JP6523020B2 - 生体分子の検出又は定量方法、及び生体分子の検出又は定量用標識試薬粒子 - Google Patents
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Description
本発明は、生体分子の検出又は定量方法、及び生体分子の検出又は定量用標識試薬粒子に関する。
生体中の核酸や抗原などの生体分子を標的物質として検出する手法として、生体分子を捕捉する捕捉物質を担体に固定化させた多孔質の試験片と、標識試薬粒子を用いた検出法がある。この方法では、検体液に含まれる生体分子と標識試薬粒子に対して、毛細管現象により試験片の多孔質支持体内を移動させる。そして、多孔質支持体に例えばライン状に固定された捕捉物質と標識試薬粒子とを接触させることによって標識試薬粒子を濃縮し、捕捉物質が固定されたラインを標識試薬粒子により発色させる。この発色によって生体分子の有無を判定することができる。
かかる生体分子の検出法の特徴として下記の３点が挙げられる。
（１）判定までに要する時間が短く迅速な検査が可能である。
（２）検体を滴下するだけで測定でき操作が簡便である。
（３）特別な検出装置を必要とせず判定が容易である。
これらの特徴を利用して、前記の検出法は妊娠検査薬やインフルエンザ検査薬に用いられており、新たなＰＯＣＴ（Point Of Care Testing）の手法として利用されている。また、食品検査においても、例えば食物アレルゲンの検査試薬等として広く利用され益々注目を集めている。
かかる生体分子の検出法の特徴として下記の３点が挙げられる。
（１）判定までに要する時間が短く迅速な検査が可能である。
（２）検体を滴下するだけで測定でき操作が簡便である。
（３）特別な検出装置を必要とせず判定が容易である。
これらの特徴を利用して、前記の検出法は妊娠検査薬やインフルエンザ検査薬に用いられており、新たなＰＯＣＴ（Point Of Care Testing）の手法として利用されている。また、食品検査においても、例えば食物アレルゲンの検査試薬等として広く利用され益々注目を集めている。
多孔質の試験片の担体に固定化させた捕捉物質により生体分子を捕捉し、生体分子を検出する方法としては、サンドイッチ法や競合法が知られている。
このうち競合法は、多孔質支持体に固定された捕捉物質と、標識試薬粒子及び標的物質とを競合的に接触させ、捕捉物質が固定化されている領域の標識試薬粒子由来の発色度に基づいて標的物質の濃度を定量する。競合法において標識試薬粒子及び標的物質が競合して捕捉物質が固定化されている領域に結合するので、標識試薬粒子由来の発色度は、標的物質の濃度が少ないほど上昇する。よって、競合法による検出方法では、サンドイッチ法では検出できないような極微量の低分子量の生体分子を検出することができる。
そこでこれまでに、各種生体分子検出用試験キットを用いた、競合法による生体分子の検出方法が提案されている（例えば、特許文献１〜４参照）。
このうち競合法は、多孔質支持体に固定された捕捉物質と、標識試薬粒子及び標的物質とを競合的に接触させ、捕捉物質が固定化されている領域の標識試薬粒子由来の発色度に基づいて標的物質の濃度を定量する。競合法において標識試薬粒子及び標的物質が競合して捕捉物質が固定化されている領域に結合するので、標識試薬粒子由来の発色度は、標的物質の濃度が少ないほど上昇する。よって、競合法による検出方法では、サンドイッチ法では検出できないような極微量の低分子量の生体分子を検出することができる。
そこでこれまでに、各種生体分子検出用試験キットを用いた、競合法による生体分子の検出方法が提案されている（例えば、特許文献１〜４参照）。
特許文献１〜４に記載の発明では、標識試薬粒子として金コロイドやラテックスビーズを用いている。しかし標識試薬粒子として金コロイドやラテックスビーズを用いた場合、定量測定可能な範囲は非常に狭い。これまで競合法によるイムノクロマトグラフィーに用いられてきた標識試薬粒子は反応性が悪く、低濃度領域で検出対象を測定することができなかった。我々は反応性の高い標識試薬粒子を競合法によるイムノクロマトグラフィーに用いて、低濃度領域で検出対象を定量することを検討するうえで、このような問題点があることを見出した。
検出対象の検出又は定量感度を向上させるためには、標識試薬粒子に対する検出対象の添加量を調整する必要がある。競合法において、標識試薬粒子に多量の検出対象が結合してしまうと、捕捉物質が固定されたラインに対する標識試薬粒子の結合が優勢となる。その結果、検出対象の検出又は定量感度が低下してしまう。
検出対象の検出又は定量感度を向上させるためには、標識試薬粒子に対する検出対象の添加量を調整する必要がある。競合法において、標識試薬粒子に多量の検出対象が結合してしまうと、捕捉物質が固定されたラインに対する標識試薬粒子の結合が優勢となる。その結果、検出対象の検出又は定量感度が低下してしまう。
そこで、本発明は、上記のような課題を解決するため、競合法により高感度及び高精度で生体分子を検出又は定量する、生体分子の検出又は定量方法を提供することを目的とする。
さらに本発明は、前記方法に好適に用いることができる標識試薬粒子を提供することを目的とする。
さらに本発明は、前記方法に好適に用いることができる標識試薬粒子を提供することを目的とする。
本発明者らは上記課題に鑑み鋭意検討を行った。その結果、生体分子検出又は定量用の試験片と生体分子検出又は定量用の標識試薬粒子を有する生体分子検出又は定量用試験キットを用いた競合法による生体分子の検出又は定量方法において、蛍光シリカナノ粒子からなる標識試薬粒子の表面にキャリア物質を導入し、検出対象と競合する物質がキャリア物質を介して標識試薬粒子の表面に導入されている標識試薬粒子を用いることで、競合法により高感度及び高精度で生体分子を検出又は定量できることを見い出した。
本発明はこれらの知見に基づき完成されるに至ったものである。
本発明はこれらの知見に基づき完成されるに至ったものである。
本発明の上記課題は、下記の手段により解決された。
（１）生体分子検出又は定量用試験キットを用いた、生体分子の検出又は定量方法であって、
前記生体分子検出又は定量用試験キットは、生体分子検出又は定量用の試験片と、生体分子検出又は定量用の標識試薬粒子を有し、
前記試験片は、生体分子と標識試薬粒子を捕捉する試験領域を有し、
前記標識試薬粒子が蛍光シリカナノ粒子からなり、
前記標識試薬粒子の表面にキャリア物質が導入されており、
検出対象である生体分子と競合する物質が、標識試薬粒子の表面に導入されており、
前記標識試薬粒子の比重が、前記試験片に滴下する生体分子を含む試料よりも大きく、
生体分子を含む試料と前記標識試薬粒子を加えた前記試験片の前記試験領域の発光強度に基づいて、前記試料に含まれる生体分子を検出又は定量する、生体分子の検出又は定量方法。
（２）前記キャリア物質が、ウシ血清アルブミン、ポリエチレングリコール、カゼイン、スカシガイヘモシアニン、ヒト血清アルブミン、卵白アルブミン、グロブリン、アビジン、及びストレプトアビジンからなる群より選ばれる少なくとも１種の物質である、前記（１）項に記載の方法。
（３）前記標識試薬粒子の平均粒径が１００ｎｍ以上５００ｎｍ以下である、前記（１）又は（２）項に記載の方法。
（４）前記キャリア物質が親水性である、前記（１）〜（３）のいずれか１項に記載の方法。
（５）前記標識試薬粒子に導入されている生体分子と競合する物質の量が、前記蛍光シリカナノ粒子の表面１ｎｍ2当たり０．０００１個以上０．１個以下である、前記（１）〜（４）のいずれか１項に記載の方法。
（６）前記キャリア物質が、チオール基と結合できる反応性官能基、及びカルボキシル基又はアミノ基と結合できる反応性官能基を有する、前記（１）〜（５）のいずれか１項に記載の方法。
（７）前記キャリア物質が、チオールと結合できる反応性官能基としてマレイミド基を有し、カルボキシル基又はアミノ基と結合できる反応性官能基としてアミノ基、カルボキシル基又は活性エステル基を有する、前記（６）項に記載の方法。
（８）前記キャリア物質が、ウシ血清アルブミン又はポリエチレングリコールである、前記（６）又は（７）項に記載の方法。
（９）前記標識試薬粒子における生体分子と競合する物質の導入量が、前記標識試薬粒子における前記キャリア物質の導入量に対して、モル比で１０以下である、前記（１）〜（８）のいずれか１項に記載の方法。
（１０）水（４℃）に対する前記標識試薬粒子の比重が１．３以上２．２以下である、前記（１）〜（９）のいずれか１項に記載の方法。
（１１）検出対象である生体分子を含む前記試料が全血である、前記（１）〜（１０）のいずれか１項に記載の方法。
（１２）検出対象である前記生体分子がステロイド系ホルモン又は性ホルモンである、前記（１）〜（１１）のいずれか１項に記載の方法。
（１３）生体分子を含む前記試料と前記標識試薬粒子とを混合し、得られた混合物を前記試験片に滴下する、前記（１）〜（１２）のいずれか１項に記載の方法。
（１４）前記試験片がラテラルフロー用の試験片である、前記（１）〜（１３）のいずれか１項に記載の方法。
（１）生体分子検出又は定量用試験キットを用いた、生体分子の検出又は定量方法であって、
前記生体分子検出又は定量用試験キットは、生体分子検出又は定量用の試験片と、生体分子検出又は定量用の標識試薬粒子を有し、
前記試験片は、生体分子と標識試薬粒子を捕捉する試験領域を有し、
前記標識試薬粒子が蛍光シリカナノ粒子からなり、
前記標識試薬粒子の表面にキャリア物質が導入されており、
検出対象である生体分子と競合する物質が、標識試薬粒子の表面に導入されており、
前記標識試薬粒子の比重が、前記試験片に滴下する生体分子を含む試料よりも大きく、
生体分子を含む試料と前記標識試薬粒子を加えた前記試験片の前記試験領域の発光強度に基づいて、前記試料に含まれる生体分子を検出又は定量する、生体分子の検出又は定量方法。
（２）前記キャリア物質が、ウシ血清アルブミン、ポリエチレングリコール、カゼイン、スカシガイヘモシアニン、ヒト血清アルブミン、卵白アルブミン、グロブリン、アビジン、及びストレプトアビジンからなる群より選ばれる少なくとも１種の物質である、前記（１）項に記載の方法。
（３）前記標識試薬粒子の平均粒径が１００ｎｍ以上５００ｎｍ以下である、前記（１）又は（２）項に記載の方法。
（４）前記キャリア物質が親水性である、前記（１）〜（３）のいずれか１項に記載の方法。
（５）前記標識試薬粒子に導入されている生体分子と競合する物質の量が、前記蛍光シリカナノ粒子の表面１ｎｍ2当たり０．０００１個以上０．１個以下である、前記（１）〜（４）のいずれか１項に記載の方法。
（６）前記キャリア物質が、チオール基と結合できる反応性官能基、及びカルボキシル基又はアミノ基と結合できる反応性官能基を有する、前記（１）〜（５）のいずれか１項に記載の方法。
（７）前記キャリア物質が、チオールと結合できる反応性官能基としてマレイミド基を有し、カルボキシル基又はアミノ基と結合できる反応性官能基としてアミノ基、カルボキシル基又は活性エステル基を有する、前記（６）項に記載の方法。
（８）前記キャリア物質が、ウシ血清アルブミン又はポリエチレングリコールである、前記（６）又は（７）項に記載の方法。
（９）前記標識試薬粒子における生体分子と競合する物質の導入量が、前記標識試薬粒子における前記キャリア物質の導入量に対して、モル比で１０以下である、前記（１）〜（８）のいずれか１項に記載の方法。
（１０）水（４℃）に対する前記標識試薬粒子の比重が１．３以上２．２以下である、前記（１）〜（９）のいずれか１項に記載の方法。
（１１）検出対象である生体分子を含む前記試料が全血である、前記（１）〜（１０）のいずれか１項に記載の方法。
（１２）検出対象である前記生体分子がステロイド系ホルモン又は性ホルモンである、前記（１）〜（１１）のいずれか１項に記載の方法。
（１３）生体分子を含む前記試料と前記標識試薬粒子とを混合し、得られた混合物を前記試験片に滴下する、前記（１）〜（１２）のいずれか１項に記載の方法。
（１４）前記試験片がラテラルフロー用の試験片である、前記（１）〜（１３）のいずれか１項に記載の方法。
（１５）競合法による生体分子の検出又は定量方法に用いられる標識試薬粒子であって、
前記標識試薬粒子が蛍光シリカナノ粒子からなり、
前記標識試薬粒子の表面にキャリア物質が導入されており、
検出対象である生体分子と競合する物質が、前記キャリア物質を介して標識試薬粒子の表面に導入されており、
前記生体分子を含む試料よりも比重が大きい、標識試薬粒子。
（１６）前記キャリア物質が、ウシ血清アルブミン、ポリエチレングリコール、カゼイン、スカシガイヘモシアニン、ヒト血清アルブミン、卵白アルブミン、グロブリン、アビジン、及びストレプトアビジンからなる群より選ばれる少なくとも１種の物質である、前記（１５）項に記載の標識試薬粒子。
（１７）前記標識試薬粒子の平均粒径が１００ｎｍ以上５００ｎｍ以下である、前記（１５）又は（１６）項に記載の標識試薬粒子。
（１８）前記キャリア物質が親水性である、前記（１５）〜（１７）のいずれか１項に記載の標識試薬粒子。
（１９）前記標識試薬粒子に導入されている生体分子と競合する物質の量が、前記蛍光シリカナノ粒子の表面１ｎｍ2当たり０．０００１個以上０．１個以下である、前記（１５）〜（１８）のいずれか１項に記載の標識試薬粒子。
（２０）前記キャリア物質が、チオール基と結合できる反応性官能基、及びカルボキシル基又はアミノ基と結合できる反応性官能基を有する、前記（１５）〜（１９）のいずれか１項に記載の標識試薬粒子。
（２１）前記キャリア物質が、チオールと結合できる反応性官能基としてマレイミド基を有し、カルボキシル基又はアミノ基と結合できる反応性官能基としてアミノ基、カルボキシル基又は活性エステル基を有する、前記（２０）項に記載の標識試薬粒子。
（２２）前記キャリア物質が、ウシ血清アルブミン又はポリエチレングリコールである、前記（２０）又は（２１）項に記載の標識試薬粒子。
（２３）前記標識試薬粒子における生体分子と競合する物質の導入量が、前記標識試薬粒子における前記キャリア物質の導入量に対して、モル比で１０以下である、前記（１５）〜（２２）のいずれか１項に記載の標識試薬粒子。
