方法而製作導入羧基之著色纖維素微粒子。將該微粒子之物性、及用作顯色粒子時之免疫層析性能示於以下之表2。由於不存在親水層，且殘存反應性胺基量較多，故而微粒子表面之親水性並不充分，未發現蛋白質之吸附降低效果。其結果為，亦未確認到偽陽性降低效果。 [比較例7] 不進行表面親水化，藉由與比較例4相同之方法而對微粒子導入胺基。其後，於羧基導入反應中，將反應劑變更為聚(乙二醇)雙(羧基甲基)醚 Mw600(Creative PEG Works公司製造，PSB-362)16.4 g，除此以外，藉由與實施例1相同之方法而製作導入羧基之著色纖維素微粒子。將該微粒子之物性、及用作顯色粒子時之免疫層析性能示於以下之表2。由於不存在親水層，且殘存反應性胺基量較多，故而微粒子表面之親水性並不充分，而且由於間隔基亦為PEG，故而未發現蛋白質之吸附降低效果。其結果為，亦未確認到偽陽性降低效果。 [比較例8] 不進行表面親水化，藉由與比較例4相同之方法而對微粒子導入胺基。其後，於羧基導入反應中，將反應劑變更為聚(乙二醇)雙(羧基甲基)醚 Mw600(Creative PEG Works公司製造，PSB-362)16.4 g，將碳酸鈉量變更為0.01 g，除此以外，藉由與實施例1相同之方法而製作導入羧基之著色纖維素微粒子。將該微粒子之物性、及用作顯色粒子時之免疫層析性能示於以下之表2。由於不存在親水層，且殘存反應性胺基量較多，故而微粒子表面之親水性並不充分，而且由於間隔基亦為PEG，故而未發現蛋白質之吸附降低效果。其結果為，亦未確認到偽陽性降低效果。 [比較例9] 將染色反應設為1週期，除此以外，藉由與實施例1相同之方法而製作導入羧基之親水化著色纖維素微粒子。將該微粒子之物性、及用作顯色粒子時之免疫層析性能示於以下之表2。由於顯色強度較低，故而檢測感度較實施例差，隨之診斷時間亦變長。 [比較例10] 將凝固液變更為二甲基亞碸(東京化成公司製造，D0798)50.00 wt%、水50.00 wt%，除此以外，藉由與實施例1相同之方法而製作導入羧基之親水化著色纖維素微粒子。將該微粒子之物性、及用作顯色粒子時之免疫層析性能示於以下之表2。由於粒徑較小，故而檢測感度較實施例差，隨之診斷時間亦變長。 [比較例11] 於表面親水化反應中，將親水化劑之量變更為1.0 mL，除此以外，藉由與實施例1相同之方法而製作導入羧基之親水化著色纖維素微粒子。將該微粒子之物性、及用作顯色粒子時之免疫層析性能示於以下之表2。由於親水層過少，故而於羧基導入反應時微粒子之顯色強度顯著降低。 [比較例12] 於纖維素微粒子之凝固反應中，將凝固液變更為四氫呋喃濃度97.0 wt%、水濃度3.0 wt%，於羧基導入反應中，將碳酸鈉之量變更為9.9 g，將反應劑變更為11-溴十一烷酸7.2 g，除此以外，藉由與實施例1相同之方法而製作導入羧基之親水化著色纖維素微粒子。將該微粒子之物性、及用作顯色粒子時之免疫層析性能示於以下之表2。由於微粒子之粒徑過大，故而無法於膜片中展開。 [比較例13] 使用粒徑為50 nm且導入羧基之羧基改質金奈米粒子2000Da PEG Linker(CTD公司製造)作為顯色粒子，對免疫層析性能進行評價。將結果示於以下之表2。由於微粒子表面為疏水性，故而於在膜片中移動時耗費時間，顯色時間較遲。又，由於微粒子表面為疏水性，故而蛋白質亦容易吸附至微粒子表面，亦容易產生偽陽性。 [比較例14] 使用粒徑為470 nm、顯色強度為0.5且導入羧基之乳膠粒子(Bangs公司製造)作為顯色粒子，對免疫層析性能進行評價。將結果示於以下之表2。由於微粒子表面為疏水性，故而蛋白質亦容易吸附至微粒子表面，亦容易產生偽陽性。 [比較例15] 藉由與實施例1相同之方法而製作親水化著色纖維素微粒子。其後，不進行羧基導入反應，而直接用作顯色粒子。將粒子物性與免疫層析性能示於表2。儘管粒子為親水性，但不存在與抗體之鍵結部位，故而抗體無法擔載於粒子上，因此感度變得非常低。 [表1] [表2] [產業上之可利用性] 本發明之親水化著色纖維素微粒子可較佳地用作維持較高之檢測感度並且亦可進行迅速之診斷、且偽陽性之產生風險經顯著降低的免疫層析診斷套組之顯色粒子。

圖1係用以求出親水化度之對弛豫時間之變化比率(Rsp值)與微粒子之總表面積值(TSA值)進行繪圖所獲得之圖。圖2係表示免疫層析診斷套組之測定中之測試線(TL)之顯色強度(0-10之11個階段之目視等級)之照片。

Claims

一種著色纖維素微粒子，其特徵在於：其平均粒徑為60～900 nm，顯色強度為1.0～10.0，於微粒子表面具有親水層，且經由間隔基導入有羧基。
如請求項1之著色纖維素微粒子，其中上述羧基之導入量相對於上述著色纖維素微粒子每1 g為0.20～3.00 mmol。
如請求項1或2之著色纖維素微粒子，其中上述親水層係矽烷層、聚乙二醇層(PEG)、或矽烷層與聚乙二醇(PEG)層之混合層之任一者。
如請求項1至3中任一項之著色纖維素微粒子，其中上述間隔基係烴系結構體。
一種結構體，其係於如請求項1至4中任一項之著色纖維素微粒子之上述羧基上共價鍵結有配位基。
一種免疫層析診斷套組，其包含如請求項5之結構體。