KR102350870B1 - 유기 착색 미립자, 진단약 키트 및 인비트로 진단 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은, 양호한 백그라운드 및 검사 결과의 재현성을 가지며, 충분한 검출 감도를 갖는 면역크로마토그래피 진단 키트에 이용하는 유기 착색 미립자를 제공한다. 본 발명의 유기 착색 미립자는, 평균 입자경이 100∼650 nm이고, 발색 강도가 1.0∼10.0이며, 입자경 400 nm∼12000 nm의 범위에서 총 개수 100000개의 입자를 검지했을 때, 입자경 700 nm 이상의 조대 입자의 존재율이 5% 이하이고, 또한 장경(L)/단경(D)으로 표시되는 진구도가 1.0∼2.5인 것을 특징으로 한다.

Description

유기 착색 미립자, 진단약 키트 및 인비트로 진단 방법

본 발명은, 유기 고분자 유래의 유기 착색 미립자, 그리고 그것을 이용한 진단약 키트 및 인비트로 진단 방법에 관한 것이다.

최근, 바이러스, 세균 등의 병원체 감염의 유무, 임신의 유무, 암 마커의 유무, 식품 중의 특정 원재료나 잔류 농약 등의 유해 물질의 유무 등의 다양한 검사를 단시간에 행하는 간이 검사 시약, 진단약, 진단 키트가 개발되고 있다. 이들은 각각의 검사 대상 물질과 검사 대상 물질에 특이적으로 반응하는 물질에 의한 특이적 반응이 이용된다. 특히, 항원과 항체에 의한 항원 항체 반응을 이용하는 면역학적 측정법은, 면역크로마토그래피 측정법, 비탁면역 측정법, 효소면역 측정법, 화학발광 측정법, 방사면역 측정법, 표면 플라즈몬 공명을 이용하는 측정법 등, 많은 측정법이 개발되어 있다. 그리고 이들 측정법은 병원, 보건소 등에서의 병 등의 검사나 식품회사 등에서의 음식물 검사 등에 이용되고 있다. 그 중에서도 면역크로마토그래피 측정법은, 특별한 설비, 기기, 지식을 필요로 하지 않고, 조작도 간편하고, 저렴하며, 신속한 진단이 가능하다고 하는 특징 때문에 매우 많은 검사가 실시되고 있다. 최근에는 임신 검사약 등은 일반 약국에서 시판되어 일반 소비자라도 측정할 수 있게 되고, 나아가서는 검사 대상 물질의 유무를 검사하는 정성 검사뿐만 아니라 양을 측정하는 정량 검사 등도 할 수 있게 되고 있다.

면역크로마토그래피 측정법의 측정 원리로서는, 샌드위치법이라고 불리는 방법이나 경합법이라고 불리는 방법이 있다. 또한, 측정 형식으로서는, 플로우-스루(flow-through)형이나 측면 플로우(lateral flow)형이라고 불리는 방법이 있다. 검체 중의 검사 대상 물질로서는 다양한 물질을 검출할 수 있지만, 전형적인 예로서는 샌드위치법에 의해 항원을 검출하는 측정이 있으며, 다음과 같은 조작 순으로 실행된다. 단, 이 조작에 한정되는 것은 아니다.

(1) 검사 대상 물질인 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 니트로셀룰로오스막 등의 크로마토그래피 매체의 소정 부위에 고정화하여, 크로마토그래피 매체의 임의의 위치에 테스트 라인(이하, 「TL」이라고도 한다.)이라고 불리는 반응 부위를 형성한다.

(2) 효소, 발색 입자, 형광 발색 입자, 자성 입자 등의 표지 물질에, 검사 대상 물질과 특이적으로 결합하는 리간드(예컨대, 항체)를 담지시킨 검출 시약을 조제하고, 콘주게이트 패드 등에 이러한 검출 시약을 도포 건조하여, 검출 시약 함유부를 형성하게 하고, 상기 크로마토그래피 매체와 조합하여 면역크로마토그래피 진단 키트를 형성한다. 여기서 말하는 리간드란, 검사 대상 물질과 특이적으로 결합하는 것으로, 항체나 항원, 유기 분자, 단백질을 예로서 들 수 있다.

(3) 항원을 포함하는 검체 그 자체 또는 그것을 임의의 액체로 희석한 용액을, 상기 면역크로마토그래피 진단 키트의 소정 위치에, 예컨대 샘플 패드에 적하하여, 항원과 검출 시약을 크로마토그래피 매체 상에 전개시킨다.

이들 조작에 의해서, 반응 부위에 있어서 크로마토그래피 매체 상에 고정화된 항체에, 항원을 통해 표지 물질이 포착되고, 표지 물질의 신호를 검출함으로써 면역크로마토그래피 진단 키트에 의한 진단을 행한다. 일반적인 진단은 항원의 유무만을 검사하는 정성 진단이지만, 최근에는 그 신호의 강도를 시각적으로 확인 혹은 기계로 검출함으로써 정량 진단을 행할 수도 있다.

여기서, 표지 물질에 항체를 담지시키는 방법으로서 크게 두 가지가 있다. 하나는 화학 결합에 의해 담지시키는 방법, 또 하나는 물리적으로 표지 물질 표면에 흡착시켜 담지시키는 방법이다. 화학 결합에 의해 담지시키는 방법은, 효과적으로 항체를 배향시킬 수 있을 가능성이 있다는 것이 알려져 있다. 단, 일반론으로서, 항체에 따라서는 화학 결합하기 어려운 것이 있다는 점 또한 취급 조작의 간편성 때문에, 폭넓은 검사 대상에 대응하기 위해서는, 물리적으로 항체를 흡착할 수 있는 입자 쪽이 보다 니즈가 있다. 그 중에서, 물리적으로 항체를 흡착시킬 수 있는 입자로서, 이하의 특허문헌 1에는 금 콜로이드, 이하의 특허문헌 2에서는 착색 라텍스가 보고되어 있다.

면역크로마토그래피 측정법에서 요구되는 니즈의 하나로서 분석 감도의 향상이 있다. 이것은, 보다 적은 검사 대상 물질이라도 검출할 수 있다는 것을 의미한다. 분석 감도가 향상됨으로써 신속 진단이 가능하게 되기 때문에, 분석 감도는 중요한 요인이 된다. 본원 발명자들은, 이하의 특허문헌 3에서, 물리적으로 항체를 흡착할 수 있는 발색 입자로서 색이 짙고 입자경이 큰 셀룰로오스 입자를 이용함으로써 분석 감도의 향상이 가능하다는 것을 보고하고 있다.

또 한편, 다른 니즈로서, 면역크로마토그래피 전개 후의 니트로셀룰로오스막의 백그라운드의 개선이 있다. 여기서 「백그라운드」란, 발색 입자가 니트로셀룰로오스막의 세공에 가득차 막히거나 비특이적으로 흡착하거나 함으로써 니트로셀룰로오스막이 착색되어 버려 발생하는 현상이다. 백그라운드가 나쁘면, 니트로셀룰로오스막과 TL과의 콘트라스트가 나빠져, TL의 발색된 라인을 보기 어렵게 되어 버려, 의료 현장에서 판정하기 어렵게 된다. 더구나, 백그라운드가 나쁘면 음성의 TL(즉 발색 없음)의 판단이 곤란하게 되어 버린다. 이들 현상은 오진을 야기해 버릴 가능성이 있다. 특허문헌 3에는 이러한 백그라운드 문제에 관해서는 아무런 언급이 되어 있지 않다.

특허문헌 1 : 일본 특허 제4514233호 공보 특허문헌 2 : 일본 특허공개 2004-184295호 공보 특허문헌 3 : 국제공개 제2011/062157호

이러한 종래 기술에 감안하여, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는, 양호한 백그라운드 및 검사 결과의 재현성을 가지고, 충분한 검출 감도를 갖는 면역크로마토그래피 진단 키트용의 유기 착색 미립자를 제공하는 것이다.

본 발명자들은, 이러한 과제를 해결하기 위해 예의 검토하여 실험을 거듭한 결과, 유기 착색 입자의 진구도(sphericity) 및 입자 직경 700 nm 이상의 조대 입자량을 치밀하게 컨트롤한 유기 착색 미립자라면, 크로마토그램 매체인 니트로셀룰로오스막에 눈막힘이 생기지 않고 전개할 수 있으며, 그 결과, 이러한 유기 착색 미립자를 발색 입자로서 사용한 면역크로마토그래피는, 검출 감도가 높고, 검사 결과의 재현성이 우수하다는 것을 예상 밖으로 알아내어, 본 발명을 완성하기에 이른 것이다.