（２４）水（４℃）に対する前記標識試薬粒子の比重が１．３以上２．２以下である、前記（１５）〜（２３）のいずれか１項に記載の標識試薬粒子。
（２５）検出対象である前記生体分子がステロイド系ホルモン又は性ホルモンである、前記（１５）〜（２４）のいずれか１項に記載の標識試薬粒子。
（２６）前記蛍光シリカナノ粒子の表面に前記キャリア物質を導入し、蛍光シリカナノ粒子の表面に導入したキャリア物質と、検出対象である生体分子と競合する物質とを結合させて作製した、前記（１５）〜（２５）のいずれか１項に記載の標識試薬粒子。
（２７）前記（１）〜（１４）のいずれか１項に記載の方法に用いられる、前記（１５）〜（２６）のいずれか１項に記載の標識試薬粒子。
前記標識試薬粒子が蛍光シリカナノ粒子からなり、
前記標識試薬粒子の表面にキャリア物質が導入されており、
検出対象である生体分子と競合する物質が、前記キャリア物質を介して標識試薬粒子の表面に導入されており、
前記生体分子を含む試料よりも比重が大きい、標識試薬粒子。
（１６）前記キャリア物質が、ウシ血清アルブミン、ポリエチレングリコール、カゼイン、スカシガイヘモシアニン、ヒト血清アルブミン、卵白アルブミン、グロブリン、アビジン、及びストレプトアビジンからなる群より選ばれる少なくとも１種の物質である、前記（１５）項に記載の標識試薬粒子。
（１７）前記標識試薬粒子の平均粒径が１００ｎｍ以上５００ｎｍ以下である、前記（１５）又は（１６）項に記載の標識試薬粒子。
（１８）前記キャリア物質が親水性である、前記（１５）〜（１７）のいずれか１項に記載の標識試薬粒子。
（１９）前記標識試薬粒子に導入されている生体分子と競合する物質の量が、前記蛍光シリカナノ粒子の表面１ｎｍ2当たり０．０００１個以上０．１個以下である、前記（１５）〜（１８）のいずれか１項に記載の標識試薬粒子。
（２０）前記キャリア物質が、チオール基と結合できる反応性官能基、及びカルボキシル基又はアミノ基と結合できる反応性官能基を有する、前記（１５）〜（１９）のいずれか１項に記載の標識試薬粒子。
（２１）前記キャリア物質が、チオールと結合できる反応性官能基としてマレイミド基を有し、カルボキシル基又はアミノ基と結合できる反応性官能基としてアミノ基、カルボキシル基又は活性エステル基を有する、前記（２０）項に記載の標識試薬粒子。
（２２）前記キャリア物質が、ウシ血清アルブミン又はポリエチレングリコールである、前記（２０）又は（２１）項に記載の標識試薬粒子。
（２３）前記標識試薬粒子における生体分子と競合する物質の導入量が、前記標識試薬粒子における前記キャリア物質の導入量に対して、モル比で１０以下である、前記（１５）〜（２２）のいずれか１項に記載の標識試薬粒子。
（２４）水（４℃）に対する前記標識試薬粒子の比重が１．３以上２．２以下である、前記（１５）〜（２３）のいずれか１項に記載の標識試薬粒子。
（２５）検出対象である前記生体分子がステロイド系ホルモン又は性ホルモンである、前記（１５）〜（２４）のいずれか１項に記載の標識試薬粒子。
（２６）前記蛍光シリカナノ粒子の表面に前記キャリア物質を導入し、蛍光シリカナノ粒子の表面に導入したキャリア物質と、検出対象である生体分子と競合する物質とを結合させて作製した、前記（１５）〜（２５）のいずれか１項に記載の標識試薬粒子。
（２７）前記（１）〜（１４）のいずれか１項に記載の方法に用いられる、前記（１５）〜（２６）のいずれか１項に記載の標識試薬粒子。
本発明の競合法による生体分子の検出又は定量方法は、高感度及び高精度で生体分子を検出又は定量することができる。
さらに本発明の標識試薬粒子は、前記方法に好適に用いることができる。
さらに本発明の標識試薬粒子は、前記方法に好適に用いることができる。
本明細書において「物質」とは、化合物又は化学合成された分子の他、生体分子（タンパク質、ペプチド、核酸等）を包含する。これらは人工起源のものであっても、天然起源のものであってもよい。
また、本明細書において「結合」又は「連結」とは、複数のものが分離した状態から連続して一体となることを全般的に指し、共有結合やイオン結合、水素結合といった化学的な結合のほか、化学吸着や物理吸着、そのほか嵌合、螺合、咬合した物理的な連結状態等も含む意味である。ここで、「結合」又は「連結」とは、直接複数のものが結合しても、別のものを介して間接的に結合してもよい意味である。
さらに、本明細書において「検出」とは、定性的な検出や定量的な検出のみならず、その他の各種の測定や同定、分析、評価等を含む概念である。
また、本明細書において「結合」又は「連結」とは、複数のものが分離した状態から連続して一体となることを全般的に指し、共有結合やイオン結合、水素結合といった化学的な結合のほか、化学吸着や物理吸着、そのほか嵌合、螺合、咬合した物理的な連結状態等も含む意味である。ここで、「結合」又は「連結」とは、直接複数のものが結合しても、別のものを介して間接的に結合してもよい意味である。
さらに、本明細書において「検出」とは、定性的な検出や定量的な検出のみならず、その他の各種の測定や同定、分析、評価等を含む概念である。
本発明の生体分子の検出又は定量方法は、生体分子検出又は定量用試験キット（以下、単に「試験キット」ともいう）を用いて、競合法により生体分子の検出を行う。生体分子検出又は定量用試験キットは、試験片（以下、「テストストリップ」ともいう）と、生体分子検出又は定量用の標識試薬粒子（以下単に、「標識試薬粒子」ともいう）を有する。
以下、本発明の構成についてその好ましい実施形態を中心に詳述する。
以下、本発明の構成についてその好ましい実施形態を中心に詳述する。
［競合法］
本発明において、生体分子の検出又は定量は競合法により行う。ここで「競合法」とは、検出対象物質（標的物質）と標識試薬粒子との間で競合して、多孔質支持体に固定された捕捉物質により検出対象物質及び標識試薬粒子を捕捉する手法である。競合法において、検出対象物質に比べて標識試薬粒子の量が多いと、捕捉物質への標識試薬粒子の結合が優位となる。したがって、検出対象物質の量が少ないほど、捕捉物質が固定化されている領域の標識試薬粒子による標識度合が上昇する。一方、検出対象物質が多量に存在する場合捕捉物質への検出対象物質の結合が優位となるため、捕捉物質が固定されている領域の標識度合は低下する。競合法はこのようなメカニズムに基づくものであって、捕捉物質が固定されている領域の標識度合を測定し、検出対象物質濃度が増えるにしたがって標識度合が低下する現象を利用して、間接的に検出対象物質の濃度を定量する。
本発明において、生体分子の検出又は定量は競合法により行う。ここで「競合法」とは、検出対象物質（標的物質）と標識試薬粒子との間で競合して、多孔質支持体に固定された捕捉物質により検出対象物質及び標識試薬粒子を捕捉する手法である。競合法において、検出対象物質に比べて標識試薬粒子の量が多いと、捕捉物質への標識試薬粒子の結合が優位となる。したがって、検出対象物質の量が少ないほど、捕捉物質が固定化されている領域の標識試薬粒子による標識度合が上昇する。一方、検出対象物質が多量に存在する場合捕捉物質への検出対象物質の結合が優位となるため、捕捉物質が固定されている領域の標識度合は低下する。競合法はこのようなメカニズムに基づくものであって、捕捉物質が固定されている領域の標識度合を測定し、検出対象物質濃度が増えるにしたがって標識度合が低下する現象を利用して、間接的に検出対象物質の濃度を定量する。
［生体分子］
本発明において、検出対象物質（標的物質）としての生体分子に特に制限はなく、抗原、抗体、核酸、糖、糖鎖、リガンド、受容体、ペプチド、その他生体活性を有する化学物質等が挙げられる。
前述のように、本発明において生体分子の検出又は定量は競合法により行う。本発明において生体分子は、競合法による検出又は定量により生体分子を認識できる大きさであれば特に問題ない。例えば、本発明における検出対象物質としての生体分子の分子量は、４０以上が好ましく、８０以上がより好ましい。
また、一般に、サンドイッチ法による生体分子の検出方法は、低分子量の生体分子の検出には不向きである。これは、サンドイッチ法において、生体分子に２種類の抗体を結合させる必要があるからである。生体分子が小さい場合、１つの抗体が生体分子に結合すると、もう１つの抗体が他方の抗体の立体障害により結合できなくなる。したがって、低分子量の生体分子の検出又は定量を行う場合、競合法はサンドイッチ法に比べて相対的に優位な手法である。そこで、本発明の検出又は定量方法がサンドイッチ法よりも優位であるとする観点からは、生体分子は低分子量であることが好ましい。例えば、本発明における検出対象物質としての生体分子の分子量は、１，０００以下が好ましく、５００以下がより好ましい。しかしこのような分子量の範囲は、分子量が大きいものが競合法に不向きであることを示すものではない。
本発明において、検出対象物質（標的物質）としての生体分子に特に制限はなく、抗原、抗体、核酸、糖、糖鎖、リガンド、受容体、ペプチド、その他生体活性を有する化学物質等が挙げられる。
前述のように、本発明において生体分子の検出又は定量は競合法により行う。本発明において生体分子は、競合法による検出又は定量により生体分子を認識できる大きさであれば特に問題ない。例えば、本発明における検出対象物質としての生体分子の分子量は、４０以上が好ましく、８０以上がより好ましい。
また、一般に、サンドイッチ法による生体分子の検出方法は、低分子量の生体分子の検出には不向きである。これは、サンドイッチ法において、生体分子に２種類の抗体を結合させる必要があるからである。生体分子が小さい場合、１つの抗体が生体分子に結合すると、もう１つの抗体が他方の抗体の立体障害により結合できなくなる。したがって、低分子量の生体分子の検出又は定量を行う場合、競合法はサンドイッチ法に比べて相対的に優位な手法である。そこで、本発明の検出又は定量方法がサンドイッチ法よりも優位であるとする観点からは、生体分子は低分子量であることが好ましい。例えば、本発明における検出対象物質としての生体分子の分子量は、１，０００以下が好ましく、５００以下がより好ましい。しかしこのような分子量の範囲は、分子量が大きいものが競合法に不向きであることを示すものではない。
本発明において、生体分子を含む試料としては特に制限はないが、臨床検体（例えば、血液（全血）、血漿、血清、リンパ液、尿、唾液、膵液、胃液、喀痰、鼻や咽等の粘膜から採取したぬぐい液等の体液や便等）、食品検体（例えば、液体飲料、半固形食品、固形食品等）、環境サンプリング検体（例えば、土壌、河川、海水等の自然界のサンプル、工場内の生産ラインやクリーンルームに設置されたエアーサンプラーによるサンプリング検体、ふき取り検体等）等が挙げられる。
また、試料は液体であればそのまま用いることもできる。試料が半固形又は固形物等の場合には、希釈や抽出等の処理を施した後に用いることもできる。
本発明の生体分子の検出又は定量方法における検出対象としての生体分子の具体例としては、ステロイド系ホルモン（コルチゾール、コルチゾン、コルチコステロン、アルドステロン、デオキシコルチコステロン、エストロン、エストラジオール、その他合成ステロイド系ホルモンなど）や性ホルモン（アンドロゲン、エストロゲン、プロゲステロン（ゲスターゲン）など）が挙げられる。
また、試料は液体であればそのまま用いることもできる。試料が半固形又は固形物等の場合には、希釈や抽出等の処理を施した後に用いることもできる。
本発明の生体分子の検出又は定量方法における検出対象としての生体分子の具体例としては、ステロイド系ホルモン（コルチゾール、コルチゾン、コルチコステロン、アルドステロン、デオキシコルチコステロン、エストロン、エストラジオール、その他合成ステロイド系ホルモンなど）や性ホルモン（アンドロゲン、エストロゲン、プロゲステロン（ゲスターゲン）など）が挙げられる。
［生体分子検出又は定量用の試験片］
本発明で用いる試験キットに含まれる試験片の形状に特に制限はないが、平面状の試験片であることが好ましく、ラテラルフロー用又は吸い上げ法用の試験片であることがより好ましく、ラテラルフロー用の試験片がさらに好ましい。
また、試験片の構造に特に制限はないが、試料添加用部材（サンプルパッド）と、生体分子と標識試薬粒子を競合的に捕捉する試験領域を有するメンブレンと、吸収パッドとが、この順でそれぞれ相互に毛細管現象が生じるように直列に連結している構造であることが好ましい。そして、各構成部材は粘着剤付きバッキングシートにより裏打ちされていることが好ましい。
以下、上記形状及び構造を有する試験片について、図１及び２を参照しながら本発明の好ましい実施形態を説明する。しかし、本発明はこれらに制限するものではない。
本発明で用いる試験キットに含まれる試験片の形状に特に制限はないが、平面状の試験片であることが好ましく、ラテラルフロー用又は吸い上げ法用の試験片であることがより好ましく、ラテラルフロー用の試験片がさらに好ましい。
また、試験片の構造に特に制限はないが、試料添加用部材（サンプルパッド）と、生体分子と標識試薬粒子を競合的に捕捉する試験領域を有するメンブレンと、吸収パッドとが、この順でそれぞれ相互に毛細管現象が生じるように直列に連結している構造であることが好ましい。そして、各構成部材は粘着剤付きバッキングシートにより裏打ちされていることが好ましい。
以下、上記形状及び構造を有する試験片について、図１及び２を参照しながら本発明の好ましい実施形態を説明する。しかし、本発明はこれらに制限するものではない。
（サンプルパッド）
サンプルパッド２は、前記検体や標識試薬粒子を滴下する構成部材である。サンプルパッド２の材料や寸法等は特に限定されず、この種の製品に適用される一般的なものを利用することができる。
サンプルパッド２は、前記検体や標識試薬粒子を滴下する構成部材である。サンプルパッド２の材料や寸法等は特に限定されず、この種の製品に適用される一般的なものを利用することができる。
（メンブレン）
メンブレン３は、サンプルパッド２から毛細管現象により移動してきた抗原を捕捉するための構成部材である。
図１に示すように、メンブレン３には、少なくとも１つの試験領域１０が設けられている。そして、抗原に対する特異的な結合性を有し抗原と複合体を形成しうる捕捉物質（以下、「第１の抗体」ともいう）が、試験領域１０に導入されている。これにより、検出対象物質と結合した標識試薬粒子が試験領域１０へ捕捉される。
