JP2018151201A - 生体分子検出用試験キット、生体分子検出装置、及びこれらを用いた生体分子の検出方法、並びにこれらに用いられる生体分子検出用標識試薬粒子 - Google Patents
生体分子検出用試験キット、生体分子検出装置、及びこれらを用いた生体分子の検出方法、並びにこれらに用いられる生体分子検出用標識試薬粒子 Download PDFInfo
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Abstract
【課題】励起波長と重なり合う波長領域のみを透過させるフィルタを設けない発光検出装置にも適用可能な生体分子検出用試験キットを提供する。
【解決手段】生体分子検出用の試験片と、一般式（１）で表される燐光色素を含有するシリカナノ粒子からなる生体分子検出用の標識試薬粒子を有する生体分子検出用試験キットであって、試験片は、生体分子を捕捉する試験領域を設けた、標識試薬粒子が移行するメンブレンを含んでなり、標的物質とする生体分子を捕捉した標識試薬粒子が試験領域に固定化され、生体分子に対する結合性を有する捕捉物質が燐光色素含有シリカナノ粒子の表面に導入されている、生体分子検出用試験キット。Ｘ―Ｙ−Ｑ−Ｚ−Ｓｉ（Ｒ１）ｎ（ＯＲ２）（３−ｎ）一般式（１）
【選択図】図１
【解決手段】生体分子検出用の試験片と、一般式（１）で表される燐光色素を含有するシリカナノ粒子からなる生体分子検出用の標識試薬粒子を有する生体分子検出用試験キットであって、試験片は、生体分子を捕捉する試験領域を設けた、標識試薬粒子が移行するメンブレンを含んでなり、標的物質とする生体分子を捕捉した標識試薬粒子が試験領域に固定化され、生体分子に対する結合性を有する捕捉物質が燐光色素含有シリカナノ粒子の表面に導入されている、生体分子検出用試験キット。Ｘ―Ｙ−Ｑ−Ｚ−Ｓｉ（Ｒ１）ｎ（ＯＲ２）（３−ｎ）一般式（１）
【選択図】図１
Description
本発明は、生体分子検出用試験キット、生体分子検出装置、及びこれらを用いた生体分子の検出方法、並びにこれらに用いられる生体分子検出用標識試薬粒子に関する。
生体中の抗原などの生体分子を検出する手法として、生体分子を捕捉する捕捉物質を担体に固定化させた多孔質の試験片と、生体分子を捕捉する標識試薬を用いた検出法がある。この方法では、検体液に含まれる生体分子を標識粒子に捕捉させ、多孔質支持体を毛細管現象により移動させる。そして、多孔質支持体に例えばライン状に固定された捕捉物質と生体分子とを接触させることによって、前記生体分子を濃縮し、捕捉物質が固定されたラインを標識試薬により発色させる。この発色によって生体分子の有無を判定することができる。
かかる生体分子の検出法の特徴として下記の３点が挙げられる。
（１）判定までに要する時間が短く迅速な検査が可能である。
（２）検体を滴下するだけで測定でき操作が簡便である。
（３）特別な検出装置を必要とせず判定が容易である。
これらの特徴を利用して、前記の検出法は妊娠検査薬やインフルエンザ検査薬に用いられており、新たなＰＯＣＴ（Point Of Care Testing）の手法として利用されている。また、食品検査においても、例えば食物アレルゲンの検査試薬等として広く利用され益々注目を集めている。
かかる生体分子の検出法の特徴として下記の３点が挙げられる。
（１）判定までに要する時間が短く迅速な検査が可能である。
（２）検体を滴下するだけで測定でき操作が簡便である。
（３）特別な検出装置を必要とせず判定が容易である。
これらの特徴を利用して、前記の検出法は妊娠検査薬やインフルエンザ検査薬に用いられており、新たなＰＯＣＴ（Point Of Care Testing）の手法として利用されている。また、食品検査においても、例えば食物アレルゲンの検査試薬等として広く利用され益々注目を集めている。
一方で、近年、数ｎｍ〜１μｍ程度の微粒子が様々な分野に応用され、注目を集めている。例えば、吸着剤、触媒などに用いられる多孔質シリカ粒子や、樹脂の補強剤に使われるシリカ粒子など、上記微粒子の材質および用途は多岐にわたる。また、蛍光色素を含むシリカナノ粒子等は、特にバイオテクノロジーの分野において、新たな標識用粒子としての応用が期待されている。高濃度の色素を含むシリカナノ粒子もまた、高いモル吸光係数を有することから、より高感度な標識用粒子としての応用が期待されている。
上記標識用粒子は、特定の標的分子との結合能を有する生体分子（タンパク質や核酸等）をその表面に結合させることで、標的分子の検出、定量、染色等に利用可能な標識試薬として利用することができる（例えば、特許文献１及び２参照）。これらの技術により、従来の生体物質や生体細胞、あるいは金コロイド粒子を試薬に用いたものと比べ、安価かつ格段に安定した測定及び検出を可能とした。また、検出感度の向上や定量化といった要望にもより的確に応えることができ、イムノクロマトグラフィーの利用領域の拡大に大いに資するものである。
さらに上記検体の検出装置についても、本出願人は様々な技術を開発している（例えば、特許文献３及び４等参照）。
上記標識用粒子は、特定の標的分子との結合能を有する生体分子（タンパク質や核酸等）をその表面に結合させることで、標的分子の検出、定量、染色等に利用可能な標識試薬として利用することができる（例えば、特許文献１及び２参照）。これらの技術により、従来の生体物質や生体細胞、あるいは金コロイド粒子を試薬に用いたものと比べ、安価かつ格段に安定した測定及び検出を可能とした。また、検出感度の向上や定量化といった要望にもより的確に応えることができ、イムノクロマトグラフィーの利用領域の拡大に大いに資するものである。
さらに上記検体の検出装置についても、本出願人は様々な技術を開発している（例えば、特許文献３及び４等参照）。
ニューバイオケミストリー分野では、現在特定遺伝子解析、遺伝子治療、テーラーメイド医療を目的とした研究が盛んに行われている。この分野では有機蛍光試薬を用いる研究が殆どであり蛍光色素が存在しなければ、ＤＮＡ解析や抗体を含むタンパク質を用いた解析技術は完成しなかったと言われている。これらの分野で主に使用されている既存の蛍光試薬として、シアニン骨格を有するCy-dyeやローダミン骨格を有するAlexa Fluorなどの有機蛍光色素が多く用いられている。
また、有機蛍光色素の他に蛍光ナノ粒子が存在している。蛍光ナノ粒子としてQuantum Dotsなどが広く知られており、比較的安定性も高く、強い蛍光や単一の励起光による多波長蛍光、色調のバリエーションが豊富である。しかし、セレンやカドミウムなどの毒性元素を含んでいるため、安全性に問題を抱えている。
これに代わる新たな技術として無害な有機蛍光色素を含むシリカ粒子（以下、蛍光色素含有シリカ粒子という）の開発が行われている（例えば、特許文献５）。この蛍光色素含有シリカ粒子は、シリカの中に有機蛍光色素を多数含有させる事が可能なため蛍光が強いなどの特徴がある。一方、蛍光色素に比べ高い量子効率の期待できる燐光色素を含むシリカ粒子については検討されていない。
これに代わる新たな技術として無害な有機蛍光色素を含むシリカ粒子（以下、蛍光色素含有シリカ粒子という）の開発が行われている（例えば、特許文献５）。この蛍光色素含有シリカ粒子は、シリカの中に有機蛍光色素を多数含有させる事が可能なため蛍光が強いなどの特徴がある。一方、蛍光色素に比べ高い量子効率の期待できる燐光色素を含むシリカ粒子については検討されていない。
特許文献１及び２に記載されている蛍光色素含有シリカナノ粒子からなる標識試薬粒子を用いることで、高感度及び高精度で生体分子を検出することができる。
特許文献１及び２に記載されている標識試薬粒子は、図９に示すように、標識試薬粒子に照射する励起光の波長領域と、標識試薬粒子から発せられる発光領域とが、一部重なり合う。よって、発光を検出するには、特許文献３及び４に記載されているように、励起波長と重なり合う波長領域のみを透過させるフィルタを発光検出装置に設ける必要がある。しかしこのようなフィルタは高価であるため、低コストで生体分子の検出システムを提供するには発光検出装置のフィルタを不要とする生体分子の検出方法の開発が望まれる。また、発光検出装置のフィルタが不要な生体分子の検出方法は、検出キットのコンパクト化の観点からも望ましい。
しかし、特許文献１及び２に記載されているような従来の標識試薬粒子を用いる生体分子の検出方法において、励起波長と重なり合う波長領域のみを透過させるフィルタを設けない発光検出装置を用いて発光を検出しても、蛍光強度など、発光によるバックグランド値が上昇するため、ごく微量の生体分子を検出する十分な精度の確保が困難となる。
特許文献１及び２に記載されている標識試薬粒子は、図９に示すように、標識試薬粒子に照射する励起光の波長領域と、標識試薬粒子から発せられる発光領域とが、一部重なり合う。よって、発光を検出するには、特許文献３及び４に記載されているように、励起波長と重なり合う波長領域のみを透過させるフィルタを発光検出装置に設ける必要がある。しかしこのようなフィルタは高価であるため、低コストで生体分子の検出システムを提供するには発光検出装置のフィルタを不要とする生体分子の検出方法の開発が望まれる。また、発光検出装置のフィルタが不要な生体分子の検出方法は、検出キットのコンパクト化の観点からも望ましい。
しかし、特許文献１及び２に記載されているような従来の標識試薬粒子を用いる生体分子の検出方法において、励起波長と重なり合う波長領域のみを透過させるフィルタを設けない発光検出装置を用いて発光を検出しても、蛍光強度など、発光によるバックグランド値が上昇するため、ごく微量の生体分子を検出する十分な精度の確保が困難となる。
一方、有機燐光色素を含むシリカナノ粒子（以下、「燐光色素含有シリカナノ粒子」という）は、蛍光色素含有シリカ粒子を使用の際に必要となる高価なフィルタが不要となり、自家蛍光などのバックグラウンドの影響を受けない利点が存在する。また、蛍光色素含有シリカナノ粒子は励起させ続けなければ蛍光として確認ができないが、燐光色素含有シリカ粒子は、一旦励起させれば燐光を目視で確認することができる。
しかしながら、有機燐光色素は、室温での発光効率が非常に低く、発光が簡便に検出されるものはほとんど知られていない。さらには、高価なフィルタを省略できる燐光色素含有シリカナノ粒子の作製は困難であった
しかしながら、有機燐光色素は、室温での発光効率が非常に低く、発光が簡便に検出されるものはほとんど知られていない。さらには、高価なフィルタを省略できる燐光色素含有シリカナノ粒子の作製は困難であった
そこで本発明は、標識試薬粒子から発せられる発光領域が照射励起光の波長領域と重なり合わず、高価なフィルタを設けない発光検出装置にも適用可能な生体分子検出用標識試薬を提供することを課題とする。
また、本発明は、励起波長と重なり合う波長領域のみを透過させるフィルタを設けない発光検出装置にも適用可能な生体分子検出用試験キットを提供することを課題とする。
また、本発明は、フィルタを設けずに標識試薬粒子からの発光を検出して生体分子を検出できる、簡素で安価な検出装置を提供することを課題とする。
さらに、本発明は、前記生体分子検出用試験キット及び検出装置を用いた生体分子の検出方法を提供することを課題とする。
また、本発明は、励起波長と重なり合う波長領域のみを透過させるフィルタを設けない発光検出装置にも適用可能な生体分子検出用試験キットを提供することを課題とする。
また、本発明は、フィルタを設けずに標識試薬粒子からの発光を検出して生体分子を検出できる、簡素で安価な検出装置を提供することを課題とする。
さらに、本発明は、前記生体分子検出用試験キット及び検出装置を用いた生体分子の検出方法を提供することを課題とする。
本発明者は上記課題に鑑み鋭意検討を行った。具体的には、アルコキシシリル基を含有し、図１に示すような励起波長領域と発光波長とが互いに重なり合わない色素を用いた生体分子の検出可能性を検討した。その結果、励起光のノイズをカットし燐光を検出する高価なフィルタを発光検出装置に設けなくても、生体分子の検出が可能となることを見い出した。
本発明はこれらの知見に基づき完成されるに至ったものである。
本発明はこれらの知見に基づき完成されるに至ったものである。
本発明の上記課題は、下記の手段により解決された。
（１）生体分子検出用の試験片と、下記一般式（１）で表される燐光色素を含有するシリカナノ粒子からなる生体分子検出用の標識試薬粒子を有する生体分子検出用試験キットであって、
前記試験片は、生体分子を捕捉する試験領域を設けた、前記標識試薬粒子が移行するメンブレンを含んでなり、標的物質とする生体分子を捕捉した標識試薬粒子が前記試験領域に固定化され、
生体分子に対する結合性を有する捕捉物質が前記燐光色素含有シリカナノ粒子の表面に導入されている、生体分子検出用試験キット。
（１）生体分子検出用の試験片と、下記一般式（１）で表される燐光色素を含有するシリカナノ粒子からなる生体分子検出用の標識試薬粒子を有する生体分子検出用試験キットであって、
前記試験片は、生体分子を捕捉する試験領域を設けた、前記標識試薬粒子が移行するメンブレンを含んでなり、標的物質とする生体分子を捕捉した標識試薬粒子が前記試験領域に固定化され、
生体分子に対する結合性を有する捕捉物質が前記燐光色素含有シリカナノ粒子の表面に導入されている、生体分子検出用試験キット。
Ｘ―Ｙ−Ｑ−Ｚ−Ｓｉ（Ｒ１）ｎ（ＯＲ２）（３−ｎ） 一般式（１）
（一般式（１）において、Ｘは有機燐光色素を示し、Ｙは単結合、−（ＣＨ２）ｐ−、又は−（Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２）ｑ−を示す。ここで、ｐ及びｑはそれぞれ１〜１０の整数である。Ｑはアミド結合、エーテル結合、チオエーテル結合、チオエステル結合、チオウレア結合、ジスルフィド結合、又はポリオキシエチレン結合であり、Ｚは−（ＣＨ２）３−又は−（ＣＨ２）２ＮＨ（ＣＨ２）３−を示す。Ｒ１及びＲ２はそれぞれ炭素原子数が１〜４のアルキル基を示し、ｎは０又は１である。）
（２）前記燐光色素含有シリカナノ粒子が、紫外線を吸収して可視光領域側の燐光を発する紫外励起燐光色素をシリカ粒子中に含有する紫外励起燐光粒子である、前記（１）項に記載のキット。
（３）前記紫外励起燐光色素の発光寿命が10マイクロ秒以上100ミリ秒以下である、前記（２）項に記載のキット。
（４）前記紫外励起燐光色素の励起波長が２３０ｎｍ〜３５０ｎｍの範囲にあり、前記紫外励起燐光粒子の燐光発光ピークが４５０〜６００ｎｍの間にある、前記（２）又は（３）項に記載のキット。
（５）前記燐光色素含有シリカナノ粒子の平均粒径が６０ｎｍ以上３００ｎｍ以下である、前記（１）〜（４）のいずれか１項に記載の試験キット。
（６）前記メンブレンに、標的物質とする生体分子を捕捉していない標識試薬粒子が固定化される参照領域をさらに設けた、前記（１）〜（５）のいずれか１項に記載の試験キット。
（３）前記紫外励起燐光色素の発光寿命が10マイクロ秒以上100ミリ秒以下である、前記（２）項に記載のキット。
（４）前記紫外励起燐光色素の励起波長が２３０ｎｍ〜３５０ｎｍの範囲にあり、前記紫外励起燐光粒子の燐光発光ピークが４５０〜６００ｎｍの間にある、前記（２）又は（３）項に記載のキット。
（５）前記燐光色素含有シリカナノ粒子の平均粒径が６０ｎｍ以上３００ｎｍ以下である、前記（１）〜（４）のいずれか１項に記載の試験キット。
（６）前記メンブレンに、標的物質とする生体分子を捕捉していない標識試薬粒子が固定化される参照領域をさらに設けた、前記（１）〜（５）のいずれか１項に記載の試験キット。
（７）生体分子検出用試験キットを用いた生体分子の検出方法であって、
前記生体分子検出用試験キットは、生体分子検出用の試験片と、前記一般式（１）で表される燐光色素含有シリカナノ粒子からなる生体分子検出用の標識試薬粒子を有し、
前記試験片は、生体分子を捕捉する試験領域設けた、前記標識試薬粒子が移行するメンブレンを含んでなり、標的物質とする生体分子を捕捉した標識試薬粒子が前記試験領域に固定化され、
生体分子に対する結合性を有する捕捉物質が前記燐光色素含有シリカナノ粒子の表面に導入されている、
生体分子の検出方法。
（８）前記燐光色素含有シリカナノ粒子が、紫外線を吸収して可視光領域側の燐光を発する紫外励起燐光色素をシリカ粒子中に含有する紫外励起燐光粒子である、前記（７）項に記載の生体分子の検出方法。
（９）前記紫外励起燐光色素の発光寿命が10マイクロ秒以上100ミリ秒以下である前記（８）項に記載の生体分子の検出方法。
（１０）前記紫外励起燐光色素の励起波長が２３０ｎｍ〜３５０ｎｍの範囲にあり、前記紫外励起燐光粒子の燐光発光ピークが４５０〜６００ｎｍの間にある、前記（８）又は（９）項に記載の生体分子の検出方法。
（１１）前記燐光色素含有シリカナノ粒子の平均粒径が６０ｎｍ以上３００ｎｍ以下である、前記（７）〜（１０）のいずれか１項に記載の生体分子の検出方法。
（１２）前記燐光色素含有シリカナノ粒子への励起光の照射停止後、100ミリ秒経過前に燐光の測定を開始する、前記（７）〜（１１）のいずれか１項に記載の生体分子の検出方法。
