ES2909503T3

ES2909503T3 - Micropartículas de celulosa colorantes hidrófilas

Info

Publication number: ES2909503T3
Application number: ES18781015T
Authority: ES
Inventors: Yoshiyuki Shiomi; Atsushi Horii; Takeshi Matsuse; Ken Muraoka
Original assignee: Asahi Kasei Corp; Asahi Chemical Industry Co Ltd
Current assignee: Asahi Kasei Corp; Asahi Chemical Industry Co Ltd
Priority date: 2017-04-06
Filing date: 2018-03-28
Publication date: 2022-05-06
Anticipated expiration: 2038-03-28
Also published as: JPWO2018186267A1; WO2018186267A1; TW201842334A; EP3608670A1; CA3058871C; US11353453B2; KR102300483B1; TWI682174B; CA3058871A1; EP3608670A4; EP3608670B1; US20210109093A1; CN110476063A; CN110476063B; JP6865813B2; KR20190117678A

Abstract

Micropartículas de celulosa coloreadas que tienen un diámetro de partícula promedio de 60 nm a 900 nm; intensidad de coloración medida tal como se describe en la descripción de 1,0 a 10,0; una capa hidrófila en la superficie de las micropartículas, en las que la capa hidrófila está unida químicamente a los grupos hidroxilo de las micropartículas, y en las que la capa hidrófila es cualquiera de una capa de silano, una capa de polietilenglicol (PEG) o una capa mixta de una capa de silano y una capa de polietilenglicol (PEG); grupos carboxilo introducidos en la superficie de las micropartículas con espaciadores hidrófobos interpuestos entre los mismos, en las que los espaciadores hidrófobos son grupos químicos que se unen con grupos reactivos de la capa hidrófila y conectan la micropartícula con el grupo carboxilo a través de la capa hidrófila, en las que los espaciadores son estructuras a base de hidrocarburos; y un grado de hidrofilización medido tal como se describe en la descripción de 30,0 a 200,0.

Description

DESCRIPCIÓN

Micropartículas de celulosa colorantes hidrófilas

Campo

La presente invención se refiere a micropartículas de celulosa coloreadas que tienen una capa hidrófila en la superficie de las micropartículas y grupos carboxilo introducidos en la superficie de las micropartículas con espaciadores hidrófobos a base de hidrocarburos interpuestos entre los mismos que conectan la micropartícula con el grupo carboxilo a través de la capa hidrófila, y a un kit de diagnóstico inmunocromatográfico que contiene dichas micropartículas.

Antecedentes

En los últimos años, se ha buscado una tecnología que puede determinar fácil y rápidamente la presencia o ausencia de enfermedades, patógenos y similares en los campos de la salud y la alimentación. Se han desarrollado diversas tecnologías para responder a esta necesidad. Actualmente, es posible realizar de manera fácil y rápida diversos exámenes tales como los de infecciones por el virus de la gripe y otros patógenos, pruebas de embarazo, exámenes para determinar la presencia de marcadores de cáncer o marcadores musculares, o exámenes para determinar la presencia de sustancias alergénicas presentes en alimentos o sustancias que provocan intoxicación alimentaria. Se han desarrollado numerosos métodos de medición para su uso con estas tecnologías, tales como el ensayo inmunocromatográfico, el ensayo inmunocromatográfico de fluorescencia, el inmunoensayo enzimático, la prueba de aglutinación de látex o el ensayo de quimioluminiscencia. Entre estos, se usan ampliamente los ensayos inmunocromatográficos que permiten determinar visualmente los resultados ya que se caracterizan por no requerir ningún dispositivo especial ni conocimientos especializados y por permitir una realización de manera fácil y rápida de diagnósticos. Por ejemplo, las pruebas de embarazo, que son un tipo de ensayo inmunocromatográfico, pueden adquirirse en farmacias normales y ofrecen a los consumidores un alto grado de uso general.

Los ensayos inmunocromatográficos (que se denominarán “inmunocromatografía”) utilizan una reacción antígeno-anticuerpo y consisten en ensayos tipo sándwich y ensayos competitivos. Los métodos de medición se dividen a grandes rasgos en un método de flujo lateral, en el que la sustancia que va a detectarse se desarrolla en dirección horizontal sobre una membrana, y un método de flujo continuo, en el que la sustancia que va a detectarse se desarrolla en dirección vertical. Desde el punto de vista de la sencillez, se usa ampliamente un método que consiste en capturar el antígeno con el anticuerpo mediante un ensayo sándwich con el método de flujo continuo. El procedimiento de medición consiste en las etapas indicadas a continuación.

(i) Se inmoviliza un anticuerpo que reacciona con un antígeno u otra sustancia que va a detectarse sobre una membrana tal como una membrana de nitrocelulosa en un sitio específico (línea de prueba).

(ii) Se prepara un reactivo de detección que soporta el anticuerpo que reacciona con la diana de detección en una sustancia marcadora denominada partícula coloreada y se recubre sobre una almohadilla de conjugado y se seca, seguido por la combinación con la membrana mencionada anteriormente, una almohadilla de muestra y una almohadilla absorbente para preparar un kit de inmunocromatografía.

(iii) Se añade en gotas una disolución de desarrollo, que se mezcla con una muestra que se desea examinar para detectar la presencia de antígeno, sobre la almohadilla de muestra y se observa visualmente la presencia de color en la línea de prueba (TL) (o usando un lector de inmunocromatografía simple) para determinar la presencia o ausencia de antígeno. En caso de que el antígeno esté presente en la muestra, la línea de prueba se colorea.

En general, en muchos casos en los que los resultados se determinan visualmente, se usan análisis cualitativos que sólo permiten determinar si está presente la diana de detección en forma de antígeno o no.

Los ejemplos de partículas colorantes usadas en inmunocromatografía incluyen las partículas de oro coloidal dadas a conocer en el siguiente documento PTL1 y el látex coloreado dado a conocer en el siguiente documento PTL2. El problema de estas partículas colorantes es que, debido a las propiedades hidrófobas de la superficie de las micropartículas, acaba produciéndose un fenómeno conocido como adsorción inespecífica en el que se adsorben biomoléculas tales como proteínas. Cuando se produce una adsorción inespecífica, existe el riesgo de que se produzcan falsos positivos, considerado el principal problema asociado a la inmunocromatografía. Un falso positivo se refiere a que la línea de prueba está coloreada aunque no haya una diana de detección presente en una muestra. Dado que la aparición de un falso positivo puede conducir a un diagnóstico erróneo, es fundamental no permitir la aparición de falsos positivos cuando se lanza al mercado un kit de inmunocromatografía. Se cree que uno de los mecanismos detrás de la aparición de falsos positivos se debe a que la partícula colorante se adsorbe en el anticuerpo que recubre la línea de prueba a través de una sustancia que no se ha adsorbido de manera inespecífica en la partícula colorante. Por tanto, el siguiente documento PTL3 da a conocer que los falsos positivos se reducen como resultado de la supresión de la adsorción inespecífica mediante una técnica que consiste en unir polietilenglicol (PEG) hidrófilo a la superficie hidrófoba del oro coloidal. Sin embargo, en este método, la estructura estérica de la cadena de PEG en la superficie de las micropartículas inhibe la reacción antígeno-anticuerpo, lo que genera el riesgo de una disminución de la sensibilidad de detección. De esta manera, existen muchos casos en los que las medidas adoptadas para reducir los falsos positivos acaban provocando una disminución de la sensibilidad de detección.

Teniendo en cuenta lo anterior, el siguiente documento PTL4 da a conocer que se logró un nivel extremadamente alto de sensibilidad de detección mediante la unión química de micropartículas de celulosa coloreadas a anticuerpos. Dado que estas micropartículas se derivan de la celulosa, aunque la superficie es ligeramente hidrófila en comparación con el oro coloidal, dado que la superficie sigue siendo hidrófoba, existe la posibilidad de que se produzca una adsorción inespecífica, por lo que aún se mantiene el riesgo de que se produzcan falsos positivos de la misma manera que las partículas colorantes convencionales. PTL5 se refiere a un kit de diagnóstico inmunocromatográfico de tipo flujo lateral que incluye una almohadilla de conjugado que contiene un conjugado que incluye partículas cromogénicas y una almohadilla de muestra que se compone de un material textil no tejido elaborado de fibras celulósicas regeneradas para un reactivo de diagnóstico in vitro. Documento PTL6 se refiere a la unión covalente de compuestos bioactivos a superficies de polímeros funcionalizadas, incluyendo técnicas relevantes en la modificación de superficies de polímeros, tales como tratamientos químicos en húmedo, de organosilanización, con gas ionizado e irradiación UV, así como métodos de análisis de superficies de polímeros biofuncionalizadas, tales como métodos espectrales (espectroscopía de fotoelectrones de rayos X, espectroscopía infrarroja por transformada de Fourier, microscopía de fuerza atómica y otros) y métodos no espectrales (ángulo de contacto, ensayos de tinte, ensayos biológicos y potencial zeta). Documento PTL7 se refiere a partículas magnéticamente sensibles que comprenden una partícula central que comprende un metal magnéticamente sensible, una aleación metálica o un óxido metálico y un recubrimiento de polímero con un hidrato de carbono o un polímero vinílico que puede unir adsorbentes de bioafinidad.

Documento PTL8 se refiere a un procedimiento para etiquetar un artículo y/o documento con una partícula con fines de autenticación mediante (a) modificar/funcionalizar, opcionalmente una o ambas especies de marcador y una superficie de las partículas para que puedan reaccionar entre sí para formar un enlace y (b) hacer reaccionar dicho marcador con dicha superficie de partícula para unir el marcador a la misma para formar partículas marcadas.

Tal como se ha descrito anteriormente, todavía existe la necesidad de proporcionar tecnología para reducir los falsos positivos mientras se mantiene una alta sensibilidad de detección y, como una forma de responder a esta necesidad, existe un fuerte deseo de desarrollar partículas colorantes que puedan suprimir la adsorción inespecífica considerablemente sin inhibir la reacción anticuerpo-antígeno.

Lista de referencias

Bibliografía de patentes

PTL1: publicación internacional n.° WO 2015/163384 A1

PTL2: publicación de patente japonesa no examinada n.° 2009-168495

PTL3: publicación internacional n.° WO 2013/141122 A1

PTL4: publicación internacional n.° WO 2011/062157 A1

PTL5: documento EP 3009840

PTL6: J.M. Goddard et al., “Polymer Surface modification for the attunement of bioactive compounds”, PROGRESS IN POLYMER SCIENCE, vol. 32, 2007, páginas 698-725

PTL7: documento WO90/15666

PTL8: documento WO03/030129

Sumario

Problema técnico

Teniendo en cuenta lo anterior, un objetivo de la presente invención es proporcionar partículas colorantes que puedan reducir considerablemente los falsos positivos manteniendo al mismo tiempo una alta sensibilidad de detección.

Solución al problema

Como resultado de la realización de extensos estudios para resolver los problemas mencionados anteriormente, los inventores de la presente invención encontraron que pueden encontrarse micropartículas de celulosa que sorprendentemente pueden reducir la adsorción inespecífica de proteínas y otras biomoléculas impartiendo una capa hidrófila a la superficie de las micropartículas e introduciendo grupos carboxilo en la superficie de las micropartículas con espaciadores interpuestos entre los mismos, y confirmaron que la inmunocromatografía que usa los mismos como partículas colorantes puede reducir considerablemente los falsos positivos manteniendo al mismo tiempo una alta sensibilidad de detección, lo que conduce de este modo a la finalización de la presente invención.

La presente invención y sus realizaciones preferidas son evidentes a partir de las reivindicaciones adjuntas. Efectos ventajosos de la invención

Las micropartículas de celulosa coloreadas según la presente invención pueden reducir considerablemente los falsos positivos manteniendo al mismo tiempo una alta sensibilidad de detección si se usan como partículas colorantes de inmunocromatografía ya que se reduce la adsorción inespecífica de biomoléculas.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 es un gráfico que indica una gráfica de la tasa de cambio en el tiempo de relajación (valor Rsp) frente al área de superficie total de las micropartículas (valor TSA) para determinar el grado de hidrofilización.

La figura 2 es una fotografía que indica la intensidad de coloración (grado visual en una escala de 11 grados desde 0 hasta 10) de una línea de prueba (TL) durante un ensayo con un kit de diagnóstico inmunocromatográfico.

Descripción de las realizaciones

Los inventores de la presente invención descubrieron inesperada y sorprendentemente que son posibles un efecto que reduce considerablemente los falsos positivos y el mantenimiento de una alta sensibilidad de detección combinando una capa hidrófila prescrita y un espaciador prescrito en micropartículas de celulosa coloreadas.

Tal como se da a conocer en el documento PTL4, se determinó que la sensibilidad de detección mejoraba como resultado de la unión química de un anticuerpo con micropartículas de celulosa coloreadas que tenían un gran diámetro de partícula y un color intenso. Sin embargo, debido a la hidrofilia inadecuada de la superficie de estas micropartículas, las micropartículas son susceptibles de que se produzca una adsorción inespecífica de proteínas y otras biomoléculas, lo que da como resultado el riesgo de que se produzcan falsos positivos cuando se usan para inmunocromatografía. Por tanto, aunque se implementaron medidas tales como añadir un aditivo como un tensioactivo a la disolución de desarrollo para reducir los falsos positivos, estas medidas dieron como resultado una disminución simultánea en la sensibilidad de detección. Los inventores de la presente invención pensaron que podría ser posible reducir los falsos positivos manteniendo al mismo tiempo una alta sensibilidad de detección haciendo que las micropartículas per se fueran resistentes a la adsorción inespecífica y posibilitando la introducción de grandes cantidades de anticuerpos en la superficie de las micropartículas. Como resultado de la realización repetida de experimentos basados en esta hipótesis, los inventores de la presente invención encontraron que puede mantenerse una alta sensibilidad de detección mientras se reducen considerablemente los falsos positivos impartiendo una capa hidrófila a la superficie de micropartículas de celulosa coloreadas e introduciendo una gran cantidad de grupos carboxilo en la superficie de las micropartículas con espaciadores a base de hidrocarburos interpuestos entre los mismos, lo que hace posible introducir una gran cantidad de anticuerpo en las micropartículas mientras se reduce la adsorción inespecífica de proteínas y otras biomoléculas en la superficie de las micropartículas.

Tal como se da a conocer en el documento PTL3, se determinó que los falsos positivos podían reducirse impartiendo una capa hidrófila a la superficie de las micropartículas. Por otro lado, se dice normalmente que los compuestos a base de hidrocarburos absorben fácilmente proteínas y otras biomoléculas, lo que provoca falsos positivos. Teniendo en cuenta lo anterior, los inventores de la presente invención encontraron inesperadamente que los falsos positivos pueden reducirse considerablemente combinando un espaciador hidrófobo a base de hidrocarburos además de impartir una superficie hidrófila. Sin querer limitarse a una teoría específica, los inventores de la presente invención creen que lograron reducir considerablemente los falsos positivos ya que los espaciadores a base de hidrocarburos se elevan desde la superficie de las micropartículas como resultado de repelerse por la capa hidrófila y se introducen densamente en la superficie de las micropartículas debido a la interacción hidrófoba entre los espaciadores, y cuando se eliminan los huecos que permiten la entrada de proteínas y otras biomoléculas que provocan falsos positivos en la superficie de las micropartículas y se suprime la adsorción inespecífica, es decir, aunque las proteínas que provocan falsos positivos no pueden adsorberse en los lados de los espaciadores lineales a base de hidrocarburos como resultado de que los espaciadores están dispuestos aproximadamente en filas paralelas en la superficie de las micropartículas, los anticuerpos pueden unirse covalentemente a los grupos carboxilo en los extremos de los espaciadores.