즉, 본 발명은 다음과 같은 것이다.

[1] 평균 입자경이 100∼650 nm이고, 발색 강도가 1.0∼10.0이며, 입자경 400 nm∼12000 nm의 범위에서 총 개수 100000개의 입자를 검지했을 때, 입자경 700 nm 이상의 조대 입자의 존재율이 5% 이하이고, 또한 장경(L)/단경(D)으로 표시되는 진구도가 1.0∼2.5인 것을 특징으로 하는 유기 착색 미립자.

[2] 상기 유기 착색 미립자의 중량의 10∼90 중량%가 착색 성분인 상기 [1]에 기재한 유기 착색 미립자.

[3] 상기 착색 성분이 반응성 염료인 상기 [2]에 기재한 유기 착색 미립자.

[4] 상기 반응성 염료가 피리미딘 구조 또는 트리아진 구조를 갖는 상기 [3]에 기재한 유기 착색 미립자.

[5] 상기 유기 착색 미립자의 친수도(親水度)는 1.0∼30.0인 상기 [1]∼[4]의 어느 하나에 기재한 유기 착색 미립자.

[6] 물리 흡착에 의해 리간드가 결합되어 있는 상기 [1]∼[5]의 어느 하나에 기재한 유기 착색 미립자.

[7] 상기 리간드가 카제인에 의해 코팅되어 있는 상기 [6]에 기재한 유기 착색 미립자.

[8] 상기 [1]∼[7]의 어느 하나에 기재한 유기 착색 미립자를 포함하는 진단약 키트.

[9] 면역크로마토그래피 키트인 상기 [8]에 기재한 진단약 키트.

[10] 상기 [1]∼[7]의 어느 하나에 기재한 유기 착색 미립자를 사용하는 공정을 포함하는 인비트로 진단 방법.

[11] 면역크로마토그래피 방법인 상기 [10]에 기재한 인비트로 진단 방법.

본 발명의 유기 착색 미립자를 발색 입자로서 사용한 면역크로마토그래피는, 양호한 백그라운드 및 검사 결과의 재현성을 가지고, 충분한 검출 감도를 갖는다.

본 발명은, 유기 착색 미립자의 진구도 및 입자경 700 nm 이상의 조대 입자를 치밀하게 컨트롤함으로써, 높은 검출 감도를 유지하면서 백그라운드가 양호하고, 검사 결과의 재현성이 우수하다는 것을 알아내어, 이것에 기초하여 완성된 발명이다.

특허문헌 3에는, 입자경이 크고, 색이 짙은 유기 착색 미립자를 면역크로마토그래피의 발색 입자로서 사용함으로써 검출 감도가 향상되는 것이 개시되어 있다. 그러나, 이러한 미립자는, 진구도가 낮고, 구형(球形)이 왜곡되기 때문에, 니트로셀룰로오스막에 전개할 때, 세공 내에서 걸려 버리기 때문에, 백그라운드 악화로 이어질 우려가 있다.

또 한편, 본원 발명자들은, 면역크로마토그래피용의 발색 입자로서 전개할 때에, 입자경이 700 nm 이상인 조대 입자가 백그라운드 악화의 주원인인 것을 알아내어, 입자경이 700 nm 이상인 입자를 조대 입자로 했다. 특허문헌 3에서는, 700 nm 이상의 조대 입자에 관해서 아무런 언급이 되어 있지 않으며, 그 문헌 중에 기재되어 있는 파라미터(예컨대, CV치)만을 관리하고 있으면, 백그라운드가 나빠져 버린다. 백그라운드를 개선하는 방법으로서는, 전개액에 계면활성제, 아미노산 등의 첨가제를 가하는 수법도 있지만, 이들 수법에서는 감도도 저하시켜 버릴 우려가 있다.

본 발명자들은, 입자의 형상이 보다 진구에 가깝게 되며 또한 니트로셀룰로오스막의 세공에 막히기 쉬운 조대인 입자를 줄일 수 있다면, 니트로셀룰로오스막에 착색되지 않고 전개되는, 바꿔 말하면 백그라운드가 양호하게 되는 것은 아닌 가라고 생각했다. 이러한 가설 하에 실험을 검토한 결과, 중합도를 정밀하게 컨트롤하여, 피리미딘 구조 또는 트리아진 구조를 갖는 반응성 염료를 이용하여 염색한 입자는, 입자의 형상이 보다 진구에 가깝게 되며 또한 입자경 700 nm 이상의 조대 입자를 감소시킬 수 있다는 것을 발견했다. 이러한 유기 착색 미립자를 면역크로마토그래피의 발색 입자로서 사용하면, 지금까지의 높은 검출 감도를 유지하면서 양호한 백그라운드가 얻어지는 결과, TL과의 콘트라스트도 좋아져, 발색 유무의 판단도 하기 쉽게 되고, 나아가서는 재현성도 향상된다. 또한, 입자 표면의 친소수성을 정밀하게 컨트롤함으로써, 조대 입자가 줄어든 만큼의 검출 감도가 향상되어, 검사의 재현성도 대폭 향상된다.

도 1은 본 발명의 일 실시형태로서의 측면 플로우 타입의 면역크로마토그래피 진단 키트의 단면도이다.
도 2는 친수도를 구하는 방법의 설명도이다.
도 3은 실시예 1에서 얻어진 착색 셀룰로오스 미립자의 전자현미경 화상이다.

이하, 본 발명의 실시형태에 관해서 상세히 설명한다.

본 실시형태에 따른 유기 착색 미립자는, 평균 입자경이 100∼650 nm이고, 발색 강도가 1.0∼10.0이며, 입자경 400 nm∼12000 nm의 범위에서 총 개수 100000개의 입자를 검지했을 때, 입자경 700 nm 이상의 조대 입자의 존재율이 5% 이하이고, 또한 장경(L)/단경(D)으로 표시되는 진구도가 1.0∼2.5인 것을 특징으로 한다.

본 실시형태에 있어서의 「유기 착색 입자」란, 물, 완충액 등에 불용성이고, 색소, 염료 등이 담지된 입자상 물질을 가리킨다. 입자를 구성하는 소재는 특별히 한정되지 않지만, 이러한 유기 착색 미립자로서는, 예컨대 폴리스티렌 라텍스 등의 스티렌계 라텍스나 아크릴산계 라텍스 등을 착색한 착색 라텍스 입자, 규소 원자 및 산소 원자로 이루어지는 3차원 구조체로 구성되는 실리카를 착색한 착색 실리카 입자, 셀룰로오스를 착색한 착색 셀룰로오스 입자 등의 착색 성분을 그대로 입자화한 발색 입자 등을 들 수 있다. 또한, 상기 유기 착색 미립자는 형광 발광성 입자라도 상관없다. 입자경의 조정, 색 농도의 조정, 색 종류의 조정, 입자 표면 상태의 조정 등의 입자의 특징을 조정하기 쉬우므로, 착색 셀룰로오스 입자가 바람직하다. 셀룰로오스는 대량의 수산기를 갖기 때문에, 친수성이 높고 분산 안정성이 우수하여, 착색 성분을 대량으로 함유할 수 있다.

「유기 착색 입자의 제조 방법」은 특별히 한정되지 않는다. 유기 입자를 우선 성형하여, 색소, 염료 등의 착색 성분을 담지시키는 방법, 입자를 성형하여, 금속 콜로이드나 안료 등의 보다 작은 발색 입자를 담지시키는 방법, 입자의 성형 시에 색소, 염료, 안료, 금속 콜로이드 등의 착색 성분도 함께 가하여 성형하는 방법 등을 들 수 있다. 그 중에서도 입자경의 조정, 색 농도의 조정, 색 종류의 조정, 입자 표면 상태의 조정 등의 입자의 특징을 조정하기 쉬우므로, 입자를 우선 성형하여, 색소, 염료 등의 착색 성분을 담지시키는 방법이 바람직하다. 또한, 담지시키는 착색 성분으로서는, 담지의 용이함 때문에 염료가 바람직하다.

착색 성분으로서 염료를 이용하는 경우, 반응성 염료가 바람직하다. 직접 염료, 함금(含金) 염료, 산성 염료, 염기성 염료, 분산 염료, 황화 염료, 식물 염료, 나프톨 염료, 형광 염료 등의 염료를 이용한 경우에는, 높은 발색 강도를 얻을 수 없고, 강하게 염색할 수 있었다고 해도 탈색 등이 우려가 있다. 단, 반응성 염료를 사용하는 경우, 직접 염료, 함금 염료, 산성 염료, 염기성 염료, 분산 염료, 황화 염료, 식물 염료, 나프톨 염료, 형광 염료 등의 염료를 조합하여도 상관없다.