（１３）前記燐光色素含有シリカナノ粒子への励起光の照射停止後、10マイクロ秒以上経過後100ミリ秒経過前に燐光の測定を開始する、前記（７）〜（１２）のいずれか１項に記載の生体分子の検出方法。
（１４）前記燐光色素含有シリカナノ粒子への励起光の照射停止後、前記燐光色素含有シリカナノ粒子の燐光発光持続時間内で燐光を測定する、前記（７）〜（１３）のいずれか１項に記載の生体分子の検出方法。
（１５）前記メンブレンに、標的物質とする生体分子を捕捉していない標識試薬粒子が固定化される参照領域をさらに設けた、前記（７）〜（１４）のいずれか１項に記載の生体分子の検出方法。
前記生体分子検出用試験キットは、生体分子検出用の試験片と、前記一般式（１）で表される燐光色素含有シリカナノ粒子からなる生体分子検出用の標識試薬粒子を有し、
前記試験片は、生体分子を捕捉する試験領域設けた、前記標識試薬粒子が移行するメンブレンを含んでなり、標的物質とする生体分子を捕捉した標識試薬粒子が前記試験領域に固定化され、
生体分子に対する結合性を有する捕捉物質が前記燐光色素含有シリカナノ粒子の表面に導入されている、
生体分子の検出方法。
（８）前記燐光色素含有シリカナノ粒子が、紫外線を吸収して可視光領域側の燐光を発する紫外励起燐光色素をシリカ粒子中に含有する紫外励起燐光粒子である、前記（７）項に記載の生体分子の検出方法。
（９）前記紫外励起燐光色素の発光寿命が10マイクロ秒以上100ミリ秒以下である前記（８）項に記載の生体分子の検出方法。
（１０）前記紫外励起燐光色素の励起波長が２３０ｎｍ〜３５０ｎｍの範囲にあり、前記紫外励起燐光粒子の燐光発光ピークが４５０〜６００ｎｍの間にある、前記（８）又は（９）項に記載の生体分子の検出方法。
（１１）前記燐光色素含有シリカナノ粒子の平均粒径が６０ｎｍ以上３００ｎｍ以下である、前記（７）〜（１０）のいずれか１項に記載の生体分子の検出方法。
（１２）前記燐光色素含有シリカナノ粒子への励起光の照射停止後、100ミリ秒経過前に燐光の測定を開始する、前記（７）〜（１１）のいずれか１項に記載の生体分子の検出方法。
（１３）前記燐光色素含有シリカナノ粒子への励起光の照射停止後、10マイクロ秒以上経過後100ミリ秒経過前に燐光の測定を開始する、前記（７）〜（１２）のいずれか１項に記載の生体分子の検出方法。
（１４）前記燐光色素含有シリカナノ粒子への励起光の照射停止後、前記燐光色素含有シリカナノ粒子の燐光発光持続時間内で燐光を測定する、前記（７）〜（１３）のいずれか１項に記載の生体分子の検出方法。
（１５）前記メンブレンに、標的物質とする生体分子を捕捉していない標識試薬粒子が固定化される参照領域をさらに設けた、前記（７）〜（１４）のいずれか１項に記載の生体分子の検出方法。
（１６）前記一般式（１）で表される燐光色素含有シリカナノ粒子からなる、生体分子検出用標識試薬。
（１７）前記燐光色素含有シリカナノ粒子が、紫外線を吸収して可視光領域側の燐光を発する紫外励起燐光色素をシリカ粒子中に含有する紫外励起燐光粒子である、前記（１６）項に記載の生体分子検出用標識試薬。
（１８）前記紫外励起燐光色素の発光寿命が10マイクロ秒以上100ミリ秒以下である、前記（１７）項に記載の生体分子検出用標識試薬。
（１９）前記紫外励起燐光色素の励起波長が２３０ｎｍ〜３５０ｎｍの範囲にあり、前記紫外励起燐光粒子の燐光発光ピークが４５０〜６００ｎｍの間にある、前記（１７）又は（１８）項に記載の生体分子検出用標識試薬。
（２０）前記燐光色素含有シリカナノ粒子の平均粒径が６０ｎｍ以上３００ｎｍ以下である、前記（１６）〜（１９）のいずれか１項に記載の生体分子検出用標識試薬。
（１７）前記燐光色素含有シリカナノ粒子が、紫外線を吸収して可視光領域側の燐光を発する紫外励起燐光色素をシリカ粒子中に含有する紫外励起燐光粒子である、前記（１６）項に記載の生体分子検出用標識試薬。
（１８）前記紫外励起燐光色素の発光寿命が10マイクロ秒以上100ミリ秒以下である、前記（１７）項に記載の生体分子検出用標識試薬。
（１９）前記紫外励起燐光色素の励起波長が２３０ｎｍ〜３５０ｎｍの範囲にあり、前記紫外励起燐光粒子の燐光発光ピークが４５０〜６００ｎｍの間にある、前記（１７）又は（１８）項に記載の生体分子検出用標識試薬。
（２０）前記燐光色素含有シリカナノ粒子の平均粒径が６０ｎｍ以上３００ｎｍ以下である、前記（１６）〜（１９）のいずれか１項に記載の生体分子検出用標識試薬。
（２１）生体分子検出用の試験片を設置する試験片設置部、
設置された試験片に光を照射するための光照射源、
前記試験片からの光を集光する集光部、及び
集光された光を検出する検出部、を有する生体分子検出装置であって、
前記集光部は、検出する生体分子を捕捉した、前記一般式（１）で表される燐光色素含有シリカナノ粒子からなる生体分子検出用の標識試薬粒子が濃縮された前記試験片の部位からの光を集光するものであり、
前記集光部は、前記標識試薬粒子に照射する励起光と波長領域が重なり合わない波長領域の光を透過させるフィルタを介さずに集光する、生体分子検出装置。
（２２）前記検出部と連動し、検出部と光照射源のon/off、又はon/off時間を制御することを特徴とする、前記（２１）項に記載の生体分子検出装置。
（２３）前記光照射源をoffにした後の10μ秒〜100m秒間で、前記標識試薬粒子の標識を測定する、前記（２１）又は（２２）項に記載の生体分子検出装置。
（２４）前記燐光色素含有シリカナノ粒子の平均粒径が６０ｎｍ以上３００ｎｍ以下である、前記（２１）〜（２３）のいずれか１項に記載の生体分子検出装置。
（２５）前記（２１）〜（２４）のいずれか１項に記載の生体分子検出装置を用いた、生体分子の検出方法。
設置された試験片に光を照射するための光照射源、
前記試験片からの光を集光する集光部、及び
集光された光を検出する検出部、を有する生体分子検出装置であって、
前記集光部は、検出する生体分子を捕捉した、前記一般式（１）で表される燐光色素含有シリカナノ粒子からなる生体分子検出用の標識試薬粒子が濃縮された前記試験片の部位からの光を集光するものであり、
前記集光部は、前記標識試薬粒子に照射する励起光と波長領域が重なり合わない波長領域の光を透過させるフィルタを介さずに集光する、生体分子検出装置。
（２２）前記検出部と連動し、検出部と光照射源のon/off、又はon/off時間を制御することを特徴とする、前記（２１）項に記載の生体分子検出装置。
（２３）前記光照射源をoffにした後の10μ秒〜100m秒間で、前記標識試薬粒子の標識を測定する、前記（２１）又は（２２）項に記載の生体分子検出装置。
（２４）前記燐光色素含有シリカナノ粒子の平均粒径が６０ｎｍ以上３００ｎｍ以下である、前記（２１）〜（２３）のいずれか１項に記載の生体分子検出装置。
（２５）前記（２１）〜（２４）のいずれか１項に記載の生体分子検出装置を用いた、生体分子の検出方法。
本発明の生体分子検出用試験キットは、励起波長と重なり合う波長領域のみを透過させるフィルタを設けない発光検出装置にも適用することができる。
また、本発明の生体分子の検出方法は、励起波長と重なり合う波長領域のみを透過させるフィルタを設けない発光検出装置を用いても生体分子を検出することができる。
また、本発明の燐光色素シリカナノ粒子からなる生体分子検出用標識試薬は、前記方法に好適に用いることができる。
さらに本発明の検出装置は、フィルタを設けずに標識試薬粒子からの発光を検出して生体分子を検出することができる。さらに本発明の検出装置はフィルタを設けないので、装置のコンパクト化及び低コスト化を実現できる。
また、本発明の生体分子の検出方法は、励起波長と重なり合う波長領域のみを透過させるフィルタを設けない発光検出装置を用いても生体分子を検出することができる。
また、本発明の燐光色素シリカナノ粒子からなる生体分子検出用標識試薬は、前記方法に好適に用いることができる。
さらに本発明の検出装置は、フィルタを設けずに標識試薬粒子からの発光を検出して生体分子を検出することができる。さらに本発明の検出装置はフィルタを設けないので、装置のコンパクト化及び低コスト化を実現できる。
本明細書において「物質」とは、化合物又は化学合成された分子の他、生体分子（タンパク質、ペプチド、核酸等）を包含する。これらは人工起源のものであっても、天然起源のものであってもよい。
また、本明細書において「結合」又は「連結」とは、複数のものが分離した状態から連続して一体となることを全般的に指し、共有結合やイオン結合、水素結合といった化学的な結合のほか、化学吸着や物理吸着、そのほか嵌合、螺合、咬合した物理的な連結状態等も含む意味である。ここで、「結合」又は「連結」とは、直接複数のものが結合しても、別のものを介して間接的に結合してもよい意味である。
さらに、本明細書において「検出」とは、定性的な検出や定量的な検出のみならず、その他の各種の測定や同定、分析、評価等を含む概念である。
また、本明細書において「結合」又は「連結」とは、複数のものが分離した状態から連続して一体となることを全般的に指し、共有結合やイオン結合、水素結合といった化学的な結合のほか、化学吸着や物理吸着、そのほか嵌合、螺合、咬合した物理的な連結状態等も含む意味である。ここで、「結合」又は「連結」とは、直接複数のものが結合しても、別のものを介して間接的に結合してもよい意味である。
さらに、本明細書において「検出」とは、定性的な検出や定量的な検出のみならず、その他の各種の測定や同定、分析、評価等を含む概念である。
本発明の生体分子検出用試験キットは、生体分子検出用の試験片と、燐光色素含有シリカナノ粒子からなる生体分子検出用の標識試薬粒子を有する。そして、本発明の生体分子の検出方法は、当該生体分子検出用試験キットを用いて、生体分子の検出を行う。
以下、本発明の生体分子検出用試験キットの構成についてその好ましい実施形態を中心に詳述する。
以下、本発明の生体分子検出用試験キットの構成についてその好ましい実施形態を中心に詳述する。
［生体分子］
本発明において、検出対象（標的物質）としての生体分子に特に制限はなく、抗原、抗体、核酸、糖、糖鎖、リガンド、受容体、ペプチド、その他生体活性を有する化学物質等が挙げられる。これらのうち、本発明は抗原の検出に好適に用いることができる。
本発明において、検出対象（標的物質）としての生体分子に特に制限はなく、抗原、抗体、核酸、糖、糖鎖、リガンド、受容体、ペプチド、その他生体活性を有する化学物質等が挙げられる。これらのうち、本発明は抗原の検出に好適に用いることができる。
本発明において、生体分子を含有する試料としては特に制限はないが、臨床検体（例えば、血液、血漿、血清、リンパ液、尿、唾液、膵液、胃液、喀痰、鼻や咽等の粘膜から採取したぬぐい液等の体液や便等）、食品検体（例えば、液体飲料、半固形食品、固形食品等）、環境サンプリング検体（例えば、土壌、河川、海水等の自然界のサンプル、工場内の生産ラインやクリーンルームに設置されたエアーサンプラーによるサンプリング検体、ふき取り検体等）等が挙げられる。
また、試料は液体であればそのまま用いることもできる。試料が半固形又は固形物等の場合には、希釈や抽出等の処理を施した後に用いることもできる。
また、試料は液体であればそのまま用いることもできる。試料が半固形又は固形物等の場合には、希釈や抽出等の処理を施した後に用いることもできる。
［生体分子検出用の試験片］
本発明において、生体分子検出用の試験片（以下、「試験片」、又は「テストストリップ」ともいう）と、燐光色素含有シリカナノ粒子からなる生体分子検出用の標識試薬粒子（以下単に、「標識試薬粒子」ともいう）とを有する生体分子検出用試験キット（以下、単に「試験キット」ともいう）を用いて、抗原抗体反応により抗原などの検出対象物質を検出することが好ましい。
以下、本発明で好ましく用いることができる試験キットについて説明する。
本発明において、生体分子検出用の試験片（以下、「試験片」、又は「テストストリップ」ともいう）と、燐光色素含有シリカナノ粒子からなる生体分子検出用の標識試薬粒子（以下単に、「標識試薬粒子」ともいう）とを有する生体分子検出用試験キット（以下、単に「試験キット」ともいう）を用いて、抗原抗体反応により抗原などの検出対象物質を検出することが好ましい。
以下、本発明で好ましく用いることができる試験キットについて説明する。
［本発明の第１の実施態様で好ましく用いることができる試験片］
本発明の第１の実施態様で好ましく用いることができる試験キットに含まれる試験片の形状に特に制限はないが、平面状の試験片であることが好ましく、ラテラルフロー用の試験片であることがより好ましい。
また、試験片の構造に特に制限はないが、試料添加用部材（サンプルパッド）と、検出対象物質を捕捉する試験領域を有するメンブレンと、吸収パッドとが、この順でそれぞれ相互に毛細管現象が生じるように直列に連結している構造であることが好ましい。そして、各構成部材は粘着剤付きバッキングシートにより裏打ちされていることが好ましい。
以下、上記形状及び構造を有する試験片について、図２及び３を参照しながら説明する。しかし、本発明はこれに制限するものではない。
本発明の第１の実施態様で好ましく用いることができる試験キットに含まれる試験片の形状に特に制限はないが、平面状の試験片であることが好ましく、ラテラルフロー用の試験片であることがより好ましい。
また、試験片の構造に特に制限はないが、試料添加用部材（サンプルパッド）と、検出対象物質を捕捉する試験領域を有するメンブレンと、吸収パッドとが、この順でそれぞれ相互に毛細管現象が生じるように直列に連結している構造であることが好ましい。そして、各構成部材は粘着剤付きバッキングシートにより裏打ちされていることが好ましい。
以下、上記形状及び構造を有する試験片について、図２及び３を参照しながら説明する。しかし、本発明はこれに制限するものではない。
（サンプルパッド）
サンプルパッド２は生体分子、標識試薬粒子、これらの複合体を含む試料を滴下する構成部材である。サンプルパッド２の材料や寸法等は特に限定されず、この種の製品に適用される一般的なものを利用することができる。
サンプルパッド２は生体分子、標識試薬粒子、これらの複合体を含む試料を滴下する構成部材である。サンプルパッド２の材料や寸法等は特に限定されず、この種の製品に適用される一般的なものを利用することができる。
（メンブレン）
メンブレン３は、サンプルパッド２から毛細管現象により移動してきた生体分子を捕捉するための構成部材である。
図２に示すように、メンブレン３には、少なくとも１つの試験領域１０が設けられている。そして、生体分子に対する特異的な結合性を有し生体分子と複合体を形成しうる捕捉物質が、試験領域１０に導入されている。サンプルパッド２から移動してきた標識試薬粒子がメンブレン３を移行することで、標的物質とする生体分子を捕捉した標識試薬粒子が試験領域１０へ固定化される。
この試験領域１０で捕捉物質−生体分子−標識試薬粒子からなる複合体が形成され、標識試薬粒子が濃縮される。そして、標識試薬粒子が有する標識量の程度により生体分子を定性的又は定量的に検出することができる。
メンブレン３は、サンプルパッド２から毛細管現象により移動してきた生体分子を捕捉するための構成部材である。
図２に示すように、メンブレン３には、少なくとも１つの試験領域１０が設けられている。そして、生体分子に対する特異的な結合性を有し生体分子と複合体を形成しうる捕捉物質が、試験領域１０に導入されている。サンプルパッド２から移動してきた標識試薬粒子がメンブレン３を移行することで、標的物質とする生体分子を捕捉した標識試薬粒子が試験領域１０へ固定化される。
この試験領域１０で捕捉物質−生体分子−標識試薬粒子からなる複合体が形成され、標識試薬粒子が濃縮される。そして、標識試薬粒子が有する標識量の程度により生体分子を定性的又は定量的に検出することができる。
図３に示すように、メンブレン３には、標的物質とする生体分子を捕捉した標識試薬粒子を固定化するための試験領域２０を設け、試験領域２０の下流に、標的物質とする生体分子を捕捉していないため試験領域２０に固定化されなかった標識試薬粒子を固定化する参照領域２１をさらに設けてもよい。このような参照領域２１を設けることにより、サンプルパッド２に滴下した試料が毛細管現象によりメンブレン３に移動し、さらに試験領域２０を超えて移動しているかを確認することができる。参照領域２１は設けなくてもよい。
前記試験領域及び参照領域の形状としては、局所的に捕捉物質が固定化されている限り特に制限はなく、ライン状、円状、帯状等が挙げられる。本発明において試験領域及び参照領域はそれぞれライン状であることが好ましく、幅０．５〜１．５ｍｍのライン状であることがより好ましい。
前記捕捉物質は、抗原抗体反応などの特異的な結合により生体分子を捕捉し、前記試験領域で捕捉物質−生体分子−標識試薬粒子からなる複合体を形成しうるものであれば特に制限はない。
前記参照領域に用いる、標識試薬粒子を捕捉する捕捉物質としては、標識試薬粒子に対して結合性を有するものから適宜選択することができる。具体的には、抗体、抗原、核酸、受容体、リガンド、糖鎖、アプタマーなどから適宜選択することができる。