Lo siguiente proporciona una explicación detallada de la presente realización. Las micropartículas de celulosa coloreadas de la presente realización tienen un diámetro de partícula promedio de 60 nm a 900 nm; intensidad de coloración medida tal como se describe en la descripción de 1,0 a 10,0;

una capa hidrófila en la superficie de las micropartículas, en las que la capa hidrófila está unida químicamente a grupos hidroxilo de las micropartículas, y en las que la capa hidrófila es cualquiera de una capa de silano, una capa de polietilenglicol (PEG) o una capa mixta de una capa de silano y una capa de polietilenglicol (PEG); grupos carboxilo introducidos en la superficie de las micropartículas con espaciadores hidrófobos interpuestos entre los mismos, en las que los espaciadores hidrófobos son grupos químicos que se unen a grupos reactivos de la capa hidrófila y conectan la micropartícula con el grupo carboxilo a través de la capa hidrófila, en las que los espaciadores son estructuras a base de hidrocarburos; y

un grado de hidrofilización medido tal como se describe en la descripción de 30,0 a 200,0.

El término “diámetro de partícula promedio” se refiere al diámetro mediano promedio de volumen en el caso de haberse medido por dispersión de luz dinámica. En la presente realización, el diámetro de partícula promedio está dentro del intervalo de 60 nm a 900 nm. Si el diámetro de partícula promedio está dentro de este intervalo, la línea de prueba se vuelve más intensa, o en otras palabras, aumenta la sensibilidad de detección, en el caso de usar en inmunocromatografía debido al aumento de área de superficie de las micropartículas. Si el diámetro de partícula promedio es inferior a 60 nm, la intensidad de coloración por micropartícula disminuye debido a la disminución del área de superficie, lo que da como resultado una menor sensibilidad de detección o la aparición de agregación de micropartículas. Basándose en eso, el límite inferior del diámetro de partícula es preferiblemente de 70 nm y más preferiblemente de 80 nm. Por otro lado, dado que los poros de la membrana terminan obstruyéndose si el diámetro de las micropartículas supera 900 nm, se requiere más tiempo para el diagnóstico o la superficie de la membrana puede colorearse después de la prueba, lo que tiene de ese modo un efecto perjudicial en la evaluación de los resultados de la prueba o dando como resultado una baja sensibilidad de detección. Basándose en eso, el límite superior del diámetro de partícula es preferiblemente de 800 nm y más preferiblemente de 700 nm. Además, se pretende que el diámetro de partícula promedio mencionado en este caso sea un valor promedio, y una parte de la distribución del diámetro de partícula puede estar fuera del intervalo mencionado anteriormente.

El motivo para usar el promedio de volumen para el diámetro de partícula es que, aunque las micropartículas excesivamente grandes terminan obstruyendo la membrana durante la inmunocromatografía, dado que los efectos de las micropartículas grandes se potencian en el caso de usar el promedio de volumen, incluso si sólo está presente un pequeño número de partículas grandes, el efecto del mismo se refleja en el resultado. También hay otras diversas formas de representar el promedio además del promedio de volumen, tal como promedio numérico o promedio de área. Naturalmente, el valor del diámetro de partícula cambia cuando difiere el método usado para representar el diámetro de partícula.

El término “intensidad de coloración” se refiere a un valor que define la profundidad de color de las micropartículas antes de la unión del anticuerpo después de haber introducido un grupo reactivo y, en la presente realización, está dentro del intervalo de 1,0 a 10,0. Cuanto mayor sea este valor, más intensa será el color de las micropartículas y mayor será la sensibilidad de detección en el caso de usar en inmunocromatografía. Naturalmente, a medida que este valor aumenta, pueden emplearse diversos métodos para dar color, tal como usar un tinte de color intenso, aumentar el número de ciclos de teñido, realizar acoplamiento a través de algún tipo de compuesto que sirva como espaciador, facilitar la captación del tinte al aumentar la región amorfa de las micropartículas, o facilitar la captación del tinte haciendo porosas las micropartículas. Sin embargo, cuando se considera la economía, el límite superior de la intensidad de coloración es preferiblemente 7,0 y más preferiblemente 5,0. Además, dado que la sensibilidad de detección durante la inmunocromatografía disminuye a medida que el valor se vuelve más pequeño, el límite inferior de la intensidad del color es preferiblemente 1,5 y más preferiblemente 2,0.

El método usado para medir la intensidad de coloración consiste en preparar una dispersión en agua pura de micropartículas de concentración conocida, medir la absorbancia visible usando una esfera integradora en un intervalo de 400 nm a 800 nm en una longitud de camino óptico de 10 mm, medir el valor máximo de la curva de absorbancia resultante (ABS), dividir el valor resultante entre el porcentaje en peso de las partículas colorantes y definir como el valor obtenido al convertir a absorbancia por 0,01% en peso de las partículas colorantes. Por ejemplo, cuando la concentración de las micropartículas preparadas es del 0,0045% en peso y el valor máximo de la curva de absorbancia es 1,0, la intensidad de coloración se convierte en (1 * 0,01) 0,0045 = 2,2.

El motivo para medir la absorbancia visible usando una esfera integradora al medir la profundidad de color de las micropartículas es poder medir la profundidad de color de las micropartículas cuando se dispersan en un líquido con la mayor precisión. Aunque se ha empleado un método que consiste en secar las micropartículas y luego medir el sólido resultante con un colorímetro como método para medir la profundidad de color de las micropartículas, este método no puede medir con precisión la profundidad de color de las micropartículas. Dado que el tono de color y la longitud de onda máxima difieren entre los coloides metálicos, por ejemplo, según el diámetro de partícula, la profundidad de color no puede reflejarse con precisión entre las micropartículas agregadas secas y las que se encuentran en estado disperso. Además, aunque las micropartículas pueden dispersarse en un líquido a la misma concentración, la profundidad de color disminuye una vez que se ha producido la agregación. Además, el motivo para usar una esfera integradora al medir la absorbancia visible es eliminar los efectos atribuibles a la dispersión de las micropartículas per se. La medición normal de la absorbancia visible consiste en medir la luz transmitida, y no sólo los efectos atribuibles a la absorbancia de los componentes de luz de color de la luz incidente, sino también los efectos atribuibles a la dispersión de las micropartículas per se, se reflejan en la medición de la absorbancia. Por ejemplo, aunque el oro coloidal que normalmente se usa en inmunocromatografía se usa con un diámetro de partícula de 40 nm a 60 nm y ocasionalmente puede usarse con un diámetro de partícula de 100 nm, apenas hay efectos de la luz dispersada debido al pequeño diámetro de partícula en cualquiera de estos casos. Por el contrario, las partículas de látex tienen un efecto considerable en la dispersión de la luz debido al gran diámetro de partícula de las mismas. Por estos motivos, la medición de la absorbancia visible usando una esfera integradora se usa para reflejar con mayor precisión la profundidad de color de las micropartículas per se, incluso en los casos en que los diámetros de partícula o los materiales de las partículas difieren.

El término “capa hidrófila” se refiere a una capa que se compone de una estructura que tiene una alta hidrofilicidad, tal como implica el nombre, que está unida químicamente a los grupos hidroxilo de las micropartículas. Como esta capa hidrófila, una capa de silano, una capa de polietilenglicol (PEG) o una capa mixta de una capa de silano y una capa de polietilenglicol (PEG) son según la presente invención. Por ejemplo, puede formarse una capa que contiene una capa de silano y una capa de PEG en una razón de 1:1. La capa de silano a la que se hace referencia en este caso es una capa formada por la unión de grupos hidroxilo de las partículas a una estructura que contiene grupos Si. De manera similar, una capa de PEG se refiere a una capa en la que los grupos hidroxilo de las partículas están unidos a estructuras que contienen grupos PEG. Desde el punto de vista de la capacidad de unión posterior con el reactivo, una de las estructuras que forman la capa hidrófila contiene preferiblemente un grupo amino. Se determina si se ha formado o no una capa hidrófila mediante un método tal como espectroscopía infrarroja, observación microscópica o análisis elemental.

Además, en la presente descripción, un “espaciador” difiere de la “capa hidrófila” en que el espaciador se une a un grupo reactivo presente en la “capa hidrófila”.

Los ejemplos del agente hidrofilizante usado para impartir la capa hidrófila incluyen los siguientes: viniltrimetoxisilano, viniltrietoxisilano, 2-(3,4-epoxiciclohexil)etiltrimetoxisilano, 3-glicidoxipropilmetildimetoxisilano, 3-glicidoxipropilmetildietoxisilano, 3-glicidoxipropiltrietoxisilano, p-estiriltrimetoxisilano, 3-metacriloxipropilmetildimetoxisilano, 3-metacriloxipropiltrimetoxisilano, 3-metacriloxipropilmetildietoxisilano, 3-metacriloxipiropiltrietoxisilano, 3-acriloxipropiltrimetoxisilano, N-2-(aminoetil)-3-aminopropilmetildimetoxisilano, N-2- (aminoetil)-3-aminopropiltrimetoxisilano, 3-aminopropiltrimetoxisilano, 3-aminopropiltrietoxisilano, 3-trietoxisilil-N-(1,3-dimetil-butliden)propilamina, N-fenil-3-aminopropiltrimetoxisilano, 3-mercaptopropilmetildimetoxisilano, 3-mercaptopropiltrimetoxisilano, 3-isocianatopropiltrimetoxisilano, trimetoxisilano de polietilenglicol, trietoxisilano de polietilenglicol, ácido amino-PEG12-propiónico, ácido amino-PEG8-propiónico, ácido amino-PEG4-propiónico, ácido acético de poli(etilenglicol)-2-aminoetil éter, FMOC-PEG 5k-butanoato de succinimida, HO-PEG 5k-NHS, O-[2-(Fmoc-amino)-etil]-O'-2-carboetil)polietilenglicol y bis(amina) de polietilenglicol. Entre estos, los ejemplos preferibles incluyen N-2-(aminoetil)-3-aminopropilmetildimetoxisilano, N-2-(aminoetil)3-aminopropiltrimetoxisilano, 3- aminopropiltrimetoxisilano, 3-aminopropiltrietoxisilano, 3-trietoxisilil-N-(1,3-dimetil-butiliden)propilamina, ácido amino-PEG12-propiónico, ácido amino-PEG8-propiónico, ácido amino-PEG4-propiónico, ácido acético de poli(etilenglicol)-2-aminoetil éter y bis(amina) de polietilenglicol, y ejemplos más preferibles incluyen N-2-(aminoetil)-3-aminopropilmetildimetoxisilano, N-2-(aminoetil)-3-aminopropiltrimetoxisilano, 3-aminopropiltrimetoxisilano, 3-aminopropiltrietoxisilano y 3-trietoxisilil-N-(1,3-dimetilbutiliden)propilamina.

En el caso de usar una capa hidrófila que contiene grupos amino, la cantidad de grupos amino reactivos que quedan después de haber introducido grupos carboxilo es preferiblemente inferior a 0,20 mmol por gramo de micropartículas de celulosa coloreadas. Si dentro de este intervalo, no sólo es posible suprimir la adsorción de sustancias hidrófobas, sino dado que también puede suprimirse la adsorción de sustancias que forman enlaces de hidrógeno, la cantidad adsorbida de biomoléculas puede reducirse drásticamente. Si la cantidad de grupos amino reactivos que quedan después de haber introducido grupos carboxilo es de 0,20 mmol o más por g de micropartículas de celulosa coloreadas, el efecto de reducción de falsos positivos se ve disminuido debido a un aumento de la adsorción por enlaces de hidrógeno en particular. Basándose en lo anterior, el límite superior de la cantidad de grupos amino reactivos residuales es preferiblemente de 0,15 mmol y más preferiblemente de 0,10 mmol.

El ensayo de fluorescencia se usa para medir la cantidad de grupos amino reactivos residuales. Se usa un reactivo de fluorescencia que emite luz únicamente en el caso de haber reaccionado con un grupo amino. En primer lugar, se crea una curva de calibración para la relación entre la cantidad de grupos amino y la intensidad luminosa usando muestras que tienen cantidades conocidas de grupos amino. Posteriormente, el reactivo de fluorescencia se hace reaccionar con las micropartículas. Luego se mide la intensidad de fluorescencia de las micropartículas para obtener la intensidad luminosa de las mismas. Luego, la intensidad luminosa resultante se introduce en la curva de calibración para calcular la cantidad de grupos amino.

El “grado de hidrofilización” se define como un indicador que representa el grado de hidrofilización de la capa hidrófila. En la presente descripción, el “grado de hidrofilización” se refiere a la facilidad de humectación de la superficie de las micropartículas, o en otras palabras, es un indicador que representa la afinidad por el agua. El grado de hidrofilización se mide por RMN pulsada. La RMN pulsada es una técnica analítica que consiste en excitar los protones de las moléculas de agua mediante la irradiación de una dispersión de micropartículas con ondas de radio y luego medir la cantidad de tiempo hasta que los protones regresan al estado fundamental (tiempo de relajación). El tiempo de relajación se acorta ya que las moléculas de agua adsorbidas en la superficie de las micropartículas suprimen la movilidad, mientras que el tiempo de relajación se alarga ya que hay poca supresión de la movilidad por parte de las moléculas de agua a granel (las moléculas de agua no adsorbidas en la superficie de las micropartículas), lo que permite que las moléculas de agua se muevan libremente. Por tanto, el tiempo de relajación de una dispersión de micropartículas determinado por RMN pulsada cambia según la relación entre las moléculas de agua adsorbidas en la superficie de las micropartículas y las moléculas de agua a granel. Es decir, cuanto mayor sea la hidrofilia de la superficie de las micropartículas, mayor será el número de moléculas de agua que pueden adsorberse en la superficie, acortando así el tiempo de relajación.

El sistema Minispec mq20 fabricado por Bruker Corporation se usa para la medición por RMN pulsada. Después de agitar una dispersión de micropartículas con una concentración del 1% (p/v), se transfieren 0,5 ml a un tubo de RMN de vidrio con un diámetro exterior de 10 mm, se colocan en un aparato de RMN ajustado a 30°C y se mide cada tipo de parámetro después de configurarlo de la manera indicada a continuación.

* Núcleo observado: 1H

* Tiempo de relajación medido: tiempo de relajación transversal T2 (ms)

* Modo de medición: método CPMG

* Ciclos de integración: 32

* Retraso de reciclaje: 10 (s)

* Separación de pulsos 90°-180° (^t ): 2 (ms)

* Número total de ecos adquiridos: 2000 puntos

La curva de pérdida de magnetización resultante (curva que indica cambios en la intensidad de magnetización basados en el tiempo) se ajustó a la siguiente ecuación (1) según el método de mínimos cuadrados usando la función de aproximación exponencial de Microsoft Excel:

M(t) = Mo-exp(-t/T2) (Ecuación 1)

(en la que M(t) representa la intensidad de la señal en un determinado momento t, M⁰representa el valor inicial de la intensidad de la señal y T2 representa el tiempo de relajación).