この試験領域１０で第１の抗体−抗原−標識試薬粒子からなる複合体が形成され、標識試薬粒子が濃縮される。そして、標識試薬粒子が有する標識量の程度により生体分子を定性的又は定量的に検出することができる。
メンブレン３は、サンプルパッド２から毛細管現象により移動してきた抗原を捕捉するための構成部材である。
図１に示すように、メンブレン３には、少なくとも１つの試験領域１０が設けられている。そして、抗原に対する特異的な結合性を有し抗原と複合体を形成しうる捕捉物質（以下、「第１の抗体」ともいう）が、試験領域１０に導入されている。これにより、検出対象物質と結合した標識試薬粒子が試験領域１０へ捕捉される。
この試験領域１０で第１の抗体−抗原−標識試薬粒子からなる複合体が形成され、標識試薬粒子が濃縮される。そして、標識試薬粒子が有する標識量の程度により生体分子を定性的又は定量的に検出することができる。
図２に示すように、メンブレン３には、抗原と結合した標識試薬粒子を捕捉するための試験領域２０を設け、試験領域２０の下流に、試験領域２０に結合しなかった標識試薬粒子を捕捉する参照領域２１をさらに設けてもよい。このような参照領域２１を設けることにより、サンプルパッド２に滴下した試料が毛細管現象によりメンブレン３に移動し、さらに試験領域２０を超えて移動しているかを確認することができる。参照領域２１は設けなくてもよい。
前記試験領域及び参照領域の形状としては、局所的に捕捉物質が固定化されている限り特に制限はなく、ライン状、円状、帯状等が挙げられる。本発明において試験領域及び参照領域はそれぞれライン状であることが好ましく、幅０．５〜１．５ｍｍのライン状であることがより好ましい。
前記第１の抗体は、抗原抗体反応により抗原を捕捉し、前記試験領域で第１の抗体−抗原−標識試薬粒子からなる複合体を形成しうるものであれば特に制限はない。
前記参照領域に用いる、標識試薬粒子を捕捉する捕捉物質としては、標識試薬粒子に対して結合性を有するものから適宜選択することができる。具体的には、抗体、抗原、核酸、受容体、リガンド、糖鎖、アプタマーなどから適宜選択することができる。
前記参照領域に用いる、標識試薬粒子を捕捉する捕捉物質としては、標識試薬粒子に対して結合性を有するものから適宜選択することができる。具体的には、抗体、抗原、核酸、受容体、リガンド、糖鎖、アプタマーなどから適宜選択することができる。
前記試験領域における第１の抗体の導入量に特に制限なく、適宜設定することができる。例えば、試験領域の形状がライン状の場合、単位長さ（ｃｍ）当たりの第１の抗体の固定化量は０．００１μｇ以上が好ましく、０．０１μｇ以上がより好ましく、１０μｇ以下が好ましく、２μｇ以下がより好ましい。
第１の抗体の固定化方法としては、第１の抗体の溶液をメンブレン３の所定の領域に塗布、滴下又は噴霧後、乾燥して物理吸着により固定化する方法等が挙げられる。また、非特異的吸着による測定への影響を防止するため、捕捉物質の固定化後にメンブレン３全体をいわゆるブロッキング処理を施してもよい。
第１の抗体の固定化方法としては、第１の抗体の溶液をメンブレン３の所定の領域に塗布、滴下又は噴霧後、乾燥して物理吸着により固定化する方法等が挙げられる。また、非特異的吸着による測定への影響を防止するため、捕捉物質の固定化後にメンブレン３全体をいわゆるブロッキング処理を施してもよい。
（吸収パッド）
吸収パッド４は、毛細管現象でメンブレン３を移動してきた溶液を吸収し、一定の流れを生じさせるための構成部材である。
吸収パッド４は、毛細管現象でメンブレン３を移動してきた溶液を吸収し、一定の流れを生じさせるための構成部材である。
これら各構成部材の材料としては特に制限は無く、この種の試験片に通常用いられる部材が使用できる。例えば、サンプルパッド２としてはGlass Fiber Conjugate Pad（商品名、MILLIPORE社製）等のガラスファイバーのパッドを好ましく用いることができる。メンブレン３としてはHi-Flow Plus180メンブレン（商品名、MILLIPORE社製）等のニトロセルロースメンブレンを好ましく用いることができる。吸収パッド４としてはCellulose Fiber Sample Pad（商品名、MILLIPORE社製）等のセルロースメンブレンを好ましく用いることができる。
前記粘着剤付きバッキングシート６としては、AR9020（商品名、Adhesives Research社製）等が挙げられる。
前記粘着剤付きバッキングシート６としては、AR9020（商品名、Adhesives Research社製）等が挙げられる。
試験片の作製法としては、サンプルパッド２、メンブレン３、吸収パッド４の並び順に、各部材間で毛管現象を生じさせ易くするために、それら各部材の両端と隣接する部材と１〜５ｍｍ程度重ね合わせて（好ましくはバッキングシート６上に）貼付することで、テストストリップ１を作製することができる。
［標識試薬粒子］
この種の試験キットに通常適用される標識試薬粒子としては、蛍光シリカナノ粒子からなる標識試薬粒子、吸光シリカナノ粒子からなる標識試薬粒子、蛍光ラテックスナノ粒子からなる標識試薬粒子、吸光ラテックスナノ粒子からなる標識試薬粒子、半導体微粒子からなる標識試薬粒子、金コロイド粒子からなる標識試薬粒子、放射性物質で標識した粒子が挙げられる。
本発明で用いる標識試薬粒子は、蛍光シリカナノ粒子からなる。蛍光シリカナノ粒子を用いた場合、蛍光検出装置により蛍光強度を容易に数値化でき、高感度及び高精度で生体分子を検出することができる。さらに、蛍光シリカナノ粒子の表面に様々な官能基を導入することができ、試験領域の発光が高輝度である。そのため、蛍光シリカナノ粒子を用いた場合、広い定量レンジで生体分子の検出を実現することができる。さらに、蛍光シリカナノ粒子の表面に様々な官能基を導入することができるため、様々な種類の対象物質の検出に用いることができる。
以下、本発明で用いる蛍光シリカナノ粒子からなる標識試薬粒子について説明する。しかし、本発明はこれに限定するものではない。
この種の試験キットに通常適用される標識試薬粒子としては、蛍光シリカナノ粒子からなる標識試薬粒子、吸光シリカナノ粒子からなる標識試薬粒子、蛍光ラテックスナノ粒子からなる標識試薬粒子、吸光ラテックスナノ粒子からなる標識試薬粒子、半導体微粒子からなる標識試薬粒子、金コロイド粒子からなる標識試薬粒子、放射性物質で標識した粒子が挙げられる。
本発明で用いる標識試薬粒子は、蛍光シリカナノ粒子からなる。蛍光シリカナノ粒子を用いた場合、蛍光検出装置により蛍光強度を容易に数値化でき、高感度及び高精度で生体分子を検出することができる。さらに、蛍光シリカナノ粒子の表面に様々な官能基を導入することができ、試験領域の発光が高輝度である。そのため、蛍光シリカナノ粒子を用いた場合、広い定量レンジで生体分子の検出を実現することができる。さらに、蛍光シリカナノ粒子の表面に様々な官能基を導入することができるため、様々な種類の対象物質の検出に用いることができる。
以下、本発明で用いる蛍光シリカナノ粒子からなる標識試薬粒子について説明する。しかし、本発明はこれに限定するものではない。
蛍光シリカナノ粒子の調製方法に特に制限はなく、任意のいかなる調製方法によって蛍光シリカナノ粒子を得ることができる。例えば、Journal of Colloid and Interface Science，159，p．150-157（1993）に記載のゾル−ゲル法や、国際公開第２００７／０７４７２２号パンフレットに記載されたコロイドシリカ粒子の調製方法を参照することができる。
蛍光材料としての蛍光色素を用いた蛍光シリカナノ粒子の調製例について、具体的に説明する。
蛍光色素を含有するシリカ粒子は、蛍光色素とシランカップリング剤とを反応させ、共有結合、イオン結合その他の化学的に結合若しくは吸着させて得られた生成物に１種又は２種以上のシラン化合物を縮重合させシロキサン結合を形成させることにより調製することができる。これによりオルガノシロキサン成分とシロキサン成分とがシロキサン結合してなるシリカ粒子が得られる。１例としては、N-ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル基などの活性エステル基、マレイミド基、イソシアナート基、イソチオシアナート基、アルデヒド基、パラニトロフェニル基、ジエトキシメチル基、エポキシ基、シアノ基等の活性基を有する又は付加した蛍光色素と、それら活性基と対応して反応する置換基（例えば、アミノ基、水酸基、チオール基）を有するシランカップリング剤とを反応させ、共有結合させて得られた生成物に１又は２種以上のシラン化合物を縮重合させシロキサン結合を形成させることにより調製することができる。
蛍光色素を含有するシリカ粒子は、蛍光色素とシランカップリング剤とを反応させ、共有結合、イオン結合その他の化学的に結合若しくは吸着させて得られた生成物に１種又は２種以上のシラン化合物を縮重合させシロキサン結合を形成させることにより調製することができる。これによりオルガノシロキサン成分とシロキサン成分とがシロキサン結合してなるシリカ粒子が得られる。１例としては、N-ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル基などの活性エステル基、マレイミド基、イソシアナート基、イソチオシアナート基、アルデヒド基、パラニトロフェニル基、ジエトキシメチル基、エポキシ基、シアノ基等の活性基を有する又は付加した蛍光色素と、それら活性基と対応して反応する置換基（例えば、アミノ基、水酸基、チオール基）を有するシランカップリング剤とを反応させ、共有結合させて得られた生成物に１又は２種以上のシラン化合物を縮重合させシロキサン結合を形成させることにより調製することができる。
前記シランカップリング剤としてアミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＳ）、シラン化合物としてテトラエトキシシラン（ＴＥＯＳ）を用いた場合を下記に例示する。
前記活性基を有する又は付加した前記蛍光色素の具体例として、5-（及び-6）-カルボキシテトラメチルローダミン-NHSエステル（商品名、emp Biotech GmbH社製）や、下記式でそれぞれ表されるDY550-NHSエステル又はDY630-NHSエステル（いずれも商品名、Dyomics GmbH社製）等のＮＨＳエステル基を有する蛍光色素化合物を挙げることができる。
前記置換基を有するシランカップリング剤の具体例として、γ-アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＳ）、3-［2-（2-アミノエチルアミノ）エチルアミノ］プロピル−トリエトキシシラン、N-2（アミノエチル）3-アミノプロピルメチルジメトキシシラン、3-アミノプロピルトリメトキシシラン等のアミノ基を有するシランカップリング剤を挙げることができる。中でも、ＡＰＳが好ましい。
縮重合させる前記シラン化合物としては特に制限はないが、ＴＥＯＳ、γ-メルカプトプロピルトリメトキシシラン（ＭＰＳ）、γ-メルカプトプロピルトリエトキシシラン、ＡＰＳ、3-チオシアナトプロピルトリエトキシシラン、3-グリシジルオキシプロピルトリエトキシシラン、3-イソシアナトプロピルトリエトキシシラン、及び3-［2-（2-アミノエチルアミノ）エチルアミノ］プロピル−トリエトキシシランを挙げることができる。中でも、前記シリカ粒子内部のシロキサン成分を形成する観点からはＴＥＯＳが好ましく、前記シリカ粒子内部のオルガノシロキサン成分を形成する観点からはＭＰＳ又はＡＰＳが好ましい。
上述のように調製すると、球状、又は球状に近いシリカ粒子を調製することができる。ここで、「球状に近いシリカ粒子」とは、具体的には長軸と短軸の比が２以下の形状である。
蛍光シリカナノ粒子の平均粒径に特に制限はないが、１００ｎｍ以上が好ましく、６００ｎｍ以下がより好ましく、５００ｎｍ以下がさらに好ましく、３００ｎｍ以下が特に好ましい。粒径が小さすぎると、検出感度が低下し、粒径が大きすぎると、試験片に用いられる多孔質支持体（メンブレン）の目詰まりの原因となる。
本発明において、前記平均粒径は、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）等の画像から無作為に選択した１００個の標識試薬シリカ粒子の合計の投影面積から蛍光シリカナノ粒子の占有面積を画像処理装置によって求め、この合計の占有面積を、選択した蛍光シリカナノ粒子の個数（１００個）で割った値に相当する円の直径の平均値（平均円相当直径）を求めたものである。
なお、前記平均粒径は、一次粒子が凝集してなる二次粒子を含む概念の後述する「動的光散乱法による粒度」とは異なり、一次粒子のみからなる粒子の平均粒径である。
所望の平均粒径の蛍光シリカナノ粒子を得るためには、ＹＭ−１０、ＹＭ−１００（いずれも商品名、ミリポア社製）等の限外ろ過膜を用いて限外ろ過を行い、粒径が大きすぎる粒子、及び小さすぎる粒子を除去するか、又は適切な重力加速度で遠心分離を行い、上清若しくは沈殿のみを回収することで可能である。
蛍光シリカナノ粒子は粒状物質として単分散であることが好ましい。蛍光シリカナノ粒子の粒度分布の変動係数、いわゆるＣＶ値に特に制限はないが、１０％以下が好ましく、８％以下がより好ましい。
本発明において、前記平均粒径は、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）等の画像から無作為に選択した１００個の標識試薬シリカ粒子の合計の投影面積から蛍光シリカナノ粒子の占有面積を画像処理装置によって求め、この合計の占有面積を、選択した蛍光シリカナノ粒子の個数（１００個）で割った値に相当する円の直径の平均値（平均円相当直径）を求めたものである。
なお、前記平均粒径は、一次粒子が凝集してなる二次粒子を含む概念の後述する「動的光散乱法による粒度」とは異なり、一次粒子のみからなる粒子の平均粒径である。