前記参照領域に用いる、標識試薬粒子を捕捉する捕捉物質としては、標識試薬粒子に対して結合性を有するものから適宜選択することができる。具体的には、抗体、抗原、核酸、受容体、リガンド、糖鎖、アプタマーなどから適宜選択することができる。
前記試験領域における捕捉物質の導入量に特に制限なく、適宜設定することができる。例えば、試験領域の形状がライン状の場合、単位長さ（ｃｍ）当たりの捕捉物質の固定化量は０．００１μｇ以上が好ましく、０．０１μｇ以上がより好ましく、１０μｇ以下が好ましく、２μｇ以下がより好ましい。
捕捉物質の固定化方法としては、捕捉物質の溶液をメンブレン３の所定の領域に塗布、滴下又は噴霧後、乾燥して物理吸着により固定化する方法等が挙げられる。また、非特異的吸着による測定への影響を防止するため、捕捉物質の固定化後にメンブレン３全体をいわゆるブロッキング処理を施してもよい。
捕捉物質の固定化方法としては、捕捉物質の溶液をメンブレン３の所定の領域に塗布、滴下又は噴霧後、乾燥して物理吸着により固定化する方法等が挙げられる。また、非特異的吸着による測定への影響を防止するため、捕捉物質の固定化後にメンブレン３全体をいわゆるブロッキング処理を施してもよい。
（吸収パッド）
吸収パッド４は、毛細管現象でメンブレン３を移動してきた溶液を吸収し、一定の流れを生じさせるための構成部材である。
吸収パッド４は、毛細管現象でメンブレン３を移動してきた溶液を吸収し、一定の流れを生じさせるための構成部材である。
これら各構成部材の材料としては特に制限は無く、この種の試験片に通常用いられる部材が使用できる。例えば、サンプルパッド２としてはGlass Fiber Conjugate Pad（商品名、MILLIPORE社製）等のガラスファイバーのパッドを好ましく用いることができる。メンブレン３としてはHi-Flow Plus180メンブレン（商品名、MILLIPORE社製）等のニトロセルロースメンブレンを好ましく用いることができる。吸収パッド４としてはCellulose Fiber Sample Pad（商品名、MILLIPORE社製）等のセルロースメンブレンを好ましく用いることができる。
前記粘着剤付きバッキングシート６としては、AR9020（商品名、Adhesives Research社製）等が挙げられる。
前記粘着剤付きバッキングシート６としては、AR9020（商品名、Adhesives Research社製）等が挙げられる。
試験片の作製法としては、サンプルパッド２、メンブレン３、吸収パッド４の並び順に、各部材間で毛管現象を生じさせ易くするために、それら各部材の両端と隣接する部材と１〜５ｍｍ程度重ね合わせて（好ましくはバッキングシート６上に）貼付することで、テストストリップ１を作製することができる。
［本発明の第２の実施態様で好ましく用いることができる試験片］
本発明の第２の実施態様で好ましく用いることができる試験キットに含まれる試験片の形状に特に制限はないが、平面状の試験片であることが好ましく、ラテラルフロー用の試験片であることがより好ましい。
また、試験片の構造に特に制限はないが、サンプルパッドと、標識試薬粒子を含浸して得られた部材（以下、「コンジュゲートパッド」ともいう）と、検出対象物質を捕捉する試験領域を有するメンブレンと、吸収パッドとが、この順でそれぞれ相互に毛細管現象が生じるように直列に連結している構造であることが好ましい。そして、各構成部材は粘着剤付きバッキングシートにより裏打ちされていることが好ましい。
以下、上記形状及び構造を有する試験片について、図４を参照しながら説明する。しかし、本発明はこれに制限するものではない。
本発明の第２の実施態様で好ましく用いることができる試験キットに含まれる試験片の形状に特に制限はないが、平面状の試験片であることが好ましく、ラテラルフロー用の試験片であることがより好ましい。
また、試験片の構造に特に制限はないが、サンプルパッドと、標識試薬粒子を含浸して得られた部材（以下、「コンジュゲートパッド」ともいう）と、検出対象物質を捕捉する試験領域を有するメンブレンと、吸収パッドとが、この順でそれぞれ相互に毛細管現象が生じるように直列に連結している構造であることが好ましい。そして、各構成部材は粘着剤付きバッキングシートにより裏打ちされていることが好ましい。
以下、上記形状及び構造を有する試験片について、図４を参照しながら説明する。しかし、本発明はこれに制限するものではない。
（サンプルパッド）
サンプルパッド２は、生体分子を滴下する構成部材である。サンプルパッド２の材料や寸法等は特に限定されず、この種の製品に適用される一般的なものを利用することができる。
サンプルパッド２は、生体分子を滴下する構成部材である。サンプルパッド２の材料や寸法等は特に限定されず、この種の製品に適用される一般的なものを利用することができる。
（コンジュゲートパッド）
コンジュゲートパッド５は、標識試薬粒子を含浸して得られた構成部材である。そして、サンプルパッド２から毛細管現象により移動した生体分子を含む液と標識試薬粒子とを混合する部分である。
コンジュゲートパッド５に含浸させる標識試薬粒子の量に特に制限はなく、適宜設定することができる。
コンジュゲートパッド５は、標識試薬粒子を含浸して得られた構成部材である。そして、サンプルパッド２から毛細管現象により移動した生体分子を含む液と標識試薬粒子とを混合する部分である。
コンジュゲートパッド５に含浸させる標識試薬粒子の量に特に制限はなく、適宜設定することができる。
（メンブレン）
図４に示すように、メンブレン３には、少なくとも１つの試験領域２０が設けられている。そして、生体分子に対する特異的な結合性を有し生体分子と複合体を形成しうる捕捉物質が、試験領域２０に導入されている。サンプルパッド２から移動してきた標識試薬粒子がメンブレン３を移行することで、標的物質とする生体分子を捕捉した標識試薬粒子が試験領域２０へ固定化される。
この試験領域２０で捕捉物質−生体分子−標識試薬粒子からなる複合体が形成され、標識試薬粒子が濃縮される。そして、標識試薬粒子が有する標識量の程度により生体分子を定性的又は定量的に検出することができる。
さらに図４に示すように、メンブレン３には、試験領域２０の下流に、標的物質とする生体分子を捕捉していないため試験領域２０に固定化されなかった標識試薬粒子を固定化する参照領域２１をさらに設けてもよい。このような参照領域２１を設けることにより、サンプルパッド２に滴下した試料が毛細管現象によりメンブレン３に移動し、さらに試験領域２０を超えて移動しているかを確認することができる。参照領域２１は設けなくてもよい。
図４に示すように、メンブレン３には、少なくとも１つの試験領域２０が設けられている。そして、生体分子に対する特異的な結合性を有し生体分子と複合体を形成しうる捕捉物質が、試験領域２０に導入されている。サンプルパッド２から移動してきた標識試薬粒子がメンブレン３を移行することで、標的物質とする生体分子を捕捉した標識試薬粒子が試験領域２０へ固定化される。
この試験領域２０で捕捉物質−生体分子−標識試薬粒子からなる複合体が形成され、標識試薬粒子が濃縮される。そして、標識試薬粒子が有する標識量の程度により生体分子を定性的又は定量的に検出することができる。
さらに図４に示すように、メンブレン３には、試験領域２０の下流に、標的物質とする生体分子を捕捉していないため試験領域２０に固定化されなかった標識試薬粒子を固定化する参照領域２１をさらに設けてもよい。このような参照領域２１を設けることにより、サンプルパッド２に滴下した試料が毛細管現象によりメンブレン３に移動し、さらに試験領域２０を超えて移動しているかを確認することができる。参照領域２１は設けなくてもよい。
前記試験領域及び参照領域の形状としては、局所的に捕捉物質が固定化されている限り特に制限はなく、ライン状、円状、帯状等が挙げられる。本発明において試験領域及び参照領域はそれぞれライン状であることが好ましく、幅０．５〜１．５ｍｍのライン状であることがより好ましい。
前記捕捉物質は、抗原抗体反応などの特異的な結合により抗原を捕捉し、前記試験領域で捕捉物質−生体分子−標識試薬粒子からなる複合体を形成しうるものであれば特に制限はない。
前記参照領域に用いる、標識試薬粒子を捕捉する捕捉物質としては、標識試薬粒子に対して結合性を有するものから適宜選択することができる。具体的には、抗体、抗原、核酸、受容体、リガンド、糖鎖、アプタマーなどから適宜選択することができる。
前記参照領域に用いる、標識試薬粒子を捕捉する捕捉物質としては、標識試薬粒子に対して結合性を有するものから適宜選択することができる。具体的には、抗体、抗原、核酸、受容体、リガンド、糖鎖、アプタマーなどから適宜選択することができる。
前記試験領域における捕捉物質の導入量に特に制限なく、適宜設定することができる。例えば、試験領域の形状がライン状の場合、単位長さ（ｃｍ）当たりの捕捉物質の固定化量は０．００１μｇ以上が好ましく、０．０１μｇ以上がより好ましく、１０μｇ以下が好ましく、２μｇ以下がより好ましい。
捕捉物質の固定化方法としては、捕捉物質の溶液をメンブレン３の所定の領域に塗布、滴下又は噴霧後、乾燥して物理吸着により固定化する方法等が挙げられる。また、非特異的吸着による測定への影響を防止するため、捕捉物質の固定化後にメンブレン３全体をいわゆるブロッキング処理を施してもよい。
捕捉物質の固定化方法としては、捕捉物質の溶液をメンブレン３の所定の領域に塗布、滴下又は噴霧後、乾燥して物理吸着により固定化する方法等が挙げられる。また、非特異的吸着による測定への影響を防止するため、捕捉物質の固定化後にメンブレン３全体をいわゆるブロッキング処理を施してもよい。
（吸収パッド）
吸収パッド４は、毛細管現象でメンブレン３を移動してきた溶液を吸収し、一定の流れを生じさせるための構成部材である。
吸収パッド４は、毛細管現象でメンブレン３を移動してきた溶液を吸収し、一定の流れを生じさせるための構成部材である。
これら各構成部材の材料としては特に制限は無く、この種の試験片に通常用いられる部材が使用できる。例えば、サンプルパッド２及びコンジュゲートパッド５としてはGlass Fiber Conjugate Pad（商品名、MILLIPORE社製）等のガラスファイバーのパッドを好ましく用いることができる。メンブレン３としてはHi-Flow Plus180メンブレン（商品名、MILLIPORE社製）等のニトロセルロースメンブレンを好ましく用いることができる。吸収パッド４としてはCellulose Fiber Sample Pad（商品名、MILLIPORE社製）等のセルロースメンブレンを好ましく用いることができる。
前記粘着剤付きバッキングシート６としては、AR9020（商品名、Adhesives Research社製）等が挙げられる。
前記粘着剤付きバッキングシート６としては、AR9020（商品名、Adhesives Research社製）等が挙げられる。
試験片の作製法としては、サンプルパッド２、コンジュゲートパッド５、メンブレン３、吸収パッド４の並び順に、各部材間で毛管現象を生じさせ易くするために、それら各部材の両端と隣接する部材と１〜５ｍｍ程度重ね合わせて（好ましくはバッキングシート６上に）貼付することで、テストストリップ１を作製することができる。
［標識試薬粒子］
本発明の標識試薬粒子は、アルコキシシリル基含有燐光色素（以下単に、「燐光色素」ともいう）からなり、アルコキシシリル基含有燐光色素の縮合体からなってもよい。本発明で用いる燐光色素は、励起波長領域と発光波長とが互いに重なり合わない。よって、本発明の標識試薬粒子を用いた場合、励起光のノイズをカットし燐光を検出する高価なフィルタを発光検出装置に設けなくても、生体分子の検出が可能となる。
中でも、励起波長が紫外領域にあり、発光波長が可視光領域にあるアルコキシシリル基含有燐光色素含有シリカナノ粒子が好ましく、紫外線を吸収して可視光領域側の燐光を発する紫外励起燐光色素をシリカ粒子中に含有する紫外励起燐光粒子がより好ましい。紫外励起燐光色素の発光寿命は、10マイクロ秒以上100ミリ秒以下であることが好ましい。また、紫外励起燐光色素の励起波長が２３０ｎｍ〜３５０ｎｍの範囲にあり、紫外励起燐光粒子の燐光発光ピークが４５０〜６００ｎｍの間にあることが好ましい。このような燐光色素含有シリカナノ粒子を用いることで、励起光をカットした後で光を検出できるため、励起光に起因するノイズがなくなり高感度及び高精度で生体分子を検出することができる。また、シリカナノ粒子の表面には様々な官能基を導入することができ、試験領域の発光が高輝度であるので、広い定量レンジで生体分子の検出を実現することができる。
以下、燐光色素含有シリカナノ粒子からなる標識試薬粒子について説明する。しかし、本発明はこれに限定するものではない。
本発明の標識試薬粒子は、アルコキシシリル基含有燐光色素（以下単に、「燐光色素」ともいう）からなり、アルコキシシリル基含有燐光色素の縮合体からなってもよい。本発明で用いる燐光色素は、励起波長領域と発光波長とが互いに重なり合わない。よって、本発明の標識試薬粒子を用いた場合、励起光のノイズをカットし燐光を検出する高価なフィルタを発光検出装置に設けなくても、生体分子の検出が可能となる。
中でも、励起波長が紫外領域にあり、発光波長が可視光領域にあるアルコキシシリル基含有燐光色素含有シリカナノ粒子が好ましく、紫外線を吸収して可視光領域側の燐光を発する紫外励起燐光色素をシリカ粒子中に含有する紫外励起燐光粒子がより好ましい。紫外励起燐光色素の発光寿命は、10マイクロ秒以上100ミリ秒以下であることが好ましい。また、紫外励起燐光色素の励起波長が２３０ｎｍ〜３５０ｎｍの範囲にあり、紫外励起燐光粒子の燐光発光ピークが４５０〜６００ｎｍの間にあることが好ましい。このような燐光色素含有シリカナノ粒子を用いることで、励起光をカットした後で光を検出できるため、励起光に起因するノイズがなくなり高感度及び高精度で生体分子を検出することができる。また、シリカナノ粒子の表面には様々な官能基を導入することができ、試験領域の発光が高輝度であるので、広い定量レンジで生体分子の検出を実現することができる。
以下、燐光色素含有シリカナノ粒子からなる標識試薬粒子について説明する。しかし、本発明はこれに限定するものではない。
本発明で用いるアルコキシシリル基含有燐光色素は、下記一般式（１）で表される。
Ｘ―Ｙ−Ｑ−Ｚ−Ｓｉ（Ｒ１）ｎ（ＯＲ２）（３−ｎ） 一般式（１）
一般式（１）において、Ｘは有機燐光色素を示し、Ｙは単結合、−（ＣＨ２）ｐ−、又は−（Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２）ｑ−を示す。ここで、ｐ及びｑはそれぞれ１〜１０の整数である。
Ｑはアミド結合、エーテル結合、チオエーテル結合、チオエステル結合、チオウレア結合、ジスルフィド結合、又はポリオキシエチレン結合であり、Ｚは−（ＣＨ２）３−又は−（ＣＨ２）２ＮＨ（ＣＨ２）３−を示す。
Ｒ１及びＲ２はそれぞれ炭素原子数が１〜４のアルキル基を示し、ｎは０又は１である。
Ｘ―Ｙ−Ｑ−Ｚ−Ｓｉ（Ｒ１）ｎ（ＯＲ２）（３−ｎ） 一般式（１）
一般式（１）において、Ｘは有機燐光色素を示し、Ｙは単結合、−（ＣＨ２）ｐ−、又は−（Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２）ｑ−を示す。ここで、ｐ及びｑはそれぞれ１〜１０の整数である。
Ｑはアミド結合、エーテル結合、チオエーテル結合、チオエステル結合、チオウレア結合、ジスルフィド結合、又はポリオキシエチレン結合であり、Ｚは−（ＣＨ２）３−又は−（ＣＨ２）２ＮＨ（ＣＨ２）３−を示す。
Ｒ１及びＲ２はそれぞれ炭素原子数が１〜４のアルキル基を示し、ｎは０又は１である。
Ｘで示す有機燐光色素（以下、「燐光色素」ともいう）としては、カルバゾール及びその置換体、ジベンゾフラン及びその置換体、チオナフテン及びその置換体、インドール及びその置換体、1,3,5-トリアジン及びその置換体からなる群から選択される少なくとも１種の化合物が挙げられる。
このうち、好ましくは、カルバゾール及びその置換体である。カルバゾールの置換体としては、N-エチルカルバゾール、N-ヒドロキシエチルカルバゾール、フェニルカルバゾール、N-ニトロカルバゾール、N-ニトロソ-3-ニトロカルバゾール、3-ニトロカルバゾール、N-置換カルバゾール、[3-（9-フェニル-9H-カルバゾール-3−イル）フェニル]ボロン酸、9H-カルバゾール-3-ブロモ-9-（9-フェナントレン）、[4-（9-フェニル-9H-カルバゾール-3-イル）フェニル]ボロン酸、9H-カルバゾール-9-（1,1’-ビフェニル）-4-イル-3-ヨウ素、9H-カルバゾール-9-（4-ブロモフェニル）-3-ヨウ素、3-ブロモ-9-(1-ナフチル)-9H-カルバゾール、3-（9H-カルバゾール-9-イル）フェニルボロン酸、4-(9H-カルバゾール-9-イル)フェニルボロン酸、3-ブロモ-9-フェニルカルバゾール、ベンゼンアミン-4-（9H-カルバゾール-9イル）N,N-ジフェニル、3-ヨード-9-フェニルカルバゾール、9-フェニルカルバゾール-3-ボロン酸、9-（4-ブロモフェニル）カルバゾール、3-ブロモカルバゾール、3-（4-ブロモフェニル）-9-フェニルカルバゾールなどが挙げられる。また、これら置換体の置換基が、カルバゾール環を構成する窒素原子に結合していることが好ましい。