Para calcular el grado de hidrofilización a partir del tiempo de relajación medido, se prepara un gráfico en el que la tasa de cambio en el tiempo de relajación (valor Rsp) se representa en el eje vertical y el área de superficie total (valor TSA) de las micropartículas se traza en el eje horizontal seguido por crear una curva de aproximación usando el método de mínimos cuadrados y definir la pendiente de esa curva como el grado de hidrofilización.

* Cálculo del valor Rsp:

Valor Rsp = Rav Rb - 1

(en la que Rav representa una constante de tiempo de relajación promedio (recíproca del tiempo de relajación de la muestra) y Rb representa una constante de tiempo de relajación de micropartículas a granel (recíproca del tiempo de relajación del blanco de agua).

* Cálculo del valor TSA (m2):

Valor TSA = SA x V x yp x p

(en la que SA representa el área de superficie específica de micropartículas (m2/g) = 6 p * d), en la que p representa la densidad de micropartículas (g/cm3) (densidad de micropartículas: 1,4 g/cm3, densidad de partículas de látex: 1,0 g/cm3, densidad de partículas de oro coloidal: 19,3 g/cm3), d representa el diámetro de las micropartículas (pm), V representa el volumen del tubo de RMN de la porción irradiada con ondas de radio (cm3) (= cantidad de muestra), yp representa la razón en volumen de micropartículas, en la que volumen de micropartículas (i) = concentración de micropartículas (% en peso) 100 densidad de micropartículas, volumen de agua (ii) = (1 - volumen de micropartículas (i)) = densidad de agua (0,997 g/cm3) y yp (razón en volumen de micropartículas) = volumen de micropartículas (i) volumen de agua (ii), teniendo p el mismo significado tal como se describió anteriormente).

Por ejemplo, tal como se muestra en la figura 1, los valores de la micropartícula A (valor TSA: 0,5, valor Rsp: 10) y la micropartícula B (valor TSA: 1, valor Rsp: 5) se trazaron en un gráfico para crear sus respectivas curvas de aproximación usando el método de mínimos cuadrados. En el caso de la micropartícula A, Y = 20x, mientras que en el caso de la micropartícula B, Y = 5x. Se determinó que la micropartícula que tenía la mayor pendiente de la curva de aproximación (grado de hidrofilización), a saber, la micropartícula A, tenía un mayor grado de hidrofilización.

Según la presente invención, el grado de hidrofilización está dentro del intervalo de 30,0 a 200,0. Si el grado de hidrofilización está dentro de este intervalo, además de que las micropartículas pueden moverse fácilmente a través de la membrana debido a que la superficie de las mismas es hidrófila, la cantidad de proteínas que se adhieren a la superficie de las micropartículas disminuye. Como resultado, disminuye el número de falsos positivos que se producen cuando se usan en inmunocromatografía. Además, dado que las micropartículas que tienen un grado de hidrofilización dentro de este intervalo son tales que la capa hidrófila actúa inesperadamente como una capa protectora, hay menos susceptibilidad a la disminución de la intensidad de coloración durante la introducción de grupos carboxilo. Por consiguiente, dado que las micropartículas pueden soportar condiciones de reacción severas, es posible introducir un mayor número de grupos carboxilo. Como resultado, puesto que también puede soportarse un gran número de anticuerpos sobre las micropartículas, pueden obtenerse micropartículas que mantienen una alta sensibilidad de detección. Si el grado de hidrofilización es inferior a 30,0, dado que la superficie de las micropartículas se vuelve hidrófoba, las proteínas terminan adsorbiéndose en la superficie de las micropartículas, lo que aumenta la susceptibilidad a la aparición de falsos positivos. Además, el flujo a través de la membrana se vuelve deficiente, lo que da como resultado tiempos de diagnóstico más prolongados. Además, si el grado de hidrofilización es inferior a 30,0, dado que existe una mayor susceptibilidad a la disminución de la densidad de coloración de las micropartículas durante la reacción de introducción de grupos carboxilo, la sensibilidad a la densidad termina disminuyendo. Basándose en lo anterior, el límite inferior del grado de hidrofilización es más preferiblemente de 35,0 e incluso más preferiblemente de 40,0. Por otro lado, si el grado de hidrofilización supera 200,0, dado que los enlaces de hidrógeno se vuelven dominantes, la cantidad de proteínas y otras biomoléculas adsorbidas aumenta, y dado que esto genera el riesgo de que se produzcan falsos positivos, el límite superior del grado de hidrofilización es más preferiblemente de 190,0 e incluso más preferiblemente de 180,0.

El término “espaciador” se refiere a un grupo químico que conecta una micropartícula con un grupo carboxilo a través de la “capa hidrófila”. En la presente realización, aunque el “espaciador” se une a grupos reactivos de la “capa hidrófila”, la “capa hidrófila” se une a grupos hidroxilo de las micropartículas. Por ejemplo, en el caso de haber hecho reaccionar ácido bromoesteárico C18 a través de una capa de silano unida a las micropartículas, la capa hidrófila se convierte en capa de silano mientras que el espaciador se convierte en (CH2)17. Según la presente invención, el espaciador hidrófobo tiene una estructura a base de hidrocarburos. Como espaciador se pueden usar grupos alquilo, grupos alqueno, grupos alcano o anillos de benceno.

Aunque no existen limitaciones particulares sobre el número de átomos de carbono, desde el punto de vista de poder lograr una sensibilidad mejorada sin verse afectada por la doble capa eléctrica de la superficie de la partícula, el número de carbonos es preferiblemente de 3 o más. En general, dado que una estructura hidrófila es efectiva para suprimir la adsorción de biomoléculas, un espaciador hidrófilo tal como PEG se usa con frecuencia para partículas de oro coloidal, látex o sílice, ya que la superficie de las micropartículas es hidrófoba en estos casos. Por ejemplo, Nagasaki, et al. informaron que la adsorción inespecífica puede reducirse considerablemente mediante la introducción de cadenas de PEG de diferentes longitudes en una superficie de oro (véase Nagasaki et al., Polymer, vol. 61, n.° 2, 2012). Esto se debe a que se cree que los espaciadores hidrófobos, tales como los espaciadores a base de hidrocarburos, dan como resultado que los espaciadores se adhieran a la superficie de las micropartículas debido a la interacción hidrófoba. Por consiguiente, la reactividad entre los grupos carboxilo y los anticuerpos se vuelve deficiente y la cantidad requerida de anticuerpo no puede inmovilizarse en las micropartículas, lo que da como resultado el riesgo de una disminución en la sensibilidad de detección. Además, es probable que las estructuras hidrófobas experimenten una interacción hidrófoba con las proteínas. En otras palabras, el uso de una estructura hidrófoba como espaciador provoca que se adsorban las proteínas y otras biomoléculas, lo que da como resultado una alta posibilidad de que se produzca un falso positivo. Por el contrario, los inventores de la presente invención desafiaron este conocimiento común y sorprendentemente lograron reducir considerablemente la cantidad adsorbida de biomoléculas responsables de la aparición de falsos positivos al combinar la capa hidrófila de la superficie de la micropartícula con un espaciador hidrófobo tal como un espaciador a base de hidrocarburos, y confirmaron que los falsos positivos pueden reducirse significativamente mientras se mantiene la sensibilidad de detección. Dado que una capa hidrófila está presente en la superficie de la micropartícula, si el espaciador es hidrófilo, se cree que se produce la interacción de los enlaces de hidrógeno con la capa hidrófila. Por consiguiente, el espaciador acaba adsorbido sobre la capa hidrófila impidiendo de ese modo que se inmovilice la cantidad necesaria de anticuerpo sobre las micropartículas, lo que además de provocar una disminución de la sensibilidad de detección, también evita que se consiga la supresión de falsos positivos como consecuencia de no poder disminuir la cantidad adsorbida de biomoléculas. Por otro lado, en una realización que usaba espaciadores hidrófobos tales como espaciadores a base de hidrocarburos, los espaciadores no sólo no se adsorbían en la capa hidrófila, sino que los espaciadores se alineaban de manera ordenada y se introdujeron de manera confiable en las micropartículas sin espacios entre los mismos, y se cree que esto eliminó los espacios donde las biomoléculas pueden acercarse a la superficie de las micropartículas o los espaciadores y permitió que la cantidad adsorbida de biomoléculas se redujera considerablemente, lo que hizo posible reducir considerablemente los falsos positivos.

Por ejemplo, tal como se muestra en la siguiente tabla 1, en contraste con la incidencia de falsos positivos del ejemplo 15 que usó una cadena de PEG que fue del 1%, la incidencia de falsos positivos del ejemplo 2 que usó un espaciador hidrófobo fue del 0%, en contraste con la incidencia de falsos positivos del ejemplo 17 que usa una cadena de PEG que es del 1%, la incidencia de falsos positivos del ejemplo 1 que usó un espaciador hidrófobo fue del 0%, en contraste con la incidencia de falsos positivos del ejemplo 18 que usó una cadena de PEG que fue del 2%, la incidencia de falsos positivos del ejemplo 16 que usó un espaciador hidrófobo fue del 1% y, en contraste con la incidencia de falsos positivos del ejemplo 20 que usó una cadena de PEG que fue del 2%, la incidencia de falsos positivos del ejemplo 19 que usó un espaciador hidrófobo fue del 1%.

Puede usarse un método tal como espectroscopía infrarroja, análisis elemental, resonancia magnética nuclear (RMN) o espectrometría de masas (Em ) para identificar el espaciador. Por ejemplo, la porción espaciadora puede separarse de las micropartículas haciendo reaccionar un ácido fuerte o una base fuerte con las micropartículas introducidas con grupos carboxilo a alta temperatura. Posteriormente, las micropartículas pueden separarse mediante centrifugación y el sobrenadante puede medirse mediante RMN o EM para identificar la estructura del espaciador.

El término “cantidad introducida de grupos carboxilo” se refiere a la cantidad de grupos carboxilo introducidos por gramo de micropartículas de celulosa coloreadas. La cantidad introducida de los mismos es preferiblemente de 0,20 mmol/g a 3,00 mmol/g. Al hacer que la cantidad introducida esté dentro de este intervalo, el anticuerpo o la proteína usado como el agente de bloqueo puede unirse químicamente a las micropartículas de manera firme y en gran cantidad, lo que hace posible lograr una alta sensibilidad y una reducción de los falsos positivos. Si la cantidad introducida es inferior a 0,20 mmol/g, dado que la cantidad unida de anticuerpo u otra proteína es inadecuada, existe el riesgo de una disminución de la sensibilidad de detección si se emplean medidas de reducción de falsos positivos, tales como la adición de aditivos. Además, si la cantidad introducida es inferior a 0,20 mmol/g, la distancia entre los grupos carboxilo introducidos se vuelve excesivamente grande, lo que aumenta la probabilidad de que los grupos carboxilo que no reaccionaron con el anticuerpo induzcan enlaces de hidrógeno entre moléculas en lugar de dentro de las moléculas. En otras palabras, existe el riesgo de que se produzcan falsos positivos como resultado de la adsorción de proteínas a través de enlaces de hidrógeno. Por consiguiente, el límite inferior de la cantidad introducida de grupos carboxilo es preferiblemente de 0,25 mmol/g y más preferiblemente de 0,30 mmol/g. Por otro lado, si la cantidad introducida supera 3,00 mmol/g, al aumentar el peso por partícula, disminuye la intensidad de coloración por micropartícula. Dado que existe el riesgo de una disminución en la sensibilidad de detección durante el uso en inmunocromatografía si la intensidad de coloración disminuye, el límite superior es preferiblemente de 2,50 mmol/g y más preferiblemente de 2,00 mmol/g.

Los ejemplos de métodos usados para calcular la cantidad introducida incluyen fluorometría, titulación de neutralización y espectroscopía infrarroja. En la presente realización, la fluorometría se usa principalmente para medir con precisión la cantidad de grupos carboxilo que pueden reaccionar con el anticuerpo y la proteína. Se usa un reactivo de fluorescencia que emite luz únicamente en el caso de haber reaccionado con un grupo carboxilo. En primer lugar, se prepara una curva de calibración para la relación entre la cantidad de grupos carboxilo y la intensidad luminosa usando muestras que tienen cantidades conocidas de grupos carboxilo. Posteriormente, el reactivo de fluorescencia se hace reaccionar con las micropartículas. Luego se mide la intensidad de fluorescencia de las micropartículas para obtener la intensidad luminosa. Luego, la intensidad luminosa resultante se introduce en la curva de calibración para calcular la cantidad de grupos carboxilo.

Aunque no existen limitaciones particulares sobre el agente carboxilante utilizado cuando se introducen grupos carboxilo, los ejemplos específicos del mismo incluyen los siguientes: ácido 2-bromoacético, ácido 3bromopropiónico, ácido 4-bromobutírico, ácido 5-bromopentanoico, ácido 6-bromohexanoico, ácido 7-bromoheptanoico, ácido 8-bromooctanoico, ácido 11-bromoundecanoico, ácido 18-bromoesteárico, ácido 16-heptadecenoico, ácido 5-hexanoico, epiclorhidrina, ácido 4-aminobutírico, ácido 3-aminopropiónico, ácido 5-aminopentanoico, ácido 6-aminohexanoico, ácido 7-aminoheptanoico, ácido 8-aminooctanoico, ácido adípico, ácido eicosanodioco, ácido 1,8-octanodicarboxílico, ácido 1,4-butanodicarboxílico, ácido 1,6-hexanodicarboxílico, ácido 2-cloroacético, ácido 3-cloropropiónico, ácido 4-clorobutírico, ácido 5-cloropentanoico, ácido 6-clorohexanoico, ácido 7-cloroheptanoico, ácido 8-clorooctanoico, ácido 11-cloroundecanoico, ácido 18-cloroesteárico, ácido amino-PEG12-propiónico, ácido amino-PEG8-propiónico, ácido amino-PEG4-propiónico, a,w-bis[2-{(3-carboxi-1-oxipropil)amino}etil]polietilenglicol, HO-PEG12-COOH, ácido HO-PEG12-propiónico, ácido HO-PEG8-propiónico, O-(2-carboxietil)polietilenglicol, COOH-PEG12-COOH, bis(carboximetil)éter de poli(etilenglicol), ácido propiónico-PEG12-ácido propiónico, ácido propiónico-PEG8-ácido propiónico y ácido propiónico-PEG4-ácido propiónico. Entre estos, los ejemplos preferibles incluyen ácido 3-bromopropiónico, ácido 4-bromobutírico, ácido 5-bromopentanoico, ácido 6-bromohexanoico, ácido 7-bromoheptanoico, ácido 8-bromooctanoico, ácido 11-bromoundecanoico, ácido 18-bromoesteárico, ácido adípico, ácido eicosanodioco, ácido 1,8-octanodicarboxílico, ácido 1,4-butanodicarboxílico y ácido 1,6-hexanodicarboxílico, y los ejemplos más preferibles incluyen ácido 8-bromooctanoico, ácido 11-bromoundecanoico, ácido 18-bromoesteárico, ácido adípico, ácido eicosanodioco y ácido 1,8-octanodicarboxílico.