반응성 염료는 피리미딘 구조 또는 트리아진 구조를 갖는 것이 바람직하다. 여기서, 피리미딘 구조 또는 트리아진 구조가, 입자를 소수화하여, 후술하는 친수도에 크게 영향을 주는 것을 알게 되었다. 반응성 염료로서는, 피리미딘 구조 또는 트리아진 구조를 갖고 있는 것이라면 특별히 제한은 없고, Sumifix 시리즈, Sumifix HF 시리즈, Sumifix Supra 시리즈(이상, 등록상표, 스미토모카가쿠사 제조), Levafix 시리즈(등록상표, 다이스타사 제조) 등을 적합하게 사용할 수 있다. 이들 반응성 염료는, 고농도의 수산화나트륨을 이용한 경우라도 적합하게 염색할 수 있다. 피리미딘 구조 또는 트리아진 구조를 반응 부위로 하고 있지 않은 반응성 염료에서는, 고농도의 수산화나트륨을 사용하면, 셀룰로오스의 수산기와 반응하기 전에, 반응 부위가 실활되어 버려, 원하는 발색 강도나 친수도에 도달하지 않는다. 본 실시형태에서는, 고농도의 수산화나트륨과, 피리미딘 구조 또는 트리아진 구조를 반응 부위로 하는 반응성 염료를 이용하여 유기 입자를 염색함으로써, 입자 전체가 균일하게 염색되어, 입자경이 균일하게 되고, 또한 후술하는 친수도가 달성된다.

셀룰로오스 입자를 우선 성형하고, 그 후 착색 성분을 담지시키는 경우, 「셀룰로오스 입자의 성형 방법」은 특별히 한정되지 않는다. 천연의 셀룰로오스를 볼 밀이나 고압 호모게나이저로 물리적으로 미세화하는 방법, 산이나 알칼리 등으로 화학적으로 처리하여 미세화하는 방법, 셀룰로오스를 그 양용매에 한번 용해시켜 입자형으로 성형하는 방법 등을 들 수 있다. 또한 유도체화된 셀룰로오스를 용해, 입자형으로 성형하고, 유도체화된 치환기를 수산기로 되돌려 셀룰로오스 입자를 조제하여도 좋다. 또한, 이들 성형 방법을 조합하여도 좋다. 또한 「셀룰로오스의 종류」도 특별히 한정되는 것은 아니며, 재생 셀룰로오스, 정제 셀룰로오스, 천연 셀룰로오스, 상기한 것이 유도체화된 셀룰로오스, 유도체화된 치환기를 수산기로 되돌린 셀룰로오스 등을 이용할 수 있다. 그 중에서도 입자경의 조정, 입자 형상의 조정 등의 점에서 양용매에 한번 용해시켜 입자형으로 성형하는 방법이 바람직하고, 셀룰로오스의 종류로서는 재생 셀룰로오스가 바람직하다.

셀룰로오스를 그 양용매에 한번 용해시켜 입자형으로 성형하는 경우, 「셀룰로오스를 용해시키는 양용매의 종류」도 특별히 한정되는 것은 아니며, 구리암모니아 용액, 비스코스 용액, N-메틸모르폴린, 각종 이온성 액체 등 셀룰로오스를 용해할 수 있도록 다양한 양용매를 이용할 수 있다. 그 중에서도 입자경의 조정, 입자 형상의 조정 등의 점에서 구리암모니아 용액이 바람직하다. 또한, 용해시킨 셀룰로오스를 입자로 성형하는 방법도 특별히 한정되는 것은 아니며, 본 실시형태에서는 상분리에 의한 방법을 선택했다.

유기 착색 미립자의 「평균 입자경」이란, 동적 광산란법으로 측정한 경우의 체적 평균 메디안 직경을 가리키며, 체적 평균 메디안 직경이 100∼650 nm의 범위에 있다. 평균 입자경이 이 범위에 있으면, 입자의 표면적이 크기 때문에, 면역크로마토그래피 진단 키트로서 이용하는 경우에 TL이 보다 짙어지게, 즉 분석 감도가 높아지게 된다. 평균 입자경이 지나치게 작으면, 표면적이 작아져 분석 감도가 내려가거나 입자의 응집이 일어나거나 하는 경우가 있다. 그러므로, 평균 입자경은 150 nm 이상이 바람직하고, 보다 바람직하게는 200 nm 이상이다. 입자경이 지나치게 크면 니트로셀룰로오스 등의 크로마토그래피 매체의 구멍이 막힘으로써 원래 검사 후에는 희게 될 부분이 착색되어, 검사 결과의 판단에 악영향을 미치거나 검출 한계가 나빠지거나 하는 경우가 있다. 그러므로, 평균 입자경은 600 nm 이하가 바람직하고, 보다 바람직하게는 550 nm 이하이다. 또한, 여기서 말한 평균 입자경은 어디까지나 평균치이고, 입자경 분포의 일부가 상기 범위에서 벗어나더라도 상관없다.

입자경의 평가에 체적 평균을 이용하는 이유로서, 면역크로마토그래피 진단 키트에 있어서 너무 큰 입자는 니트로셀룰로오스 등의 크로마토그래피 매체에 눈막힘이 생겨 버리는데, 체적 평균이 큰 입자가 약간 존재하는 것만으로도 그 영향이 반영되기 때문이다. 입자경의 평가 방법으로서는 체적 평균 이외에도, 수평균, 면적 평균 등 다양한 것이 있고, 평가 방법이 다르면 당연히 입자경의 값도 다르게 된다.

본 실시형태의 유기 착색 미립자의 평균 입자경의 CV치는 특별히 규정하지 않는다. 단, 진단약으로서 이용하는 경우는 30% 이하가 바람직하다. 평균 입자경의 CV치가 30%를 넘으면, 진단약으로서의 진단의 정확성에 악영향이 생기기 때문에, 보다 바람직하게는 25% 이하이고, 더욱 바람직하게는 20% 이하이다. 일반적으로 평균 입자경의 CV치가 작으면 진단의 정확성은 향상되지만, CV치가 지나치게 작아지면 제조의 시간이나 비용이 커져 버리기 떼문에, 비용과 정확성의 밸런스를 생각하면 1% 이상이 바람직하다.

「발색 강도」란, 입자의 색 농도를 정의한 값이다. 발색 강도의 측정 방법은 이하와 같다.

농도 기지의 유기 착색 미립자의 순수 분산액을 조제하고, 광로 길이 10 mm로 하여, 400∼800 nm의 범위에서 적분구를 이용한 가시 흡광도 측정을 행하여, 얻어진 흡광도 곡선의 피크치(ABS)를 측정하고, 얻어진 값을 유기 착색 미립자의 중량 퍼센트로 나누고, 발색 입자 0.01 중량% 당 흡광도로 환산한 값을 구하여, 이것을 발색 강도로 정의한다. 예컨대, 조제한 유기 착색 미립자의 농도가 0.0045%이고, 흡광도 곡선의 피크치가 1.0이었던 경우, 그 발색 강도는 (1×0.01)÷0.0045=2.2가 된다.

입자의 색 농도의 측정에 적분구를 이용한 가시 흡광도 측정을 행하는 이유로서는, 액체에 분산된 상태의 입자의 색 농도를 가장 정확하게 측정할 수 있기 때문이다. 입자의 색 농도를 측정하는 방법으로서는, 입자를 건조시켜 얻어진 고체를 측색계(測色計) 등으로 측정하는 방법도 있지만, 이러한 방법으로는 입자의 색 농도를 정확하게 측정할 수 없다. 예컨대, 금속 콜로이드 등은 입자경에 따라서 색조나 최대 파장이 다르며, 건조한 응집 상태는 액체에 분산된 상태의 색 농도를 정확하게 반영할 수 없다. 또한, 액체 중에 동일한 입자 농도로 분산시키더라도 응집이 발생하면 색의 농도는 옅어진다. 더욱이, 가시 흡광도 측정을 행할 때에 적분구를 이용하는 이유는, 입자 자체의 산란에 의한 영향을 제거하기 위해서이다. 통상의 가시 흡광도 측정은 투과광을 측정하는 방법이며, 입사광에 대하여 착색 성분에 의한 흡수뿐만 아니라 입자 자체의 산란에 의한 영향도 반영되어 버린다. 예컨대, 면역크로마토그래피에 일반적으로 사용되는 금 콜로이드는, 입자경이 40 nm∼60 nm, 때로는 100 nm인 것이 이용되는 경우도 있지만, 모두 입자경이 작기 때문에 산란광의 영향은 거의 없다. 이에 대하여 폴리스티렌 라텍스 입자는 입자경이 커, 분명히 산란광의 영향이 크다. 상기와 같은 이유에서, 입자경이나 입자 소재가 다른 경우에 입자 자체의 색 농도를 보다 정확하게 반영하기 위해서, 본 실시형태에서는 적분구를 이용한 가시 흡광도 측정을 채용한다.