このうち、好ましくは、カルバゾール及びその置換体である。カルバゾールの置換体としては、N-エチルカルバゾール、N-ヒドロキシエチルカルバゾール、フェニルカルバゾール、N-ニトロカルバゾール、N-ニトロソ-3-ニトロカルバゾール、3-ニトロカルバゾール、N-置換カルバゾール、[3-（9-フェニル-9H-カルバゾール-3−イル）フェニル]ボロン酸、9H-カルバゾール-3-ブロモ-9-（9-フェナントレン）、[4-（9-フェニル-9H-カルバゾール-3-イル）フェニル]ボロン酸、9H-カルバゾール-9-（1,1’-ビフェニル）-4-イル-3-ヨウ素、9H-カルバゾール-9-（4-ブロモフェニル）-3-ヨウ素、3-ブロモ-9-(1-ナフチル)-9H-カルバゾール、3-（9H-カルバゾール-9-イル）フェニルボロン酸、4-(9H-カルバゾール-9-イル)フェニルボロン酸、3-ブロモ-9-フェニルカルバゾール、ベンゼンアミン-4-（9H-カルバゾール-9イル）N,N-ジフェニル、3-ヨード-9-フェニルカルバゾール、9-フェニルカルバゾール-3-ボロン酸、9-（4-ブロモフェニル）カルバゾール、3-ブロモカルバゾール、3-（4-ブロモフェニル）-9-フェニルカルバゾールなどが挙げられる。また、これら置換体の置換基が、カルバゾール環を構成する窒素原子に結合していることが好ましい。
以下、Ｘで示す燐光色素の具体例を下記に示す。しかし本発明は、これに制限するものではない。なお下記式において、「Ｒ」は置換又は無置換のアルキル基（好ましくは、炭素原子数が１〜４の置換又は無置換のアルキル基）を示し、「Ｐｈ」はフェニル基を示す。
Ｙは単結合、−（ＣＨ２）ｐ−、又は−（Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２）ｑ−を示し、ｐ及びｑはそれぞれ、１〜１０の整数である。
ｐは１〜８の整数が好ましく、１〜４の整数がより好ましく、１又は２の整数がより好ましい。ｑは１〜８の整数が好ましく、１〜４の整数がより好ましい。
一般式（１）において、Ｙは単結合又は−（ＣＨ２）ｐ−であり、ｐが１又は２の整数であることが好ましく、単結合又は−（ＣＨ２）−であることがより好ましい。
ｐは１〜８の整数が好ましく、１〜４の整数がより好ましく、１又は２の整数がより好ましい。ｑは１〜８の整数が好ましく、１〜４の整数がより好ましい。
一般式（１）において、Ｙは単結合又は−（ＣＨ２）ｐ−であり、ｐが１又は２の整数であることが好ましく、単結合又は−（ＣＨ２）−であることがより好ましい。
Ｑは、アミド結合、エーテル結合、チオエーテル結合、チオエステル結合、チオウレア結合、ジスルフィド結合およびポリオキシエチレン結合から選択される１種の結合である。このうち、アミド結合、チオエーテル結合、又はチオエステル結合が好ましく、アミド結合がより好ましい。
なお、アミド結合は、−ＣＯ（ＮＲ）−で表すことができ、Ｒは水素原子又は炭素原子数１〜４のアルキル基を示し、水素原子又はメチル基が好ましく、水素原子がより好ましい。また、ポリオキシエチレン結合は、−（Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２）ｒ−で表すことができ、ｒは１〜１０の整数であり、好ましくは１〜５の整数である。
なお、アミド結合は、−ＣＯ（ＮＲ）−で表すことができ、Ｒは水素原子又は炭素原子数１〜４のアルキル基を示し、水素原子又はメチル基が好ましく、水素原子がより好ましい。また、ポリオキシエチレン結合は、−（Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２）ｒ−で表すことができ、ｒは１〜１０の整数であり、好ましくは１〜５の整数である。
Ｚは−（ＣＨ２）３−又は−（ＣＨ２）２ＮＨ（ＣＨ２）３−を示し、−（ＣＨ２）３−が好ましい。
Ｒ１及びＲ２はそれぞれ炭素原子数が１〜４のアルキル基を示す。炭素原子数が１〜４のアルキル基の具体例としては、メチル基、エチル基、及びｎ−プロピル基が挙げられる。このうち、メチル基又はエチル基が好ましい。
また、ｎは０又は１である。
また、ｎは０又は１である。
本発明で用いるアルコキシシリル基含有燐光色素の具体例を下記に示す。しかし、本発明はこれらに制限するものではない。
本発明で用いるアルコキシシリル基含有燐光色素は、常法に従い製造できる。例えば、以下の方法に従い、製造できる。例えば、スクシンイミジルエステル基、アルコラート基、アミノ基、メルカプト基、及び末端ヒドロキシ基含有ポリオキシエチレン基からなる群から選択される少なくとも１種の反応性基を有する有機燐光色素と、シランカップリング剤とを混合して反応させ、共有結合（アミド結合、エーテル結合、チオエーテル結合、チオエステル結合、チオウレア結合、ジスルフィド結合又はポリオキシエチレン結合）を形成することで製造できる。しかし本発明は、これに制限するものではない。
シランカップリング剤には、アミノアルキルシラン、グリシジルオキシアルキルシラン、メルカプトシラン、イソチオシアネートシラン、イソシアネートシラン、ハロゲン化シラン等を用いることができる。このうち、好ましくは、アミノアルキルシランである。
アミノアルキルシランの具体例としては、3-アミノプロピルトリエトキシシラン、3-（2-アミノエチルアミノ）プロピルトリメトキシシラン、3-（2-アミノエチルアミノ）プロピルジメトキシメチルシラン、3-（2-アミノエチルアミノ）プロピルトリエトキシシラン、3-アミノプロピルジエトキシメチルシラン、3-アミノプロピルトリメトキシシランが挙げられる。このうち、好ましくは3-アミノプロピルトリメトキシシランである。
グリシジルオキシアルキルシランの具体例としては、ジエトキシ（3-グリシジルオキシプロピル）メチルシラン、3-グリシジルオキシプロピルトリメトキシシラン、3-グリシジルオキシプロピル（ジメトキシ）メチルシラン、トリエトキシ（3-グリシジルオキシプロピル）シランが挙げられる。
メルカプトシランの具体例としては、3-メルカプトプロピルメチルメトキシシランや3-メルカプトプロピルトリメトキシシランが挙げられる。
イソチオシアネートシランの具体例としては、3-チオシアナトプロピルトリエトキシシランが挙げられる。
イソシアネートシランの具体例としては、3-イソシアネートプロピルトリエトキシシランや3-イソシアネートプロピルトリメトキシシランが挙げられる。
ハロゲン化シランの具体例としては、（3-ブロモプロピル）トリメトキシシラン、3-トリメトキシシリルプロピルクロライド、3-クロロプロピルジメトキシメチルシラン、3-ヨードプロピルトリメトキシシランが挙げられる。
アミノアルキルシランの具体例としては、3-アミノプロピルトリエトキシシラン、3-（2-アミノエチルアミノ）プロピルトリメトキシシラン、3-（2-アミノエチルアミノ）プロピルジメトキシメチルシラン、3-（2-アミノエチルアミノ）プロピルトリエトキシシラン、3-アミノプロピルジエトキシメチルシラン、3-アミノプロピルトリメトキシシランが挙げられる。このうち、好ましくは3-アミノプロピルトリメトキシシランである。
グリシジルオキシアルキルシランの具体例としては、ジエトキシ（3-グリシジルオキシプロピル）メチルシラン、3-グリシジルオキシプロピルトリメトキシシラン、3-グリシジルオキシプロピル（ジメトキシ）メチルシラン、トリエトキシ（3-グリシジルオキシプロピル）シランが挙げられる。
メルカプトシランの具体例としては、3-メルカプトプロピルメチルメトキシシランや3-メルカプトプロピルトリメトキシシランが挙げられる。
イソチオシアネートシランの具体例としては、3-チオシアナトプロピルトリエトキシシランが挙げられる。
イソシアネートシランの具体例としては、3-イソシアネートプロピルトリエトキシシランや3-イソシアネートプロピルトリメトキシシランが挙げられる。
ハロゲン化シランの具体例としては、（3-ブロモプロピル）トリメトキシシラン、3-トリメトキシシリルプロピルクロライド、3-クロロプロピルジメトキシメチルシラン、3-ヨードプロピルトリメトキシシランが挙げられる。
有機燐光色素とシランカップリング剤との間でアミド結合を形成する場合、シランカップリング剤にはアミノアルキルシランを用い、有機燐光色素の反応性基としてスクシンイミジルエステル基を用いることが好ましい。
また、エーテル結合を形成する場合、シランカップリング剤にはハロゲン化アルキルシランを用い、有機燐光色素の反応性基としては、アルコラート基を用いることが好ましい。
また、チオエーテル結合を形成する場合、シランカップリング剤には（3-メルカプトプロピル）トリメトキシシランを用い、有機燐光色素の反応性基としてマレイミド基を用いることが好ましい。
また、チオエステル結合を形成する場合、シランカップリング剤には(3-メルカプトプロピル)トリメトキシシランを用い、有機燐光色素の反応性基としてカルボキシル基を用いることが好ましい。
また、チオウレア結合を形成する場合、シランカップリング剤にはイソチオシアネートシランを用い、有機燐光色素の反応性基としてアミノ基を用いることが好ましい。
また、ジスルフィド結合を形成する場合、シランカップリング剤にはメルカプトシランを用い、有機燐光色素の反応性基としてメルカプト基を用いることが好ましい。
また、ポリオキシエチレン結合を形成する場合、シランカップリング剤にはグリシジルオキシアルキルシランを用い、有機燐光色素の反応性基として末端ヒドロキシ基含有ポリオキシエチレン基を用いることが好ましい。
また、エーテル結合を形成する場合、シランカップリング剤にはハロゲン化アルキルシランを用い、有機燐光色素の反応性基としては、アルコラート基を用いることが好ましい。
また、チオエーテル結合を形成する場合、シランカップリング剤には（3-メルカプトプロピル）トリメトキシシランを用い、有機燐光色素の反応性基としてマレイミド基を用いることが好ましい。
また、チオエステル結合を形成する場合、シランカップリング剤には(3-メルカプトプロピル)トリメトキシシランを用い、有機燐光色素の反応性基としてカルボキシル基を用いることが好ましい。
また、チオウレア結合を形成する場合、シランカップリング剤にはイソチオシアネートシランを用い、有機燐光色素の反応性基としてアミノ基を用いることが好ましい。
また、ジスルフィド結合を形成する場合、シランカップリング剤にはメルカプトシランを用い、有機燐光色素の反応性基としてメルカプト基を用いることが好ましい。
また、ポリオキシエチレン結合を形成する場合、シランカップリング剤にはグリシジルオキシアルキルシランを用い、有機燐光色素の反応性基として末端ヒドロキシ基含有ポリオキシエチレン基を用いることが好ましい。
燐光色素とシランカップリング剤との反応は、溶媒にジクロロメタン、クロロホルム、ＤＭＦ等を用い、室温から６０℃の温度で、混合攪拌することにより行うことができる。必要に応じて溶媒を減圧等により除去して反応物を取り出すことができる。
燐光色素含有シリカナノ粒子の調製方法に特に制限はなく、任意のいかなる調製方法によって燐光色素含有シリカナノ粒子を得ることができる。例えば、Journal of Colloid and Interface Science，159，p．150-157（1993）に記載のゾル−ゲル法や、国際公開第２００７／０７４７２２号パンフレットに記載されたコロイドシリカ粒子の調製方法を参照することができる。
燐光色素含有シリカナノ粒子の調製例について、具体的に説明する。しかし本発明はこれに制限されるものではない。
燐光色素を含有するシリカ粒子は、アルコキシシリル基含有燐光色素とシランカップリング剤とを反応させ、共有結合、イオン結合その他の化学的に結合若しくは吸着させて得られた生成物に１種又は２種以上のシラン化合物を縮重合させシロキサン結合を形成させることにより調製することができる。これによりオルガノシロキサン成分とシロキサン成分とがシロキサン結合してなるシリカ粒子が得られる。１例としては、N-ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル基、マレイミド基、イソシアナート基、イソチオシアナート基、アルデヒド基、パラニトロフェニル基、ジエトキシメチル基、エポキシ基、シアノ基等の活性基を有する又は付加した燐光色素と、それら活性基と対応して反応する置換基（例えば、アミノ基、水酸基、チオール基）を有するシランカップリング剤とを反応させ、共有結合させて得られた生成物に１又は２種以上のシラン化合物を縮重合させシロキサン結合を形成させることにより調製することができる。
燐光色素を含有するシリカ粒子は、アルコキシシリル基含有燐光色素とシランカップリング剤とを反応させ、共有結合、イオン結合その他の化学的に結合若しくは吸着させて得られた生成物に１種又は２種以上のシラン化合物を縮重合させシロキサン結合を形成させることにより調製することができる。これによりオルガノシロキサン成分とシロキサン成分とがシロキサン結合してなるシリカ粒子が得られる。１例としては、N-ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル基、マレイミド基、イソシアナート基、イソチオシアナート基、アルデヒド基、パラニトロフェニル基、ジエトキシメチル基、エポキシ基、シアノ基等の活性基を有する又は付加した燐光色素と、それら活性基と対応して反応する置換基（例えば、アミノ基、水酸基、チオール基）を有するシランカップリング剤とを反応させ、共有結合させて得られた生成物に１又は２種以上のシラン化合物を縮重合させシロキサン結合を形成させることにより調製することができる。
前記シランカップリング剤としてアミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＳ）、シラン化合物としてテトラエトキシシラン（ＴＥＯＳ）を用いた場合を下記に例示する。
前記置換基を有するシランカップリング剤の具体例として、γ-アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＳ）、3-［2-（2-アミノエチルアミノ）エチルアミノ］プロピル−トリエトキシシラン、N-2（アミノエチル）3-アミノプロピルメチルジメトキシシラン、3-アミノプロピルトリメトキシシラン等のアミノ基を有するシランカップリング剤を挙げることができる。中でも、ＡＰＳが好ましい。
縮重合させる前記シラン化合物としては特に制限はないが、ＴＥＯＳ、γ-メルカプトプロピルトリメトキシシラン（ＭＰＳ）、γ-メルカプトプロピルトリエトキシシラン、ＡＰＳ、3-チオシアナトプロピルトリエトキシシラン、3-グリシジルオキシプロピルトリエトキシシラン、3-イソシアナトプロピルトリエトキシシラン、及び3-［2-（2-アミノエチルアミノ）エチルアミノ］プロピル−トリエトキシシランを挙げることができる。中でも、前記シリカ粒子内部のシロキサン成分を形成する観点からはＴＥＯＳが好ましく、前記シリカ粒子内部のオルガノシロキサン成分を形成する観点からはＭＰＳ又はＡＰＳが好ましい。
上述のように調製すると、球状、又は球状に近いシリカ粒子を調製することができる。ここで、「球状に近いシリカ粒子」とは、具体的には長軸と短軸の比が２以下の形状である。
シリカナノ粒子の平均粒径に特に制限はないが、２０ｎｍ以上が好ましく、３０ｎｍ以上がより好ましく、６０ｎｍ以上がさらに好ましく、１０００ｎｍ未満が好ましく、６００ｎｍ以下がより好ましく、５００ｎｍ以下がさらに好ましく、３００ｎｍ以下が特に好ましい。粒径が小さすぎると、検出感度が低下し、粒径が大きすぎると、試験片に用いられる多孔質支持体（メンブレン）の目詰まりの原因となる。
本発明において、前記平均粒径は、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）等の画像から無作為に選択した１００個の標識試薬シリカ粒子の合計の投影面積からシリカナノ粒子の占有面積を画像処理装置によって求め、この合計の占有面積を、選択したシリカナノ粒子の個数（１００個）で割った値に相当する円の直径の平均値（平均円相当直径）を求めたものである。
なお、前記平均粒径は、一次粒子が凝集してなる二次粒子を含む概念の後述する「動的光散乱法による粒度」とは異なり、一次粒子のみからなる粒子の平均粒径である。
所望の平均粒径のシリカナノ粒子を得るためには、ＹＭ−１０、ＹＭ−１００（いずれも商品名、ミリポア社製）等の限外ろ過膜を用いて限外ろ過を行い、粒径が大きすぎたり小さすぎる粒子を除去するか、または適切な重力加速度で遠心分離を行い、上清又は沈殿のみを回収することで可能である。