En la presente descripción, una “micropartícula” se refiere a una estructura en la que el eje mayor (L) y el eje menor (D) son casi iguales y la forma es casi esférica. Más específicamente, la razón L/D representada por L D es de 1,0 a 3,0. Si el valor de L/D está dentro de este intervalo, hay menos susceptibilidad a la aparición de obstrucciones en el caso de usar como kit de diagnóstico inmunocromatográfico, y el valor de L/D es más preferiblemente de 1,0 a 2,0, incluso más preferiblemente de 1,0 a 1,5 y lo más preferiblemente de 1,0 a 1,3. L/D se mide capturando una micrografía electrónica de las partículas, midiendo el eje mayor (L) y el eje menor (D) para 100 partículas y luego calculando el valor promedio de las 100 partículas.

No existen limitaciones particulares sobre el método usado para producir las micropartículas de celulosa coloreadas. Los ejemplos de métodos usados incluyen un método que consiste en moldear en primer lugar micropartículas y luego soportar un componente colorante tal como un pigmento o tinte sobre las mismas, un método que consiste en moldear micropartículas y soportar micropartículas colorantes más pequeñas tales como un coloide metálico o colorante sobre las mismas, y un método que consiste en añadir colectivamente un componente colorante tal como un pigmento, tinte, colorante o coloide metálico durante el moldeo de micropartículas seguido por moldeo. Entre estos, es preferible el método que consiste en moldear en primer lugar micropartículas y luego soportar un componente colorante tal como un pigmento o tinte sobre las mismas, debido a la facilidad de ajustar las características de las micropartículas, tal como ajustar el diámetro de partícula, ajustar la profundidad de color, ajustar el tipo de color o ajustar el estado superficial de las micropartículas. Además, como el componente colorante soportado, es preferible un tinte debido a la facilidad de soportarse sobre las micropartículas.

No existen limitaciones particulares sobre el tipo de tinte en el caso de usar un tinte como componente colorante. Pueden usarse tintes tales como tintes reactivos, tintes directos, tintes de complejos metálicos, tintes ácidos, tintes básicos, tintes dispersos, tintes de azufre, tintes vegetales, tintes de naftol o tintes fluorescentes. Naturalmente, también puede combinarse cualquiera de estos tintes. Entre estos, los tintes reactivos que se unen covalentemente a los grupos hidroxilo de la celulosa son particularmente preferibles en cuanto a estabilidad y para retener una gran cantidad de tinte.

No existen limitaciones particulares sobre el método usado para moldear las micropartículas de celulosa en el caso de moldear en primer lugar las micropartículas de celulosa seguido por cargar un componente colorante sobre las mismas. Los ejemplos de métodos usados incluyen un método que consiste en refinar físicamente la celulosa natural con un molino de bolas o un homogeneizador de alta presión, un método que consiste en refinar mediante tratamiento químico con ácido o base, y un método que consiste en disolver temporalmente la celulosa en un buen disolvente y moldearla en forma de material particulado. Además, la celulosa derivatizada también puede disolverse y moldearse en forma de material particulado, seguido por devolver los sustituyentes derivatizados a grupos hidroxilo para preparar micropartículas de celulosa. Además, estos métodos de moldeo pueden usarse en combinación. Además, no existen limitaciones particulares sobre el tipo de celulosa, y puede usarse celulosa tal como celulosa regenerada, celulosa purificada, celulosa natural o celulosa en la que los sustituyentes derivatizados se han devuelto a los grupos hidroxilo. Entre estos, el método que consiste en disolver temporalmente la celulosa en un buen disolvente y moldearla en forma de material particulado es preferible desde el punto de vista de ajustar el diámetro de partícula y ajustar la forma de partícula, y la celulosa regenerada es preferible para el tipo de celulosa.

No existen limitaciones particulares sobre el tipo de buen disolvente usado para disolver la celulosa en el caso de disolver temporalmente la celulosa en un buen disolvente seguido por moldearla en forma de material particulado, y pueden usarse diversos buenos disolventes que pueden disolver la celulosa, tales como disolución de cupramonio, disolución de viscosa, N-metilmorfolina o diversos tipos de líquidos iónicos. Entre estos, la disolución de cupramonio es preferible desde el punto de vista del ajuste del diámetro de partícula o del ajuste de la forma de partícula. Además, tampoco hay limitaciones particulares sobre el método usado para moldear la celulosa disuelta para dar partículas. En la presente realización se usó la separación de fases.

El término “ligando” se refiere a una sustancia que tiene la propiedad de unirse selectiva y específicamente a una sustancia diana de prueba específica. Aunque no existen limitaciones particulares sobre el tipo del mismo, los ejemplos incluyen anticuerpos, enzimas, genes, hormonas, ácidos nucleicos, péptidos y proteínas.

El término “kit de diagnóstico inmunocromatográfico” se refiere a un producto que usa una reacción antígenoanticuerpo para detectar fácilmente la presencia o ausencia de una sustancia diana de prueba presente en diversas muestras. Los tipos de kits de diagnóstico inmunocromatográfico consisten en tipos de flujo lateral y tipos de flujo continuo. Aunque no existen limitaciones particulares sobre el tipo de kit siempre que use partículas colorantes y una almohadilla de muestra, es preferible un tipo de flujo lateral. Además, aunque los tipos de flujo lateral consisten en tipos de tira reactiva y tipos de casete, no existen limitaciones particulares al respecto. No existen limitaciones particulares sobre la composición del kit de diagnóstico inmunocromatográfico y puede emplearse una composición usada normalmente en la técnica. No existen limitaciones particulares sobre el tipo de elementos distintos de las partículas colorantes y la almohadilla de muestra, siempre que sean elementos usados en la técnica, y los ejemplos de los mismos incluyen una almohadilla conjugada (que incluye partículas colorantes sensibilizadas con anticuerpos), nitrocelulosa u otra membrana, almohadilla adsorbente y preparación. Además, una parte de estos elementos puede omitirse según sea necesario. Según la presente invención, un kit de diagnóstico inmunocromatográfico contiene las partículas de celulosa coloreadas mencionadas anteriormente.

Un “método de diagnóstico” que usa el kit de diagnóstico inmunocromatográfico se refiere a diversos diagnósticos realizados usando el kit de diagnóstico inmunocromatográfico. No existen limitaciones particulares sobre la diana de diagnóstico, y pueden ser diversas dianas de diagnóstico tales como aquellas para seres humanos, aquellas para animales, aquellas para alimentos, aquellas para plantas u otras pruebas ambientales. Un procedimiento de diagnóstico típico consiste en recoger una muestra de ejemplar de la diana de prueba, someter la muestra a un tratamiento previo, tal como extracción o filtración, según sea necesario, añadir en gotas la muestra en la almohadilla de muestra, esperar una cantidad de tiempo recomendada desde el inicio de la prueba, y evaluar el resultado del diagnóstico según la coloración que difiere según la presencia o ausencia de la sustancia diana de prueba. Naturalmente, el procedimiento no se limita a este procedimiento, sino que puede aplicarse a procedimientos o de diagnóstico principal similares. Preferiblemente, la muestra de prueba se filtra con antelación para que sea posible retirar cualquier exceso de objetos extraños o contaminantes, lo que permite anticipar tiempos de diagnóstico incluso más cortos y mejorar la precisión del diagnóstico.

No existen limitaciones particulares sobre la diana que puede diagnosticarse con el kit de diagnóstico inmunocromatográfico, y los ejemplos específicos incluyen los siguientes: marcadores de cáncer, hormonas, enfermedades infecciosas, autoinmunidad, proteínas séricas, TDM, coagulación y fibrinólisis, aminoácidos, péptidos, proteínas, genes y células. Más específicamente, los ejemplos incluyen CEA, AFP, ferritina, p2-microglobulina, PSA, CA19-9, CA125, BFP, esterasa 1, pepsinógeno 1,2, sangre oculta, p2-microglobulina en orina, PIVKA-2, BTA en orina, insulina, E3, HCG, HPL, LH, antígeno de VHC, antígeno de HBs, anticuerpo contra HBs, anticuerpo contra HBc, antígeno de HBe, anticuerpo contra HBe, anticuerpo contra HTLV-1, anticuerpo contra VIH, anticuerpo contra toxoplasma, sífilis, ASO, antígeno de gripe tipo A, anticuerpo contra gripe tipo A, antígeno de gripe tipo B, anticuerpo contra gripe tipo B, antígeno de rotavirus, antígeno de adenovirus, antígeno de rotavirus y adenovirus, estreptococo del grupo A, estreptococo del grupo B, antígeno de Candida, CD, antígeno de criptococo, cólera, antígeno de meningococo, elastasa granulocítica, anticuerpo contra Helicobacter pylori, anticuerpo 0157, antígeno 0157, anticuerpo contra Leptospira, antígeno de Aspergillus, MRSA, RF, IgE total, prueba LE, PCR, IgG, A, M, IgD, transferrina, albúmina en orina, transferrina en orina, mioglobina, C3-C4, SAA, LP(a), a1-AC, a1-M, haptoglobina, microtransferrina, puntuación APR, FDP, dímero D, plasminógeno, AT3, a2PI, PIC, PAI-1, proteína C, factor de coagulación X3, colágeno tipo IV, ácido hialurónico, GHbA1c, otros diversos tipos de antígenos, diversos tipos de anticuerpos, diversos tipos de virus, diversos tipos de bacterias, diversos tipos de aminoácidos, diversos tipos de péptidos, diversos tipos de proteínas, diversos tipos de ADN, diversos tipos de células, diversos tipos de alérgenos, diversos tipos de productos químicos agrícolas residuales y diversos tipos de sustancias tóxicas.

Lo siguiente proporciona una descripción de ejemplos de un método para preparar micropartículas de celulosa, un método para micropartículas de celulosa coloreadas, un método para hidrofilizar micropartículas de celulosa, un método para introducir grupos carboxilo y un método para preparar un kit de diagnóstico inmunocromatográfico.

[Método para preparar micropartículas de celulosa]

El línter de celulosa se disuelve en un buen disolvente de celulosa. Como buen disolvente se usa una disolución de cupramonio preparada usando un método conocido. Como líquido de coagulación se usa principalmente un sistema mixto que consiste en un disolvente orgánico, agua y amoniaco. La disolución de celulosa de cupramonio preparada se añade mientras se agita este líquido de coagulación para llevar a cabo la coagulación. Además, puede obtenerse una suspensión que contiene las micropartículas de celulosa diana añadiendo ácido sulfúrico, neutralizando y regenerando las micropartículas de celulosa. En este momento, la suspensión se vuelve ácida debido al ácido que queda después del uso para la regeneración, y dado que también contiene impurezas tales como el amoniaco generado durante la neutralización, es necesario un procedimiento para realizar purificación hasta obtener una dispersión de celulosa que comprende micropartículas de celulosa y medio. Para este procedimiento de purificación se usa repetidamente un tratamiento que consiste en centrifugación, decantación y dilución con el medio líquido de dispersión. Dado que las micropartículas de celulosa presentes en la dispersión de micropartículas de celulosa resultante pueden aglomerarse durante el transcurso del procedimiento de purificación, en este caso puede llevarse a cabo un tratamiento de dispersión por cizallamiento. Se usa un homogeneizador de alta presión como medio para aplicar cizallamiento.

[Método para colorear micropartículas de celulosa]

Se añaden sulfato de sodio y tinte reactivo a la dispersión acuosa resultante de micropartículas de celulosa después de calentar hasta una temperatura adecuada en una cámara termostática mientras se agita con un agitador magnético. Después del calentamiento, se añade base en forma de carbonato de sodio para iniciar la tinción. Después de que haya transcurrido una cantidad de tiempo recomendada, puede obtenerse una suspensión que contiene las micropartículas de celulosa coloreadas objetivo. Dado que la suspensión es alcalina en este momento y además contiene sulfato de sodio, tinte sin reaccionar, es necesario un procedimiento para realizar purificación hasta obtener una dispersión de micropartículas de celulosa coloreadas compuesta por las micropartículas de celulosa coloreadas y el medio. La purificación se lleva a cabo por centrifugación de la misma manera tal como se describió anteriormente para obtener una dispersión de micropartículas de celulosa coloreadas. Dado que las micropartículas de celulosa coloreadas presentes en la dispersión de micropartículas de celulosa coloreadas resultante pueden aglomerarse durante el transcurso del procedimiento de purificación, en este caso puede llevarse a cabo un tratamiento de dispersión tal como cizallamiento. Se usa un homogeneizador de alta presión como medio para aplicar cizallamiento.

[Método para hidrofilizar micropartículas de celulosa coloreadas]

Se añaden un disolvente orgánico y agua a la dispersión acuosa resultante de micropartículas de celulosa coloreadas seguido por calentamiento hasta una temperatura adecuada en una cámara termostática mientras se agita con un agitador magnético. Después del calentamiento, se añade un agente hidrofilizante comercialmente disponible para iniciar la reacción. Después de que haya transcurrido una cantidad de tiempo recomendada, puede obtenerse una suspensión que contiene las micropartículas de celulosa coloreadas hidrofilizadas objetivo. Dado que la suspensión es alcalina en este momento y además contiene agente hidrofilizante sin reaccionar, es necesario un procedimiento para realizar purificación hasta obtener la dispersión de micropartículas de celulosa coloreadas hidrofilizadas compuesta por las micropartículas de celulosa coloreadas hidrofilizadas y el medio. La purificación se lleva a cabo por centrifugación de la misma manera tal como se describió anteriormente para obtener una dispersión de micropartículas de celulosa coloreadas hidrofilizadas. Dado que las micropartículas de celulosa coloreadas hidrofilizadas presentes en la dispersión de micropartículas de celulosa coloreadas hidrofilizadas resultante pueden aglomerarse durante el transcurso del procedimiento de purificación, en este caso puede llevarse a cabo un tratamiento de dispersión tal como cizallamiento. Se usa un homogeneizador de alta presión como medio para aplicar cizallamiento.

[Método para introducir grupos carboxilo en micropartículas de celulosa coloreadas hidrofilizadas]

Se añaden un disolvente orgánico y una base a la dispersión acuosa resultante de micropartículas de celulosa coloreadas hidrofilizadas seguido por calentamiento hasta una temperatura adecuada en una cámara termostática mientras se agita con un agitador magnético. Después del calentamiento, se añade un reactivo que tiene grupos carboxilo para iniciar la reacción. Después de que haya transcurrido una cantidad de tiempo recomendada, puede obtenerse una suspensión que contiene las micropartículas de celulosa coloreadas hidrofilizadas con el grupo carboxilo introducido objetivo. Dado que la suspensión contiene disolvente orgánico, base o reactivo sin reaccionar en este momento, es necesario un procedimiento para realizar purificación hasta obtener una dispersión de micropartículas de celulosa coloreadas hidrofilizadas con el grupo carboxilo introducido compuesta por las micropartículas de celulosa coloreadas hidrofilizadas con el grupo carboxilo introducido y el medio. La purificación se lleva a cabo por centrifugación de la misma manera tal como se describió anteriormente para obtener una dispersión de micropartículas de celulosa coloreadas hidrofilizadas con el grupo carboxilo introducido. Dado que las micropartículas de celulosa coloreadas hidrofilizadas con el grupo carboxilo introducido presentes en la dispersión de micropartículas de celulosa coloreadas hidrofilizadas con el grupo carboxilo introducido resultante pueden aglomerarse durante el transcurso del procedimiento de purificación, en este caso puede llevarse a cabo un tratamiento de dispersión tal como cizallamiento. Se usa un homogeneizador de alta presión como medio para aplicar cizallamiento.