所望の平均粒径の蛍光シリカナノ粒子を得るためには、ＹＭ−１０、ＹＭ−１００（いずれも商品名、ミリポア社製）等の限外ろ過膜を用いて限外ろ過を行い、粒径が大きすぎる粒子、及び小さすぎる粒子を除去するか、又は適切な重力加速度で遠心分離を行い、上清若しくは沈殿のみを回収することで可能である。
蛍光シリカナノ粒子は粒状物質として単分散であることが好ましい。蛍光シリカナノ粒子の粒度分布の変動係数、いわゆるＣＶ値に特に制限はないが、１０％以下が好ましく、８％以下がより好ましい。
本明細書において、前記「動的光散乱法による粒度」とは、動的光散乱法により測定され、前記の平均粒径とは異なり、一次粒子だけでなく、一次粒子が凝集してなる二次粒子をも含めた概念であり、前記複合粒子の分散安定性を評価する指標となる。
動的光散乱法による粒度の測定装置としては、ゼータサイザーナノ（商品名；マルバーン社製）が挙げられる。この手法は、微粒子などの光散乱体による光散乱強度の時間変動を測定し、その自己相関関数から光散乱体のブラウン運動速度を計算し、その結果から光散乱体の粒度分布を導出するというものである。
動的光散乱法による粒度の測定装置としては、ゼータサイザーナノ（商品名；マルバーン社製）が挙げられる。この手法は、微粒子などの光散乱体による光散乱強度の時間変動を測定し、その自己相関関数から光散乱体のブラウン運動速度を計算し、その結果から光散乱体の粒度分布を導出するというものである。
本発明で用いる標識試薬粒子の比重に特に制限はないが、試験片に滴下する生体分子を含む試料よりも比重を大きくすることが好ましい。生体分子を含む試料よりも標識試薬粒子の比重を大きくすることで、生体分子を含む試料が標識試薬粒子よりも先に試験片の試験領域に到達する。よって、低濃度の生体分子を定量する場合であっても、競合法による反応を行うことができる。
本発明で用いる標識試薬粒子の比重は、水（４℃）に対して１．３以上２．２以下が好ましく、１．５以上２．０以下がより好ましい。
本発明で用いる標識試薬粒子の比重は、水（４℃）に対して１．３以上２．２以下が好ましく、１．５以上２．０以下がより好ましい。
蛍光シリカナノ粒子の表面には、検出対象である生体分子と競合する物質が導入されている。蛍光シリカナノ粒子の表面に生体分子と競合する物質が導入されていることで、生体分子と標識試薬粒子とが互いに競合して、前記試験領域に結合する。
生体分子と競合する物質は、生体分子と競合して、前記試験領域に標識試薬粒子が結合しうるものであれば特に制限はなく、検出対象である生体分子や試験領域に固定化する捕捉物質などに応じて適宜選択することができる。なお、蛍光シリカナノ粒子の表面に導入する生体分子と競合する物質は、検出対象である生体分子と同種の物質であっても、異種の物質であってもよい。
生体分子と競合する物質は、生体分子と競合して、前記試験領域に標識試薬粒子が結合しうるものであれば特に制限はなく、検出対象である生体分子や試験領域に固定化する捕捉物質などに応じて適宜選択することができる。なお、蛍光シリカナノ粒子の表面に導入する生体分子と競合する物質は、検出対象である生体分子と同種の物質であっても、異種の物質であってもよい。
また、本発明で用いる標識試薬粒子の表面にはキャリア物質が導入されており、前記キャリア物質を介して、検出対象である生体分子と競合する物質が導入されている。このような構成とすることで、蛍光シリカナノ粒子への生体分子と競合する物質の固定化の効率が向上する。さらに、蛍光シリカナノ粒子が試験領域に非特異的に吸着することを抑制し、生体分子の定量結果の精度をさらに向上させることができる。
本発明で用いる標識試薬粒子の作製方法としては、蛍光シリカナノ粒子の表面にキャリア物質を導入し、蛍光シリカナノ粒子の表面に導入したキャリア物質と、検出対象である生体分子と競合する物質とを結合させる方法、キャリア物質と、検出対象である生体分子と競合する物質との複合体を作製し、蛍光シリカナノ粒子の表面に複合体を導入する方法が挙げられる。このうち、本発明で用いる標識試薬粒子は、蛍光シリカナノ粒子の表面にキャリア物質を導入し、蛍光シリカナノ粒子の表面に導入したキャリア物質と、検出対象である生体分子と競合する物質とを結合させる方法で作製することが好ましい。このように作製することで、検出対象である生体分子と競合する物質が、標識試薬粒子の表面に露出し、試験領域に固定化された捕捉物質との反応効率が向上する。
本発明で用いる標識試薬粒子の作製方法としては、蛍光シリカナノ粒子の表面にキャリア物質を導入し、蛍光シリカナノ粒子の表面に導入したキャリア物質と、検出対象である生体分子と競合する物質とを結合させる方法、キャリア物質と、検出対象である生体分子と競合する物質との複合体を作製し、蛍光シリカナノ粒子の表面に複合体を導入する方法が挙げられる。このうち、本発明で用いる標識試薬粒子は、蛍光シリカナノ粒子の表面にキャリア物質を導入し、蛍光シリカナノ粒子の表面に導入したキャリア物質と、検出対象である生体分子と競合する物質とを結合させる方法で作製することが好ましい。このように作製することで、検出対象である生体分子と競合する物質が、標識試薬粒子の表面に露出し、試験領域に固定化された捕捉物質との反応効率が向上する。
前述のように試験片１に参照領域が設けられている場合、参照領域に対する結合性を有するキャリア物質を蛍光シリカナノ粒子の表面に導入することが好ましい。キャリア物質と参照領域に固定化した捕捉物質との結合性により、生体分子との競合により試験領域に結合しなかった標識試薬粒子を参照領域に捕捉することができる。
本発明で用いるキャリア物質に特に制限はないが、水に対して可溶性の、親水性の物質であることが好ましい。キャリア物質を親水性の物質とすることで、標識試薬粒子の疎水部が試験領域に固定化した抗体と非特異的に結合し、標識試薬粒子が試験領域に非特異的に吸着することを防ぐことができる。親水性のキャリア物質として具体的には、タンパク質（例えば、ウシ血清アルブミン（以下、「ＢＳＡ」ともいう）、ポリエチレングリコール、カゼイン、スカシガイヘモシアニン、ヒト血清アルブミン、卵白アルブミン、グロブリン、アビジン、及びストレプトアビジンなど）、アミノ酸、タグペプチド（例えば、Hisタグ、FLAGタグなど）、抗体、核酸、糖鎖が挙げられる。
生体分子と競合する物質をキャリア物質を介して蛍光シリカナノ粒子の表面に導入する方法としては特に制限はなく、常法に従って導入することができる。例えば、静電的引力、ファンデルワールス力、疎水性相互作用等によって、キャリア物質を介して生体分子と競合する物質を蛍光シリカナノ粒子の表面に導入することができる。あるいは、架橋剤や縮合剤の化学結合によって、生体分子と競合する物質をキャリア物質を介して蛍光シリカナノ粒子の表面に導入してもよい。なお、蛍光シリカナノ粒子の表面に生体分子と競合する物質をキャリア物質を介して導入したときに蛍光シリカナノ粒子同士が凝集する場合は、予め交互吸着法によって蛍光シリカナノ粒子の表面に表面処理を施しておいてもよい。
以下、キャリア物質としてＢＳＡを用いて、生体分子と競合する物質をキャリア物質を介して導入した蛍光シリカナノ粒子の調製方法の１例について説明する。しかし、本発明はこれに制限するものではない。
まず、反応性官能基を有するシランカップリング剤を加水分解し、加水分解されたシランカップリング剤と蛍光シリカナノ粒子の表面に存在するヒドロキシル基とを縮重合させ、反応性官能基を蛍光シリカナノ粒子の表面に導入する。
反応性官能基を有するシランカップリング剤の具体例としては、3-メルカプトプロピルトリメトキシシラン、ＭＰＳ、ＡＰＳ、3-チオシアナトプロピルトリエトキシシラン、3-グリシジルオキシプロピルトリエトキシシラン、3-イソチオシアナトプロピルトリエトキシシラン、3-［2-（2-アミノエチルアミノ）エチルアミノ］プロピルトリエトキシシラン、（-クロロプロピルトリメトキシシラン、ビニルメトキシシラン、3-メタクリロキシプロピルメチルジメトキシシラン、3-アクリロキシプロピルトリメトキシシラン、N-フェニル-3-アミノプロピルトリメトキシシラン、3-ウレイドプロピルトリエトキシシラン、ビス（トリエトキシシリルプロピル）テトラスルフィドが挙げられる。
反応性官能基を有するシランカップリング剤の具体例としては、3-メルカプトプロピルトリメトキシシラン、ＭＰＳ、ＡＰＳ、3-チオシアナトプロピルトリエトキシシラン、3-グリシジルオキシプロピルトリエトキシシラン、3-イソチオシアナトプロピルトリエトキシシラン、3-［2-（2-アミノエチルアミノ）エチルアミノ］プロピルトリエトキシシラン、（-クロロプロピルトリメトキシシラン、ビニルメトキシシラン、3-メタクリロキシプロピルメチルジメトキシシラン、3-アクリロキシプロピルトリメトキシシラン、N-フェニル-3-アミノプロピルトリメトキシシラン、3-ウレイドプロピルトリエトキシシラン、ビス（トリエトキシシリルプロピル）テトラスルフィドが挙げられる。
反応性官能基としてはチオール基、アミノ基、カルボキシル基、ハロゲン基、ビニル基、エポキシ基及びイソシアネート基から選ばれる少なくとも１種の反応性官能基が好ましく、チオール基、及びアミノ基又はカルボキシル基がより好ましい。
反応性官能基がチオール基である場合は、蛍光シリカナノ粒子表面におけるチオール基の密度は０．００２〜０．２個／ｎｍ2が好ましく、０．００２〜０．１個／ｎｍ2がより好ましい。当該含色素シリカ粒子の表面に存在するチオール基の量Ｂは、ＤＮＴＢ（5,5'-ジチオビス(2-ニトロ安息香酸)）を試薬として用いて測定することができる。ＤＮＴＢを用いたチオール基の定量法としては、例えば、Archives of Biochemistry and Biophysics, 82, 70(1959)の方法で行うことができる。具体的な方法の一例としては、リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解した１０ｍＭのＤＮＴＢの溶液２０μＬと、２００ｍｇ／ｍＬに調製したシリカ粒子コロイド２．５ｍＬとを混合し、１時間後に４１２ｎｍの吸光度を測定し、標準物質としてγ−メルカプトプロピルトリメトキシシラン（ＭＰＳ）を用いて作成した検量線から粒子表面に存在するチオール基量を定量することができる。
反応性官能基がチオール基である場合は、蛍光シリカナノ粒子表面におけるチオール基の密度は０．００２〜０．２個／ｎｍ2が好ましく、０．００２〜０．１個／ｎｍ2がより好ましい。当該含色素シリカ粒子の表面に存在するチオール基の量Ｂは、ＤＮＴＢ（5,5'-ジチオビス(2-ニトロ安息香酸)）を試薬として用いて測定することができる。ＤＮＴＢを用いたチオール基の定量法としては、例えば、Archives of Biochemistry and Biophysics, 82, 70(1959)の方法で行うことができる。具体的な方法の一例としては、リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解した１０ｍＭのＤＮＴＢの溶液２０μＬと、２００ｍｇ／ｍＬに調製したシリカ粒子コロイド２．５ｍＬとを混合し、１時間後に４１２ｎｍの吸光度を測定し、標準物質としてγ−メルカプトプロピルトリメトキシシラン（ＭＰＳ）を用いて作成した検量線から粒子表面に存在するチオール基量を定量することができる。
蛍光シリカナノ粒子の表面に導入した反応性官能基と、これと化学結合を形成するリンカー分子とを反応させる。そして、リンカー分子とＢＳＡとを結合させ、蛍光シリカナノ粒子とＢＳＡとの複合体を形成する。
反応性官能基がチオール基である場合は、チオール基が導入された蛍光シリカナノ粒子と、マレイミド基及びカルボキシル基を有するリンカー分子とを非プロトン性溶媒中に共存させる。これにより、チオール基とマレイミド基との間でチオエーテル結合を形成させて、リンカー分子が結合した粒子を作製する。続いて、リンカー分子が結合した粒子と、カルボジイミドと、アミノ基を有するＢＳＡとを水系溶媒中に共存させる。これにより、カルボジイミドにより活性エステル化されたリンカー分子のカルボキシル基と、ＢＳＡが有するアミノ基との間でアミド結合を形成させ、蛍光シリカナノ粒子とＢＳＡとの複合体を形成する。
反応性官能基がアミノ基、カルボキシル基、ビニル基、エポキシ基、イソシアネート基である場合も、常法によりＢＳＡと蛍光シリカナノ粒子との複合体を形成することができる。これらの方法は、例えば、特開２００９−２７４９２３号公報、特開２００９−１６２５３７号公報、特開２０１０−１００５４２号公報等の記載を参照することができる。
反応性官能基がチオール基である場合は、チオール基が導入された蛍光シリカナノ粒子と、マレイミド基及びカルボキシル基を有するリンカー分子とを非プロトン性溶媒中に共存させる。これにより、チオール基とマレイミド基との間でチオエーテル結合を形成させて、リンカー分子が結合した粒子を作製する。続いて、リンカー分子が結合した粒子と、カルボジイミドと、アミノ基を有するＢＳＡとを水系溶媒中に共存させる。これにより、カルボジイミドにより活性エステル化されたリンカー分子のカルボキシル基と、ＢＳＡが有するアミノ基との間でアミド結合を形成させ、蛍光シリカナノ粒子とＢＳＡとの複合体を形成する。
反応性官能基がアミノ基、カルボキシル基、ビニル基、エポキシ基、イソシアネート基である場合も、常法によりＢＳＡと蛍光シリカナノ粒子との複合体を形成することができる。これらの方法は、例えば、特開２００９−２７４９２３号公報、特開２００９−１６２５３７号公報、特開２０１０−１００５４２号公報等の記載を参照することができる。
そして、蛍光シリカナノ粒子に結合するＢＳＡと、生体分子と競合する物質とを常法に従って結合させる。例えば、静電的引力、ファンデルワールス力、疎水性相互作用等によって、ＢＳＡと、生体分子と競合する物質とを結合させることができる。あるいは、架橋剤や縮合剤の化学結合により、ＢＳＡと、生体分子と競合する物質とを結合させることができる。なお、ＢＳＡと、生体分子と競合する物質とが直接結合して複合体を形成してもよいし、他の物質を介して間接的にＢＳＡと、生体分子と競合する物質とが結合して複合体を形成していてもよい。
蛍光シリカナノ粒子の表面における生体分子と競合する物質の導入量に特に制限なく、適宜設定することができる。例えば、蛍光シリカナノ粒子の表面１ｎｍ2当たりの生体分子と競合する物質の導入量は、０．０００１個以上０．１個以下が好ましく、０．００１個以上０．０５個以下が好ましい。