본 실시형태의 유기 착색 미립자의 「발색 강도」는 1.0∼10.0이다. 이 값이 클수록 입자의 색 농도가 짙고, 면역크로마토그래피 진단 키트로서 이용하는 경우에 분석 감도가 높다. 물론 값이 크면 클수록 좋으며, 색이 짙은 염료를 이용한다, 염색 횟수를 늘린다, 스페이서로서 어떠한 화합물을 통해 연결시킨다, 입자의 비정(非晶) 영역을 늘려 염료가 들어가기 쉽게 한다, 입자를 다공성으로 하여 염료가 들어가기 쉽게 한다 등의 방법을 채용할 수 있다. 그러나, 경제성을 고려하면, 상한은 7.0 이하가 바람직하고, 보다 바람직하게는 5.0 이하이다. 또한, 값이 작을수록 면역크로마토그래피 진단 키트로서 이용한 경우에 분석 감도가 저하하기 때문에, 하한은 1.5 이상이 바람직하고, 보다 바람직하게는 2.0 이상이다.

본 실시형태의 유기 착색 미립자의 「진구도」란, 입자의 장경(L)/단경(D)으로 표시되는 값이며, 장경(L)과 단경(D)의 길이가 가까운 형상은 구에 가까운 구조체이다. 본 실시형태의 유기 착색 미립자의 「진구도」(즉, L÷D로 표시되는 L/D비)는 1.0∼2.5이다. 진구도가 이 범위 밖이면, 발색 입자의 형태가 찌그러지기 때문에, 니트로셀룰로오스막의 세공을 통과할 때, 입자가 걸려 버리므로 백그라운드가 악화한다. 그 결과, TL과의 콘트라스트가 악화해 버리기 때문에, 오진으로 이어질 우려가 있다. 또한 당연하지만 검사의 재현성도 나빠진다. 진구도는 보다 바람직하게는 1.0∼2.2, 더욱 바람직하게는 1.0∼2.0, 가장 바람직하게는 1.0∼1.5이다. 측정 방법으로서는 입자의 전자현미경 화상을 촬영하고, 100개의 입자의 장경(L)과 단경(D)을 측정하여, 그 100개의 평균치를 산출한다.

본 실시형태의 유기 착색 미립자는, 입자경 400 nm∼12000 nm의 범위에서 총 개수 100000개의 입자를 검지했을 때, 입자경 700 nm 이상의 조대 입자의 존재율이 5% 이하이다.

여기서 「조대 입자」란, 일정한 분포를 갖는 입자 중, 입자경 700 nm 이상의 입자를 가리킨다. 본원 발명자들은, 면역크로마토그래피 진단 키트에 있어서의 발색 입자를 예의 검토한 결과, 이 입자경 700 nm 이상의 조대 입자가 니트로셀룰로오스막의 백그라운드를 악화시키는 요인의 하나인 것을 밝혀냈다. 이유로서는 단순히 입자경 700 nm 이상의 입자가 니트로셀룰로오스막의 세공에 가득차 버리기 때문에, 백그라운드를 악화시킨다. 이 조대 입자의 존재율이 5%를 넘으면, 현저히 백그라운드를 악화시켜 버리고, 그 결과, TL과의 콘트라스트가 악화해 버리기 때문에, 오진으로 이어질 우려가 있다. 면역크로마토그래피 진단 키트에 전개시킨다고 하는 관점에서, 조대 입자의 존재율은 바람직하게는 4.5% 이하이고, 보다 바람직하게는 4.0% 이하이다.

여기서, 조대 입자의 비율과 평균 입자경의 %CV는 일견 관련되어 있는 것처럼 보이지만, 링크되지 않음이 판명되었다. 특허문헌 3에서는 %CV에 관해서 언급하고 있지만, 이것은 동적 광산란식에 의해 입자의 브라운 운동의 모습을 산란광 강도의 흔들림으로서 관측하여 산출된 값이다. 바꿔 말하면, 입경 분포의 평균치를 계측하는 것이다. 한편, 이번의 조대 입자의 비율은 코울터 카운터(Coulter counter)의 식으로 측정하고 있다. 이것은, 입자가 세공을 통과할 때에 생기는 전극 사이의 전기 저항의 변화를 측정하고 있다, 즉 코울터 카운터의 식에서는, 실제의 입자 사이즈를 직접적으로 산출할 수 있다. 본원 발명자들은, 이 코울터 카운터의 식에 의해 평가를 한 바, 일견 분포가 좁은(%CV가 작은) 입자라도 입자에 따라서는 조대 입자의 비율이 5%를 넘는 것이 있다는 것을 발견했다. 특허문헌 3에서 사용하고 있는 동적 광산란식의 장치에서는, 분포의 기울기에 관해서 정확하게 측정할 수 없기 때문에, 본 실시형태에서는, 코울터 카운터의 식에 의한 장치를 이용하여, 이 조대 입자를 측정했다.

「유기 착색 미립자의 착색 성분의 비율」이란, 유기 착색 미립자의 전체 중량에 있어서의 착색 성분의 비율을 가리킨다. 예컨대, 유기 착색 미립자 1.0 g이 0.2 g의 셀룰로오스와 0.8 g의 착색 성분으로 구성되는 경우, 그 착색 성분의 비율은 80 중량%이다. 유기 착색 미립자의 착색 성분의 비율은 10∼90 중량%가 바람직하다. 이 범위에 있으면 면역크로마토그래피 진단 키트로서 이용하는 경우에 분석 감도가 높다. 또한, 발색 입자로서 셀룰로오스를 염료로 염색한 입자를 이용하는 경우, 셀룰로오스에 이 범위의 염료를 유지하게 함으로써 셀룰로오스에 적절한 소수성을 부여할 수 있어, 항체 등의 피검출물에 특이적으로 결합하는 물질을 흡착에 의해 유지할 수 있다. 물론 흡착에 의한 유지뿐만 아니라, 착색 셀룰로오스 입자에 카르복실기나 아미노기 등을 도입하여, 공유 결합에 의해 피검출물에 특이적으로 결합하는 물질을 유지하는 것도 가능하다. 착색 성분의 비율이 적은 경우는, 충분한 발색 강도를 가질 수 없고, 면역크로마토그래피 진단 키트로서 이용하는 경우에 분석 감도가 낮아진다. 또한, 유기 착색 미립자로서 셀룰로오스를 염료로 염색한 입자를 이용하는 경우, 착색 성분의 비율을 늘림으로써 피검출물에 특이적으로 결합하는 물질도 증가하는 경우도 있다. 이 관점에서, 유기 착색 미립자의 착색 성분의 비율의 하한은 20 중량% 이상이 바람직하고, 보다 바람직하게는 30 중량% 이상이다. 착색 성분의 비율이 90 중량%를 넘더라도 특별히 문제는 없지만, 경제적인 면에서 생각하면 85 중량% 이하가 바람직하고, 보다 바람직하게는 80 중량% 이하이다.

「유기 착색 미립자의 착색 성분의 비율의 산출 방법」으로서는, 착색 전후의 중량 변화로부터 산출할 수 있다. 또한, 중량 변화로부터의 산출이 곤란한 경우는, 착색 성분을 입자로부터 분리하는 조작을 행하여 착색 성분 또는 입자를 단리하여 산출할 수 있다. 예컨대, 셀룰로오스 입자를 반응성 염료로 염색한 경우, 산이나 알칼리 등으로 셀룰로오스와 염료의 공유 결합을 절단하여, 원심분리에 의해 셀룰로오스 입자를 회수함으로써 산출할 수 있다. 또한, 셀룰라아제를 이용하여 셀룰로오스만을 분해함으로써 산출할 수도 있다.