[Método para preparar el kit de diagnóstico inmunocromatográfico]

Se prepara una dispersión de micropartículas de celulosa coloreadas hidrofilizadas con el grupo carboxilo introducido ajustada a una concentración recomendada, seguida por la adición de tampón y anticuerpo y agitación durante una cantidad de tiempo recomendada mientras se ajusta la temperatura para unir el anticuerpo a las micropartículas de celulosa coloreadas hidrofilizadas con el grupo carboxilo introducido. Después de agitar durante una determinada cantidad de tiempo, se añade adicionalmente un agente de bloqueo seguido por agitación durante una determinada cantidad de tiempo mientras se ajusta la temperatura para llevar a cabo el bloqueo de las micropartículas de celulosa coloreadas hidrofilizadas con el grupo carboxilo introducido. Como el agente de bloqueo pueden usarse diversos agentes de bloqueo correspondientes a factores tales como la sustancia diana de la prueba, la muestra o la composición de la disolución usada para la dilución de la misma. La caseína es particularmente preferible como el agente de bloqueo de las micropartículas de celulosa coloreadas hidrofilizadas con el grupo carboxilo introducido. Se lleva a cabo una centrifugación para lavar las micropartículas de celulosa coloreadas hidrofilizadas con el grupo carboxilo introducido después de la unión y bloqueo del anticuerpo, se separan las micropartículas que han precipitado con el sobrenadante que contiene exceso de anticuerpo y agente de bloqueo y se retira el sobrenadante por decantación. Se añade un líquido, tal como un tampón, a las micropartículas precipitadas, seguido por la realización de un tratamiento de dispersión por ultrasonidos según sea necesario. El lavado mediante esta serie de procedimientos que consisten en precipitación por centrifugación, retirada del sobrenadante y adición de líquido se realiza tantas veces como sea necesario para preparar una dispersión que contiene una concentración recomendada de micropartículas que se han sometido a adsorción y bloqueo de anticuerpos. Se añaden a la dispersión proteína, tensioactivo y azúcar tal como sacarosa o trehalosa según sea necesario, una determinada cantidad de la disolución resultante se recubre sobre una almohadilla de conjugado elaborada de fibra de vidrio seguido por secado para preparar una porción que contiene el reactivo de detección. Además, los tampones, los tensioactivos, las proteínas, los reactivos que atrapan los contaminantes presentes en la muestra de ejemplar, los conservantes, los agentes antibacterianos, los antioxidantes o los agentes higroscópicos se recubren sobre el material textil no tejido de fibra larga continua de celulosa regenerada según sea necesario, seguido por secado para preparar una almohadilla de muestra. Además, se preparan una membrana de nitrocelulosa porosa que tiene anticuerpos inmovilizados sobre la misma en los lugares recomendados y una almohadilla absorbente elaborada de papel de filtro de celulosa para absorber la muestra. Estos componentes se inmovilizan en una hoja denominada hoja de empaquetamiento que tiene un sitio adhesivo que luego se corta a un tamaño recomendado para preparar un kit de diagnóstico inmunocromatográfico.

Ejemplos

Además, todos los procedimientos se llevaron a cabo a una temperatura de 23°C y una humedad relativa del 55% de HR a menos que se indique específicamente lo contrario.

En primer lugar, se proporciona una explicación de los métodos usados para medir diversas propiedades físicas.

[Diámetro de partícula promedio de micropartículas]

Se usó como aparato el analizador de tamaño de partículas Nanotrac modelo UPA-EX150 (sistema de dispersión de luz dinámica) fabricado por Nikkiso Co., Ltd. Como muestra de medición se usó una muestra que contenía el 0,01% en peso de micropartículas y el 99,99% en peso de agua. Las condiciones de medición consistieron en 30 ciclos de integración, tiempo de medición de 30 segundos por medición, uso del volumen promedio de la distribución del diámetro de partícula, y tomando la mediana del mismo como el diámetro de partícula promedio.

[Intensidad de coloración de micropartículas]

Se usó como aparato un aparato que tenía la unidad de esfera integradora modelo ISV-722 fabricada por Jasco Corp. unida al espectrofotómetro de UV-visible/infrarrojo cercano JASCO modelo V-650 fabricado por el mismo fabricante. Como muestra de medición se usó una muestra que contenía el 0,01% en peso de micropartículas y el 99,99% en peso de agua y se midió la muestra colocándola en una celda de cuarzo que tenía una longitud del camino óptico de 10 mm. Se tomó el valor máximo (ABS) de los picos de absorbancia resultantes dentro del intervalo de luz visible de 400 nm a 800 nm como la intensidad de coloración.

[Razón L/D de micropartículas (esfericidad)]

Se usó como aparato el microscopio electrónico de barrido modelo JSM-6700 fabricado por JEOL Ltd. Se añadió en gotas una muestra que contenía el 0,01% en peso de micropartículas y el 99,99% en peso de agua sobre una placa de mica, se permitió que las micropartículas se adsorbieran en la placa de mica dejando pasar diez segundos y se absorbió el exceso de líquido con un paño Kimwipe seguido por secado. Se recubrió la placa de mica resultante con platina para preparar una muestra para la medición con microscopio electrónico. Se llevó a cabo la observación con un voltaje de aceleración de 1,6 kV y un factor de aumento de medición de 50.000X, se fotografió el número requerido de imágenes para que el número de imágenes de micropartículas fuera 100 o más, y se midieron el eje mayor (L) y el eje menor (D) para cada micropartícula seguido por calculación del valor promedio de la razón ^l/^dpara 100 micropartículas.

[Identificación de estructuras espadadoras]

Se usó como aparato un sistema de resonancia magnética nuclear (Avance II 400) fabricado por Bruker Corp. Se añadieron 0,1 ml de una disolución acuosa de hidróxido de sodio 1,0 M (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., 72082100) o 10,0 ml de una disolución acuosa de ácido clorhídrico 1,0 M (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., 080-10035) a una dispersión al 1,0% en peso de micropartículas con espaciadores introducidos seguido por calentamiento y agitación durante 5 horas a 60°C. Posteriormente, se recogió el sobrenadante por centrifugación para obtener una disolución en la que los espaciadores se habían disuelto o dispersado de las micropartículas. Se diluyó esta disolución con un disolvente pesado óptimo y se identificaron las estructuras a partir del espectro obtenido por RMN usando el sistema de resonancia magnética nuclear.

[Cantidad de grupos carboxilo introducidos]

Se usó como aparato el espectrofluorómetro modelo FP-8300 fabricado por Jasco Corp. Se unió a las micropartículas un reactivo que emite luz únicamente en el caso de haber reaccionado con grupos carboxilo y se midió la cantidad de grupos carboxilo introducida a partir de la intensidad de fluorescencia de las mismas. Lo siguiente indica un ejemplo de medición. Se colocaron 0,1 ml de una dispersión al 1,0% en peso de micropartículas de las que se desea medir la cantidad introducida de grupos carboxilo, 4,0 ml de una disolución de etanol 2,3 mM del reactivo fluorescente ADAM (KAK Corp., FK-101) y 3,9 ml de etanol (Kanto Chemical Co., Inc., 14033-70) en un recipiente y se dejaron reaccionar durante 5 minutos a 60°C. Posteriormente, se añadieron 2.0 ml de etanol a 10,0 pl de la disolución de reacción resultante y se irradió con luz de excitación a 365 nm con el aparato FP-8300 para medir la intensidad de fluorescencia a 410 nm. Se usó ácido octanoico (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd., 00027) para la curva de calibración.

[Cantidad de grupos amino reactivos residuales]

Se usó como aparato el espectrofluorómetro modelo FP-8300 fabricado por Jasco Corp. Se unió a las micropartículas un reactivo que emite luz únicamente en el caso de haber reaccionado con grupos amino y se midió la cantidad de grupos amino introducida a partir de la intensidad de fluorescencia de las mismas. Lo siguiente indica un ejemplo de medición. Se colocaron 0,1 ml de una dispersión al 1,0% en peso de micropartículas de las que se desea medir la cantidad introducida de grupos amino, 4,0 ml de una disolución de etanol 2,5 mM de reactivo fluorescente NBD-F (Dojin Chemical Co., Ltd.) y 3,9 ml de etanol (Kanto Chemical Co., Inc., 14033-70) en un recipiente y se dejó reaccionar durante 60 minutos a 30°C. Posteriormente, se añadieron 2.0 ml de etanol a 10,0 pl de la disolución de reacción resultante y se irradió con luz de excitación a 480 nm con el aparato FP-8300 para medir la intensidad de fluorescencia a 530 nm. Se usó octilamina (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd., 00045) para la curva de calibración.

[Grado de hidrofilización de micropartículas]

Se ajustó una dispersión de micropartículas hasta una concentración del 1% (p/v) y se usó como disolución de muestra. Después de agitar, se transfirieron 0,5 ml de la disolución de muestra a un tubo de RMN de vidrio que tenía un diámetro exterior de 10 mm y se colocó en un sistema de RMN pulsado ajustado a 30°C. Se usó el sistema Minispec mq20 fabricado por Bruker Corporation como el sistema de RMN pulsado. Se midió la disolución de muestra después de configurar cada uno de los parámetros tal como se indica a continuación. * Núcleo observado: 1H

* Tiempo de relajación medido: tiempo de relajación transversal T2 (ms)

* Modo de medición: método CPMG

* Ciclos de integración: 32

* Retraso de reciclaje: 10 (s)

* Separación de pulsos 90°-180° (x): 2 (ms)

Las curvas de decaimiento de magnetización resultantes (curvas que indican cambios en la intensidad de magnetización basados en el tiempo) se ajustaron a la siguiente ecuación (1) según el método de mínimos cuadrados usando la función de aproximación exponencial de Microsoft Excel.

M(t) = M q- exp(-t/T2) (Ecuación 1)

A continuación, tal como se muestra en la figura 1, se preparó un gráfico trazando la tasa de cambio en el tiempo de relajación (valor Rsp) en el eje vertical y el área de superficie total (valor TSA) de las micropartículas en el eje horizontal. Se elaboró una curva de aproximación según el método de mínimos cuadrados, se definió la pendiente de la misma como el grado de hidrofilización y se comparó el grado de hidrofilización de las micropartículas. Los métodos usados para calcular el valor Rsp y el valor TSA son los que se indican a continuación.

* Cálculo del valor Rsp:

Valor Rsp = Rav Rb - 1

* Cálculo del valor TSA (m2):

Valor TSA = SA x V x yp x p

[Cantidad adsorbida de proteína]

Se usó como aparato el espectrofotómetro de UV visible/infrarrojo cercano JASCO modelo V-650 fabricado por Jasco Corp. Lo siguiente indica el método para calcular la cantidad adsorbida de proteína usando el ejemplo de albúmina de suero bovino (BSA, Sigma-Aldrich Corp., A7906). Se dejaron reaccionar 30,0 pl de una dispersión al 1,0% en peso de micropartículas para las que se desea medir la cantidad de proteína adsorbida, 270,0 pl de tampón fosfato que tiene un pH de 5,0 y una concentración de 100 mM (Kishida Chemical Co., Ltd.) y 3,0 pl de disolución de bSa al 1,0% en peso durante 2 horas a 37°C, después de lo cual se recogió el sobrenadante mediante centrifugación. Se hizo reaccionar este sobrenadante con un reactivo BCA comercialmente disponible (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., 297-73101) y se midió la absorbancia a 562 nm con el aparato V-650 seguido por cálculo de la cantidad de BSA en el sobrenadante. Posteriormente, se restó la cantidad de BSA en el sobrenadante de la cantidad de BSA cargada seguido por dividisión entre la cantidad de micropartículas usadas para calcular el grado en que se adsorbió BSA a las mismas.

[Método para unir micropartículas de celulosa hidrofilizadas con grupos carboxilo introducidos y anticuerpo]

Se preparó tampón de ácido 2-morfolinoetanosulfónico (MES) que tenía un pH de 6,0 y una concentración de 100 mM usando MES (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd., M0606), sosa cáustica y agua. Se colocaron 63,0 pl del tampón MES resultante, 7,0 pl de una dispersión al 1,0% en peso de micropartículas de celulosa coloreadas hidrofilizadas con el grupo carboxilo introducido, 3,5 pL de una disolución al 1,0% en peso de clorhidrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carboximida (EDC, Tokyo Chemical Industry Co., Ltd., D1601) y 7,0 pl de una disolución al 1,0% en peso de N-hidroxisuccinimida (NHS, Tokyo Chemical Industry Co., Ltd., B0249) en un recipiente y se agitaron durante 15 minutos a temperatura ambiente. Posteriormente, se descartó el sobrenadante por centrifugación para retirar EDC y NHS sin reaccionar. Luego se colocaron 70,0 pl de tampón MES en el recipiente para suspender las micropartículas, seguido por adición de anticuerpo anti-hCG (Fitzgerald, n.° 5014) a las micropartículas de celulosa coloreadas hidrofilizadas con el grupo carboxilo introducido en un tubo Spitz hasta una concentración del 10,0% en peso seguido por reacción durante 2 horas a 37°C. Posteriormente, se añadieron 840,0 pl de una disolución de proteína (100 mM, tampón borato, pH = 8,5) que contenía el 1,0% en peso de caseína (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., 030-01505) a un tubo Spitz y se dejó reposar sin alterar durante 1 hora en secador a 37°C. Una hora más tarde, se llevó a cabo la centrifugación a 14.000 g durante 30 minutos usando una centrífuga (Kubota Corp., 6200) y un rotor de centrífuga (Kubota Corp., AF-5008C), y después de que habían precipitado las micropartículas de celulosa coloreadas hidrofilizadas con el grupo carboxilo introducido unidas a anticuerpos, se descartó el sobrenadante. Luego se añadieron 840,0 pl de tampón de borato (50 mM, pH = 10,0) al tubo Spitz seguido por tratamiento durante 10 segundos con un homogeneizador ultrasónico (SMT Co., Ltd. u H-50) para dispersar las micropartículas de celulosa coloreadas hidrofilizadas con el grupo carboxilo introducido unidas a anticuerpos. Después de una dispersión adecuada, se llevó a cabo una centrifugación a 14000 g durante 20 minutos seguido por descartar el sobrenadante. Luego se añadió tampón borato (50 mM, pH = 10,0) de modo que la concentración de micropartículas de celulosa coloreadas hidrofilizadas con el grupo carboxilo introducido unidas a anticuerpos fuera del 0,04% en peso, seguido por una dispersión adecuada con el homogeneizador ultrasónico. Se obtuvieron micropartículas de celulosa coloreadas hidrofilizadas con el grupo carboxilo introducido unidas a anticuerpos (a las que se hará referencia como el “reactivo de detección”) según el método descrito anteriormente.