蛍光シリカナノ粒子の表面におけるキャリア物質の結合量に特に制限なく、適宜設定することができる。例えば、蛍光シリカナノ粒子１ｇ当たりのキャリア物質の結合量は、１ｍｇ以上２００ｍｇ以下が好ましく、１０ｍｇ以上５０ｍｇ以下が好ましい。
また、前記標識試薬粒子に導入されている生体分子と競合する物質の量は、前記標識試薬粒子に導入されている前記キャリア物質の添加量に対して、モル比で１０以下であることが好ましい。このように生体分子と競合する物質の量を設定することで、試験領域に固定化された抗体に対しての標識試薬粒子の吸着力が強くなりすぎるのを防ぎ、検出対象物質の検出感度が向上する。
また、前記標識試薬粒子に導入されている生体分子と競合する物質の量は、前記標識試薬粒子に導入されている前記キャリア物質の添加量に対して、モル比で１０以下であることが好ましい。このように生体分子と競合する物質の量を設定することで、試験領域に固定化された抗体に対しての標識試薬粒子の吸着力が強くなりすぎるのを防ぎ、検出対象物質の検出感度が向上する。
［生体分子の検出又は定量方法］
以下、前述の試験キットを用いた生体分子の検出又は定量方法について、好ましい実施態様に基づいて説明する。しかし、本発明はこれに制限するものではない。
以下、前述の試験キットを用いた生体分子の検出又は定量方法について、好ましい実施態様に基づいて説明する。しかし、本発明はこれに制限するものではない。
生体分子を含有しうる液体試料と前記構成の標識試薬粒子とをそれぞれ、生体分子検出又は定量用の試験片１のサンプルパッド２に滴下する。液体試料と標識試薬粒子は、互いに別々にサンプルパッド２に滴下してもよいし、液体試料と標識試薬粒子とを混合し、得られた混合物をサンプルパッド２に滴下してもよい。サンプルパッド２に滴下する液体試料の量は、試験片１の構成に合わせて適宜設定することができる。また、サンプルパッド２に滴下する生体分子と標識試薬粒子の量は、試験片１の試験領域における捕捉物質の固定化量に応じて、適宜設定することができる。
そして、毛細管現象によりサンプルパッド２からメンブレン３に移動してきた生体分子と標識試薬粒子が互いに競合して、試験片１の試験領域上に固定された捕捉物質との結合によりそれぞれ濃縮される。そして、試験領域に光を照射し、濃縮された標識試薬粒子の標識（蛍光シリカナノ粒子に含まれる色素の発光強度）を検出する。
ここで、試験領域の発光強度と、試験領域に結合する粒子量の関係性を決定する。そして、決定した発光強度と粒子量との関係性と、実際に測定した試験領域の発光強度から、試験領域に結合した標識試薬粒子量を算出することができる。その結果、間接的に、試料に含まれる生体分子を定性的又は定量的に検出することができる。
ここで、試験領域の発光強度と、試験領域に結合する粒子量の関係性を決定する。そして、決定した発光強度と粒子量との関係性と、実際に測定した試験領域の発光強度から、試験領域に結合した標識試薬粒子量を算出することができる。その結果、間接的に、試料に含まれる生体分子を定性的又は定量的に検出することができる。
蛍光シリカナノ粒子に含まれる色素の発光強度の検出方法に特に制限はなく、目視で検出してもよいし、汎用の蛍光検出器を用いて検出してもよい。
汎用の蛍光検出器は、励起光源及びフィルタからなる。前記励起光源としては水銀ランプ、ハロゲンランプ、キセノンランプ、レーザダイオード、発光ダイオードなどが挙げられる。前記フィルタは、励起光源から特定の波長の光のみを透過するフィルタであり、前記蛍光微粒子の蛍光波長、蛍光波長から適宜選択する。前記蛍光検出器は、蛍光を受光する光電子倍増管又はＣＣＤ検出器を備えていてもよい。これにより目視では確認できない強度ないしは波長の蛍光も検出でき、さらにはその蛍光強度を測定できる。
照射する励起光の波長は特に限定されないが、３００ｎｍ以上が好ましく、４００ｎｍ以上がより好ましく、５００ｎｍ以上が特に好ましい。また、７００ｎｍ以下が好ましく、６００ｎｍ以下がより好ましく、５５０ｎｍ以下が特に好ましい。
蛍光の波長は３５０ｎｍ以上が好ましく、４５０ｎｍ以上がより好ましく、５３０ｎｍ以上が特に好ましい。また、８００ｎｍ以下が好ましく、７５０ｎｍ以下がより好ましく、５８０ｎｍ以下が特に好ましい。これら波長に対応する粒子を用いて測定することで、ＬＥＤ等の直進性の強い光源を用いることもできるため光源を簡素化でき、測定系の構築が技術的にも、コスト的にも容易になる。
汎用の蛍光検出器は、励起光源及びフィルタからなる。前記励起光源としては水銀ランプ、ハロゲンランプ、キセノンランプ、レーザダイオード、発光ダイオードなどが挙げられる。前記フィルタは、励起光源から特定の波長の光のみを透過するフィルタであり、前記蛍光微粒子の蛍光波長、蛍光波長から適宜選択する。前記蛍光検出器は、蛍光を受光する光電子倍増管又はＣＣＤ検出器を備えていてもよい。これにより目視では確認できない強度ないしは波長の蛍光も検出でき、さらにはその蛍光強度を測定できる。
照射する励起光の波長は特に限定されないが、３００ｎｍ以上が好ましく、４００ｎｍ以上がより好ましく、５００ｎｍ以上が特に好ましい。また、７００ｎｍ以下が好ましく、６００ｎｍ以下がより好ましく、５５０ｎｍ以下が特に好ましい。
蛍光の波長は３５０ｎｍ以上が好ましく、４５０ｎｍ以上がより好ましく、５３０ｎｍ以上が特に好ましい。また、８００ｎｍ以下が好ましく、７５０ｎｍ以下がより好ましく、５８０ｎｍ以下が特に好ましい。これら波長に対応する粒子を用いて測定することで、ＬＥＤ等の直進性の強い光源を用いることもできるため光源を簡素化でき、測定系の構築が技術的にも、コスト的にも容易になる。
以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
（実施例１）標識試薬粒子の調製
（１）蛍光シリカナノ粒子の調製
蛍光分子であるカルボキシローダミン６Ｇを含有する蛍光シリカナノ粒子を以下の方法で調製した。
5-（及び-6）-カルボキシローダミン６Ｇ・スクシンイミジルエステル（商品名、emp Biotech GmbＨ社製）３１ｍｇをジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）１０ｍＬに溶解した。これにＡＰＳ（信越シリコーン社製）１２μＬを加え室温（２３℃）で１時間反応を行い、5-（及び-6）-カルボキシローダミン６Ｇ−ＡＰＳ複合体（５ｍＭ）を得た。
（１）蛍光シリカナノ粒子の調製
蛍光分子であるカルボキシローダミン６Ｇを含有する蛍光シリカナノ粒子を以下の方法で調製した。
5-（及び-6）-カルボキシローダミン６Ｇ・スクシンイミジルエステル（商品名、emp Biotech GmbＨ社製）３１ｍｇをジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）１０ｍＬに溶解した。これにＡＰＳ（信越シリコーン社製）１２μＬを加え室温（２３℃）で１時間反応を行い、5-（及び-6）-カルボキシローダミン６Ｇ−ＡＰＳ複合体（５ｍＭ）を得た。
得られた5-（及び-6）-カルボキシローダミン６Ｇ−ＡＰＳ複合体の溶液６００μＬと、エタノール１４０ｍＬ、ＴＥＯＳ（信越シリコーン社製）６．５ｍＬ、蒸留水２０ｍＬ及び２８質量％アンモニア水１５ｍＬを混合し、室温で２４時間反応を行った。
反応終了後１８０００×ｇの重力加速度で３０分間遠心分離を行い、上清を除去した。沈殿した粒子に蒸留水４ｍＬを加え粒子を分散させ、再度１８０００×ｇの重力加速度で３０分間遠心分離を行った。本洗浄操作をさらに２回繰り返し、分散液に含まれる未反応のＴＥＯＳやアンモニア等を除去した。
反応終了後１８０００×ｇの重力加速度で３０分間遠心分離を行い、上清を除去した。沈殿した粒子に蒸留水４ｍＬを加え粒子を分散させ、再度１８０００×ｇの重力加速度で３０分間遠心分離を行った。本洗浄操作をさらに２回繰り返し、分散液に含まれる未反応のＴＥＯＳやアンモニア等を除去した。
その結果、平均粒径２７１ｎｍの蛍光分子を含有する蛍光シリカナノ粒子１．６５ｇを得た（収率約９４％）。
（２）蛍光シリカナノ粒子へのチオール基の導入
上記で得た蛍光シリカナノ粒子１ｇを水／エタノール＝１／４の混合液１５０ｍＬに分散させた。これにＭＰＳ（和光純薬社製）１．５ｍＬを加えた。続いて２８％アンモニア水２０ｍＬを加え、室温で４時間混合した。
上記で得た蛍光シリカナノ粒子１ｇを水／エタノール＝１／４の混合液１５０ｍＬに分散させた。これにＭＰＳ（和光純薬社製）１．５ｍＬを加えた。続いて２８％アンモニア水２０ｍＬを加え、室温で４時間混合した。
反応終了後１８０００×ｇの重力加速度で３０分間遠心分離を行い、上清を除去した。沈殿した蛍光シリカナノ粒子に蒸留水１０ｍＬを加え蛍光シリカナノ粒子を分散させ、再度１８０００×ｇの重力加速度で３０分間遠心分離を行った。本洗浄操作をさらに２回繰り返し、分散液に含まれる未反応のＭＰＳやアンモニア等を除去した。その結果、チオール基が導入された蛍光シリカナノ粒子（以下、「チオール基導入蛍光シリカナノ粒子Ａ」と呼ぶ。）を得た。
得られたチオール基導入蛍光シリカナノ粒子Ａ ５００ｍｇについて、ＤＮＴＢを用いて導入されたチオール基の定量分析を行った。その結果、チオール基導入蛍光シリカナノ粒子Ａの粒子表面のチオール基の密度は、０．０４６個／ｎｍ2であった。
得られたチオール基導入蛍光シリカナノ粒子Ａ ５００ｍｇについて、ＤＮＴＢを用いて導入されたチオール基の定量分析を行った。その結果、チオール基導入蛍光シリカナノ粒子Ａの粒子表面のチオール基の密度は、０．０４６個／ｎｍ2であった。
（３）チオール基導入蛍光シリカナノ粒子ＡとＢＳＡとの結合
以下の方法により、チオール基を介して、前記チオール基導入蛍光シリカナノ粒子ＡにＢＳＡをキャリア物質として結合させた。
チオール基導入蛍光シリカナノ粒子Ａの分散液（濃度２５ｍｇ／ｍＬ、分散媒：蒸留水）８０μＬにＤＭＦ４２０μＬを加え、１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離した。上清を除去し、ＤＭＦを５００μＬ加え遠心分離し、上清を除去した。再度ＤＭＦ５００μＬを加えチオール基導入蛍光シリカナノ粒子Ａを分散させた。これにリンカー分子として3-マレイミド安息香酸１ｍｇを加え３０分混合した。このようにして、前記リンカー分子のマレイミド基とチオール基導入蛍光シリカナノ粒子Ａのチオール基との間でチオエーテル結合を形成させた。
以下の方法により、チオール基を介して、前記チオール基導入蛍光シリカナノ粒子ＡにＢＳＡをキャリア物質として結合させた。
チオール基導入蛍光シリカナノ粒子Ａの分散液（濃度２５ｍｇ／ｍＬ、分散媒：蒸留水）８０μＬにＤＭＦ４２０μＬを加え、１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離した。上清を除去し、ＤＭＦを５００μＬ加え遠心分離し、上清を除去した。再度ＤＭＦ５００μＬを加えチオール基導入蛍光シリカナノ粒子Ａを分散させた。これにリンカー分子として3-マレイミド安息香酸１ｍｇを加え３０分混合した。このようにして、前記リンカー分子のマレイミド基とチオール基導入蛍光シリカナノ粒子Ａのチオール基との間でチオエーテル結合を形成させた。
この反応液を１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離した。上清を除去後、蒸留水８８．６μＬを加え粒子を分散させた。続いて、０．５Ｍ ＭＥＳ（2-モルホリノエタンスルホン酸)（ｐＨ６．０）１００μＬ、５０ｍｇ／ｍＬ ＮＨＳ（N-ヒドロキシスクシンイミド）２３０．４μＬ、１９．２ｍｇ／ｍＬ ＥＤＣ（1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）７５μＬを加え混合した。これにキャリア物質としてＢＳＡ（１０ｍｇ／ｍＬ、Sigma Aldrich社製）を６．０μＬ加え、６０分間混合した。
１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離し、上清を除去した。これに１０ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4（ｐＨ７．５）４００μＬを加え、粒子を分散させた。続いて１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離し、上清を除去した。再度１０ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4（ｐＨ７．５）４００μＬを加え、粒子を分散させてコロイドを得た。
１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離し、上清を除去した。これに１０ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4（ｐＨ７．５）４００μＬを加え、粒子を分散させた。続いて１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離し、上清を除去した。再度１０ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4（ｐＨ７．５）４００μＬを加え、粒子を分散させてコロイドを得た。
得られたコロイド２００μＬをサンプルとして、チオール基導入蛍光シリカナノ粒子Ａに結合したＢＳＡの定量を行った。ＢＳＡの定量は、PierceBCA Protein Assay Kit（商品名、Thermo Fisher Scientific社製）を用いた。
その結果、チオール基導入蛍光シリカナノ粒子Ａ１ｇあたりのＢＳＡの結合量は、１４．６ｍｇであった。
その結果、チオール基導入蛍光シリカナノ粒子Ａ１ｇあたりのＢＳＡの結合量は、１４．６ｍｇであった。
（４）ＢＳＡを介したチオール基導入蛍光シリカナノ粒子Ａとプロゲステロンとの結合
以下の方法により、ＢＳＡを介して、前記チオール基導入蛍光シリカナノ粒子Ａにプロゲステロンを生体分子と競合する物質として結合させた。