シリカナノ粒子は粒状物質として単分散であることが好ましい。シリカナノ粒子の粒度分布の変動係数、いわゆるＣＶ値に特に制限はないが、１０％以下が好ましく、８％以下がより好ましい。
本発明において、前記平均粒径は、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）等の画像から無作為に選択した１００個の標識試薬シリカ粒子の合計の投影面積からシリカナノ粒子の占有面積を画像処理装置によって求め、この合計の占有面積を、選択したシリカナノ粒子の個数（１００個）で割った値に相当する円の直径の平均値（平均円相当直径）を求めたものである。
なお、前記平均粒径は、一次粒子が凝集してなる二次粒子を含む概念の後述する「動的光散乱法による粒度」とは異なり、一次粒子のみからなる粒子の平均粒径である。
所望の平均粒径のシリカナノ粒子を得るためには、ＹＭ−１０、ＹＭ−１００（いずれも商品名、ミリポア社製）等の限外ろ過膜を用いて限外ろ過を行い、粒径が大きすぎたり小さすぎる粒子を除去するか、または適切な重力加速度で遠心分離を行い、上清又は沈殿のみを回収することで可能である。
シリカナノ粒子は粒状物質として単分散であることが好ましい。シリカナノ粒子の粒度分布の変動係数、いわゆるＣＶ値に特に制限はないが、１０％以下が好ましく、８％以下がより好ましい。
本明細書において、前記「動的光散乱法による粒度」とは、動的光散乱法により測定され、前記の平均粒径とは異なり、一次粒子だけでなく、一次粒子が凝集してなる二次粒子をも含めた概念であり、前記複合粒子の分散安定性を評価する指標となる。
動的光散乱法による粒度の測定装置としては、ゼータサイザーナノ（商品名；マルバーン社製）が挙げられる。この手法は、微粒子などの光散乱体による光散乱強度の時間変動を測定し、その自己相関関数から光散乱体のブラウン運動速度を計算し、その結果から光散乱体の粒度分布を導出するというものである。
動的光散乱法による粒度の測定装置としては、ゼータサイザーナノ（商品名；マルバーン社製）が挙げられる。この手法は、微粒子などの光散乱体による光散乱強度の時間変動を測定し、その自己相関関数から光散乱体のブラウン運動速度を計算し、その結果から光散乱体の粒度分布を導出するというものである。
燐光色素含有シリカナノ粒子の表面には、抗原などの生体分子に対する結合性を有する捕捉物質が導入されている。シリカナノ粒子の表面に導入する捕捉物質は、生体分子に対する特異的な結合性を有するものであれば特に制限はない。
燐光色素含有シリカナノ粒子の表面に捕捉物質を導入する方法としては特に制限はなく、常法に従って導入することができる。例えば、静電的引力、ファンデルワールス力、疎水性相互作用等によって燐光色素含有シリカナノ粒子の表面に捕捉物質を導入してもよい。あるいは、架橋剤や縮合剤の化学結合によって、燐光色素含有シリカナノ粒子の表面に捕捉物質を導入してもよい。また、燐光色素含有シリカナノ粒子の表面に導入する捕捉物質を導入したときに燐光色素含有シリカナノ粒子同士が凝集する場合は、予め交互吸着法によって燐光色素含有シリカナノ粒子の表面に表面処理を施しておいてもよい。
以下、燐光色素含有シリカナノ粒子を調製する方法について説明する。しかし、本発明はこれに制限するものではない。
まず、反応性官能基を有するシランカップリング剤を加水分解し、加水分解されたシランカップリング剤と燐光色素含有シリカナノ粒子の表面に存在するヒドロキシル基とを縮重合させ、反応性官能基を燐光色素シリカナノ粒子の表面に導入する。
反応性官能基を有するシランカップリング剤の具体例としては、（3-メルカプトプロピル）トリメトキシシラン、ＭＰＳ、ＡＰＳ、3-チオシアナトプロピルトリエトキシシラン、3-グリシジルオキシプロピルトリエトキシシラン、3-イソチオシアナトプロピルトリエトキシシラン、3-［2-（2-アミノエチルアミノ）エチルアミノ］プロピルトリエトキシシラン、（-クロロプロピルトリメトキシシラン、ビニルメトキシシラン、3-メタクリロキシプロピルメチルジメトキシシラン、3-アクリロキシプロピルトリメトキシシラン、N-フェニル-3-アミノプロピルトリメトキシシラン、3-ウレイドプロピルトリエトキシシラン、ビス（トリエトキシシリルプロピル）テトラスルフィドが挙げられる。
反応性官能基を有するシランカップリング剤の具体例としては、（3-メルカプトプロピル）トリメトキシシラン、ＭＰＳ、ＡＰＳ、3-チオシアナトプロピルトリエトキシシラン、3-グリシジルオキシプロピルトリエトキシシラン、3-イソチオシアナトプロピルトリエトキシシラン、3-［2-（2-アミノエチルアミノ）エチルアミノ］プロピルトリエトキシシラン、（-クロロプロピルトリメトキシシラン、ビニルメトキシシラン、3-メタクリロキシプロピルメチルジメトキシシラン、3-アクリロキシプロピルトリメトキシシラン、N-フェニル-3-アミノプロピルトリメトキシシラン、3-ウレイドプロピルトリエトキシシラン、ビス（トリエトキシシリルプロピル）テトラスルフィドが挙げられる。
反応性官能基としてはチオール基、アミノ基、カルボキシル基、ハロゲン基、ビニル基、エポキシ基及びイソシアネート基から選ばれる少なくとも１種の反応性官能基が好ましく、チオール基がより好ましい。
反応性官能基がチオール基である場合は、燐光色素含有シリカナノ粒子表面におけるチオール基の密度は０．００２〜０．２個／ｎｍ2が好ましく、０．００２〜０．１個／ｎｍ2がより好ましい。当該含色素シリカ粒子の表面に存在するチオール基の量Ｂは、ＤＮＴＢ（5,5'-ジチオビス(2-ニトロ安息香酸)）を試薬として用いて測定することができる。ＤＮＴＢを用いたチオール基の定量法としては、例えば、Archives of Biochemistry and Biophysics, 82, 70(1959)の方法で行うことができる。具体的な方法の一例としては、リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解した１０ｍＭのＤＮＴＢの溶液２０μＬと、２００ｍｇ／ｍＬに調製したシリカ粒子コロイド２．５ｍＬとを混合し、１時間後に４１２ｎｍの吸光度を測定し、標準物質としてγ−メルカプトプロピルトリメトキシシラン（ＭＰＳ）を用いて作成した検量線から粒子表面に存在するチオール基量を定量することができる。
反応性官能基がチオール基である場合は、燐光色素含有シリカナノ粒子表面におけるチオール基の密度は０．００２〜０．２個／ｎｍ2が好ましく、０．００２〜０．１個／ｎｍ2がより好ましい。当該含色素シリカ粒子の表面に存在するチオール基の量Ｂは、ＤＮＴＢ（5,5'-ジチオビス(2-ニトロ安息香酸)）を試薬として用いて測定することができる。ＤＮＴＢを用いたチオール基の定量法としては、例えば、Archives of Biochemistry and Biophysics, 82, 70(1959)の方法で行うことができる。具体的な方法の一例としては、リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解した１０ｍＭのＤＮＴＢの溶液２０μＬと、２００ｍｇ／ｍＬに調製したシリカ粒子コロイド２．５ｍＬとを混合し、１時間後に４１２ｎｍの吸光度を測定し、標準物質としてγ−メルカプトプロピルトリメトキシシラン（ＭＰＳ）を用いて作成した検量線から粒子表面に存在するチオール基量を定量することができる。
シリカナノ粒子の表面に導入した反応性官能基と、これと化学結合を形成するリンカー分子とを反応させる。そして、リンカー分子とウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）とを結合させ、燐光色素含有シリカナノ粒子とＢＳＡとの複合体を形成する。
反応性官能基がチオール基である場合は、チオール基が導入された燐光色素含有シリカナノ粒子と、マレイミド基及びカルボキシル基を有するリンカー分子とを非プロトン性溶媒中に共存させる。これにより、チオール基とマレイミド基との間でチオエーテル結合を形成させて、リンカー分子が結合した粒子を作製する。続いて、リンカー分子が結合した粒子と、カルボジイミドと、アミノ基を有するＢＳＡとを水系溶媒中に共存させる。これにより、カルボジイミドにより活性エステル化されたリンカー分子のカルボキシル基と、ＢＳＡが有するアミノ基との間でアミド結合を形成させ、燐光色素シリカナノ粒子とＢＳＡとの複合体を形成する。
反応性官能基がアミノ基、カルボキシル基、ビニル基、エポキシ基、イソシアネート基である場合も、常法によりＢＳＡと燐光色素含有シリカナノ粒子との複合体を形成することができる。これらの方法は、例えば、特開２００９−２７４９２３号公報、特開２００９−１６２５３７号公報、特開２０１０−１００５４２号公報等の記載を参照することができる。
反応性官能基がチオール基である場合は、チオール基が導入された燐光色素含有シリカナノ粒子と、マレイミド基及びカルボキシル基を有するリンカー分子とを非プロトン性溶媒中に共存させる。これにより、チオール基とマレイミド基との間でチオエーテル結合を形成させて、リンカー分子が結合した粒子を作製する。続いて、リンカー分子が結合した粒子と、カルボジイミドと、アミノ基を有するＢＳＡとを水系溶媒中に共存させる。これにより、カルボジイミドにより活性エステル化されたリンカー分子のカルボキシル基と、ＢＳＡが有するアミノ基との間でアミド結合を形成させ、燐光色素シリカナノ粒子とＢＳＡとの複合体を形成する。
反応性官能基がアミノ基、カルボキシル基、ビニル基、エポキシ基、イソシアネート基である場合も、常法によりＢＳＡと燐光色素含有シリカナノ粒子との複合体を形成することができる。これらの方法は、例えば、特開２００９−２７４９２３号公報、特開２００９−１６２５３７号公報、特開２０１０−１００５４２号公報等の記載を参照することができる。
そして、シリカナノ粒子に結合するＢＳＡと、捕捉物質とを常法に従って結合させる。例えば、静電的引力、ファンデルワールス力、疎水性相互作用等によって、ＢＳＡと捕捉物質とを結合させることができる。あるいは、架橋剤や縮合剤の化学結合により、ＢＳＡと捕捉物質とを結合させることができる。なお、ＢＳＡと捕捉物質とが直接結合して複合体を形成してもよいし、他の物質を介して間接的にＢＳＡと捕捉物質とが結合して複合体を形成していてもよい。
燐光色素含有シリカナノ粒子の表面における捕捉物質の導入量に特に制限なく、適宜設定することができる。例えば、燐光色素含有シリカナノ粒子の表面１ｎｍ2当たりの捕捉物質の導入量は、０．０００１ｍｏｌ以上０．１ｍｏｌ以下が好ましく、０．００１ｍｏｌ以上０．０５ｍｏｌ以下が好ましい。
［生体分子の検出方法］
次に、上記構成の生体分子検出用の試験片と燐光色素含有シリカナノ粒子からなる標識試薬粒子を有する生体分子検出用試験キットを用いた生体分子の検出方法について、好ましい実施態様に基づいて説明する。しかし、本発明はこれに制限するものではない。
次に、上記構成の生体分子検出用の試験片と燐光色素含有シリカナノ粒子からなる標識試薬粒子を有する生体分子検出用試験キットを用いた生体分子の検出方法について、好ましい実施態様に基づいて説明する。しかし、本発明はこれに制限するものではない。
まず本発明の第１の実施態様では、生体分子を含有しうる液体試料と本発明の標識試薬粒子との混合物を、前記試験片１のサンプルパッド２に滴下する。サンプルパッド２に滴下する液体試料の量は、試験片１の構成に合わせて適宜調節することができる。
そして、毛細管現象によりサンプルパッド２からメンブレン３に移動してきた生体分子と燐光色素含有シリカナノ粒子との複合体が、試験片１の試験領域（テストライン）上に導入された捕捉物質との結合により濃縮される。そして、試験領域に光を照射し、濃縮された標識試薬粒子の標識を検出する。検出した標識の有無又は標識の程度により、生体分子を検出することができる。
そして、毛細管現象によりサンプルパッド２からメンブレン３に移動してきた生体分子と燐光色素含有シリカナノ粒子との複合体が、試験片１の試験領域（テストライン）上に導入された捕捉物質との結合により濃縮される。そして、試験領域に光を照射し、濃縮された標識試薬粒子の標識を検出する。検出した標識の有無又は標識の程度により、生体分子を検出することができる。
本発明の第２の実施態様では、本発明の標識試薬粒子を生体分子アッセイに用いる部材に乾燥された状態で含ませておく。そして、抗原抗体反応などの特異的な反応により生体分子を検出する前に、生体分子を含有しうる液体試料と前記標識試薬粒子とを混合させる。例えば、イムノクロマト法により生体分子を検出する場合、前記標識試薬粒子をサンプルパッド２やメンブレン３に含ませておき、生体分子を含有しうる液体試料がこれらの部材を通過する際に、生体分子を含有しうる液体試料と前記標識試薬粒子とを混合してもよい。あるいは、前記標識試薬粒子を含ませたコンジュゲートパッド５をメンブレン３よりも上流に設け、生体分子を含有しうる液体試料がこの部材を通過する際に、生体分子を含有しうる液体試料と前記標識試薬粒子とを混合してもよい。これらの場合、生体分子を含有しうる液体試料が前記部材を通過した後に抗原抗体反応などの特異的な反応が行われる。
そして、毛細管現象によりコンジュゲートパッド５からメンブレン３に移動してきた生体分子と燐光色素含有シリカナノ粒子との複合体が、試験片１の試験領域（テストライン）上に導入された捕捉物質との結合により濃縮される。そして、試験領域に光を照射し、濃縮された標識試薬粒子の標識を検出する。検出した標識の有無又は標識の程度により、生体分子を検出することができる。
そして、毛細管現象によりコンジュゲートパッド５からメンブレン３に移動してきた生体分子と燐光色素含有シリカナノ粒子との複合体が、試験片１の試験領域（テストライン）上に導入された捕捉物質との結合により濃縮される。そして、試験領域に光を照射し、濃縮された標識試薬粒子の標識を検出する。検出した標識の有無又は標識の程度により、生体分子を検出することができる。
［検出装置］
本発明の生体分子検出装置は、生体分子検出用の試験片を設置する試験片設置部、設置された試験片に光を照射するための光照射源、前記試験片からの光を集光する集光部、及び集光された光を検出する検出部を有する。そして前記集光部は、検出する生体分子を捕捉した、燐光色素含有シリカナノ粒子からなる生体分子検出用の標識試薬粒子が濃縮された前記試験片の部位からの光を集光する。さらに前記集光部は、標識試薬粒子に照射する励起光と波長領域が重なり合わない波長領域の光を透過させるフィルタを設けず、集光レンズのみからなる。
以下、本発明の生体分子検出装置の構成についてその好ましい実施形態を中心に詳述する。
本発明の生体分子検出装置は、生体分子検出用の試験片を設置する試験片設置部、設置された試験片に光を照射するための光照射源、前記試験片からの光を集光する集光部、及び集光された光を検出する検出部を有する。そして前記集光部は、検出する生体分子を捕捉した、燐光色素含有シリカナノ粒子からなる生体分子検出用の標識試薬粒子が濃縮された前記試験片の部位からの光を集光する。さらに前記集光部は、標識試薬粒子に照射する励起光と波長領域が重なり合わない波長領域の光を透過させるフィルタを設けず、集光レンズのみからなる。
以下、本発明の生体分子検出装置の構成についてその好ましい実施形態を中心に詳述する。
本発明の検出装置は生体分子検出用の試験片を設置する試験片設置部を有し、特定波長の励起光を光照射源から試験片設置部に設置された試験片に照射する。
光照射源としては特に制限はなく、水銀ランプ、ハロゲンランプ、キセノンランプ、レーザダイオード、発光ダイオードなどから適宜選択することができる。
照射する励起光の波長は特に限定されないが、２５０ｎｍ〜３４０ｎｍが好ましい。また、発光の波長は３５０ｎｍ以上が好ましく、４５０ｎｍ以上がより好ましく、５３０ｎｍ以上が特に好ましい。また、８００ｎｍ以下が好ましく、７５０ｎｍ以下がより好ましく、５８０ｎｍ以下が特に好ましい。
光照射源としては特に制限はなく、水銀ランプ、ハロゲンランプ、キセノンランプ、レーザダイオード、発光ダイオードなどから適宜選択することができる。
照射する励起光の波長は特に限定されないが、２５０ｎｍ〜３４０ｎｍが好ましい。また、発光の波長は３５０ｎｍ以上が好ましく、４５０ｎｍ以上がより好ましく、５３０ｎｍ以上が特に好ましい。また、８００ｎｍ以下が好ましく、７５０ｎｍ以下がより好ましく、５８０ｎｍ以下が特に好ましい。
（集光部）
光照射源からの光を照射され、検出する生体分子を捕捉した、後述する標識試薬粒子が濃縮された前記試験片の部位から発せられた発光を、集光部で集光する。本発明で用いる集光部は、集光レンズのみから構成される。
集光部に用いられる集光レンズに特に制限はなく、両凸レンズ、凹レンズ、平凸レンズ、メニスカス凸レンズ、フレネルレンズ、回折レンズ、シリンドリカル凸レンズなどこの種の集光部に通常用いられるレンズから適宜選択することができる。
光照射源からの光を照射され、検出する生体分子を捕捉した、後述する標識試薬粒子が濃縮された前記試験片の部位から発せられた発光を、集光部で集光する。本発明で用いる集光部は、集光レンズのみから構成される。