[Impregnación del reactivo de detección en la almohadilla de conjugado y secado]

Se sumergió una almohadilla de conjugado de ftalato de polietileno (Ah Corp., 6615) en Tween-20 al 0,05% en peso (Sigma-Aldrich Corp., T2700) y se secó durante 60 minutos a 50°C después de retirar el exceso de líquido. A continuación, se cortó la almohadilla de conjugado en una forma que tenía una altura de 10 mm y una longitud de 300 mm. A continuación, se recubrió uniformemente el reactivo de detección sobre la almohadilla de conjugado a 272 jj.l/800 mm2 usando una micropipeta seguido por secado durante 30 minutos a 37°C.

[Pretratamiento de la almohadilla de muestra]

Se impregnó un material textil no tejido de fibra larga continua de celulosa regenerada con un gran exceso de tampón PBS (66 mM, pH 7,4) que contenía el 2,0% en peso de BSA (Sigma-Aldrich Corp., A7906) y el 2,0% en peso de Tween-20 y se secó durante 60 minutos a 50°C después de retirar el exceso de líquido. A continuación, se cortó el material textil no tejido en una forma que tenía una altura de 20 mm y una longitud de 300 mm.

[Preparación de la membrana recubierta de anticuerpo de captura]

Se cortó una membrana de nitrocelulosa (Millipore Corp., SHF0900425) en una forma que tenía un ancho de 25 mm y una longitud de 300 mm. Se recubrió una disolución de PBS (66 mM, pH 7,4) que contenía el 0,1% en peso de anticuerpo de ratón contra hCG-p (Medix Biochemical Inc., 6601) sobre una porción que tenía una altura de 12 mm en una razón de 0,1 |il/mm usando un sistema de recubrimiento de líquido (Musashi Engineering Inc., 300DS). A continuación, se secó la membrana durante 30 minutos a 37°C.

[Preparación de kit de diagnóstico inmunocromatográfico]

Se adhirieron la membrana recubierta de anticuerpo de captura obtenida de la manera descrita anteriormente, una almohadilla absorbente (Millipore Corp., C083), la almohadilla de conjugado que contiene el reactivo de detección y la almohadilla de muestra a un cartón de respaldo (Adhesives Research, Inc., AR9020). A continuación, se cortó el cartón hasta un ancho de 5 mm con un cortador para obtener un kit de diagnóstico inmunocromatográfico que tenía un ancho de 5 mm y una longitud de 60 mm.

[Evaluación de falsos positivos del kit de diagnóstico inmunocromatográfico]

Se midieron los falsos positivos usando orina obtenida de 100 mujeres no embarazadas. 15 minutos más tarde, se evaluó visualmente la intensidad de coloración de la línea de prueba (TL) en uno de once grados que oscilan entre 0 y 10. Tal como se muestra en la figura 2, un valor más alto para el grado visual representa un color más oscuro en la línea de la TL y un grado de 0 indica que la línea no es visible. Esta medición se llevó a cabo cinco veces y se consideró que la muestra no era un falso positivo si el valor promedio de los valores resultantes arrojaba un grado visual de 0. El número de muestras que demostraron un falso positivo se contó entre 100 muestras y el resultado de dividir ese número entre 100 se tomó como incidencia de falsos positivos. Además, se registraron los grados visuales de aquellas muestras que se consideraron falsos positivos.

[Tiempo de diagnóstico del kit de diagnóstico inmunocromatográfico]

Se colocó un kit de diagnóstico inmunocromatográfico cortado hasta un ancho de 5 mm en una carcasa de plástico. Se evaluó visualmente el kit de diagnóstico resultante colocado en la carcasa en uno de once grados que oscilaban entre 0 y 10. Como sustancia diana de prueba se usó anticuerpo de ratón anti-hCG-p. Se diluyó el anticuerpo contra hCG mencionado anteriormente con tampón fosfato 66 mM, pH 7,4 que contenía BSA al 1,0% en peso (que se denominará “PBS”) para preparar una muestra positiva que contenía el anticuerpo contra hCG mencionado anteriormente a 10,0 mUI/ml. Se añadieron en gotas 120,0 |il de esta muestra positiva en la parte de adición de gotas de muestras del kit de diagnóstico, seguido por la medición de los cambios en la TL basándose en el tiempo mediante la realización de mediciones visuales cada 20 segundos. La cantidad de tiempo hasta que la intensidad de coloración de la TL resultante alcanzó 1,0 o más se midió con un aparato Immunochromato-Reader. En este caso, la razón para medir hasta un valor de 1,0 o superior es que, aunque existen diferencias individuales, la presencia de la TL puede confirmarse visualmente si el valor es de 1,0 o superior. Esta medición se realizó cinco veces y se tomó el tiempo promedio como el tiempo de diagnóstico.

[Límite de detección del kit de diagnóstico inmunocromatográfico]

Se colocó un kit de diagnóstico inmunocromatográfico cortado hasta un ancho de 5 mm en una carcasa de plástico. Se evaluó visualmente el kit de diagnóstico resultante colocado en la carcasa en uno de once grados que oscilaban entre 0 y 10. Como sustancia diana de prueba se usó gonadotropina coriónica humana (que se denominará “hCG”). La hCG se diluyó con tampón fosfato 66 mM, pH 7,4 que contenía 1,0% en peso de BSA (que se denominará “PBS”) para preparar muestras positivas que tenián concentraciones cada vez menores de la hCG mencionada anteriormente que consiste en 1,600 mIU/ml, 0,800 mIU/ ml, 0,400 mIU/ml, 0,200 mIU/ml, 0,100 mIU/ml, 0,050 mIU/ml, 0,025 mIU/ml, 0,013 mIU/ml, 0,007 mIU/ml y 0,0025 mIU/ml. Se añadieron en gotas 120,0 |il de esta muestra positiva sobre la parte de adición de gotas de muestras del kit de diagnóstico seguido por evaluar visualmente la intensidad de coloración de la TL 15 minutos más tarde. Se llevó a cabo esta medición cinco veces en cada concentración, se consideró que la muestra era positiva en el caso de que el valor promedio de los valores resultantes fuera de 1,0 o más, y se consideró que la muestra estaba por debajo del límite de detección en el caso de que el valor promedio fuera inferior a 1,0. El límite inferior de concentración de hCG en el que se obtuvo este juicio positivo se tomó como el límite de detección.

[EJEMPLO 1]

Se preparó una disolución de celulosa de cupramonio usando un método convencionalmente conocido que tenía una concentración de celulosa del 0,37% en peso, una concentración de cobre del 0,13% en peso y una concentración de amoniaco del 1,00% en peso. Se preparó además un líquido de coagulación que tenía una concentración de tetrahidrofurano del 89,00% en peso y una concentración de agua del 11,00% en peso.

Se añadieron 500 g de la disolución de celulosa de cupramonio preparada mientras se agitaban suavemente 5000 g del líquido de coagulación usando un agitador magnético. Después de seguir agitando durante aproximadamente 5 segundos, se añadieron 1000 g de ácido sulfúrico al 10% en peso para neutralizar la disolución y regenerar la celulosa para obtener 6500 g de una suspensión que contenía micropartículas de celulosa.

Se centrifugó la suspensión resultante durante 10 minutos a una velocidad de 10000 rpm. Después de retirar el precipitado por decantación, se inyectó agua desionizada seguido por agitación y recentrifugación. Se repitió varias veces este procedimiento hasta que el pH alcanzó de 6,0 a 7,0, después de lo cual se realizó un tratamiento de dispersión con un homogeneizador de alta presión para obtener 150 g de una suspensión de micropartículas de celulosa. Como resultado de medir el diámetro de partícula promedio de las micropartículas de celulosa resultantes, el diámetro de partícula promedio fue de 261 nm.

A continuación, se tiñeron las micropartículas de celulosa preparadas de la manera descrita anteriormente. Se añadieron 30 g de sulfato de sodio y 1,00 g de tinte reactivo (Dystar Japan, Ltd., Levafix Red CA GR®) a 100 g de la dispersión de micropartículas de celulosa ajustada a una concentración de micropartículas del 1,00% en peso seguido por calentamiento hasta 60°C usando una cámara termostática mientras se agitaba. Después de calentar hasta 60°C, se añadieron 4 g de carbonato de sodio seguido por tinción durante 2 horas. Luego se sometieron las micropartículas colorantes resultantes a un total de tres ciclos de una serie de procedimientos, consistiendo un ciclo en el lavado con una disolución acuosa de hidróxido de sodio al 5%, recuperación por centrifugación, lavado con agua pura y finalmente recuperación por centrifugación, para obtener micropartículas de celulosa coloreadas.

A continuación, se llevó a cabo una reacción de hidrofilización de superficie sobre las micropartículas de celulosa coloreadas preparadas de la manera descrita anteriormente. Se añadieron 10,0 ml de N-2-(aminoetil)-3-aminopropiltrimetoxisilano (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd., A0774) como agente hidrofilizante y 50,0 ml de N,N-dimetilformamida (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd., D0939) a 10,0 ml de micropartículas de celulosa coloreadas ajustadas al 10,0% en peso seguido por calentamiento a 50°C usando una cámara termostática mientras se agitaba y reaccionaba durante 4 horas. Después de la reacción, se recuperaron las micropartículas por centrifugación y se lavaron con agua pura seguido por recuperación por centrifugación. Se repitió el procedimiento de lavado mencionado anteriormente hasta que el pH alcanzó 11,00 para obtener micropartículas de celulosa coloreadas hidrofilizadas. El grado de hidrofilización y otras propiedades de las partículas se muestran en la siguiente tabla 1.

A continuación, se llevó a cabo una reacción de introducción de grupos carboxilo en las micropartículas de celulosa coloreadas hidrofilizadas preparadas de la manera descrita anteriormente. Se añadieron 6,0 g de ácido 6-bromohexanoico (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd., B 1290) como reactivo, 50,0 ml de N,N-dimetilformamida (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd., D0939) y 0,1 g de carbonato de sodio (Kishida Chemical Co., Ltd., 000 71245) a 10,0 ml de una suspensión de micropartículas de celulosa coloreadas hidrofilizadas ajustada al 5,0% en peso seguido por calentamiento a 50°C usando una cámara termostática mientras se agitaba y reaccionaba durante 6 horas. Después de la reacción, se recuperaron las micropartículas por centrifugación y se lavaron por centrifugación tres veces con 2-propanol (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd., 10277) seguido por lavado por centrifugación tres veces con agua pura para obtener micropartículas de celulosa coloreadas de superficie hidrofilizada con el grupo carboxilo introducido. Dado que las micropartículas resultantes estaban en forma de carboxilato de sodio, se añadieron 15,0 ml de una disolución de HCl 0,1 M (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., 083-01115) y 35,0 ml de agua pura y se hicieron reaccionar durante 2 horas a temperatura ambiente. Posteriormente, se recuperaron las micropartículas por centrifugación y se lavaron con agua pura seguido por recuperación por centrifugación. Se llevó a cabo el lavado hasta que el pH alcanzó 4,0 o superior para obtener una dispersión de micropartículas de celulosa coloreadas hidrofilizadas con el grupo carboxilo introducido. Propiedades tales como la cantidad introducida de grupos carboxilo y el rendimiento inmunocromatográfico cuando se usaron estas micropartículas como partículas colorantes se muestran en la siguiente tabla 1. La adsorción de proteína pudo reducirse considerablemente debido a los efectos de la capa hidrófila y los espaciadores. Como resultado, la incidencia de falsos positivos fue del 0%. Se mantuvo una alta sensibilidad de detección ya que los anticuerpos se inmovilizaron adecuadamente en la superficie de las micropartículas debido a la gran cantidad de grupos carboxilo. Además, pudo acortarse el tiempo de diagnóstico ya que las micropartículas pudieron migrar rápidamente sin adsorberse a la membrana por efecto de la capa hidrófila. [EJEMPLO 2]

Se prepararon micropartículas de celulosa coloreadas hidrofilizadas con el grupo carboxilo introducido usando el mismo método que en el ejemplo 1 con la excepción de cambiar la cantidad de carbonato de sodio usado en la reacción de introducción de grupo carboxilo a 9,9 g. Las propiedades de las micropartículas y el rendimiento inmunocromatográfico cuando se usan como micropartículas coloreadas se muestran en la siguiente tabla 1. La adsorción de proteína pudo reducirse considerablemente como resultado de la hidrofilización con una capa hidrófila y la introducción de espaciadores hidrófobos y grupos carboxilo de la misma manera que el ejemplo 1. Como resultado, la incidencia de falsos positivos fue del 0%. Se mantuvo una alta sensibilidad de detección ya que los anticuerpos se inmovilizaron adecuadamente en la superficie de las micropartículas debido a la gran cantidad de grupos carboxilo. Además, pudo acortarse el tiempo de diagnóstico ya que las micropartículas pudieron migrar rápidamente sin adsorberse a la membrana por efecto de la capa hidrófila.

[EJEMPLO 3]

Se prepararon micropartículas de celulosa coloreadas hidrofilizadas con el grupo carboxilo introducido usando el mismo método que en el ejemplo 1 con la excepción de cambiar la cantidad de carbonato de sodio usado en la reacción de introducción de grupo carboxilo a 29,7 g. Las propiedades de las micropartículas y el rendimiento inmunocromatográfico cuando se usan como partículas colorantes se muestran en la siguiente tabla 1. La adsorción de proteína pudo reducirse considerablemente como resultado de la hidrofilización con una capa hidrófila y la introducción de espaciadores hidrófobos y grupos carboxilo de la misma manera que el ejemplo 1. Como resultado, la incidencia de falsos positivos fue del 0%. Se mantuvo una alta sensibilidad de detección ya que los anticuerpos se inmovilizaron adecuadamente en la superficie de las micropartículas debido a la gran cantidad de grupos carboxilo. Además, pudo acortarse el tiempo de diagnóstico ya que las micropartículas pudieron migrar rápidamente sin adsorberse a la membrana por efecto de la capa hidrófila.

[EJEMPLO 4]

Se prepararon micropartículas de celulosa coloreadas hidrofilizadas con el grupo carboxilo introducido usando el mismo método que en el ejemplo 1 con la excepción de llevar a cabo la reacción de tinción durante 5 ciclos y cambiar la cantidad de carbonato de sodio usado en la reacción de introducción de grupo carboxilo a 9,9 g. Las propiedades de las micropartículas y el rendimiento inmunocromatográfico cuando se usan como partículas colorantes se muestran en la siguiente tabla 1. La adsorción de proteína pudo reducirse considerablemente como resultado de la hidrofilización con una capa hidrófila y la introducción de espaciadores hidrófobos y grupos carboxilo de la misma manera que en el ejemplo 1. Como resultado, la incidencia de falsos positivos fue del 0%. Se mantuvo una alta sensibilidad de detección ya que los anticuerpos se inmovilizaron adecuadamente en la superficie de las micropartículas debido a la gran cantidad de grupos carboxilo. Además, pudo acortarse el tiempo de diagnóstico ya que las micropartículas pudieron migrar rápidamente sin adsorberse a la membrana por efecto de la capa hidrófila.