「유기 착색 미립자의 셀룰로오스 유래 성분의 산출 방법」은, 상기한 유기 착색 미립자의 착색 성분의 비율로부터 계산할 수 있다. 즉, 「유기 착색 미립자의 셀룰로오스 유래 성분의 비율」=100%-(유기 착색 미립자의 착색 성분의 비율)의 계산식에 의해서 계산할 수 있다. 유기 착색 미립자의 셀룰로오스 유래 성분의 비율은 90∼10 중량%가 바람직하다. 이 범위에 있으면, 셀룰로오스 입자의 분산 안정성을 유지할 수 있다. 또한, 상기 착색 성분의 비율에서 기재한 이유에 의해, 유기 착색 미립자의 셀룰로오스 유래 성분의 하한으로서는 15 중량% 이상이 보다 바람직하고, 특히 바람직하게는 20 중량% 이상이며, 상한은 80 중량% 이하가 보다 바람직하고, 특히 바람직하게는 70 중량% 이하이다.

본 실시형태의 유기 착색 미립자의 소수성 친수성의 정도를 나타내는 지표로서, 본 실시형태에서는 「친수도」를 측정했다. 본 명세서 중, 「친수도」란, 미립자 표면의 습윤 용이성, 즉 물과의 친화성을 나타내는 지표이다.

본 실시형태의 유기 착색 미립자의 친수도는 1.0∼30.0의 범위인 것이 바람직하다. 친수도가 이 범위에 있으면, 입자 표면이 소수적이기 때문에, 유기 착색 미립자 표면에의 단백질, 항체 등의 흡착량이 증가한다. 셀룰로오스는 친수성이고, 단백질이나 항체는 일반적으로 흡착하기 어렵기 때문에, 단백질이나 항체를 흡착시키기 위해서는 입자의 표면을 소수화할 필요가 있다. 반대로 말하면, 소수화의 정도를 이 지표로 컨트롤함으로써, 흡착량에 관해서도 마찬가지로 컨트롤할 수 있다. 즉, 면역크로마토그래피 진단 키트에 있어서, 재현성이 우수한 유기 착색 미립자를 제작할 수 있다. 특허문헌 3에서는, 이 지표에 관해서 하등 관리되어 있지 않으며, 재현성이 부족한 데이터를 보이는 경우가 있었다. 친수도가 30.0 이상이면 미립자 표면은 친수적으로 되기 때문에, 미립자 표면에 단백질이나 항체 등의 흡착이 저해되어 버려, 감도가 저하하거나 재현성이 부족한 결과로 되어 버리거나 한다. 또한, 1.0 미만이면, 소수성이 지나치게 강해져 버려, 니트로셀룰로오스막에 흡착하여, 백그라운드를 악화시켜 버린다. 이상의 점에서, 친수도의 상한은 보다 바람직하게는 27.0이 바람직하고, 더욱 보다 바람직하게는 25.0이다. 다른 한편, 친수도의 하한은 보다 바람직하게는 1.5가 바람직하고, 더욱 보다 바람직하게는 2.0이다.

미립자의 착색에 사용한 반응성 염료가 F 원소를 함유하는 경우, 본 실시형태의 유기 착색 미립자 표면에는 F 원소가 잔존한다. 본 실시형태의 유기 착색 미립자에 있어서는, X선 광전분광법(XPS)에 의한 측정에 의해 산출된 입자 표면의 F 원소의 상대 원소 농도는 0.1 atomic% 이상인 것이 바람직하다. F 원소의 상대 원소 농도가 이 범위에 있으면, 유기 착색 미립자 표면의 단백질이나 항체의 흡착 시에, 놀랍게도 감도 및 재현성이 향상된다. 본 실시형태의 유기 착색 미립자 표면의 F 원소의 상대 원소 농도의 하한은, 바람직하게는 0.2 atomic% 이상, 더욱 바람직하게는 0.3 atomic% 이상이다.

본 실시형태의 유기 착색 미립자를 요소로서 포함하는 「면역크로마토그래피 진단 키트」란, 항원 항체 반응을 이용하여 여러가지 검체 중의 검사 대상 물질의 유무를 간편하게 검출하는 것이다. 이 진단 키트의 종류로서는, 측면 플로우 타입이나 플로우-스루 타입이 있다. 발색 입자(유기 착색 미립자)나 샘플 패드를 이용하는 것이라면 특히 한정되지 않지만, 바람직하게는 측면 플로우 타입이다. 또한, 측면 플로우 타입 중에서도 딥스틱 타입과 카세트 타입이 있지만, 이들 타입은 특별히 한정되지 않는다. 진단 키트의 구성은, 특별히 한정되는 것은 아니며, 이 분야에서 일반적으로 이용되는 구성이라면 어느 것이라도 상관없다. 항체 감작 발색 입자를 포함하는 콘주게이트 패드(b)와 샘플 패드(a) 이외의 부재의 종류는, 이 분야에서 이용되는 것이라면 특별히 한정되지 않으며, 예컨대, 도 1에 도시하는 (e) 크로마토그래피 매체, (f) 흡수 패드 및 (g) 대지(臺紙)를 들 수 있다. 또한, 필요에 따라서 이들 부재를 일부 생략하여도 상관없다. 구조의 예로서는 특허문헌 1의 도 1에 기재되어 있는 것과 같은 구조를 들 수 있다. 본 명세서에 첨부하는 도 1은 어디까지나 예이고, 본 실시형태를 하등 한정하는 것이 아니다.

도 1 중 (a)로 나타내는 것과 같이, 「샘플 패드」란, 면역크로마토그래피에 있어서 측정 대상인 검체를 맨 처음에 수취하는 부분이다. 일반적인 샘플 패드로서는, 셀룰로오스 여과지, 종이, 유리 섬유, 글래스 파이버, 아크릴 섬유, 나일론 섬유, 각종 직물 등을 들 수 있다.

샘플 패드의 친수성/발수성, 흡수 배율의 컨트롤을 위해서, 상기 물성에 악영향을 미치지 않고, 항원 항체 반응이나 항체의 안정성에 영향을 주지 않는 범위라면, 재생 셀룰로오스계 섬유로 이루어지는 부직포에 각종 약제나 분체를 함유시키거나, 셀룰로오스의 일부를 유도체화하거나 하여도 좋다. 함침시키는 약제의 일례로서는, 계면활성제, 단백질, 항체, 수지, 수용성 고분자, 항균제, 방부제, 산화방지제 등을 들 수 있다. 또한, 셀룰로오스의 유도체화의 일례로서는, 카르복시메틸화, 카르복시에틸화, 1급 아미노화, 2급 아미노화, 3급 아미노화, 4급 아미노화, 옥시화 등을 들 수 있다.

샘플 패드는 필요에 따라서 전처리를 행하여도 상관없다. 예컨대, 완충액, 계면활성제, 단백, 검체 시료 중의 협잡물을 트랩하는 시약, 방부제, 항균제, 산화방지제, 흡습제 등을 미리 포함시키는 등의 처리를 행하여도 상관없다. 또한, 샘플 패드의 형상은 특별히 한정되지 않지만, 예컨대 샘플 패드의 사이즈로서, 길이(액이 흐르는 길이)는, 검체액으로부터의 결합성이나 진단 시간을 고려하면, 10∼25 mm 정도인 것이 바람직하고, 폭(액의 흐름에 대하여 수직)은, 콘주게이트 패드의 폭보다 크면 문제는 없다. 폭이 지나치게 좁으면 샘플 패드의 단부로부터 검사액이 돌아들어가 버릴 가능성이 있다.

「콘주게이트 패드」란, 발색 입자(유기 착색 미립자)를 포함하는 콘주게이트를 함유하는 패드이며, 예컨대 검사 대상 물질에 결합하는 항체와 결합한 발색 입자를 함유하는 것이다. 콘주게이트 패드의 소재로서는 특별히 한정되지 않지만, 일반적인 유리 섬유 또는 수지 섬유 등을 이용할 수 있다. 수지 섬유로서는, 폴리에틸렌 등의 폴리올레핀계나, 폴리에스테르계, 폴리아미드계, 아크릴계 등의 수지 섬유 및 이들 수지 섬유의 복합 섬유를 적합하게 사용할 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 작업 환경에서 생각하면 수지 섬유제가 바람직하다. 수지 섬유제 중에서도, 발색 입자의 릴리스 용이성의 관점에서 생각하면, 어느 정도 소수성의 소재인 것이 보다 바람직하다. 소수성이 지나치게 높은 경우는 계면활성제 등으로 전처리하여 이용하여도 상관없다. 폴리에틸렌 섬유제의 콘주게이트 패드를 계면활성제로 전처리한 것이 보다 바람직하다.