ＢＳＡ定量後に残ったコロイド２００μＬを１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離し、上清を除去した。これに１０ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4（ｐＨ７．５）５００μＬを加え、粒子を分散させた。分散液を１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離し、上清を除去した。続いて蒸留水を７４．６μＬ加え粒子を分散させた。さらに０．５Ｍ ＭＥＳ（ｐＨ６．０）１００μＬ、５０ｍｇ／ｍＬ ＮＨＳ２３０．４μＬ、１９．２ｍｇ／ｍＬ ＥＤＣ７５μＬを加え、よく混合した。
これにプロゲステロン−１１α−ヘミコハク酸エステル（０．０５ｍｇ／ｍＬ）２０μＬを加え、６０分間混合した。
以下の方法により、ＢＳＡを介して、前記チオール基導入蛍光シリカナノ粒子Ａにプロゲステロンを生体分子と競合する物質として結合させた。
ＢＳＡ定量後に残ったコロイド２００μＬを１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離し、上清を除去した。これに１０ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4（ｐＨ７．５）５００μＬを加え、粒子を分散させた。分散液を１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離し、上清を除去した。続いて蒸留水を７４．６μＬ加え粒子を分散させた。さらに０．５Ｍ ＭＥＳ（ｐＨ６．０）１００μＬ、５０ｍｇ／ｍＬ ＮＨＳ２３０．４μＬ、１９．２ｍｇ／ｍＬ ＥＤＣ７５μＬを加え、よく混合した。
これにプロゲステロン−１１α−ヘミコハク酸エステル（０．０５ｍｇ／ｍＬ）２０μＬを加え、６０分間混合した。
反応液を１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離し、上清を回収した。上清を回収した後の粒子の沈降物に１０ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4（ｐＨ７．５）４００μＬを加え、粒子を分散させた。続いて１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離し、上清を除去した。続いて１０ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4（ｐＨ７．５）４００μＬを加え粒子を分散させて、ＢＳＡを介してプロゲステロンが結合した蛍光シリカナノ粒子のコロイドを得た。
回収した上清液に含まれるプロゲステロンをELISA法により定量測定した結果、初期濃度からの減少分が０．１３μｇであった。すなわち、０．１３μｇのプロゲステロンが前記蛍光シリカナノ粒子に結合したことが分かった。これをチオール基導入蛍光シリカナノ粒子Ａ １ｎｍ2当たりで計算すると、プロゲステロンの結合量は１ｎｍ2あたり０．０１７個であった。
回収した上清液に含まれるプロゲステロンをELISA法により定量測定した結果、初期濃度からの減少分が０．１３μｇであった。すなわち、０．１３μｇのプロゲステロンが前記蛍光シリカナノ粒子に結合したことが分かった。これをチオール基導入蛍光シリカナノ粒子Ａ １ｎｍ2当たりで計算すると、プロゲステロンの結合量は１ｎｍ2あたり０．０１７個であった。
定容積膨張法で、得られた蛍光シリカナノ粒子の、水（４℃）に対する比重を測定した。その結果、得られた蛍光シリカナノ粒子の比重は１．６であった。
（調製例１）生体分子検出又は定量用テストストリップの作製
生体分子検出又は定量用テストストリップを以下の方法で作製した。
メンブレン３（丈２５ｍｍ、商品名：Hi-Flow Plus180 メンブレン、MILLIPORE社製）の端から約８ｍｍの位置に、幅約１ｍｍの試験領域（テストライン）２０として、ウサギ由来の抗プロゲステロンポリクローナル抗体（Sigma Aldrich社製）を１ｍｇ／ｍＬ含有する溶液（（５０ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4、ｐＨ７．０）＋５％スクロース）を０．７５μＬ／ｃｍの塗布量で塗布した。
また、幅約１ｍｍの参照領域（コントロールライン）２１として、ウサギ由来の抗ＢＳＡポリクローナル抗体（ミリポア社製）を１ｍｇ／ｍＬ含有する溶液（（５０ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4、ｐＨ７．０）シュガー・フリー）を０．７５μＬ／ｃｍの塗布量で塗布した。
その後、５０℃で３０分乾燥させ、メンブレン３を作製した。なお、テストライン２０とコントロールライン２１との間隔は５ｍｍとした。
生体分子検出又は定量用テストストリップを以下の方法で作製した。
メンブレン３（丈２５ｍｍ、商品名：Hi-Flow Plus180 メンブレン、MILLIPORE社製）の端から約８ｍｍの位置に、幅約１ｍｍの試験領域（テストライン）２０として、ウサギ由来の抗プロゲステロンポリクローナル抗体（Sigma Aldrich社製）を１ｍｇ／ｍＬ含有する溶液（（５０ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4、ｐＨ７．０）＋５％スクロース）を０．７５μＬ／ｃｍの塗布量で塗布した。
また、幅約１ｍｍの参照領域（コントロールライン）２１として、ウサギ由来の抗ＢＳＡポリクローナル抗体（ミリポア社製）を１ｍｇ／ｍＬ含有する溶液（（５０ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4、ｐＨ７．０）シュガー・フリー）を０．７５μＬ／ｃｍの塗布量で塗布した。
その後、５０℃で３０分乾燥させ、メンブレン３を作製した。なお、テストライン２０とコントロールライン２１との間隔は５ｍｍとした。
前記メンブレン３、サンプルパッド（Glass Fiber Conjugate Pad（ＧＦＣＰ）、MILLIPORE社製）２、及び吸収パッド（Cellulose Fiber Sample Pad（ＣＦＳＰ）、MILLIPORE社製）４の順で、バッキングシート（商品名：AR9020、Adhesives Research社製）６上で組み立てた。なお、メンブレン３は、テストラインがサンプルパッド２側、コントロールラインが吸収パッド４側に位置するように配置した。
続いて、５ｍｍ幅、長さ６０ｍｍのストリップ状に切断し、生体分子検出又は定量用テストストリップ１を作製した。
続いて、５ｍｍ幅、長さ６０ｍｍのストリップ状に切断し、生体分子検出又は定量用テストストリップ１を作製した。
（実施例２）プロゲステロンの定量
表１に示す濃度で、プロゲステロン（Sigma Aldrich社製）の溶液を調製した。
続いて、プロゲステロン溶液１００μＬと、前記調製例１で作製した蛍光シリカナノ粒子のコロイド（２．５ｍｇ／ｍＬ）２μＬを混合し、混合液をテストストリップ１のサンプルパッド２に滴下した。
１５分後、下記検出装置を用いて、テストラインの発光強度（Ｔ）とコントロールラインの発光強度（Ｃ）を数値化した。
その結果を表１に示す。
表１に示す濃度で、プロゲステロン（Sigma Aldrich社製）の溶液を調製した。
続いて、プロゲステロン溶液１００μＬと、前記調製例１で作製した蛍光シリカナノ粒子のコロイド（２．５ｍｇ／ｍＬ）２μＬを混合し、混合液をテストストリップ１のサンプルパッド２に滴下した。
１５分後、下記検出装置を用いて、テストラインの発光強度（Ｔ）とコントロールラインの発光強度（Ｃ）を数値化した。
その結果を表１に示す。
＜検出装置＞
光源と光学フィルタと光電子倍増管（ＰＭＴ）からなる検出ユニットを有し、該検出ユニットが、モーターによって一定速度で直線移動する機構を備え、ＰＭＴの受光強度を５０μ秒ごとに記録する記録機構を備えた検出装置を作製した。なお、検出ユニットは、光源が５３２ｎｍのレーザダイオードであり、レーザダイオードをサンプルに照射し、反射光を５５０ｎｍ以上の波長の光のみを透過する光学フィルタを透過させた後にＰＭＴで受光する機構を有する。
光源と光学フィルタと光電子倍増管（ＰＭＴ）からなる検出ユニットを有し、該検出ユニットが、モーターによって一定速度で直線移動する機構を備え、ＰＭＴの受光強度を５０μ秒ごとに記録する記録機構を備えた検出装置を作製した。なお、検出ユニットは、光源が５３２ｎｍのレーザダイオードであり、レーザダイオードをサンプルに照射し、反射光を５５０ｎｍ以上の波長の光のみを透過する光学フィルタを透過させた後にＰＭＴで受光する機構を有する。
表１の結果を、後述する定量範囲計算法にしたがって定量可能範囲を算出した。その結果、定量可能範囲は０．５〜９７．５ｎｇ／ｍＬであった。これは、低濃度領域（〜１０ｎｇ／ｍＬ）で定量可能であるだけではなく、検出対象を定量できる濃度範囲が非常に広い（１００〜９９９倍）ことが示された。
（定量範囲の算出方法）
測定感度の性能を示す指標として、IC50（inhibitory concentration：50%阻害濃度）と定量範囲がある。IC50とはサンプル液中の対象物質（阻害剤）が粒子とテストラインの抗体との反応の半分を阻害するにはどれだけの濃度が必要かを示す指標である。一方定量範囲とは、サンプル液中の対象物質濃度が測定可能な範囲を示す。
それぞれの値は、IC50の前後の濃度の蛍光強度測定結果を用いて、以下のように算出する。定量範囲の算出方法を模式的に示す図を図３に示す。
（１）テストライン蛍光強度の最大値と最小値から、IC50となる場合のテストライン強度（最大値と最小値の平均）を算出する。
（２）前記（１）で算出した、IC50となる場合のテストライン強度の前後2点（A、B）を通る直線式を求める。
（３）IC50付近は直線式で近似できるため、前記（１）で算出したテストライン強度を前記（２）で算出した直線式に代入し、IC50の濃度を算出する。
（４）最大値×０．８、最小値×１．２、のテストライン強度を算出する。
（５）前記（４）で算出したテストライン強度を、それぞれ前記（２）で算出した直線式に代入し、最大値ｘ０．８のテストライン強度に対応する濃度を定量範囲の下限、最小値ｘ１．２のテストライン強度に対応する濃度を定量範囲の下限とする。
ここで、図３に示すグラフの縦軸の「相対値」とは、検出対象物質の濃度が０ｎｇ／ｍＬの場合の蛍光強度測定値を１００％としたときの蛍光強度測定値を示す。
測定感度の性能を示す指標として、IC50（inhibitory concentration：50%阻害濃度）と定量範囲がある。IC50とはサンプル液中の対象物質（阻害剤）が粒子とテストラインの抗体との反応の半分を阻害するにはどれだけの濃度が必要かを示す指標である。一方定量範囲とは、サンプル液中の対象物質濃度が測定可能な範囲を示す。
それぞれの値は、IC50の前後の濃度の蛍光強度測定結果を用いて、以下のように算出する。定量範囲の算出方法を模式的に示す図を図３に示す。
（１）テストライン蛍光強度の最大値と最小値から、IC50となる場合のテストライン強度（最大値と最小値の平均）を算出する。
（２）前記（１）で算出した、IC50となる場合のテストライン強度の前後2点（A、B）を通る直線式を求める。
（３）IC50付近は直線式で近似できるため、前記（１）で算出したテストライン強度を前記（２）で算出した直線式に代入し、IC50の濃度を算出する。
（４）最大値×０．８、最小値×１．２、のテストライン強度を算出する。
（５）前記（４）で算出したテストライン強度を、それぞれ前記（２）で算出した直線式に代入し、最大値ｘ０．８のテストライン強度に対応する濃度を定量範囲の下限、最小値ｘ１．２のテストライン強度に対応する濃度を定量範囲の下限とする。
ここで、図３に示すグラフの縦軸の「相対値」とは、検出対象物質の濃度が０ｎｇ／ｍＬの場合の蛍光強度測定値を１００％としたときの蛍光強度測定値を示す。
（比較例１）BSAを修飾せずに直接プロゲステロンを添加した粒子の調製方法
以下の方法により、チオール基を介して、前記チオール基導入蛍光シリカナノ粒子Ａにプロゲステロンを結合させた。
チオール基導入蛍光シリカナノ粒子Ａの分散液（濃度２５ｍｇ／ｍＬ、分散媒：蒸留水）８０μＬにＤＭＦ４２０μＬを加え、１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離した。上清を除去し、ＤＭＦを５００μＬ加え遠心分離し、上清を除去した。再度ＤＭＦ５００μＬを加えチオール基導入蛍光シリカナノ粒子Ａを分散させた。これにリンカー分子としてＮ−（４−アミノフェニル）マレイミド１ｍｇを加え３０分混合した。このようにして、前記リンカー分子のマレイミド基とチオール基導入蛍光シリカナノ粒子Ａのチオール基との間でチオエーテル結合を形成させた。
以下の方法により、チオール基を介して、前記チオール基導入蛍光シリカナノ粒子Ａにプロゲステロンを結合させた。
チオール基導入蛍光シリカナノ粒子Ａの分散液（濃度２５ｍｇ／ｍＬ、分散媒：蒸留水）８０μＬにＤＭＦ４２０μＬを加え、１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離した。上清を除去し、ＤＭＦを５００μＬ加え遠心分離し、上清を除去した。再度ＤＭＦ５００μＬを加えチオール基導入蛍光シリカナノ粒子Ａを分散させた。これにリンカー分子としてＮ−（４−アミノフェニル）マレイミド１ｍｇを加え３０分混合した。このようにして、前記リンカー分子のマレイミド基とチオール基導入蛍光シリカナノ粒子Ａのチオール基との間でチオエーテル結合を形成させた。
この反応液を１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離した。上清を除去後、蒸留水８８．６μＬを加え粒子を分散させた。続いて、０．５Ｍ ＭＥＳ（ｐＨ６．０）１００μＬ、５０ｍｇ／ｍＬ ＮＨＳ２３０．４μＬ、１９．２ｍｇ／ｍＬ ＥＤＣ７５μＬを加え混合した。
これにプロゲステロン−１１α−ヘミコハク酸エステル（０．０５ｍｇ／ｍＬ）２０μＬを加え、６０分間混合した。