[EJEMPLO 5]

Se prepararon micropartículas de celulosa coloreadas hidrofilizadas con el grupo carboxilo introducido usando el mismo método que en el ejemplo 1 con la excepción de cambiar el reactivo a 7,2 g de ácido 11-bromoundecanoico (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd., B0389) y la cantidad de carbonato de sodio a 9,9 g en la reacción de introducción de grupo carboxilo. Las propiedades de las micropartículas y el rendimiento inmunocromatográfico cuando se usan como partículas coloreadas se muestran en la siguiente tabla 1. La adsorción de proteína pudo reducirse considerablemente como resultado de la hidrofilización con una capa hidrófila y la introducción de espaciadores hidrófobos y grupos carboxilo de la misma manera que en el ejemplo 1. Como resultado, la incidencia de falsos positivos fue del 0%. Se mantuvo una alta sensibilidad de detección ya que los anticuerpos se inmovilizaron adecuadamente en la superficie de las micropartículas debido a la gran cantidad de grupos carboxilo. Además, pudo acortarse el tiempo de diagnóstico ya que las micropartículas pudieron migrar rápidamente sin adsorberse a la membrana por efecto de la capa hidrófila.

[EJEMPLO 6]

Se prepararon micropartículas de celulosa coloreadas hidrofilizadas con el grupo carboxilo introducido usando el mismo método que en el ejemplo 1 con la excepción de cambiar el reactivo a 10,0 g de ácido eicosanodioco (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd., E0320) y la cantidad de carbonato de sodio a 9,9 g en la reacción de introducción de grupo carboxilo. Las propiedades de las micropartículas y el rendimiento inmunocromatográfico cuando se usan como partículas coloreadas se muestran en la siguiente tabla 1. La adsorción de proteína pudo reducirse considerablemente como resultado de la hidrofilización con una capa hidrófila y la introducción de espaciadores hidrófobos y grupos carboxilo de la misma manera que en el ejemplo 1. Como resultado, la incidencia de falsos positivos fue del 0%. Se mantuvo una alta sensibilidad de detección ya que los anticuerpos se inmovilizaron adecuadamente en la superficie de las micropartículas debido a la gran cantidad de grupos carboxilo. Además, pudo acortarse el tiempo de diagnóstico ya que las micropartículas pudieron migrar rápidamente sin adsorberse a la membrana por efecto de la capa hidrófila.

[EJEMPLO 7]

Se prepararon micropartículas de celulosa coloreadas hidrofilizadas con el grupo carboxilo introducido usando el mismo método que en el ejemplo 1 con la excepción de cambiar el reactivo a 6,5 g de ácido tereftálico (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd., T0166) y la cantidad de carbonato de sodio a 9,9 g en la reacción de introducción de grupo carboxilo. Las propiedades de las micropartículas y el rendimiento inmunocromatográfico cuando se usan como partículas coloreadas se muestran en la siguiente tabla 1. La adsorción de proteína pudo reducirse considerablemente como resultado de la hidrofilización con una capa hidrófila y la introducción de espaciadores hidrófobos y grupos carboxilo de la misma manera que en el ejemplo 1. Como resultado, la incidencia de falsos positivos fue del 0%. Se mantuvo una alta sensibilidad de detección ya que los anticuerpos se inmovilizaron adecuadamente en la superficie de las micropartículas debido a la gran cantidad de grupos carboxilo. Además, pudo acortarse el tiempo de diagnóstico ya que las micropartículas pudieron migrar rápidamente sin adsorberse a la membrana por efecto de la capa hidrófila.

[EJEMPLO 8]

Se prepararon micropartículas de celulosa coloreadas hidrofilizadas con el grupo carboxilo introducido usando el mismo método que en el ejemplo 1 con la excepción de cambiar el líquido de coagulación a uno que tiene una concentración de acetato de etilo (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd., Q0040) del 94,0% en peso y concentración de agua del 6,0% en peso en la reacción de coagulación de micropartículas de celulosa y cambiar la cantidad de carbonato de sodio a 9,9 g en la reacción de introducción de grupos carboxilo. Las propiedades de las micropartículas y el rendimiento inmunocromatográfico cuando se usan como partículas colorantes se muestran en la siguiente tabla 1. La adsorción de proteína pudo reducirse considerablemente como resultado de la hidrofilización con una capa hidrófila y la introducción de espaciadores hidrófobos y grupos carboxilo de la misma manera que en el ejemplo 1. Como resultado, la incidencia de falsos positivos fue del 0%. Se mantuvo una alta sensibilidad de detección ya que los anticuerpos se inmovilizaron adecuadamente en la superficie de las micropartículas debido a la gran cantidad de grupos carboxilo. Además, pudo acortarse el tiempo de diagnóstico ya que las micropartículas pudieron migrar rápidamente sin adsorberse a la membrana por efecto de la capa hidrófila.

[EJEMPLO 9]

Se prepararon micropartículas de celulosa coloreadas hidrofilizadas con el grupo carboxilo introducido usando el mismo método que en el ejemplo 1 con la excepción de cambiar el líquido de coagulación a uno que tiene una concentración de acetona del 27,0% en peso, una concentración de agua del 0,2% en peso y una concentración de amoniaco del 72,8% en peso en la reacción de coagulación de micropartículas de celulosa y cambiar la cantidad de carbonato de sodio a 9,90 g en la reacción de introducción de grupos carboxilo. Las propiedades de las micropartículas y el rendimiento inmunocromatográfico cuando se usan como partículas colorantes se muestran en la siguiente tabla 1. La adsorción de proteína pudo reducirse considerablemente como resultado de la hidrofilización con una capa hidrófila y la introducción de espaciadores hidrófobos y grupos carboxilo de la misma manera que en el ejemplo 1. Como resultado, la incidencia de falsos positivos fue del 0%. Se mantuvo una alta sensibilidad de detección ya que los anticuerpos se inmovilizaron adecuadamente en la superficie de las micropartículas debido a la gran cantidad de grupos carboxilo. Además, pudo acortarse el tiempo de diagnóstico ya que las micropartículas pudieron migrar rápidamente sin adsorberse a la membrana por efecto de la capa hidrófila.

[EJEMPLO 10]

Se prepararon micropartículas de celulosa coloreadas hidrofilizadas con el grupo carboxilo introducido usando el mismo método que en el ejemplo 1 con la excepción de cambiar la cantidad de carbonato de sodio a 9,9 g y el reactivo a 4,2 g de ácido 3-bromopropiónico (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd., B0645) en la reacción de introducción de grupo carboxilo. Las propiedades de las micropartículas y el rendimiento inmunocromatográfico cuando se usan como partículas colorantes se muestran en la siguiente tabla 1. La adsorción de proteína pudo reducirse considerablemente como resultado de la hidrofilización con una capa hidrófila y la introducción de espaciadores hidrófobos y grupos carboxilo de la misma manera que en el ejemplo 1. Como resultado, la incidencia de falsos positivos fue del 0%. Se mantuvo una alta sensibilidad de detección ya que los anticuerpos se inmovilizaron adecuadamente en la superficie de las micropartículas debido a la gran cantidad de grupos carboxilo. Además, pudo acortarse el tiempo de diagnóstico ya que las micropartículas pudieron migrar rápidamente sin adsorberse a la membrana por efecto de la capa hidrófila.

[EJEMPLO 11]

Se prepararon micropartículas de celulosa coloreadas hidrofilizadas con el grupo carboxilo introducido usando el mismo método que en el ejemplo 1 con la excepción de cambiar el agente hidrofilizante a una mezcla de 10,0 ml de N-2-(aminoetil)-3-aminopropiltrimetoxisilano (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd., A0774) y 10,0 ml de silano de polietilenglicol (Mw 2000, Creative PEGWorks, PLS-2012) en la reacción de hidrofilización de superficie y cambiar el reactivo a 7,2 g de ácido 11-bromoundecanoico en la reacción de introducción de grupo carboxilo. Las propiedades de las micropartículas y el rendimiento inmunocromatográfico cuando se usan como partículas colorantes se muestran en la siguiente tabla 1. La adsorción de proteína pudo reducirse considerablemente como resultado de la hidrofilización con una capa hidrófila y la introducción de espaciadores hidrófobos y grupos carboxilo de la misma manera que en el ejemplo 1. Como resultado, la incidencia de falsos positivos fue del 0%. Se mantuvo una alta sensibilidad de detección ya que los anticuerpos se inmovilizaron adecuadamente en la superficie de las micropartículas debido a la gran cantidad de grupos carboxilo. Además, pudo acortarse el tiempo de diagnóstico ya que las micropartículas pudieron migrar rápidamente sin adsorberse a la membrana por efecto de la capa hidrófila.

[EJEMPLO 12]

Se prepararon micropartículas de celulosa coloreadas hidrofilizadas con el grupo carboxilo introducido usando el mismo método que en el ejemplo 1 con la excepción de cambiar el agente hidrofilizante a 10,0 ml de ácido amino-PEG12-propiónico (Sigma-Aldrich Corp., JKA12006) en la reacción de hidrofilización de superficie y cambiar el reactivo a 7,2 g de ácido 11-bromoundecanoico y la cantidad de carbonato de sodio a 9,9 g en la reacción de introducción de grupo carboxilo. Las propiedades de las micropartículas y el rendimiento inmunocromatográfico cuando se usan como partículas colorantes se muestran en la siguiente tabla 1. La adsorción de proteína pudo reducirse considerablemente como resultado de la hidrofilización con una capa hidrófila y la introducción de espaciadores hidrófobos y grupos carboxilo de la misma manera que en el ejemplo 1. Como resultado, la incidencia de falsos positivos fue del 0%. Se mantuvo una alta sensibilidad de detección ya que los anticuerpos se inmovilizaron adecuadamente en la superficie de las micropartículas debido a la gran cantidad de grupos carboxilo. Además, se logró acortar el tiempo de diagnóstico ya que las micropartículas pudieron migrar rápidamente sin adsorberse a la membrana por efecto de la capa hidrófila.

[EJEMPLO 13]

Se prepararon micropartículas de celulosa coloreadas hidrofilizadas con el grupo carboxilo introducido usando el mismo método que en el ejemplo 1 con la excepción de cambiar el reactivo a 11,0 g de Br-(CH²)³⁰-COOH y la cantidad de carbonato de sodio a 9,9 g en la reacción de introducción de grupo carboxilo. Las propiedades de las micropartículas y el rendimiento inmunocromatográfico cuando se usan como partículas colorantes se muestran en la siguiente tabla 1. La adsorción de proteína pudo reducirse considerablemente como resultado de la hidrofilización con una capa hidrófila y la introducción de espaciadores hidrófobos y grupos carboxilo de la misma manera que en el ejemplo 1. Como resultado, la incidencia de falsos positivos fue del 0%. Se mantuvo una alta sensibilidad de detección ya que los anticuerpos se inmovilizaron adecuadamente en la superficie de las micropartículas debido a la gran cantidad de grupos carboxilo. Además, se logró acortar el tiempo de diagnóstico ya que las micropartículas pudieron migrar rápidamente sin adsorberse a la membrana por efecto de la capa hidrófila.

[EJEMPLO 14]

Se prepararon micropartículas de celulosa coloreadas hidrofilizadas con el grupo carboxilo introducido usando el mismo método que en el ejemplo 1 con la excepción de cambiar la cantidad de carbonato de sodio a 0,01 g en la reacción de introducción de grupo carboxilo. Las propiedades de las micropartículas y el rendimiento inmunocromatográfico cuando se usan como partículas colorantes se muestran en la siguiente tabla 1. La adsorción de proteína pudo reducirse en comparación con el siguiente ejemplo comparativo 1 debido a los efectos de la capa hidrófila y los espaciadores hidrófilos y una se observó un efecto de reducción de falsos positivos.

[EJEMPLO 15] (Ejemplo de referencia)

Se prepararon micropartículas de celulosa coloreadas hidrofilizadas con el grupo carboxilo introducido usando el mismo método que en el ejemplo 1 con la excepción de cambiar el reactivo en la reacción de introducción de grupo carboxilo a 16,4 g de bis(carboximetil)éter de poli(etilenglicol) (Mw 600, Creative PEGWorks, PSB-362). Las propiedades de las micropartículas y el rendimiento inmunocromatográfico cuando se usan como partículas colorantes se muestran en la siguiente tabla 1. La adsorción de proteína pudo reducirse ligeramente en comparación con el siguiente ejemplo comparativo 1 debido a los efectos de la capa hidrófila y los espaciadores hidrófilos y se observó un efecto de reducción de falsos positivos.

[EJEMPLO 16]

Se prepararon micropartículas de celulosa coloreadas hidrofilizadas con el grupo carboxilo introducido usando el mismo método que en el ejemplo 1 con la excepción de cambiar la cantidad de agente hidrofilizante a 40,0 ml en la reacción de hidrofilización de superficie y cambiar el reactivo a 7,2 g de ácido 11-bromoundeanoico en la reacción de introducción de grupo carboxilo. Las propiedades de las micropartículas y el rendimiento inmunocromatográfico cuando se usan como partículas colorantes se muestran en la siguiente tabla 1. La adsorción de proteína pudo reducirse en comparación con el siguiente ejemplo comparativo 1 debido a los efectos de la capa hidrófila y los espaciadores hidrófilos y se observó un efecto de reducción de falsos positivos.

[EJEMPLO 17] (Ejemplo de referencia)

Se prepararon micropartículas de celulosa coloreadas hidrofilizadas con el grupo carboxilo introducido usando el mismo método que en el ejemplo 1 con la excepción de cambiar la cantidad de agente hidrofilizante a 8,0 ml en la reacción de hidrofilización de superficie y cambiar el reactivo a 16,4 g de bis(carboximetil)éter de poli(etilenglicol) (Mw 600, Creative PEGWorks, PSB-362) y la cantidad de carbonato de sodio a 0,01 g en la reacción de introducción de grupo carboxilo. Las propiedades de las micropartículas y el rendimiento inmunocromatográfico cuando se usan como partículas colorantes se muestran en la siguiente tabla 1. La adsorción de proteína mejoró ligeramente en comparación con el siguiente ejemplo comparativo 1. La adsorción de proteína pudo reducirse ligeramente en comparación con el siguiente ejemplo comparativo 1 y se observó un efecto de reducción de falsos positivos.

[EJEMPLO 18] (Ejemplo de referencia)

Se prepararon micropartículas de celulosa coloreadas hidrofilizadas con el grupo carboxilo introducido usando el mismo método que en el ejemplo 1 con la excepción de cambiar la cantidad de agente hidrofilizante a 40,0 ml en la reacción de hidrofilización de superficie y cambiar el reactivo a 16,4 g de bis(carboximetil)éter de poli(etilenglicol) (Mw 600, Creative PEGWorks, PSB-362) y la cantidad de carbonato de sodio a 9,9 g en la reacción de introducción de grupo carboxilo. Las propiedades de las micropartículas y el rendimiento inmunocromatográfico cuando se usan como partículas colorantes se muestran en la siguiente tabla 1. La adsorción de proteína mejoró ligeramente en comparación con el siguiente ejemplo comparativo 1. Como resultado, se observó un efecto de reducción de falsos positivos, aunque solo ligeramente.

[EJEMPLO 19]

Se prepararon micropartículas de celulosa coloreadas hidrofilizadas con el grupo carboxilo introducido usando el mismo método que en el ejemplo 1 con la excepción de cambiar el reactivo a 7,2 g de ácido 11-bromoundecanoico y la cantidad de carbonato de sodio a 0,01 g. Las propiedades de las micropartículas y el rendimiento inmunocromatográfico cuando se usan como partículas colorantes se muestran en la siguiente tabla 1. La adsorción de proteína disminuyó en comparación con el siguiente ejemplo comparativo 1 debido a los efectos de la capa hidrófila y los espaciadores hidrófilos. Como resultado, se observó un efecto de reducción de falsos positivos.