集光部に用いられる集光レンズに特に制限はなく、両凸レンズ、凹レンズ、平凸レンズ、メニスカス凸レンズ、フレネルレンズ、回折レンズ、シリンドリカル凸レンズなどこの種の集光部に通常用いられるレンズから適宜選択することができる。
本発明の検出装置において、集光レンズと後述する検出部との間の距離は、用いる集光レンズの大きさや開口数（ＮＡ）などによって適宜決定することができる。集光される光の受光効率や検出装置のダウンサイジングの観点からは、４ｍｍ以上が好ましく、７ｍｍ以上がより好ましく、１８ｍｍ以下が好ましく、１５ｍｍ以下がより好ましい。また、前記集光レンズにより集光された光束を光ファイバで受光して、装置内部の別の部位に取り付けられた検出部まで光を導く構造であってもよい。
また、検出部として実施例で示すような受光器としてＣＡＮ実装型のフォトダイオード（ＰＤ）を用いることを想定すると、集光レンズの口径は、２ｍｍ以上が好ましく、３ｍｍ以上がより好ましく、６ｍｍ以下が好ましく、４ｍｍ以下がより好ましい。さらに、集光レンズ側の開口数（ＮＡ）は、前記励起光を遮らないだけの距離を確保する限り特に制限はないが、０．０２以上が好ましく、０．０４以上がより好ましく、０．１以下が好ましく、０．０８以下がより好ましい。一方、検出部側のＮＡは、検出部の光受光面のＮＡに合わせて適宜決定することができる。
また、検出部として実施例で示すような受光器としてＣＡＮ実装型のフォトダイオード（ＰＤ）を用いることを想定すると、集光レンズの口径は、２ｍｍ以上が好ましく、３ｍｍ以上がより好ましく、６ｍｍ以下が好ましく、４ｍｍ以下がより好ましい。さらに、集光レンズ側の開口数（ＮＡ）は、前記励起光を遮らないだけの距離を確保する限り特に制限はないが、０．０２以上が好ましく、０．０４以上がより好ましく、０．１以下が好ましく、０．０８以下がより好ましい。一方、検出部側のＮＡは、検出部の光受光面のＮＡに合わせて適宜決定することができる。
本発明の検出装置において、この種の検出装置に通常用いられるフィルタは、必要としない。ここで「フィルタ」とは前述のように、標識試薬粒子に照射する励起光と波長領域が重なり合わない波長領域の光を透過させるフィルタである。後述するように、本発明の検出装置に適用される標識試薬粒子を構成する燐光色素含有シリカナノ粒子として、図１に示すように、励起光の励起波長領域と発光波長領域とが互いに重なり合わない粒子を使用する。そのため、従来の検出装置で設けられていた前述のフィルタは、本発明の装置では必要としない。
（検出部）
集光部で集光された光束は、検出部で検出する。本発明の検出装置における検出部としては、この種の装置で通常用いられる物から適宜選択することができ、ＰＤ、アバランシェフォトダイオード（ＡＰＤ）、光電子倍増管（ＰＭＴ）、ＣＣＤなどが挙げられる。製造コストの観点からは、ＰＤが好ましく、煩雑な製造工程を要しないＣＡＮ実装型ＰＤであることがより好ましい。
本発明で好ましく用いることができるＣＡＮ実装型ＰＤの受光面のレンズとしては、集光レンズからの光がＰＤに集光される限り特に制限はない。例えば、口径１．５ｍｍ、前記集光レンズ側のＮＡが０．２、ＰＤ側のＮＡが０．４の回転対称型両凸レンズのＣＡＮ実装型ＰＤが市販されている。
なお、検出部による検出装置の嵩張りを防止する等の観点から、集光レンズと検出部との間に光ファイバを設け、集光レンズからの光を光ファイバの端で受け、検出部に導くこともできる。このような光ファイバとしては、プラスチック光ファイバ、ガラス光ファイバ等が挙げられる。十分な内径を確保する観点からは、プラスチック光ファイバであることが好ましい。
前記検出部は、検出した光を目視で観察する目視開口部であってもよいし、検出した光をカメラなどで観察する画像検出器であってもよい。
集光部で集光された光束は、検出部で検出する。本発明の検出装置における検出部としては、この種の装置で通常用いられる物から適宜選択することができ、ＰＤ、アバランシェフォトダイオード（ＡＰＤ）、光電子倍増管（ＰＭＴ）、ＣＣＤなどが挙げられる。製造コストの観点からは、ＰＤが好ましく、煩雑な製造工程を要しないＣＡＮ実装型ＰＤであることがより好ましい。
本発明で好ましく用いることができるＣＡＮ実装型ＰＤの受光面のレンズとしては、集光レンズからの光がＰＤに集光される限り特に制限はない。例えば、口径１．５ｍｍ、前記集光レンズ側のＮＡが０．２、ＰＤ側のＮＡが０．４の回転対称型両凸レンズのＣＡＮ実装型ＰＤが市販されている。
なお、検出部による検出装置の嵩張りを防止する等の観点から、集光レンズと検出部との間に光ファイバを設け、集光レンズからの光を光ファイバの端で受け、検出部に導くこともできる。このような光ファイバとしては、プラスチック光ファイバ、ガラス光ファイバ等が挙げられる。十分な内径を確保する観点からは、プラスチック光ファイバであることが好ましい。
前記検出部は、検出した光を目視で観察する目視開口部であってもよいし、検出した光をカメラなどで観察する画像検出器であってもよい。
測定の手順は以下のものなどが挙げられる。
まず、ＰＣからファンクションジェネレーター経由であらかじめＰＭＴをＯＮにしたから、０．００１μ秒後にＰＣからファンクションジェネレーターを経由で293nmの波長のレーザーをサンプルに照射し、サンプルからの発光を１０μ秒、ＰＭＴを介して受光する。この作業を繰り返し、オシロスコープにデータを蓄積し、全データをＰＣへ出力して測定を完了する。また、ＰＣからの制御とは別に、受光状態、レーザー照射があらかじめ設定されていてもよい。
まず、ＰＣからファンクションジェネレーター経由であらかじめＰＭＴをＯＮにしたから、０．００１μ秒後にＰＣからファンクションジェネレーターを経由で293nmの波長のレーザーをサンプルに照射し、サンプルからの発光を１０μ秒、ＰＭＴを介して受光する。この作業を繰り返し、オシロスコープにデータを蓄積し、全データをＰＣへ出力して測定を完了する。また、ＰＣからの制御とは別に、受光状態、レーザー照射があらかじめ設定されていてもよい。
本発明の検出装置には、前記検出部と連動する制御部を設けることが好ましい。ここで「制御部」とは、検出部と光照射源のon/offや、on/off時間を制御する部位である。「制御部」は、パソコン（PC）からの指示により制御部であるファンクションジェネレータ（FJ）に光電子増倍管（PMT）、レーザへのトリガ信号を出力する。
前記制御部について、本発明の検出装置の好ましい実施態様のブロック図を示す図５を参照して説明する。しかし、本発明はこれに制限するものではない。
前記制御部は最初に、光電子倍増管（検出部）３０７を起動し、光電子倍増管３０７の起動中にパルスレーザー３０４（照射部）の電源３０３のon/offを行う。そして、レーザーoff後に燐光発光時間経過後に光電子倍増管３０７をoffにする。
前記制御部は最初に、光電子倍増管（検出部）３０７を起動し、光電子倍増管３０７の起動中にパルスレーザー３０４（照射部）の電源３０３のon/offを行う。そして、レーザーoff後に燐光発光時間経過後に光電子倍増管３０７をoffにする。
本発明の検出装置は、励起光の照射と、燐光の測定を遮光下で行うため、試験片をハウジングする筐体を有することが好ましい。また、本発明の検出装置は、試験片を固定し位置決めするための保持台を有することが好ましい。
標識試薬粒子の標識の検出方法に特に制限はなく、目視で検出してもよいし、汎用の燐光色素検出器を用いて検出してもよい。
また、測定開始のタイミングに特に制限はないが、測定開始時期は励起光照射後サンプルから燐光のみが発せられてからのタイミングが好ましい。フィルタ無しでもノイズが大幅に低減されるためである。また、測定時間は、燐光の持続時間内で測定時間を決定することが好ましい。有機燐光色素における燐光の持続時間は例えば10μ秒〜100m秒以下であるため、励起光をoffにした後100ミリ秒経過前に燐光の測定を開始することが好ましく、励起光をoffにした後10μ秒〜100m秒間での測定が好ましい。続けて測定する場合は、再度励起光照射後、同様の測定工程を繰り返すことが好ましい。
図６を参照して具体的に説明すると、制御部により集光部（ＰＤ１０９）をONにした後、光照射源から0.001μsec間照射後に標識試薬粒子の標識の測定を開始することが好ましい。ただし、パルスなので励起光はこの時点でカットもしくはＯＦＦにする。そして、燐光を10μs間測定、検出する。
また、測定開始のタイミングに特に制限はないが、測定開始時期は励起光照射後サンプルから燐光のみが発せられてからのタイミングが好ましい。フィルタ無しでもノイズが大幅に低減されるためである。また、測定時間は、燐光の持続時間内で測定時間を決定することが好ましい。有機燐光色素における燐光の持続時間は例えば10μ秒〜100m秒以下であるため、励起光をoffにした後100ミリ秒経過前に燐光の測定を開始することが好ましく、励起光をoffにした後10μ秒〜100m秒間での測定が好ましい。続けて測定する場合は、再度励起光照射後、同様の測定工程を繰り返すことが好ましい。
図６を参照して具体的に説明すると、制御部により集光部（ＰＤ１０９）をONにした後、光照射源から0.001μsec間照射後に標識試薬粒子の標識の測定を開始することが好ましい。ただし、パルスなので励起光はこの時点でカットもしくはＯＦＦにする。そして、燐光を10μs間測定、検出する。
以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
合成例１
アルコキシシリル基としてＡＰＳを含むカルバゾール置換体の合成について説明する。合成例１では、アルコキシシリル基との結合にアミド結合を用いた。
アルコキシシリル基としてＡＰＳを含むカルバゾール置換体の合成について説明する。合成例１では、アルコキシシリル基との結合にアミド結合を用いた。
（１）ブロモフェニルカルバゾール体２の合成
ブロモフェニルカルバゾール体２の合成手順を以下に示す。
ブロモフェニルカルバゾール体２の合成手順を以下に示す。
５０ｍＬの二つ口フラスコにカルバゾール体１ ０．２ｇ（０．９５ｍｍｏｌ，ｒａｔｉｏ：１．０）、2-チオフェンカルボン酸銅０．００２ｇ（０．００９５ｍｍｏｌ，ｒａｔｉｏ：０．０１）、ＤＭＳＯ １０ｍＬを入れ室温で撹拌した。これに、１−ブロモ−４−ヨードベンゼン０．２７ｇ（０．９５ｍｍｏｌ，ｒａｔｉｏ：１．０）をＤＭＳＯ １０ｍＬに溶解させた溶液をゆっくりと滴下して反応を開始した。反応が進行したのを確認後、反応溶液を水に入れ室温で撹拌しながらｐＨ≦１になるようにＨＣｌを加え、生じた沈殿を吸引濾過した。その後、真空乾燥させブロモフェニルカルバゾール体２を得た。収量０．１２ｇ、収率３５％であった。
（２）活性エステル体３の合成
活性エステル体３の合成手順を以下に示す。
活性エステル体３の合成手順を以下に示す。
ナス型フラスコに、ブロモフェニルカルバゾール体２０．１２ｇ（０．３３ｍｍｏｌ，ｒａｔｉｏ：１．０）、及びＮ−ヒドロキシコハク酸イミド０．０４ｇ（０．３６ｍｍｏｌ，ｒａｔｉｏ：１．１）を入れ、ＴＨＦ：ＣＨＣｌ３（３：１、体積比）３０ｍＬで溶解させた。これに、ＴＨＦ：ＣＨＣｌ３（１：４、体積比）２０ｍＬに溶解させたＷＳＣＩ・ＨＣｌ０．０７ｇ（０．３６ｍｍｏｌ，ｒ ａｔｉｏ：１．１）を２０分かけてゆっくりと滴下し、滴下後３分間反応させた。反応が進行したことを確認した後、反応液を減圧留去させた。残渣をＣＨＣｌ３で溶解し蒸留水で３回洗浄を行った。その後クロロホルム層に無水硫酸マグネシウムを入れ、濾過、減圧留去して、真空乾燥させた。これをシリカゲルカラムクロマトグラフィー精製（Ｋａｎｔｏ６０Ｎ，ＣＨＣ＝１００％）して活性エステル体３を得た。収量は０．０９ｇ、収率は５９％であった。
（３）活性エステル体３とＡＰＳとの反応
活性エステル体３とＡＰＳとの反応を以下に示す。
活性エステル体３とＡＰＳとの反応を以下に示す。
ナス型フラスコに、活性エステル体３０．０９ｇ（０．１９ｍｍｏｌ，ｒａｔｉｏ：１ ．０）、及び3-アミノプロピルトリエトキシシラン０．０４２ｍＬ（０．１９ｍｍｏｌ，ｒ ａｔｉｏ：１．０）を入れ、ＤＭＦ１０ｍＬで溶解させて室温で反応を開始した。反応が進行したことを確認した後、反応液を減圧留去させた。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー精製（Ｋａｎｔｏ ６０Ｎ，ＣＨＣｌ３：ＡＣＯＥＴ＝９．５：０．５）して目的物４（以下、カルバゾール−ＡＰＳ体１という）を得た。収量は０．０３ｇ、収率は２７％であった。
合成例２
アルコキシシリル基としてＭＰＳを含むカルバゾール置換体の合成について説明する。合成例２では、アルコキシシリル基との結合にチオエステル結合を用いた。以下に反応スキームを示す。
アルコキシシリル基としてＭＰＳを含むカルバゾール置換体の合成について説明する。合成例２では、アルコキシシリル基との結合にチオエステル結合を用いた。以下に反応スキームを示す。
ナス型フラスコに、炭酸カリウム０．０５３ｇ（０．３８ｍｍｏｌ，ｒａｔｉｏ：２．０）、及び（3-メルカプトプロピル）トリエトキシシラン０．０６９ｍＬ（０．２８５ｍｍｏｌ，ｒａｔｏ：１．５）を入れ、１,４−ジオキサン５ｍＬで溶解させてアルゴン雰囲気下、室温で撹拌した。これに１,４−ジオキサン５ｍＬに溶解させた活性エステル体３０．０９ｇ（０．１９ｍｍｏｌ，ｒａｔｉｏ：１．０）を滴下した。滴下後、８０℃で反応を開始した。反応が進行したことを確認した後、反応液を吸引濾過し減圧留去させた。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー精製（Ｋａｎｔｏ６０Ｎ，ＣＨＣｌ３：ＡＣＯＥＴ＝９．５：０．５）して目的物５（以下、カルバゾール−ＡＰＳ体２という）を得た。収量は０.０４ｇ、収率は３５％であった。
合成例３
アルコキシシリル基として（3-メルカプトプロピル）トリメトキシシランを含むカルバゾール置換体の合成について説明する。合成例３では、アルコキシシリル基との結合にチオエーテル結合を用いた。以下に反応例を示す。
アルコキシシリル基として（3-メルカプトプロピル）トリメトキシシランを含むカルバゾール置換体の合成について説明する。合成例３では、アルコキシシリル基との結合にチオエーテル結合を用いた。以下に反応例を示す。
ナス型フラスコに、化合物２（本合成例ではブロモフェニルカルバゾール体）２．０ｇ（５．４６ｍｍｏｌ，ｒａｔｉｏ：１．０）、塩化チオニル０．７９ｍＬ（１０．９ｍｍｏｌ，ｒａｔｏ：２．０）を入れ、クロロホルム５０ｍＬで溶解させてアルゴン雰囲気下、６０℃で反応を開始した。反応が進行したことを確認した後、反応液を減圧留去した。これに、エタノール１０ｍＬを加え室温で再度反応した。反応が進行したことを確認した後、反応液を減圧留去させた。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー精製（Ｋａｎｔｏ６０Ｎ，ＣＨＣｌ３：Ｈｅｘａｎｅ＝８：２）して化合物２ａを得た。収量は１.４ｇ、収率は６５％であった。
次に、ナス型フラスコに、化合物２ａ １．４ｇ（３．５５ｍｍｏｌ，ｒａｔｉｏ：１．０）、水素化ホウ素ナトリウム１．３４ｇ（３５．５ｍｍｏｌ，ｒａｔｏ：１０．０）を入れ、エタノール１００ｍＬで溶解させて８０℃で反応を開始した。反応が進行したことを確認した後、反応液を飽和重曹水に入れ室温で撹拌後、吸引濾過、真空乾燥させた。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー精製（Ｋａｎｔｏ６０Ｎ，ＣＨＣｌ３：ＡＣＯＥＴ＝８：２）して化合物６を得た。収量は０.８６ｇ、収率は６９％であった。
次に、ナス型フラスコに、化合物６ ０．８６ｇ（２．４４ｍｍｏｌ，ｒａｔｉｏ：１．０）、塩化チオニル１．７７ｍＬ（２４．４ｍｍｏｌ，ｒａｔｉｏ：１０．０）を入れ、クロロホルム５０ｍＬで溶解させて６０℃で反応を開始した。反応が進行したことを確認した後、反応液を水、飽和重曹水の順に洗浄してクロロホルムで抽出した。これに硫酸マグネシウムを入れ、吸引濾過後、減圧留去させた。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー精製（Ｋａｎｔｏ ６０Ｎ，ＣＨＣｌ３：Ｈｅｘａｎｅ＝６：４）して化合物７を得た。収量は０.５５ｇ、収率は６０％であった。
次に、ナス型フラスコに、炭酸カリウム０．０７５ｇ（０．５４ｍｍｏｌ，ｒａｔｉｏ：２．０）、3-メルカプトプロピルトリエトキシシラン０．０９８ｍＬ（０．４０５ｍｍｏｌ，ｒａｔｏ：１．５）、化合物７ ０．１ｇ（０．２７ｍｍｏｌ，ｒａｔｉｏ：１．０）を入れ、アセトニトリル１０ｍＬで溶解させてアルゴン雰囲気下、７５℃で反応を開始した。反応が進行したことを確認した後、反応液を吸引濾過し減圧留去させた。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー精製（Ｋａｎｔｏ ６０Ｎ，ＣＨＣｌ３：Ｈｅｘａｎｅ＝８：２）して目的物８（以下、カルバゾール−ＡＰＳ体３という）を得た。収量は０.０６３ｇ、収率は４３％であった。