これにプロゲステロン−１１α−ヘミコハク酸エステル（０．０５ｍｇ／ｍＬ）２０μＬを加え、６０分間混合した。
反応液を１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離し、上清を回収した。上清を回収した後の粒子の沈降物に１０ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4（ｐＨ７．５）４００μＬを加え、粒子を分散させた。続いて１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離し、上清を除去した。続いて１０ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4（ｐＨ７．５）４００μＬを加え粒子を分散させて、ＢＳＡを介さずにプロゲステロンが結合した蛍光シリカナノ粒子のコロイドを得た。
回収した上清液に含まれるプロゲステロンをELISA法により定量測定した結果、初期濃度からの減少分が０．０２４μｇであった。すなわち、０．０２４μｇのプロゲステロンが前記蛍光シリカナノ粒子に結合したことが分かった。これをチオール基導入蛍光シリカナノ粒子Ａ １ｎｍ2当たりで計算すると、プロゲステロンの結合量は１ｎｍ2あたり０．００３２個であった。
回収した上清液に含まれるプロゲステロンをELISA法により定量測定した結果、初期濃度からの減少分が０．０２４μｇであった。すなわち、０．０２４μｇのプロゲステロンが前記蛍光シリカナノ粒子に結合したことが分かった。これをチオール基導入蛍光シリカナノ粒子Ａ １ｎｍ2当たりで計算すると、プロゲステロンの結合量は１ｎｍ2あたり０．００３２個であった。
（試験例１）
BSA0.1%、Tween20 1%、EDTA 5mM、NaN3 0.1%を10mMリン酸バッファ(pH7.5)に溶解させ、フロー液を調製した。このフロー液８０μＬと、実施例１の粒子又は比較例の粒子（２．５ｍｇ／ｍL）０．６μLとを混合し、調製例１で作製したテストストリップ１のサンプルパット２に混合液全量を滴下した。滴下から１５分後に、テストライン２０の蛍光強度を測定した。
その結果を表２に示す。
BSA0.1%、Tween20 1%、EDTA 5mM、NaN3 0.1%を10mMリン酸バッファ(pH7.5)に溶解させ、フロー液を調製した。このフロー液８０μＬと、実施例１の粒子又は比較例の粒子（２．５ｍｇ／ｍL）０．６μLとを混合し、調製例１で作製したテストストリップ１のサンプルパット２に混合液全量を滴下した。滴下から１５分後に、テストライン２０の蛍光強度を測定した。
その結果を表２に示す。
表２に示すように、比較例の粒子は、実施例１の粒子の場合と比較して発光強度が低かった。これは、テストライン２１上に粒子が特異的に結合していないことが推察される。
以上のように本発明で作製した粒子は比較例で作製した粒子に比べて、テストストリップの試験領域への標識試薬粒子の結合効率が高いことが分かる。
以上のように本発明で作製した粒子は比較例で作製した粒子に比べて、テストストリップの試験領域への標識試薬粒子の結合効率が高いことが分かる。
（試験例２）
実施例１において、蛍光シリカナノ粒子に対するプロゲステロンの添加量を調整し、プロゲステロンの結合量が蛍光シリカナノ粒子に結合させたＢＳＡのモル数に対してモル比で12.5、10、5、0.5、0.2となるよう、実施例１と同様の方法で標識試薬粒子を作製した。
このように作製した標識試薬粒子を用いて、実施例２と同様に試験を実施し、テストラインの発光強度（Ｔ）を算出した。その結果を表３に示す。
実施例１において、蛍光シリカナノ粒子に対するプロゲステロンの添加量を調整し、プロゲステロンの結合量が蛍光シリカナノ粒子に結合させたＢＳＡのモル数に対してモル比で12.5、10、5、0.5、0.2となるよう、実施例１と同様の方法で標識試薬粒子を作製した。
このように作製した標識試薬粒子を用いて、実施例２と同様に試験を実施し、テストラインの発光強度（Ｔ）を算出した。その結果を表３に示す。
表３の結果を、前述の定量範囲計算法にしたがって定量可能範囲を算出した。その結果を表４に示す。
表４からわかるように、標識試薬粒子調製の際のBSAに対してプロゲステロン添加量が多いほど定量範囲が高濃度側にシフトする。また、標識試薬粒子調製の際のBSAに対するプロゲステロン添加量が多いほど定量範囲が狭くなることが分かった。標識試薬粒子調製の際のBSAに対するプロゲステロンの添加量が多いほど、試験領域に対する粒子の結合性が高くなり、サンプル液に含まれるプロゲステロンによる阻害が起きにくくなって低濃度側が測定しがたくなるためである。なお、定量範囲3桁を維持するには、標識試薬粒子調製の際のBSAに対するプロゲステロン添加量を10以下にすることが好ましい。
（比較例２）プロゲステロンを修飾した着色ラテックス粒子の調製
（１）着色ラテックス粒子ＡとＢＳＡとの結合
粒子表面にカルボキシル基が導入された、粒径１６０ｎｍの着色ラテックス粒子（商品名：DC02B/5641，Bangs Laboratories社製）の分散液（濃度３．２ｍｇ／ｍＬ、分散媒：蒸留水）１ｍＬを１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離した。上清を除去後、蒸留水８８．６μＬを加え粒子を分散させた。続いて、０．５Ｍ ＭＥＳ（ｐＨ６．０）１００μＬ、５０ｍｇ／ｍＬ ＮＨＳ２３０．４μＬ、１９．２ｍｇ／ｍＬ ＥＤＣ７５μＬを加え混合した。
これにキャリア物質としてＢＳＡ（１０ｍｇ／ｍＬ、Sigma Aldrich社製）を６．０μＬ加え、６０分間混合した。
（１）着色ラテックス粒子ＡとＢＳＡとの結合
粒子表面にカルボキシル基が導入された、粒径１６０ｎｍの着色ラテックス粒子（商品名：DC02B/5641，Bangs Laboratories社製）の分散液（濃度３．２ｍｇ／ｍＬ、分散媒：蒸留水）１ｍＬを１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離した。上清を除去後、蒸留水８８．６μＬを加え粒子を分散させた。続いて、０．５Ｍ ＭＥＳ（ｐＨ６．０）１００μＬ、５０ｍｇ／ｍＬ ＮＨＳ２３０．４μＬ、１９．２ｍｇ／ｍＬ ＥＤＣ７５μＬを加え混合した。
これにキャリア物質としてＢＳＡ（１０ｍｇ／ｍＬ、Sigma Aldrich社製）を６．０μＬ加え、６０分間混合した。
反応液を１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離し、上清を除去した。これに１０ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4（ｐＨ７．５）４００μＬを加え、粒子を分散させた。続いて１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離し、上清を除去した。再度１０ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4（ｐＨ７．５）４００μＬを加え、粒子を分散させてコロイドを得た。
得られたコロイド２００μＬをサンプルとして、着色ラテックス粒子に結合したＢＳＡの定量を行った。ＢＳＡの定量は、PierceBCA Protein Assay Kit（商品名、Thermo Fisher Scientific社製）を用いた。
その結果、着色ラテックス粒子１ｇあたりのＢＳＡの結合量は、２８．２ｍｇであった。これは１ｎｍ2あたり０．００６９個に相当する。
その結果、着色ラテックス粒子１ｇあたりのＢＳＡの結合量は、２８．２ｍｇであった。これは１ｎｍ2あたり０．００６９個に相当する。
（２）ＢＳＡを介した着色ラテックス粒子とプロゲステロンとの結合
以下の方法により、ＢＳＡを介して、前記着色ラテックス粒子にプロゲステロンを生体分子と競合する物質として結合させた。
ＢＳＡ定量後に残ったコロイド２００μＬを１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離し、上清を除去した。これに１０ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4（ｐＨ７．５）５００μＬを加え、粒子を分散させた。分散液を１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離し、上清を除去した。続いて蒸留水を７４．６μＬ加え粒子を分散させた。さらに０．５Ｍ ＭＥＳ（ｐＨ６．０）１００μＬ、５０ｍｇ／ｍＬ ＮＨＳ２３０．４μＬ、１９．２ｍｇ／ｍＬ ＥＤＣ７５μＬを加え、よく混合した。
これにプロゲステロン−１１α−ヘミコハク酸エステル（０．０５ｍｇ／ｍＬ）５０μＬを加え、６０分間混合した。
以下の方法により、ＢＳＡを介して、前記着色ラテックス粒子にプロゲステロンを生体分子と競合する物質として結合させた。
ＢＳＡ定量後に残ったコロイド２００μＬを１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離し、上清を除去した。これに１０ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4（ｐＨ７．５）５００μＬを加え、粒子を分散させた。分散液を１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離し、上清を除去した。続いて蒸留水を７４．６μＬ加え粒子を分散させた。さらに０．５Ｍ ＭＥＳ（ｐＨ６．０）１００μＬ、５０ｍｇ／ｍＬ ＮＨＳ２３０．４μＬ、１９．２ｍｇ／ｍＬ ＥＤＣ７５μＬを加え、よく混合した。
これにプロゲステロン−１１α−ヘミコハク酸エステル（０．０５ｍｇ／ｍＬ）５０μＬを加え、６０分間混合した。
反応液を１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離し、上清を回収した。上清を回収した後の粒子の沈降物に１０ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4（ｐＨ７．５）４００μＬを加え、粒子を分散させた。続いて１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離し、上清を除去した。続いて１０ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4（ｐＨ７．５）４００μＬを加え粒子を分散させて、ＢＳＡを介してプロゲステロンが結合した着色ラテックス粒子のコロイドを得た。
実施例１と同様の方法で着色ラテックス粒子に結合したプロゲステロンの量を求めた結果、粒子１ｇあたり、０．６７ｍｇの結合量であった。これは１ｎｍ2あたり０．０３４個に相当する。したがって、BSA結合量に対し、分子数で５倍量のプロゲステロンが結合していることが分かった。
実施例１と同様の方法で着色ラテックス粒子に結合したプロゲステロンの量を求めた結果、粒子１ｇあたり、０．６７ｍｇの結合量であった。これは１ｎｍ2あたり０．０３４個に相当する。したがって、BSA結合量に対し、分子数で５倍量のプロゲステロンが結合していることが分かった。
定容積膨張法で、得られた着色ラテックス粒子の、水（４℃）に対する比重を測定した。その結果、得られた着色ラテックス粒子の比重は１．０であった。
（比較例３）プロゲステロンを修飾した金コロイドの調製
（１）金コロイドの調製
粒径４０ｎｍの金ナノ粒子のコロイド（British BioCell International社製）２２ｍＬに、キャリア物質としてＢＳＡ（１０ｍｇ／ｍＬ、Sigma Aldrich社製）を６．０μＬ加え、６０分間混合した。
（１）金コロイドの調製
粒径４０ｎｍの金ナノ粒子のコロイド（British BioCell International社製）２２ｍＬに、キャリア物質としてＢＳＡ（１０ｍｇ／ｍＬ、Sigma Aldrich社製）を６．０μＬ加え、６０分間混合した。
反応液を１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離し、上清を除去した。これに１０ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4（ｐＨ７．５）４００μＬを加え、粒子を分散させた。続いて１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離し、上清を除去した。再度１０ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4（ｐＨ７．５）４００μＬを加え、粒子を分散させて金コロイドを得た。
（２）ＢＳＡを介した金コロイドとプロゲステロンとの結合
以下の方法により、ＢＳＡを介して、前記金コロイドにプロゲステロンを生体分子と競合する物質として結合させた。
金コロイド（１ｍｇ／ｍＬ）９００μＬにBSA（１ｍｇ／ｍＬ）１００μＬを加え、１時間４℃で静置した。続いて反応液を１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離し、上清を分離した。上清液に含まれるBSAの濃度から粒子に結合したBSAの量を評価した結果、粒子１ｇあたり５．９ｍｇであった。これは１ｎｍ2あたり０．００６９個に相当する。
上清を分離した後の粒子に、１０ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4（ｐＨ７．５）５００μＬを加え、粒子を分散させた。分散液を１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離し、上清を除去した。続いて蒸留水を７４．６μＬ加え粒子を分散させた。さらに０．５Ｍ ＭＥＳ（ｐＨ６．０）１００μＬ、５０ｍｇ／ｍＬ ＮＨＳ２３０．４μＬ、１９．２ｍｇ／ｍＬ ＥＤＣ７５μＬを加え、よく混合した。
これにプロゲステロン−１１α−ヘミコハク酸エステル（０．０１ｍｇ／ｍＬ）５０μＬを加え、６０分間混合した。
以下の方法により、ＢＳＡを介して、前記金コロイドにプロゲステロンを生体分子と競合する物質として結合させた。