본 실시형태의 면역크로마토그래피 진단 키트를 사용하는 「진단 방법」이란, 면역크로마토그래피 진단 키트를 이용하여 이루어지는 다양한 진단을 가리킨다. 진단 대상은 특별히 한정되는 것은 아니며, 사람용, 동물용, 식품용, 식물용, 기타 환경 검사 등 다양한 진단 대상의 검사에 이용할 수 있다. 일반적인 진단 수순에서는, 검사 대상으로부터 검체 시료를 채취하고, 필요하다면 그것을 추출이나 여과 등의 전처리를 행하여 샘플 패드에 적하하고, 검사 개시에서부터 소정 시간 기다렸다가 검사 대상 물질의 유무에 따라 상이한 발색으로부터 진단 결과를 판단한다. 물론 이 수순에 한정되지 않으며, 같은 수순, 원리의 진단에도 이용할 수 있다. 바람직한 것은, 검체 시료를 미리 여과해 둠으로써 여분의 이물이나 협잡물을 제거할 수 있고, 이에 따라 한층 더 진단 신속화나 진단 정밀도 향상을 기대할 수 있다.

본 실시형태에서는, 검체를 직접 샘플 패드에 적하하는 방법 이외에, 미리 소정의 조성으로 조정해 둔 검체 처리액으로 검체를 임의의 배율로 희석 처리한 것을 적하하여도 상관없다. 검체 처리액을 사용할 목적으로서는, 검체 중의 항원 등과 반응하기 쉽게 하기 위한 성분, 검체 중의 협잡물을 분해하는 성분, 검체 중의 협잡물을 트랩하는 성분, 비특이적인 반응을 억제하는 성분, 발색 입자를 흐르기 쉽게 하는 성분, 발색 입자를 적절하게 응집시켜 테스트 라인에 포착되었을 때의 시인성을 향상시키는 성분 등의 첨가를 들 수 있다. 일례로서는, 완충액, 계면활성제, 단백질, 무기염, 수용성 고분자, 환원제, 킬레이트제 등을 첨가하여도 좋다. 특히 본원 발명과 같은 발색 입자를 이용하는 경우, 비이온성 계면활성제나 각종 수용성 아미노산, 단백질, 무기염, 수용성 고분자 등의 첨가가 바람직하다. 구체적인 성분의 종류나 첨가량은 검사 대상이나 이용하는 항체의 종류에 따라서도 다르지만, 비이온성 계면활성제의 일례로서는, 폴리(옥시에틸렌)알킬에테르, 폴리(옥시에틸렌)옥틸페닐에테르, 폴리(옥시에틸렌)노닐페닐에테르 등을 들 수 있다. 수용성 아미노산의 일례로서는, 아스파라긴, 아스파라긴산, 알라닌, 아르기닌, 이소류신, 글리신, 글루타민, 글루타민산, 시스테인, 세린, 티로신, 트립토판, 트레오닌, 발린, 히스티딘, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 리신, 류신 등을 들 수 있다. 단백질의 일례로서는, 카제인, 스킴 밀크, 카제인 분해물, 소혈청 알부민, 피시 젤라틴 등을 들 수 있다. 무기염으로서는, 나트륨, 칼륨, 리튬 등의 알칼리 금속 이온을 생기게 하는 화합물이 바람직하다. 수용성 고분자로서는, 폴리에틸렌글리콜, 폴리비닐알코올, 폴리비닐피롤리돈, 카르복시메틸셀룰로오스, 기타 셀룰로오스 유도체 등이 바람직하다. 또한 이들 성분은, 검체 처리액에 첨가해 두는 것뿐만 아니라, 샘플 패드, 콘주게이트 패드, 크로마토그래피 매체(니트로셀룰로오스막) 등에 미리 첨가해 두더라도 상관없다.

면역크로마토그래피 진단 키트로 진단할 수 있는 대상은 특별히 한정되는 것은 아니지만, 구체예로서는 이하의 것을 들 수 있다: 암 마커, 호르몬, 감염증, 자기면역, 혈장단백, TDM, 응고·선용(線溶), 아미노산, 펩티드, 단백, 유전자, 세포 등을 들 수 있다. 보다 구체적으로는 CEA, AFP, 페리틴, β2 마이크로, PSA, CA19-9, CA125, BFP, 엘라스타아제 1, 펩시노겐 1·2, 변잠혈, 요중(尿中) β2 마이크로, PIVKA-2, 요중 BTA, 인슐린, E3, HCG, HPL, LH, HCV 항원, HBs 항원, HBs 항체, HBc 항체, HBe 항원, HBe 항체, HTLV-1 항체, HIV 항체, HIV 항원, HIV 바이러스 유전자, 톡소플라즈마 항체, 매독, ASO, A형 인플루엔자 항원, A형 인플루엔자 항체, B형 인플루엔자 항원, B형 인플루엔자 항체, 로타 항원, 아데노바이러스 항원, 로타·아데노바이러스 항원, A군 렌서구균, B군 렌서구균, 칸디다 항원, CD균, 크립토로커스 항원, 콜레라균, 수막염균 항원, 과립균 엘라스타아제, 헬리코박터 파일로리 항체, O157 항체, O157 항원, 렙토스피라 항체, 아스페르길루스 항원, MRSA, RF, 총 IgE, LE 테스트, CRP, IgG, A, M, IgD, 트랜스페린, 요중 알부민, 요중 트랜스페린, 미오글로빈, C3·C4, SAA, LP(a), α1-AC, α1-M, 합토글로빈, 마이크로트랜스페린, APR 스코어, FDP, D 다이머, 플라스미노겐, AT3, α2PI, PIC, PAI-1, 프로테인 C, 응고 제X3 인자, IV형 콜라겐, 히알루론산, GHbA1c, 그 밖의 각종 항원, 각종 항체, 각종 바이러스, 각종 균, 각종 아미노산, 각종 펩티드, 각종 단백질, 각종 DNA, 각종 세포, 각종 알레르겐, 각종 잔류 농약, 각종 유해물.

발색 입자(유기 착색 미립자)는, 항체 등의 피검출물에 특이적으로 결합하는 물질을 담지할 필요가 있지만, 그 담지 방법은 특별히 한정되지 않는다. 예컨대, 물리적인 흡착에 의한 담지, 공유 결합에 의한 담지, 이들의 조합에 의한 담지 등을 들 수 있다. 담지하는 물질의 종류나 양도 특별히 한정되지 않는다. 담지하는 물질의 종류로서는 항체가 가장 일반적이며 바람직하다. 또한, 담지하는 방법으로서는, 용이성의 관점에서는 물리적인 흡착에 의한 담지가, 안정성이나 성능 등의 관점에서는 공유 결합에 의한 담지가 바람직하다.

면역크로마토그래피 진단 키트에 이용되는 크로마토그래피 매체는 특별히 한정되는 것은 아니며, 일반적으로 이용되는 다양한 크로마토그래피 매체를 이용할 수 있다. 보다 구체적으로는 니트로셀룰로오스막을 들 수 있다. 시판 제품의 니트로셀룰로오스막은 플로우 레이트라고 불리는 일정 거리를 이동하기 위해서 필요한 시간에 의해서 분류되는데, 이 플로우 레이트가 빠른 막일수록 구멍 직경이 크다. 본 발명에서는 구멍 직경이 큰 막 쪽이 검체의 이동이 빠르고 발색 입자도 막히기 어렵기 때문에 바람직하다. 구체적인 플로우 레이트로서는 180 sec/4 cm보다 빠른 막이 바람직하다.

이하, 유기 착색 미립자로서의, 셀룰로오스 입자의 제작 방법, 셀룰로오스 입자의 착색 방법, 면역크로마토그래피 진단 키트의 제작 방법 등의 일례를 기재한다, 물론, 본 발명은 이들에 의해서 하등 한정되어서는 안 된다.

〔셀룰로오스 입자의 제작 방법〕

셀룰로오스 린터를 셀룰로오스의 양용매에 용해시킨다. 본 발명에서는 양용매로서 공지된 방법으로 조제한 구리암모니아 용액을 이용한다. 그리고 응고액으로서는 유기 용매+물+암모니아 혼합계를 주로 이용한다. 이 응고액을 교반하면서, 조제해 둔 구리암모니아 셀룰로오스 용액을 가하여 응고를 행한다.