（紫外線退光試験）
クロロホルムに溶解させたカルバゾール−ＡＰＳ体１をスライドガラス上に垂らし、乾燥させ、室温にて膜状のサンプルを作製した。作製したサンプルに紫外線を照射して、１時間おきにデジタルカメラまたは蛍光顕微鏡でサンプルの退光を観察した。
クロロホルムに溶解させたカルバゾール−ＡＰＳ体１をスライドガラス上に垂らし、乾燥させ、室温にて膜状のサンプルを作製した。作製したサンプルに紫外線を照射して、１時間おきにデジタルカメラまたは蛍光顕微鏡でサンプルの退光を観察した。
紫外線退光試験には、以下の装置を用いた。
紫外線ランプ：アズワンＳＬＵＶ−４、照射波長 ３６５ｎｍ
デジタルカメラ：ＲＩＣＯＨ ＣＸ４
蛍光顕微鏡：ＯＬＹＭＰＵＳ ＢＸ５０
励起フィルタ：ＥＴ３９５／４０Ｘ
ダイクロイックミラー Ｔ４７０ｐｘｒ
吸収フィルタ：ＥＴ５２５／２０ｍ
紫外線ランプ：アズワンＳＬＵＶ−４、照射波長 ３６５ｎｍ
デジタルカメラ：ＲＩＣＯＨ ＣＸ４
蛍光顕微鏡：ＯＬＹＭＰＵＳ ＢＸ５０
励起フィルタ：ＥＴ３９５／４０Ｘ
ダイクロイックミラー Ｔ４７０ｐｘｒ
吸収フィルタ：ＥＴ５２５／２０ｍ
顕微鏡撮影条件は、以下の通りである。
露出時間：１．０ｓｅｃ
ＩＳＯ感度：２００
対物レンズ：１０ｘ
露出時間：１．０ｓｅｃ
ＩＳＯ感度：２００
対物レンズ：１０ｘ
紫外線照射前と紫外線照射１時間〜６時間後のデジタルカメラによる観察画像から、カルバゾール−ＡＰＳ体１では紫外線照射６時間後でも退光は認められなかった。また、蛍光顕微鏡で観察した場合でも、紫外線照射６時間後で退光は認められなかった。
なお、カルバゾール−ＡＰＳ体２及び３についても同様の試験を行ったが、紫外線照射６時間後で退光は認められなかった。
なお、カルバゾール−ＡＰＳ体２及び３についても同様の試験を行ったが、紫外線照射６時間後で退光は認められなかった。
（調製例１）燐光色素含有標識シリカナノ粒子の調製
カルバゾール−ＡＰＳ体１をＤＭＦに溶解して調製した５ｍＭのカルバゾール−ＡＰＳ体１溶液６００μＬと、エタノール１４０ｍＬ、ＴＥＯＳ（信越シリコーン社製）６．５ｍＬ、蒸留水２０ｍＬ及び２８質量％アンモニア水１５ｍＬを混合し、室温で２４時間反応を行った。
反応液を１８０００×ｇの重力加速度で３０分間遠心分離を行い、上清を除去した。沈殿した燐光色素含有シリカナノ粒子に蒸留水を４ｍＬ加え、該粒子を分散させ、再度１８０００×ｇの重力加速度で３０分間遠心分離を行った。本洗浄操作をさらに２回繰り返し、燐光色素含有シリカナノ粒子の分散液に含まれる未反応のＴＥＯＳやアンモニア等を除去し、平均粒径２５０ｎｍの燐光色素含有シリカナノ粒子２．３３ｇを得た。収率約９０％であった。
カルバゾール−ＡＰＳ体１をＤＭＦに溶解して調製した５ｍＭのカルバゾール−ＡＰＳ体１溶液６００μＬと、エタノール１４０ｍＬ、ＴＥＯＳ（信越シリコーン社製）６．５ｍＬ、蒸留水２０ｍＬ及び２８質量％アンモニア水１５ｍＬを混合し、室温で２４時間反応を行った。
反応液を１８０００×ｇの重力加速度で３０分間遠心分離を行い、上清を除去した。沈殿した燐光色素含有シリカナノ粒子に蒸留水を４ｍＬ加え、該粒子を分散させ、再度１８０００×ｇの重力加速度で３０分間遠心分離を行った。本洗浄操作をさらに２回繰り返し、燐光色素含有シリカナノ粒子の分散液に含まれる未反応のＴＥＯＳやアンモニア等を除去し、平均粒径２５０ｎｍの燐光色素含有シリカナノ粒子２．３３ｇを得た。収率約９０％であった。
（２）チオール基の導入
上記で得た粒子１ｇを水／エタノール＝１／４の混合液１５０ｍＬに分散させた。これにＭＰＳ（和光純薬株式会社製）を１．５ｍＬ加えた。続いて２８％アンモニア水２０ｍＬを加え、室温で４時間混合した。
反応液を１８０００×ｇの重力加速度で３０分間遠心分離を行い、上清を除去した。沈殿したシリカナノ粒子に蒸留水を１０ｍＬ加え、粒子を分散させ、再度１８０００×ｇの重力加速度で３０分間遠心分離を行った。本洗浄操作をさらに２回繰り返し、チオール基を有する燐光色素含有シリカナノ粒子の分散液に含まれる未反応のＭＰＳやアンモニア等を除去し、チオール基が導入された燐光色素含有シリカナノ粒子（以下、チオール基導入燐光色素含有シリカナノ粒子Ａと呼ぶ。）を得た。
得られたチオール基導入燐光色素含有シリカナノ粒子Ａ ５００ｍｇについて、ＤＮＴＢを用いて導入されたチオール基の定量分析を行った。その結果、チオール基導入燐光色素含有シリカナノ粒子Ａの粒子表面のチオール基の密度は、０．０４６個／ｎｍ２であった。
上記で得た粒子１ｇを水／エタノール＝１／４の混合液１５０ｍＬに分散させた。これにＭＰＳ（和光純薬株式会社製）を１．５ｍＬ加えた。続いて２８％アンモニア水２０ｍＬを加え、室温で４時間混合した。
反応液を１８０００×ｇの重力加速度で３０分間遠心分離を行い、上清を除去した。沈殿したシリカナノ粒子に蒸留水を１０ｍＬ加え、粒子を分散させ、再度１８０００×ｇの重力加速度で３０分間遠心分離を行った。本洗浄操作をさらに２回繰り返し、チオール基を有する燐光色素含有シリカナノ粒子の分散液に含まれる未反応のＭＰＳやアンモニア等を除去し、チオール基が導入された燐光色素含有シリカナノ粒子（以下、チオール基導入燐光色素含有シリカナノ粒子Ａと呼ぶ。）を得た。
得られたチオール基導入燐光色素含有シリカナノ粒子Ａ ５００ｍｇについて、ＤＮＴＢを用いて導入されたチオール基の定量分析を行った。その結果、チオール基導入燐光色素含有シリカナノ粒子Ａの粒子表面のチオール基の密度は、０．０４６個／ｎｍ２であった。
（３）チオール基を介した燐光色素含有シリカナノ粒子と抗体との結合
チオール基導入燐光色素含有シリカナノ粒子Ａの分散液（濃度２５ｍｇ／ｍＬ、分散媒：蒸留水）４０μＬに、ＤＭＦ４６０μＬを加え、１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離した。上清を除去し、ＤＭＦを５００μＬ加え遠心分離し、上清を除去した。再度ＤＭＦを５００μＬ加えチオール基導入燐光色素含有シリカナノ粒子Ａを分散させた。これにリンカー分子としてＮ−(４−アミノフェニル)マレイミドを１ｍｇ加え、３０分混合することで、上記リンカー分子のマレイミド基とチオール基導入燐光色素含有シリカナノ粒子のチオール基との間でチオエーテル結合を形成させた。
この反応液を１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離し、上清を除去後、蒸留水９０．６μＬを加え、粒子を分散させた。続いて、０．５Ｍ ＭＥＳ（2-モルホリノエタンスルホン酸)（ｐＨ６．０）１００μＬ、５０ｍｇ／ｍＬ ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）２３０．４μＬ、１９．２ｍｇ／ｍＬ ＥＤＣ（1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）７５μＬを加え混合した。これに抗Ａ型インフルエンザ核タンパク質抗体（６．２ｍｇ／ｍＬ、マウス由来、HyTest社製）を４．０μＬ加え、１０分間混合した。
１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離し、上清を除去した。そして、１０ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．５）４００μＬを加え、粒子を分散させた。続いて１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離し、上清を除去した。再度１０ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．５）４００μＬを加え、粒子を分散させてコロイドを得た。
このコロイドをサンプルとして、タンパク定量を行った。タンパク定量はPierceBCA Protein Assay Kit（商品名、Thermo Fisher Scientific社製）を用いた。その結果、燐光色素含有シリカナノ粒子１ｇあたりの抗体の結合量は、７．９ｍｇであった。
チオール基導入燐光色素含有シリカナノ粒子Ａの分散液（濃度２５ｍｇ／ｍＬ、分散媒：蒸留水）４０μＬに、ＤＭＦ４６０μＬを加え、１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離した。上清を除去し、ＤＭＦを５００μＬ加え遠心分離し、上清を除去した。再度ＤＭＦを５００μＬ加えチオール基導入燐光色素含有シリカナノ粒子Ａを分散させた。これにリンカー分子としてＮ−(４−アミノフェニル)マレイミドを１ｍｇ加え、３０分混合することで、上記リンカー分子のマレイミド基とチオール基導入燐光色素含有シリカナノ粒子のチオール基との間でチオエーテル結合を形成させた。
この反応液を１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離し、上清を除去後、蒸留水９０．６μＬを加え、粒子を分散させた。続いて、０．５Ｍ ＭＥＳ（2-モルホリノエタンスルホン酸)（ｐＨ６．０）１００μＬ、５０ｍｇ／ｍＬ ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）２３０．４μＬ、１９．２ｍｇ／ｍＬ ＥＤＣ（1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）７５μＬを加え混合した。これに抗Ａ型インフルエンザ核タンパク質抗体（６．２ｍｇ／ｍＬ、マウス由来、HyTest社製）を４．０μＬ加え、１０分間混合した。
１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離し、上清を除去した。そして、１０ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．５）４００μＬを加え、粒子を分散させた。続いて１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離し、上清を除去した。再度１０ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．５）４００μＬを加え、粒子を分散させてコロイドを得た。
このコロイドをサンプルとして、タンパク定量を行った。タンパク定量はPierceBCA Protein Assay Kit（商品名、Thermo Fisher Scientific社製）を用いた。その結果、燐光色素含有シリカナノ粒子１ｇあたりの抗体の結合量は、７．９ｍｇであった。
続いて上記コロイドに１０％ＢＳＡを１０μＬ加え１０分間混合した。１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離し、上清を除去した。そして１０ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．５）５００μＬを加え、粒子を分散させ、１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離し、上清を除去した。再度１０ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．５）４００μＬを加え、粒子を分散させ、抗Ａ型インフルエンザ核タンパク質抗体が結合した燐光色素含有シリカナノ粒子Ａが分散したコロイドを得た。
得られた燐光色素含有標識シリカナノ粒子は、励起波長が２９３ｎｍであり、発光波長は５００〜６００ｎｍであった。
得られた燐光色素含有標識シリカナノ粒子は、励起波長が２９３ｎｍであり、発光波長は５００〜６００ｎｍであった。
（調製例２）イムノクロマトグラフィー用テストストリップの作製
メンブレン３（丈２５ｍｍ、商品名：Hi-Flow Plus180 メンブレン、MILLIPORE社製）の端から約６ｍｍの位置に、幅約１ｍｍの試験領域（テストライン）２０として、ウサギ由来の抗Ａ型インフルエンザ核タンパク質抗体（ポリクローナル抗体、自社製）を１ｍｇ／ｍＬ含有する溶液（（５０ｍＭＫＨ2ＰＯ4，ｐＨ７．０）＋５％スクロース）を０．７５μＬ／ｃｍの塗布量で塗布した。
メンブレン３（丈２５ｍｍ、商品名：Hi-Flow Plus180 メンブレン、MILLIPORE社製）の端から約６ｍｍの位置に、幅約１ｍｍの試験領域（テストライン）２０として、ウサギ由来の抗Ａ型インフルエンザ核タンパク質抗体（ポリクローナル抗体、自社製）を１ｍｇ／ｍＬ含有する溶液（（５０ｍＭＫＨ2ＰＯ4，ｐＨ７．０）＋５％スクロース）を０．７５μＬ／ｃｍの塗布量で塗布した。
続いて、幅約１ｍｍのコントロールライン２１として、ヤギ由来の抗マウスＩｇＧ抗体（AKP Goat anti-mouse IgG Antibody、BioLegend社製）を１ｍｇ／ｍＬで含有する溶液（（５０ｍＭＫＨ2ＰＯ4，ｐＨ７．０）シュガー・フリー）を０．７５μＬ／ｃｍの塗布量で塗布し、５０℃で３分乾燥させた。なお、テストライン２０とコントロールライン２１との間隔は３ｍｍとした。
前記抗体固定化メンブレン３、サンプルパッド（商品名：Glass Fiber Conjugate Pad（ＧＦＣＰ）、MILLIPORE社製）２、及び吸収パッド（商品名：Cellulose Fiber Sample Pad（ＣＦＳＰ）、MILLIPORE社製）４の順で、バッキングシート（商品名：AR9020、Adhesives Research社製）６上で組み立てた。なお、メンブレン３はテストライン２０がサンプルパッド２側、コントロールライン２１が吸収パッド４側になる向きで構成した。続いて、５ｍｍ幅、長さ６０ｍｍのストリップ状に切断し、生体分子検出用テストストリップ１を作製した。
（構成例１）
本発明の生体分子検出装置の好ましい実施態様として、燐光の測定装置の一部の縦断面図を図７に示す。ここで図７において、光照射部は省略する。
図７に示す装置では、装置内の保持台（図示せず）に固定された試験片１０１を、集光レンズの焦点１０２よりも手前の位置に、光軸方向に対して略垂直となるよう配置する。前記集光レンズは、測定対象領域１１０側を凸面とした平凸回転対称型レンズ１０３と、測定対象領域１１０に対して反対側を凸面とした平凸回転対称型レンズ１０４とからなる。ここで図７に示す装置では、従来の生体分子検出装置で設けられている励起光カットフィルタが省略されている。
本発明の生体分子検出装置の好ましい実施態様として、燐光の測定装置の一部の縦断面図を図７に示す。ここで図７において、光照射部は省略する。
図７に示す装置では、装置内の保持台（図示せず）に固定された試験片１０１を、集光レンズの焦点１０２よりも手前の位置に、光軸方向に対して略垂直となるよう配置する。前記集光レンズは、測定対象領域１１０側を凸面とした平凸回転対称型レンズ１０３と、測定対象領域１１０に対して反対側を凸面とした平凸回転対称型レンズ１０４とからなる。ここで図７に示す装置では、従来の生体分子検出装置で設けられている励起光カットフィルタが省略されている。
光照射源から測定対象領域１１０に照射され、平凸回転対称型レンズ１０４で集光された光束は、ＣＡＮ実装型フォトダイオード１０６で受光する。ＣＡＮ実装型ＰＤ１０６は、回転対称型両凸レンズ１０７で受光、集光し、台座１０８上のＰＤ１０９で受光する構成となっている。
なお、ＣＡＮ実装型ＰＤ１０６は制御機構と連動する。この制御機構は、ＰＤ１０９をONにした後、光照射源から0.001μ秒間照射後に測定を開始した。なお、パルスなので励起光はこの時点でカットした。さらに、測定時間は、10μ秒間とした。
なお、ＣＡＮ実装型ＰＤ１０６は制御機構と連動する。この制御機構は、ＰＤ１０９をONにした後、光照射源から0.001μ秒間照射後に測定を開始した。なお、パルスなので励起光はこの時点でカットした。さらに、測定時間は、10μ秒間とした。
（構成例２）
本発明の生体分子検出装置の別の好ましい実施態様として、別の燐光の測定装置の一部の縦断面図を図８（ａ）に、図８（ａ）の縦断面図におけるＡ−Ｂ線断面図を図８（ｂ）に、それぞれ示す。ここで図８（ａ）及び（ｂ）において、光照射部は省略する。
図８（ａ）及び（ｂ）の装置では、装置内の保持台（図示せず）に固定された試験片２０１を、測定対象領域２１０側を凸面とした平凸シリンドリカルレンズ２０２の焦点よりも手前の位置に、光軸方向に対して略垂直となるように配置する。平凸シリンドリカルレンズ２０２は平行光を試験片２０１に対して垂直な線上に集光させるレンズである。また平凸シリンドリカルレンズ２０３は検出部側が凸面となっており、測定対象領域２０１側からの平行光を試験片２０１に対して垂直な方向にのみ集光させる。
本発明の生体分子検出装置の別の好ましい実施態様として、別の燐光の測定装置の一部の縦断面図を図８（ａ）に、図８（ａ）の縦断面図におけるＡ−Ｂ線断面図を図８（ｂ）に、それぞれ示す。ここで図８（ａ）及び（ｂ）において、光照射部は省略する。