[EJEMPLO 20] (Ejemplo de referencia)

Se prepararon micropartículas de celulosa coloreadas hidrofilizadas con el grupo carboxilo introducido usando el mismo método que en el ejemplo 1 con la excepción de cambiar el reactivo a 16,4 g de bis(carboximetil)éter de poli(etilenglicol) (Mw 600, Creative PEGWorks, PSB-362) y la cantidad de carbonato de sodio a 0,01 g en la reacción de introducción de grupo carboxilo. Las propiedades de las micropartículas y el rendimiento inmunocromatográfico cuando se usan como partículas colorantes se muestran en la siguiente tabla 1. La adsorción de proteína mejoró ligeramente en comparación con el siguiente ejemplo comparativo 1. Como resultado, se observó un efecto de reducción de falsos positivos.

[EJEMPLO 21] (Ejemplo de referencia)

Se prepararon micropartículas de celulosa coloreadas hidrofilizadas con el grupo carboxilo introducido usando el mismo método que en el ejemplo 1 con la excepción de cambiar el reactivo a 65,6 g de bis(carboximetil)éter de poli(etilenglicol) (Mw 5000, Creative PEGWorks, PSB-366) y la cantidad de carbonato de sodio a 9,9 g en la reacción de introducción de grupo carboxilo. Las propiedades de las micropartículas y el rendimiento inmunocromatográfico cuando se usan como partículas colorantes se muestran en la siguiente tabla 1. Aunque los espaciadores eran PEG, se demostró un efecto de volumen excluido debido a la gran longitud de los mismos y siendo cero la cantidad de proteína adsorbida. Como resultado, se observó un efecto de reducción de falsos positivos.

En las micropartículas preparadas en los ejemplos 1 a 21, la intensidad de coloración de las micropartículas en la etapa anterior a la unión con el anticuerpo no disminuyó debido a la introducción de grupos reactivos quizás debido a que la capa hidrófila había funcionado como capa protectora.

[EJEMPLO COMPARATIVO 1]

Se prepararon micropartículas de celulosa coloreadas usando el mismo método que en el ejemplo 1 con la excepción de que no se llevó a cabo la reacción de hidrofilización de superficie ni la reacción de introducción de grupo carboxilo. Las propiedades de las micropartículas y el rendimiento inmunocromatográfico cuando se usan como partículas colorantes se muestran en la siguiente tabla 2. Se pensó que una gran cantidad de proteína se había adsorbido fácilmente sobre la superficie de las micropartículas debido a que la superficie de las micropartículas era hidrófoba. Como resultado, se produjo una adsorción inespecífica y la incidencia de falsos positivos fue del 3%.

[EJEMPLO COMPARATIVO 2]

Se prepararon micropartículas de celulosa coloreadas con el grupo carboxilo introducido en las que los espaciadores eran (CH^{2 )16}según el método descrito en el documento PTL4. Las propiedades de las micropartículas y el rendimiento inmunocromatográfico cuando se usan como partículas colorantes se muestran en la siguiente tabla 2. Aunque la sensibilidad mejoró drásticamente en comparación con el documento PTL4 ya que se usó una cantidad de anticuerpo diferente a la usada en el documento PTL4, ya que la superficie de las micropartículas fue hidrófoba, se adsorbió una gran cantidad de proteína en la superficie de las micropartículas, lo que provocó una adsorción inespecífica y dio como resultado una incidencia de falsos positivos del 3%.

[EJEMPLO COMPARATIVO 3]

Se prepararon micropartículas de celulosa coloreadas con el grupo carboxilo introducido usando el mismo método que en el ejemplo 1 con la excepción de que no se llevó a cabo la reacción de hidrofilización de superficie. Las propiedades de las micropartículas y el rendimiento inmunocromatográfico cuando se usan como partículas colorantes se muestran en la siguiente tabla 2. La adsorción de proteína mejoró ligeramente en comparación con el ejemplo comparativo 1 ó 2, quizás debido a que se introdujo una cantidad ligeramente mayor de grupos carboxilo. Sin embargo, el grado de hidrofilización fue bajo y la proteína terminó adsorbiéndose debido a la ausencia de una capa hidrófila, y apenas hubo efecto de reducción de falsos positivos.

[EJEMPLO COMPARATIVO 4]

Se introdujeron grupos amino en la superficie de las micropartículas usando el método descrito en el documento PTL4 sin llevar a cabo la hidrofilización de superficie. Posteriormente, se prepararon micropartículas de celulosa coloreadas con el grupo carboxilo introducido usando el mismo método que en el ejemplo 1. Las propiedades de las micropartículas y el rendimiento inmunocromatográfico cuando se usaron como partículas colorantes se muestran en la siguiente tabla 2. No se observó un efecto de reducción de la adsorción de proteínas debido a la ausencia de una capa hidrófila además de la gran cantidad de grupos amino reactivos residuales. Como resultado, tampoco se observó un efecto de reducción de falsos positivos.

[EJEMPLO COMPARATIVO 5]

Se prepararon micropartículas de celulosa coloreadas con el grupo carboxilo introducido usando el mismo método que en el ejemplo 1 con la excepción de no llevar a cabo la reacción de hidrofilización de superficie y cambiar el reactivo en la reacción de introducción de grupo carboxilo a 16,40 g de bis(carboximetil)éter de poli(etilenglicol) (Mw600, Creative PEGWorks, PBS-362). Las propiedades de las micropartículas y el rendimiento inmunocromatográfico cuando se usan como partículas colorantes se muestran en la siguiente tabla 2. Además de que la proteína se adsorbe debido a la interacción eléctrica entre la superficie de la micropartícula y los espaciadores como resultado de la ausencia de una capa hidrófila y el uso de PEG como espaciadores, la hidrofilia inadecuada de la superficie de las micropartículas también dio como resultado la adsorción de proteína, y no se observó un efecto de reducción de la cantidad adsorbida. Como resultado, tampoco se observó un efecto de reducción de falsos positivos.

[EJEMPLO COMPARATIVO 6]

Se introdujeron grupos amino en micropartículas usando el mismo método que en el ejemplo comparativo 4 sin llevar a cabo la hidrofilización de superficie. Posteriormente, se prepararon micropartículas de celulosa coloreadas con el grupo carboxilo introducido usando el mismo método que en el ejemplo 1 con la excepción de cambiar el reactivo a ácido 11-bromoundecanoico y la cantidad de carbonato de sodio a 0,01 g en la reacción de introducción de grupo carboxilo. Las propiedades de las micropartículas y el rendimiento inmunocromatográfico cuando se usan como partículas colorantes se muestran en la siguiente tabla 2. Debido a la ausencia de una capa hidrófila y la gran cantidad de grupos amino reactivos residuales, la hidrofilia de la superficie de las micropartículas era inadecuada y no se observó un efecto de reducción de la adsorción de proteínas. Como resultado, tampoco se observó un efecto de reducción de falsos positivos.

[EJEMPLO COMPARATIVO 7]

Se introdujeron grupos amino en micropartículas usando el mismo método que en el ejemplo comparativo 4 sin llevar a cabo la hidrofilización de superficie. Posteriormente, se prepararon micropartículas de celulosa coloreadas con el grupo carboxilo introducido usando el mismo método que en el ejemplo 1 con la excepción de cambiar el reactivo a 16,4 g de bis(carboximetil)éter de poli(etilenglicol) (Mw600, Creative PEGWorks, PSB-362) en la reacción de introducción de grupo carboxilo. Las propiedades de las micropartículas y el rendimiento inmunocromatográfico cuando se usan como partículas colorantes se muestran en la siguiente tabla 2. Debido a la ausencia de una capa hidrófila y la gran cantidad de grupos amino reactivos residuales, no se observó un efecto de reducción de la adsorción de proteínas debido a que la hidrofilia de la superficie de las micropartículas era inadecuada y se usó PEG como espaciadores. Como resultado, tampoco se observó un efecto de reducción de falsos positivos.

[EJEMPLO COMPARATIVO 8]

Se introdujeron grupos amino en micropartículas usando el mismo método que en el ejemplo comparativo 4 sin llevar a cabo la hidrofilización de superficie. Posteriormente, se prepararon micropartículas de celulosa coloreadas con el grupo carboxilo introducido usando el mismo método que en el ejemplo 1 con la excepción de cambiar el reactivo a 16,4 g de bis(carboximetil)éter de poli(etilenglicol) (Mw600, Creative PEGWorks, PSB-362) y la cantidad de carbonato de sodio a 0,01 g en la reacción de introducción de grupo carboxilo. Las propiedades de las micropartículas y el rendimiento inmunocromatográfico cuando se usan como partículas colorantes se muestran en la siguiente tabla 2. Debido a la ausencia de una capa hidrófila y la gran cantidad de grupos amino reactivos residuales, no se observó un efecto de reducción de la adsorción de proteínas debido a que la hidrofilia de la superficie de las micropartículas era inadecuada y se usó PEG como espaciadores. Como resultado, tampoco se observó un efecto de reducción de falsos positivos.

[EJEMPLO COMPARATIVO 9]

Se prepararon micropartículas de celulosa coloreadas hidrofilizadas con el grupo carboxilo introducido usando el mismo método que en el ejemplo 1 con la excepción de cambiar el número de ciclos de la reacción de tinción a un ciclo. Las propiedades de las micropartículas y el rendimiento inmunocromatográfico cuando se usan como partículas colorantes se muestran en la siguiente tabla 2. La sensibilidad de detección fue inferior a la de los ejemplos debido a la baja intensidad de coloración y por tanto el tiempo de diagnóstico fue más prolongado. [EJEMPLO COMPARATIVO 10]

Se prepararon micropartículas de celulosa coloreadas hidrofilizadas con el grupo carboxilo introducido usando el mismo método que en el ejemplo 1 con la excepción de cambiar el líquido de coagulación al 50,00% en peso de dimetilsulfóxido (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd., D0798) y el 50,00% en peso de agua. Las propiedades de las micropartículas y el rendimiento inmunocromatográfico cuando se usan como partículas colorantes se muestran en la siguiente tabla 2. La sensibilidad de detección fue inferior a la de los ejemplos debido al pequeño diámetro de partícula y por tanto el tiempo de diagnóstico fue mayor.

[EJEMPLO COMPARATIVO 11]

Se prepararon micropartículas de celulosa coloreadas hidrofilizadas con el grupo carboxilo introducido usando el mismo método que en el ejemplo 1 con la excepción de cambiar la cantidad de agente hidrofilizante en la reacción de hidrofilización de superficie a 1,0 ml. Las propiedades de las micropartículas y el rendimiento inmunocromatográfico cuando se usan como partículas colorantes se muestran en la siguiente tabla 2. La intensidad de coloración de las micropartículas disminuyó considerablemente durante la reacción de introducción de grupo carboxilo debido a la falta de una capa hidrófila.

[EJEMPLO COMPARATIVO 12]

Se prepararon micropartículas de celulosa coloreadas hidrofilizadas con el grupo carboxilo introducido usando el mismo método que en el ejemplo 1 con la excepción de cambiar el líquido de coagulación a una concentración de tetrahidrofurano del 97,0% en peso y una concentración de agua del 3,0% en peso en la reacción de coagulación de micropartículas de celulosa, y cambiar la cantidad de carbonato de sodio a 9,9 g y el reactivo a 7,2 g de ácido 11-bromoundecanoico en la reacción de introducción de grupo carboxilo. Las propiedades de las micropartículas y el rendimiento inmunocromatográfico cuando se usan como partículas colorantes se muestran en la siguiente tabla 2. Las micropartículas no pudieron moverse a través de la membrana debido a que el diámetro de las micropartículas era excesivamente grande.

[EJEMPLO COMPARATIVO 13]

Se usaron grupos de unión de PEG de 2000 Da que consistieron en nanopartículas de oro modificadas con grupo carboxilo que tenián un diámetro de partícula de 50 nm y a las que se les introdujeron grupos carboxilo (CTD Inc.) como partículas colorantes y se evaluó el rendimiento inmunocromatográfico. Los resultados se muestran en la siguiente tabla 2. Se requirió tiempo para que las micropartículas se movieran a través de la membrana debido a la superficie hidrófoba de las mismas y el tiempo de coloración fue lento. Además, dado que la superficie de las micropartículas era hidrófoba, las proteínas se adsorbían fácilmente en la superficie de las micropartículas y se producían fácilmente falsos positivos.

[EJEMPLO COMPARATIVO 14]

Se usaron partículas de látex que tenían un diámetro de partícula de 470 nm, una intensidad de coloración de 0,5 y a las que se les introdujeron grupos carboxilo (Bangs Laboratories, Inc.) como partículas colorantes y se evaluó el rendimiento inmunocromatográfico. Los resultados se muestran en la siguiente tabla 2. Dado que la superficie de las micropartículas era hidrófoba, la proteína se adsorbía fácilmente en la superficie de las micropartículas y se producían fácilmente falsos positivos.

[EJEMPLO COMPARATIVO 15]

Se prepararon micropartículas de celulosa coloreadas hidrofilizadas usando el mismo método que en el ejemplo 1. Posteriormente, no se llevó a cabo la reacción de introducción de grupo carboxilo y las micropartículas se usaron tal cual como partículas colorantes. Las propiedades de las partículas y el rendimiento inmunocromatográfico se muestran en la siguiente tabla 2. Aunque las partículas se hidrofilizaron, debido a la ausencia de sitios de unión de anticuerpos, los anticuerpos no pudieron sopotarse sobre las partículas, lo que dio como resultado una sensibilidad extremadamente baja.

Aplicabilidad industrial

Las micropartículas de celulosa coloreadas hidrofilizadas según la presente invención permiten un diagnóstico rápido manteniendo al mismo tiempo una alta sensibilidad de detección, y pueden usarse preferiblemente como partículas colorantes de un kit de diagnóstico inmunocromatográfico que sorprendentemente reduce el riesgo de aparición de falsos positivos.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Micropartículas de celulosa coloreadas que tienen

un diámetro de partícula promedio de 60 nm a 900 nm;

intensidad de coloración medida tal como se describe en la descripción de 1,0 a 10,0;

una capa hidrófila en la superficie de las micropartículas, en las que la capa hidrófila está unida químicamente a los grupos hidroxilo de las micropartículas, y en las que la capa hidrófila es cualquiera de una capa de silano, una capa de polietilenglicol (PEG) o una capa mixta de una capa de silano y una capa de polietilenglicol (PEG); grupos carboxilo introducidos en la superficie de las micropartículas con espaciadores hidrófobos interpuestos entre los mismos, en las que los espaciadores hidrófobos son grupos químicos que se unen con grupos reactivos de la capa hidrófila y conectan la micropartícula con el grupo carboxilo a través de la capa hidrófila, en las que los espaciadores son estructuras a base de hidrocarburos; y

2. Micropartículas de celulosa coloreadas según la reivindicación 1, en las que la cantidad de los grupos carboxilo introducidos es de 0,20 mmol a 3,00 mmol por gramo de las micropartículas de celulosa coloreadas.

3. Kit de diagnóstico inmunocromatográfico que contiene las micropartículas de celulosa coloreadas según una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2.