여기서, 구리암모니아 셀룰로오스 용액을 미리 공기 존재 하에서 인큐베이트하게 하여, 구리암모니아 셀룰로오스 용액 중의 셀룰로오스의 평균 중합도를 조정하는 것이 포인트가 되어 간다. 셀룰로오스의 평균 중합도(DP)가 조정되어 있지 않으면, 입자경 700 nm 이상의 조대 입자의 비율이 5% 이하로 되지 않는다. 그 때문에, 본 실시형태에서는 구리암모니아 셀룰로오스 용액 중의 셀룰로오스의 평균 중합도(DP)는 50∼400으로 조정한다. 평균 중합도가 50 미만이면, 입자 형상을 형성하기 어렵게 되어, 목표의 진구도로 되지 않는다. 한편, 평균 중합도(DP)가 400을 넘으면, 조대 입자량이 많아져 버려, 면역크로마토그래피에서 사용했을 때에, 전개 불량이 일어나 백그라운드가 나빠진다. 그 결과, TL과의 콘트라스트가 악화해 버리기 때문에, 오진으로 이어질 가능성이 있다. 평균 중합도(DP)의 하한으로서는, 입자 형성의 관점에서 60 이상이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 70 이상이다. 조대 입자 발생 억제의 관점에서, 상한으로서는 350 이하가 바람직하고, 보다 바람직하게는 300 이하이다.

셀룰로오스의 평균 중합도란, 셀룰로오스 미립자를 카독센에 용해한 희박 셀룰로오스 용액의 비점도를 우벨로데형 점도계로 측정하고, 그 극한 점도수[η]로부터, 참고문헌: Eur. Polym. J., 1,1(1996)에 기재된 이하의 점도식 및 환산식에 의해 산출한 값이다.

점도식: [η]=3.85×10^-2×M_W ^0.76

환산식: DP=M_W/162

응고 후, 황산을 가하여 중화, 재생을 행함으로써, 목적으로 하는 셀룰로오스 입자를 함유한 슬러리를 얻을 수 있다. 이때 슬러리는 재생에 이용한 산의 잔류에 의해 산성이며, 또한 중화에서 발생한 암모늄염 등의 불순물을 포함하고 있기 때문에, 셀룰로오스 입자와 매체를 포함하는 셀룰로오스 분산액으로 정제하는 조작이 필요하게 된다. 본 실시형태에서는 이 정제 조작으로서 원심분리-경사분리-분산매 액체에 의한 희석 처리의 반복을 이용한다. 얻어진 셀룰로오스 입자 분산액 중의 셀룰로오스 입자는 정제 조작 과정에서 응집하는 경우도 있기 때문에, 이 경우는 전단(剪斷) 등에 의한 분산 처리를 행할 수 있다. 본 실시형태에서는 전단을 부여하는 수단으로서는 고압 호모게나이저를 이용한다.

[셀룰로오스 입자의 착색 방법]

얻어진 셀룰로오스 입자의 슬러리에, 고농도의 수산화나트륨 수용액을 가한 곳에, 피리미딘 구조 또는 트리아진 구조를 갖는 반응성 염료를 가하고, 마그네틱 스터러로 교반하면서 항온조에서 소정의 온도로 승온한다. 소정 시간 경과 후에 목적으로 하는 염색 셀룰로오스 입자를 함유한 슬러리를 얻을 수 있다. 이 공정을 밟음으로써, 개개의 입자를 각각 균일하게 염색할 수 있기 때문에, 특허문헌 3에서 얻어진 입자는 불규칙한 윤곽을 갖고 있거나 표면이 깔쭉깔쭉하게 되어 있었지만, 본 실시형태에서 얻어지는 입자는, 불규칙한 윤곽이나 표면의 들쭉날쭉한 모양은 크게 개선되고, 진구도가 각별히 좋아진다. 상기한 반응성 염료에 의한 염색 방법으로 염색하면, 입자 전체를 마치 표면 코팅과 같이 염색할 수 있다는 것을 알아냈다. 또한 동시에, 이 방법에서는, 개개의 입자가 균일하게 코팅되기 때문인지 균일하게 입자경이 커진다, 즉 극단적으로 입자경이 큰 입자의 발생을 억제할 수 있다는 것을 알게 되었다. 또한, 입자 표면에 F 원소도 잔존하는 것을 알게 되었다. 이에 반해, 특허문헌 3에서는, 고농도의 수산화나트륨이 아니라, 탄산나트륨을 이용하여 염색을 하고 있었지만, 수산화나트륨과 비교하여 탄산나트륨은 셀룰로오스의 팽윤시키는 힘이 약하기 때문에, 팽윤되기 쉬운 입자의 가장 표면만이 팽윤되어, 반응성 염료와 반응해 버리므로, 입자 전체적으로 봤을 때 균일한 반응이 일어나지 않았다. 또한 특허문헌 3에서는, 한번 염색한 후에 수산화나트륨으로 세정하기 때문에, 일부 염료의 탈리 반응이 보여, 표면의 균일성을 쓸데없이 잃어버렸다. 이와 같이 특허문헌 3에서는, 앞서 말한 염료의 표면 코팅이 균일하게 이루어지지 않아, 만족할 수 있는 진구도를 얻을 수 없고, 또한 친수성의 셀룰로오스도 표면에 노출되어 있었기 때문에, 친수도를 내릴 수 없었다. 더구나, 탄산나트륨을 이용하여 염색하면, 불균일하고 표면적이 큰, 즉 입자경이 큰 입자부터 염색되어 버린 탓인지, 조대 입자의 양도 증가해 버리는 것을 알게 되었다. 또한, 자주 알칼리로 세정하기 때문에 입자 표면의 F 원소도 탈리되어 버린다. 그러므로, 본원 발명자들은, 입자의 코어부터 표면까지 개개의 입자 전체를 균일하게 염색할 수 있는 고농도의 수산화나트륨을 이용하는 염색 방법을 채용했다. 그 결과, 입자를 염료로 균일하게 염색할 수 있어, 입자의 진구도가 현저히 개선되고, 친수도를 저하시켜, 조대 입자를 감소시킬 수 있었다.

더욱이, 반응성이 높고, 내알칼리성 염료인 피리미딘 구조 또는 트리아진 구조를 갖는 반응성 염료를 고농도의 수산화나트륨 존재 하에 염색함으로써, 입자를 균일하게 염색할 수 있고, 친수도를 크게 저하시킬 수 있다.

이어서 원심분리에 의한 정제를 행하여, 염색 셀룰로오스 입자 분산액을 얻는다. 얻어진 염색 셀룰로오스 입자 분산액 중의 셀룰로오스 입자는, 정제 조작 과정에서 응집하는 경우도 있기 때문에, 이 경우는 전단 등에 의한 분산 처리를 행할 수 있다. 본 실시형태에서는 전단을 부여하는 수단으로서는 고압 호모게나이저를 이용한다. 그 후, 얻어진 착색 셀룰로오스 입자의 각종 물성을 측정한다.

[면역크로마토그래피 진단 키트의 제작 방법]

소정의 농도로 조정한 착색 셀룰로오스 입자의 분산액을 준비하고, 완충액, 항체를 가하여, 온도 조정을 행하면서 일정 시간 교반하여, 착색 셀룰로오스 입자에 항체를 흡착시킨다. 일정 시간 교반 후, 추가로 블로킹제를 가하여 온도 조정을 행하면서 일정 시간 교반함으로써 착색 셀룰로오스 입자의 블로킹을 행한다. 여기서 말하는 블로킹이란, 입자 단체, 또는 항체나 항원을 담지시킨 입자 등을 코팅하는 조작이다. 블로킹제로서는, 검사 대상 물질이나 검체 또는 그것을 희석하는 용액의 조성 등에 따라 다양한 블로킹제를 이용할 수 있다. 카제인은 착색 셀룰로오스 입자의 블로킹에 특히 바람직하다. 이 경우, 카제인이, 항체를 담지한 착색 셀룰로오스 입자 중의 항체 및 착색 셀룰로오스 입자의 표면을 코팅하고 있다. 항체 흡착과 블로킹 후의 착색 셀룰로오스 입자를 세정하기 위해서, 원심분리를 행하여, 필요 이상의 항체와 블로킹제가 포함된 상청액과 침강된 입자를 분리하고, 상청액을 경사분리로 제거한다. 침강된 입자에 완충액 등의 액체를 가하고, 필요에 따라서 초음파 등으로 분산 처리를 행한다. 이 원심분리에 의한 침강, 상청액의 제거, 액체의 첨가라고 하는 일련의 조작에 의한 세정을 필요 횟수 행하여, 항체 흡착과 블로킹을 행한 입자를 소정의 농도 함유한 분산액을 조정한다. 이 분산액에 필요에 따라 단백질, 계면활성제, 수크로오스나 트레할로스 등의 당을 가하고, 얻어진 용액을 폴리에틸렌제의 콘주게이트 패드에 일정량 도포하고, 건조시켜, 검출 시약 함유부를 조정한다. 또한, 재생 셀룰로오스 연속 장섬유 부직포에 필요에 따라 완충액, 계면활성제, 단백, 검체 시료 중의 협잡물을 트랩하는 시약, 방부제, 항균제, 산화방지제, 흡습제 등을 도포하고, 건조시켜, 샘플 패드를 조제한다. 또한 소정의 위치에 항체를 고정화한 니트로셀룰로오스 다공막 제조의 크로마토그래피 매체, 검체를 흡수하기 위한 셀룰로오스 여과지 제조의 흡수 패드를 조제한다. 이들을 백킹 시트라고 불리는 접착 부위를 갖는 대지에 고정화하여, 소정의 사이즈로 재단함으로써 면역크로마토그래피 진단 키트를 제작한다.