図８（ａ）及び（ｂ）の装置では、装置内の保持台（図示せず）に固定された試験片２０１を、測定対象領域２１０側を凸面とした平凸シリンドリカルレンズ２０２の焦点よりも手前の位置に、光軸方向に対して略垂直となるように配置する。平凸シリンドリカルレンズ２０２は平行光を試験片２０１に対して垂直な線上に集光させるレンズである。また平凸シリンドリカルレンズ２０３は検出部側が凸面となっており、測定対象領域２０１側からの平行光を試験片２０１に対して垂直な方向にのみ集光させる。
平凹シリンドリカルレンズ２０４は測定対象領域２０１側を凹面とするレンズであり、平凸シリンドリカルレンズ２０３により試験片２０１に対して垂直な方向に集光された光束を平行光とする。また回転対称型平凸レンズ２０５は、平凹シリンドリカルレンズ２０４により形成された平行光を集光する、検出部側を凸面とした回転対称型平凸レンズである。ここで図８（ａ）及び（ｂ）に示す装置では、従来の生体分子検出装置で設けられている励起光カットフィルタが省略されている。
回転対称型平凸レンズ２０５により集光された光束は、図７に示すＣＡＮ搭載型ＰＤ１０６と同様のＣＡＮ搭載型ＰＤで受光される。なお、ＣＡＮ実装型ＰＤは図７に示すＣＡＮ搭載型ＰＤ１０６と同様、制御機構と連動する。この制御機構による制御方法は、構成例１と同様である。
回転対称型平凸レンズ２０５により集光された光束は、図７に示すＣＡＮ搭載型ＰＤ１０６と同様のＣＡＮ搭載型ＰＤで受光される。なお、ＣＡＮ実装型ＰＤは図７に示すＣＡＮ搭載型ＰＤ１０６と同様、制御機構と連動する。この制御機構による制御方法は、構成例１と同様である。
（試験例）インフルエンザ核タンパク質の検出
表１に示す組成で、Ａ型インフルエンザ核タンパク質の溶液を調製した。続いて同混合液１００μＬと、調製例１で調製した燐光色素含有シリカナノ粒子Ａを分散させたコロイド（２．５ｍｇ／ｍＬ）２μＬの混合液をテストストリップ１のサンプルパッド２に滴下した。１５分後、下記検出器によって測定しラインの発光強度を数値化した。
その結果を表１に示す。
表１に示す組成で、Ａ型インフルエンザ核タンパク質の溶液を調製した。続いて同混合液１００μＬと、調製例１で調製した燐光色素含有シリカナノ粒子Ａを分散させたコロイド（２．５ｍｇ／ｍＬ）２μＬの混合液をテストストリップ１のサンプルパッド２に滴下した。１５分後、下記検出器によって測定しラインの発光強度を数値化した。
その結果を表１に示す。
＜検出装置＞
光源と光学フィルタと光電子倍増管（ＰＭＴ）からなる検出ユニットを有し、該検出ユニットが、モーターによって一定速度で直線移動する機構を備え、ＰＭＴの受光強度を５０μ秒ごとに記録する記録機構を備えた検出装置を作製した。
なお、検出ユニットは、光源が２９３ｎｍのレーザダイオードであり、レーザダイオードをサンプルに照射しＰＭＴで受光する機構を基本的な構成として有する。そして、実施例１として検出ユニットに光学フィルタ用意しない装置を作製した。一方、比較例１として、サンプルからの蛍光をＰＭＴで受光する前に４２０ｎｍ以上の波長の光のみを透過する光学フィルタを設置した装置を作製した。
光源と光学フィルタと光電子倍増管（ＰＭＴ）からなる検出ユニットを有し、該検出ユニットが、モーターによって一定速度で直線移動する機構を備え、ＰＭＴの受光強度を５０μ秒ごとに記録する記録機構を備えた検出装置を作製した。
なお、検出ユニットは、光源が２９３ｎｍのレーザダイオードであり、レーザダイオードをサンプルに照射しＰＭＴで受光する機構を基本的な構成として有する。そして、実施例１として検出ユニットに光学フィルタ用意しない装置を作製した。一方、比較例１として、サンプルからの蛍光をＰＭＴで受光する前に４２０ｎｍ以上の波長の光のみを透過する光学フィルタを設置した装置を作製した。
測定は、以下の手順で行った。まず、ＰＣからファンクションジェネレーター経由であらかじめＰＭＴをＯＮにしてから、０．００１μ秒後にＰＣからファンクションジェネレーターを経由で293nmの波長のレーザーをサンプルに照射し、サンプルからの発光を１０μ秒、ＰＭＴを介して受光した。この作業を繰り返し、オシロスコープにデータを蓄積し、全データをＰＣへ出力した。
測定結果から実施例１と比較例１のテストラインにおける発光強度を比較した。光学フィルタを用いた比較例１の発光強度は抗原濃度０、２０、５０ｎｇ／ｍＬに対して、３、７０、１９６a.u.であった。実施例１の発光強度は抗原濃度０、２０、５０ｎｇ／ｍＬに対して、４、６７、１９０a.u.であった。
上記結果から、光学フィルタのない実施例１でも検体の検出濃度範囲が確保でき、微量の抗原検出に対して十分な感度が得られると考えられた。
上記結果から、光学フィルタのない実施例１でも検体の検出濃度範囲が確保でき、微量の抗原検出に対して十分な感度が得られると考えられた。
１ テストストリップ
２ サンプルパッド
３ メンブレン
４ 吸収パッド
６ バッキングシート
１０ 試験領域
２０ 試験領域
２１ 参照領域
２ サンプルパッド
３ メンブレン
４ 吸収パッド
６ バッキングシート
１０ 試験領域
２０ 試験領域
２１ 参照領域
１０１ 試験片
１０２ 焦点
１０３ 平凸回転対称型レンズ
１０４ 平凸回転対称型レンズ
１０６ ＣＡＮ搭載型ＰＤ
１０７ 回転対称型両凸レンズ
１０８ 台座
１０９ ＰＤ
１１０ 測定対象領域
１０２ 焦点
１０３ 平凸回転対称型レンズ
１０４ 平凸回転対称型レンズ
１０６ ＣＡＮ搭載型ＰＤ
１０７ 回転対称型両凸レンズ
１０８ 台座
１０９ ＰＤ
１１０ 測定対象領域
Claims (25)
- 生体分子検出用の試験片と、下記一般式（１）で表される燐光色素を含有するシリカナノ粒子からなる生体分子検出用の標識試薬粒子を有する生体分子検出用試験キットであって、
前記試験片は、生体分子を捕捉する試験領域を設けた、前記標識試薬粒子が移行するメンブレンを含んでなり、標的物質とする生体分子を捕捉した標識試薬粒子が前記試験領域に固定化され、
生体分子に対する結合性を有する捕捉物質が前記燐光色素含有シリカナノ粒子の表面に導入されている、生体分子検出用試験キット。
Ｘ―Ｙ−Ｑ−Ｚ−Ｓｉ（Ｒ１）ｎ（ＯＲ２）（３−ｎ） 一般式（１）
（一般式（１）において、Ｘは有機燐光色素を示し、Ｙは単結合、−（ＣＨ２）ｐ−、又は−（Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２）ｑ−を示す。ここで、ｐ及びｑはそれぞれ１〜１０の整数である。Ｑはアミド結合、エーテル結合、チオエーテル結合、チオエステル結合、チオウレア結合、ジスルフィド結合、又はポリオキシエチレン結合であり、Ｚは−（ＣＨ２）３−又は−（ＣＨ２）２ＮＨ（ＣＨ２）３−を示す。Ｒ１及びＲ２はそれぞれ炭素原子数が１〜４のアルキル基を示し、ｎは０又は１である。） - 前記燐光色素含有シリカナノ粒子が、紫外線を吸収して可視光領域側の燐光を発する紫外励起燐光色素をシリカ粒子中に含有する紫外励起燐光粒子である、請求項１に記載のキット。
- 前記紫外励起燐光色素の発光寿命が10マイクロ秒以上100ミリ秒以下である、請求項２に記載のキット。
- 前記紫外励起燐光色素の励起波長が２３０ｎｍ〜３５０ｎｍの範囲にあり、前記紫外励起燐光粒子の燐光発光ピークが４５０〜６００ｎｍの間にある、請求項２又は３に記載のキット。
- 前記燐光色素含有シリカナノ粒子の平均粒径が６０ｎｍ以上３００ｎｍ以下である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の試験キット。
- 前記メンブレンに、標的物質とする生体分子を捕捉していない標識試薬粒子が固定化される参照領域をさらに設けた、請求項１〜５のいずれか１項に記載の試験キット。
- 生体分子検出用試験キットを用いた生体分子の検出方法であって、
前記生体分子検出用試験キットは、生体分子検出用の試験片と、下記一般式（１）で表される燐光色素含有シリカナノ粒子からなる生体分子検出用の標識試薬粒子を有し、
前記試験片は、生体分子を捕捉する試験領域設けた、前記標識試薬粒子が移行するメンブレンを含んでなり、標的物質とする生体分子を捕捉した標識試薬粒子が前記試験領域に固定化され、
生体分子に対する結合性を有する捕捉物質が前記燐光色素含有シリカナノ粒子の表面に導入されている、
生体分子の検出方法。
Ｘ―Ｙ−Ｑ−Ｚ−Ｓｉ（Ｒ１）ｎ（ＯＲ２）（３−ｎ） 一般式（１）
（一般式（１）において、Ｘは有機燐光色素を示し、Ｙは単結合、−（ＣＨ２）ｐ−、又は−（Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２）ｑ−を示す。ここで、ｐ及びｑはそれぞれ１〜１０の整数である。Ｑはアミド結合、エーテル結合、チオエーテル結合、チオエステル結合、チオウレア結合、ジスルフィド結合、又はポリオキシエチレン結合であり、Ｚは−（ＣＨ２）３−又は−（ＣＨ２）２ＮＨ（ＣＨ２）３−を示す。Ｒ１及びＲ２はそれぞれ炭素原子数が１〜４のアルキル基を示し、ｎは０又は１である。） - 前記燐光色素含有シリカナノ粒子が、紫外線を吸収して可視光領域側の燐光を発する紫外励起燐光色素をシリカ粒子中に含有する紫外励起燐光粒子である、請求項７に記載の生体分子の検出方法。
- 前記紫外励起燐光色素の発光寿命が10マイクロ秒以上100ミリ秒以下である、請求項８に記載の生体分子の検出方法。
- 前記紫外励起燐光色素の励起波長が２３０ｎｍ〜３５０ｎｍの範囲にあり、前記紫外励起燐光粒子の燐光発光ピークが４５０〜６００ｎｍの間にある、請求項８又は９に記載の生体分子の検出方法。
- 前記燐光色素含有シリカナノ粒子の平均粒径が６０ｎｍ以上３００ｎｍ以下である、請求項７〜１０のいずれか１項に記載の生体分子の検出方法。
- 前記燐光色素含有シリカナノ粒子への励起光の照射停止後、100ミリ秒経過前に燐光の測定を開始する、請求項７〜１１のいずれか１項に記載の生体分子の検出方法。
- 前記燐光色素含有シリカナノ粒子への励起光の照射停止後、10マイクロ秒以上経過後100ミリ秒経過前に燐光の測定を開始する、請求項７〜１２のいずれか１項に記載の生体分子の検出方法。
- 前記燐光色素含有シリカナノ粒子への励起光の照射停止後、前記燐光色素含有シリカナノ粒子の燐光発光持続時間内で燐光を測定する、請求項７〜１３のいずれか１項に記載の生体分子の検出方法。
- 前記メンブレンに、標的物質とする生体分子を捕捉していない標識試薬粒子が固定化される参照領域をさらに設けた、請求項７〜１４のいずれか１項に記載の生体分子の検出方法。
- 下記一般式（１）で表される燐光色素含有シリカナノ粒子からなる、生体分子検出用標識試薬。
Ｘ―Ｙ−Ｑ−Ｚ−Ｓｉ（Ｒ１）ｎ（ＯＲ２）（３−ｎ） 一般式（１）
（一般式（１）において、Ｘは有機燐光色素を示し、Ｙは単結合、−（ＣＨ２）ｐ−、又は−（Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２）ｑ−を示す。ここで、ｐ及びｑはそれぞれ１〜１０の整数である。Ｑはアミド結合、エーテル結合、チオエーテル結合、チオエステル結合、チオウレア結合、ジスルフィド結合、又はポリオキシエチレン結合であり、Ｚは−（ＣＨ２）３−又は−（ＣＨ２）２ＮＨ（ＣＨ２）３−を示す。Ｒ１及びＲ２はそれぞれ炭素原子数が１〜４のアルキル基を示し、ｎは０又は１である。） - 前記燐光色素含有シリカナノ粒子が、紫外線を吸収して可視光領域側の燐光を発する紫外励起燐光色素をシリカ粒子中に含有する紫外励起燐光粒子である、請求項１６に記載の生体分子検出用標識試薬。
- 前記紫外励起燐光色素の発光寿命が10マイクロ秒以上100ミリ秒以下である、請求項１７に記載の生体分子検出用標識試薬。
- 前記紫外励起燐光色素の励起波長が２３０ｎｍ〜３５０ｎｍの範囲にあり、前記紫外励起燐光粒子の燐光発光ピークが４５０〜６００ｎｍの間にある、請求項１７又は１８に記載の生体分子検出用標識試薬。
- 前記燐光色素含有シリカナノ粒子の平均粒径が６０ｎｍ以上３００ｎｍ以下である、請求項１６〜１９のいずれか１項に記載の生体分子検出用標識試薬。
- 生体分子検出用の試験片を設置する試験片設置部、
設置された試験片に光を照射するための光照射源、
前記試験片からの光を集光する集光部、及び
集光された光を検出する検出部、を有する生体分子検出装置であって、
前記集光部は、検出する生体分子を捕捉した、下記一般式（１）で表される燐光色素含有シリカナノ粒子からなる生体分子検出用の標識試薬粒子が濃縮された前記試験片の部位からの光を集光するものであり、
前記集光部は、前記標識試薬粒子に照射する励起光と波長領域が重なり合わない波長領域の光を透過させるフィルタを介さずに集光する、生体分子検出装置。
Ｘ―Ｙ−Ｑ−Ｚ−Ｓｉ（Ｒ１）ｎ（ＯＲ２）（３−ｎ） 一般式（１）
（一般式（１）において、Ｘは有機燐光色素を示し、Ｙは単結合、−（ＣＨ２）ｐ−、又は−（Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２）ｑ−を示す。ここで、ｐ及びｑはそれぞれ１〜１０の整数である。Ｑはアミド結合、エーテル結合、チオエーテル結合、チオエステル結合、チオウレア結合、ジスルフィド結合、又はポリオキシエチレン結合であり、Ｚは−（ＣＨ２）３−又は−（ＣＨ２）２ＮＨ（ＣＨ２）３−を示す。Ｒ１及びＲ２はそれぞれ炭素原子数が１〜４のアルキル基を示し、ｎは０又は１である。） - 前記検出部と連動し、検出部と光照射源のon/off、又はon/off時間を制御する制御部を有することを特徴とする、請求項２１に記載の生体分子検出装置。
- 前記光照射源をoffにした後の10μ秒〜100m秒間で、前記標識試薬粒子の標識を測定する、請求項２１又は２２に記載の生体分子検出装置。
- 前記燐光色素含有シリカナノ粒子の平均粒径が６０ｎｍ以上３００ｎｍ以下である、請求項２１〜２３のいずれか１項に記載の生体分子検出装置。
- 請求項２１〜２４のいずれか１項に記載の生体分子検出装置を用いた、生体分子の検出方法。
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| JP2017046220A JP2018151201A (ja) | 2017-03-10 | 2017-03-10 | 生体分子検出用試験キット、生体分子検出装置、及びこれらを用いた生体分子の検出方法、並びにこれらに用いられる生体分子検出用標識試薬粒子 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2017046220A JP2018151201A (ja) | 2017-03-10 | 2017-03-10 | 生体分子検出用試験キット、生体分子検出装置、及びこれらを用いた生体分子の検出方法、並びにこれらに用いられる生体分子検出用標識試薬粒子 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2018151201A true JP2018151201A (ja) | 2018-09-27 |
Family
ID=63680390
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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| JP2017046220A Pending JP2018151201A (ja) | 2017-03-10 | 2017-03-10 | 生体分子検出用試験キット、生体分子検出装置、及びこれらを用いた生体分子の検出方法、並びにこれらに用いられる生体分子検出用標識試薬粒子 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2018151201A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2022209892A1 (ja) * | 2021-03-31 | 2022-10-06 | 日産化学株式会社 | 電荷輸送性ワニス |
| CN117309825A (zh) * | 2023-11-30 | 2023-12-29 | 四川蜀道建筑科技有限公司 | 一种透光检测亚甲蓝mb值的设备 |
-
2017
- 2017-03-10 JP JP2017046220A patent/JP2018151201A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2022209892A1 (ja) * | 2021-03-31 | 2022-10-06 | 日産化学株式会社 | 電荷輸送性ワニス |
| CN117309825A (zh) * | 2023-11-30 | 2023-12-29 | 四川蜀道建筑科技有限公司 | 一种透光检测亚甲蓝mb值的设备 |
| CN117309825B (zh) * | 2023-11-30 | 2024-04-09 | 四川蜀道建筑科技有限公司 | 一种透光检测亚甲蓝mb值的设备 |
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