金コロイド（１ｍｇ／ｍＬ）９００μＬにBSA（１ｍｇ／ｍＬ）１００μＬを加え、１時間４℃で静置した。続いて反応液を１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離し、上清を分離した。上清液に含まれるBSAの濃度から粒子に結合したBSAの量を評価した結果、粒子１ｇあたり５．９ｍｇであった。これは１ｎｍ2あたり０．００６９個に相当する。
上清を分離した後の粒子に、１０ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4（ｐＨ７．５）５００μＬを加え、粒子を分散させた。分散液を１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離し、上清を除去した。続いて蒸留水を７４．６μＬ加え粒子を分散させた。さらに０．５Ｍ ＭＥＳ（ｐＨ６．０）１００μＬ、５０ｍｇ／ｍＬ ＮＨＳ２３０．４μＬ、１９．２ｍｇ／ｍＬ ＥＤＣ７５μＬを加え、よく混合した。
これにプロゲステロン−１１α−ヘミコハク酸エステル（０．０１ｍｇ／ｍＬ）５０μＬを加え、６０分間混合した。
反応液を１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離し、上清を回収した。上清を回収した後の粒子の沈降物に１０ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4（ｐＨ７．５）４００μＬを加え、粒子を分散させた。続いて１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離し、上清を除去した。続いて１０ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4（ｐＨ７．５）４００μＬを加え粒子を分散させて、ＢＳＡを介してプロゲステロンが結合した金ナノ粒子のコロイドを得た。
実施例１と同様の方法で金ナノ粒子に結合したプロゲステロンの量を求めた結果、粒子１ｇあたり０．１４ｍｇであった。これは１ｎｍ2あたり０．０３４個に相当する。したがって、BSA結合量に対し、分子数で５倍量のプロゲステロンが結合していることが分かった。
実施例１と同様の方法で金ナノ粒子に結合したプロゲステロンの量を求めた結果、粒子１ｇあたり０．１４ｍｇであった。これは１ｎｍ2あたり０．０３４個に相当する。したがって、BSA結合量に対し、分子数で５倍量のプロゲステロンが結合していることが分かった。
（試験例３）
0ｎｇ／ｍＬ、0.1ｎｇ／ｍＬ、0.5ｎｇ／ｍＬ、1ｎｇ／ｍＬ、2.5ｎｇ／ｍＬ、10ｎｇ／ｍＬ、50ｎｇ／ｍＬ、200ｎｇ／ｍＬ、500ｎｇ／ｍＬ、又は1000ｎｇ／ｍＬの濃度で、プロゲステロン（Sigma Aldrich社製）の溶液を調製した。
続いて、前記プロゲステロン溶液１００μＬと、比較例２で作製した着色ラテックス粒子とを混合し、混合液を調製例１で作製したテストストリップ１に滴下した。その後、実施例２と同様に、定量可能範囲を算出した。なお、ライン発色の数値化はDiaScan（大塚電子製）を用いて行った。
さらに、比較例２で作製した着色ラテックス粒子に代えて、比較例３で作製した金コロイドを用いた以外は同様に、定量可能範囲を算出した。
これらの結果を表５に示す。
0ｎｇ／ｍＬ、0.1ｎｇ／ｍＬ、0.5ｎｇ／ｍＬ、1ｎｇ／ｍＬ、2.5ｎｇ／ｍＬ、10ｎｇ／ｍＬ、50ｎｇ／ｍＬ、200ｎｇ／ｍＬ、500ｎｇ／ｍＬ、又は1000ｎｇ／ｍＬの濃度で、プロゲステロン（Sigma Aldrich社製）の溶液を調製した。
続いて、前記プロゲステロン溶液１００μＬと、比較例２で作製した着色ラテックス粒子とを混合し、混合液を調製例１で作製したテストストリップ１に滴下した。その後、実施例２と同様に、定量可能範囲を算出した。なお、ライン発色の数値化はDiaScan（大塚電子製）を用いて行った。
さらに、比較例２で作製した着色ラテックス粒子に代えて、比較例３で作製した金コロイドを用いた以外は同様に、定量可能範囲を算出した。
これらの結果を表５に示す。
表４と表５との比較から分かるように、粒子に対するBSAの結合量とプロゲステロンの結合量のモル比が５である標識粒子で比較すると、蛍光シリカ粒子を用いた場合、比重の低いラテックス粒子や、粒径が小さい金コロイドを用いた場合に比べて明らかに定量範囲が広い。そのため、比較例２で作製した着色ラテックス、比較例３で作製した金コロイドを用いた場合と比べ、蛍光シリカ粒子を用いた本発明では定量範囲が優位に広く定量評価に適しているといえる。
（試験例４）
実施例１で作製した、BSAに対するプロゲステロンの結合量のモル比が５である標識試薬粒子を調製例１で作製したテストストリップ１のサンプルパット２に滴下し、テストライン２０の蛍光強度の時間変化を測定した。実施例１で作製した標識粒子に代えて、比較例２で作製した着色ラテックス粒子、比較例３で作製した金ナノ粒子、又は蛍光色素で標識したプロゲステロンを用いて、同様に試験を実施しテストライン２０の蛍光強度の時間変化を測定した。
各試験とも滴下後１時間以降ではテストライン強度が一定であった。また、１時間後のテストライン２０の蛍光強度を１００としたときに５０のテストライン２０の蛍光強度が得られる時間は表６の結果となった。
実施例１で作製した、BSAに対するプロゲステロンの結合量のモル比が５である標識試薬粒子を調製例１で作製したテストストリップ１のサンプルパット２に滴下し、テストライン２０の蛍光強度の時間変化を測定した。実施例１で作製した標識粒子に代えて、比較例２で作製した着色ラテックス粒子、比較例３で作製した金ナノ粒子、又は蛍光色素で標識したプロゲステロンを用いて、同様に試験を実施しテストライン２０の蛍光強度の時間変化を測定した。
各試験とも滴下後１時間以降ではテストライン強度が一定であった。また、１時間後のテストライン２０の蛍光強度を１００としたときに５０のテストライン２０の蛍光強度が得られる時間は表６の結果となった。
表６に示すように、本発明の標識試薬粒子は蛍光標識したプロゲステロンに比べて、テストライン２０の蛍光強度が５０になるのに時間がかかり、メンブレンを移動する速度が遅いことが分かる。したがって、本発明の標識試薬粒子を用いた競合法イムノクロマトでは、プロゲステロンなどの低分子は標識粒子より早くテストラインに到達するといえる。これによって、検体中のプロゲステロンなどの低分子はテストライン上で効率よく抗原抗体反応することが可能となり、その結果、感度が向上する。
また、本発明の標識試薬粒子は比重の小さいラテックス粒子や粒径の小さい金ナノ粒子に比べてもテストライン２０の蛍光強度が５０になる時間が遅く、メンブレンを移動する速度が遅いことが分かる。このことから、シリカナノ粒子はラテックス粒子や金ナノ粒子に比べてプロゲステロンなどの低分子とメンブレンを移動する速度の差がより大きくなり、競合法によるイムノクロマト試験に好適といえる。
また、本発明の標識試薬粒子は比重の小さいラテックス粒子や粒径の小さい金ナノ粒子に比べてもテストライン２０の蛍光強度が５０になる時間が遅く、メンブレンを移動する速度が遅いことが分かる。このことから、シリカナノ粒子はラテックス粒子や金ナノ粒子に比べてプロゲステロンなどの低分子とメンブレンを移動する速度の差がより大きくなり、競合法によるイムノクロマト試験に好適といえる。
１ テストストリップ
２ サンプルパッド
３ メンブレン
４ 吸収パッド
６ バッキングシート
１０ 試験領域
２０ 試験領域
２１ 参照領域
２ サンプルパッド
３ メンブレン
４ 吸収パッド
６ バッキングシート
１０ 試験領域
２０ 試験領域
２１ 参照領域
Claims (27)
- 生体分子検出又は定量用試験キットを用いた、生体分子の検出又は定量方法であって、
前記生体分子検出又は定量用試験キットは、生体分子検出又は定量用の試験片と、生体分子検出又は定量用の標識試薬粒子を有し、
前記試験片は、生体分子と標識試薬粒子を捕捉する試験領域を有し、
前記標識試薬粒子が蛍光シリカナノ粒子からなり、
前記標識試薬粒子の表面にキャリア物質が導入されており、
検出対象である生体分子と競合する物質が、標識試薬粒子の表面に導入されており、
前記標識試薬粒子の比重が、前記試験片に滴下する生体分子を含む試料よりも大きく、
生体分子を含む試料と前記標識試薬粒子を加えた前記試験片の前記試験領域の発光強度に基づいて、前記試料に含まれる生体分子を検出又は定量する、生体分子の検出又は定量方法。 - 前記キャリア物質が、ウシ血清アルブミン、ポリエチレングリコール、カゼイン、スカシガイヘモシアニン、ヒト血清アルブミン、卵白アルブミン、グロブリン、アビジン、及びストレプトアビジンからなる群より選ばれる少なくとも１種の物質である、請求項１に記載の方法。
- 前記標識試薬粒子の平均粒径が１００ｎｍ以上５００ｎｍ以下である、請求項１又は２に記載の方法。
- 前記キャリア物質が親水性である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
- 前記標識試薬粒子に導入されている生体分子と競合する物質の量が、前記蛍光シリカナノ粒子の表面１ｎｍ2当たり０．０００１個以上０．１個以下である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
- 前記キャリア物質が、チオール基と結合できる反応性官能基、及びカルボキシル基又はアミノ基と結合できる反応性官能基を有する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法
。 - 前記キャリア物質が、チオールと結合できる反応性官能基としてマレイミド基を有し、カルボキシル基又はアミノ基と結合できる反応性官能基としてアミノ基、カルボキシル基又は活性エステル基を有する、請求項６に記載の方法。
- 前記キャリア物質が、ウシ血清アルブミン又はポリエチレングリコールである、請求項６又は７に記載の方法。
- 前記標識試薬粒子における生体分子と競合する物質の導入量が、前記標識試薬粒子における前記キャリア物質の導入量に対して、モル比で１０以下である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
- 水（４℃）に対する前記標識試薬粒子の比重が１．３以上２．２以下である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
- 検出対象である生体分子を含む前記試料が全血である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
- 検出対象である前記生体分子がステロイド系ホルモン又は性ホルモンである、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
- 生体分子を含む前記試料と前記標識試薬粒子とを混合し、得られた混合物を前記試験片に滴下する、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
- 前記試験片がラテラルフロー用の試験片である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
- 競合法による生体分子の検出又は定量方法に用いられる標識試薬粒子であって、
前記標識試薬粒子が蛍光シリカナノ粒子からなり、
前記標識試薬粒子の表面にキャリア物質が導入されており、
検出対象である生体分子と競合する物質が、前記キャリア物質を介して標識試薬粒子の表面に導入されており、
前記生体分子を含む試料よりも比重が大きい、標識試薬粒子。 - 前記キャリア物質が、ウシ血清アルブミン、ポリエチレングリコール、カゼイン、スカシガイヘモシアニン、ヒト血清アルブミン、卵白アルブミン、グロブリン、アビジン、及びストレプトアビジンからなる群より選ばれる少なくとも１種の物質である、請求項１５に記載の標識試薬粒子。
- 前記標識試薬粒子の平均粒径が１００ｎｍ以上５００ｎｍ以下である、請求項１５又は１６に記載の標識試薬粒子。
- 前記キャリア物質が親水性である、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の標識試薬粒子。
- 前記標識試薬粒子に導入されている生体分子と競合する物質の量が、前記蛍光シリカナノ粒子の表面１ｎｍ2当たり０．０００１個以上０．１個以下である、請求項１５〜１８のいずれか１項に記載の標識試薬粒子。
- 前記キャリア物質が、チオール基と結合できる反応性官能基、及びカルボキシル基又はアミノ基と結合できる反応性官能基を有する、請求項１５〜１９のいずれか１項に記載の標識試薬粒子。
- 前記キャリア物質が、チオールと結合できる反応性官能基としてマレイミド基を有し、カルボキシル基又はアミノ基と結合できる反応性官能基としてアミノ基、カルボキシル基又は活性エステル基を有する、請求項２０に記載の標識試薬粒子。
- 前記キャリア物質が、ウシ血清アルブミン又はポリエチレングリコールである、請求項２０又は２１に記載の標識試薬粒子。
- 前記標識試薬粒子における生体分子と競合する物質の導入量が、前記標識試薬粒子における前記キャリア物質の導入量に対して、モル比で１０以下である、請求項１５〜２２のいずれか１項に記載の標識試薬粒子。
- 水（４℃）に対する前記標識試薬粒子の比重が１．３以上２．２以下である、請求項１５〜２３のいずれか１項に記載の標識試薬粒子。
- 検出対象である前記生体分子がステロイド系ホルモン又は性ホルモンである、請求項１５〜２４のいずれか１項に記載の標識試薬粒子。
- 前記蛍光シリカナノ粒子の表面に前記キャリア物質を導入し、蛍光シリカナノ粒子の表面に導入したキャリア物質と、検出対象である生体分子と競合する物質とを結合させて作製した、請求項１５〜２５のいずれか１項に記載の標識試薬粒子。
- 請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法に用いられる、請求項１５〜２６のいずれか１項に記載の標識試薬粒子。
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