실시예

이하, 본 발명을 실시예에 의해 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예만에 한정되는 것은 아니다. 또한, 특별히 기재가 없는 모든 조작은 온도 23℃, 상대습도 55% RH의 환경 하에서 행했다. 실시예에서는 이하의 측정, 산출 방법을 이용했다.

〔셀룰로오스 미립자의 평균 중합도 측정〕

셀룰로오스의 평균 중합도(DP)란, 상기한 것과 같이, 셀룰로오스 미립자를 카독센에 용해한 희박 셀룰로오스 용액의 비점도를 우벨로데형 점도계로 측정하고, 그 극한 점도수[η]로부터 참고문헌: Eur. Polym. J., 1,1(1996)에 기재된 이하의 점도식과 환산식에 의해 산출한 값이다.

[η]=3.85×10^-2×M_W ^0.76

DP=M_W/162

[발색 입자의 평균 입자경의 측정]

장치로서는 닛키소사 제조의 나노트랙 입도 분포 측정 장치 UPA-EX150(동적 광산란식)을 이용했다. 측정 샘플로서, 착색 유기 미립자(발색 입자)가 0.01 중량%, 순수 99.99 중량%의 샘플을 이용했다. 측정 조건으로서는 적산 횟수를 30회, 1 측정 당 측정 시간을 30초로 하고, 체적 평균의 입자경 분포를 이용하여 그 메디안 직경을 평균 입자경으로 했다. 또한, 30회의 적산에 의해서 얻어진 입도 분포의 표준편차와 평균 입자경을 이용하여 CV치를 산출했다.

[발색 입자의 발색 강도 측정]

장치로서는 닛폰분코사 제조의 자외가시근적외 분광광도계 JASCO V-650(광학계: 싱글 모노크로미터, 체르니터너 마운트, 더블빔 방식, 광원: 중수소 램프(190∼350 nm), 할로겐 램프(330∼900 nm))에 동사 제조의 적분구 유닛 ISV-722를 부착한 장치를 이용했다. 측정하는 샘플은, 임의 농도의 발색 입자의 수분산액 또는 건조 입자를, 분산매로서 증류수를 이용하여 발색 입자가 0.01 중량%, 순수 99.99 중량%가 되도록 농도를 조정한 것을 사용했다. 이 농도 조정한 수분산액을, 광로 길이 10 mm의 석영 셀(용량: 3.5 mL 광로 폭: 10 mm)에 2.5 mL 가하고, 이 석영 셀을 자외가시근적외 분광광도계의 샘플 폴더에 셋트하여, 그 후, 측정을 실시했다. 얻어진 흡광도 피크 중, 400∼800 nm 가시광 범위에서의 최대치(ABS)를 발색 강도로 했다.

[발색 입자의 착색 성분 비율의 산출]

소정 횟수의 착색 조작을 행한 후의 발색 입자의 중량과 착색 전의 입자의 중량으로부터 계산하여 산출했다. 예컨대, 1.0 g의 셀룰로오스 입자를 착색하여, 2.5 g의 착색 셀룰로오스 입자를 얻은 경우의 착색 성분은, 2.5 g-1.0 g=1.5 g으로 하여 계산했다. 이 경우의 착색 성분의 비율은 1.5 g÷2.5 g×100=60.0 중량%가 된다.

〔발색 입자의 셀룰로오스 유래 성분의 비율 산출〕

상기한 것과 같이 「발색 입자의 셀룰로오스 유래 성분의 비율」=100%-(발색 입자의 착색 성분의 비율)의 계산식에 의해서 계산했다.

[발색 입자의 진구도 측정]

장치로서는 닛폰덴시가부시키가이샤 제조의 주사형 전자현미경 JSM-6700을 이용했다. 발색 입자가 0.01 중량%, 순수 99.99 중량%인 샘플을 운모판에 적하하여, 10초 경과시킴으로써 발색 입자를 운모판 상에 흡착시키고, 킴와이프로 여분의 액체를 흡수하여 건조시켰다. 얻어진 운모판을 플래티늄으로 코팅하여, 전자현미경 측정용 샘플을 조제했다. 가속 전압 1.6 kV, 측정 배율 5만배로 관측을 하여, 입자 화상이 100개 이상으로 되도록 필요 매수의 화상을 촬영하고, 각각의 입자의 장경(L)과 단경(D)을 측정하여, 입자 100개의 L/D의 평균치를 산출했다.

[발색 입자 중의 조대 입자 비율의 산출]

장치는 BECHMAN COULTER사 제조의 Multisizer 4(코울터 카운터 타입)로, 어퍼처는 AP20을 이용하여 측정을 행했다. 또한, 전해액은 마찬가지로 BECHMAN COULTER사 제조의 아이소톤 II-PC 희석액(염화나트륨 7.93 g/L, 불화나트륨 0.30 g/L, 상품 번호: 8546719)을 사용했다. 측정 샘플로서, 발색 입자가 1.00 중량%, 순수 99.00 중량%인 샘플을 이용했다. 우선, 200 mL 비이커에 100 mL의 아이소톤 II 희석액을 가한다. 이 비이커에, 추가로 아이소톤 II-PC 희석액 중의 발색 입자 농도가 5% 정도가 되도록 발색 입자를 가한다. Multisizer 4 부속의 스터러로 교반하면서 측정을 행했다. 측정 조건으로서는, 400 nm∼12000 nm의 범위에서, 입자의 총 개수가 100000개인 입자를 검지했을 때의 입자경 700 nm 이상의 입자의 개수(A)로부터 조대 입자의 존재율(X)을 이하의 식으로 산출한다.

조대 입자의 존재율(X)(%)={입자경 700 nm 이상의 입자의 개수(A)/100000}×100

예컨대, 100000개 중 입자경 700 nm 이상의 입자가 7000개 존재한 경우는 7.0%가 된다. 조작 조건의 상세한 것을 이하에 기재한다.

·어퍼처 전류치: 800 μA

·교정 계수 Kd: 29.764

·증폭률: 4

·측정 입자경 범위: 400 nm∼12000 nm

·측정 입자 개수: 100000개

·측정 시에 있어서의 아이소톤 II-PC 희석액 중의 발색 입자 농도: 5%

[발색 입자의 친수도 측정]

친수도는 펄스 NMR법에 의해 측정한다. 펄스 NMR법은, 미립자 분산액에 라디오파를 조사하여 물 분자의 프로톤을 여기시킨 후, 기저 상태로 되돌아가기까지의 시간(완화 시간)을 측정하는 분석 수법이다. 미립자 표면에 흡착되어 있는 물 분자는 운동성이 제한되기 때문에 완화 시간이 짧고, 벌크 물 분자(미립자 표면과 흡착되어 있지 않은 물 분자)는 운동성에 제한이 적어 자유롭게 운동할 수 있기 때문에 완화 시간이 길다. 따라서, 펄스 NMR법에 의해 얻어지는 미립자 분산액의 완화 시간은, 미립자 표면에 흡착되어 있는 물 분자와 벌크 물 분자의 비율에 의해 변화된다. 즉, 미립자 표면의 친수성이 높을수록 보다 많은 물 분자를 흡착할 수 있기 때문에 완화 시간은 짧아진다.

펄스 NMR의 측정에는, 브루카사 제조의 Minispec mq20 장치를 이용한다. 농도 1%(wt/vol)의 미립자 분산액을 교반한 후, 0.5 mL를 외경 10 mm의 유리제 NMR 관으로 옮기고, 30℃로 설정된 펄스 NMR 장치에 설치하여, 각종 파라미터를 다음과 같이 설정하여 측정한다.

·관측 핵: 1H

·측정하는 완화 시간: 횡완화 시간 T2(ms)

·측정 모드: CPMG법

·적산 횟수: 32회

·Recycle Delay: 10(s)

·90°-180° Pulse Separation(τ): 2(ms)

·Total Number of Acquired Echoes: 2000점.

얻어진 자화 감쇠 곡선(자화 강도의 경시 변화를 나타내는 곡선)을, Microsoft Excel의 지수 근사 기능을 이용하여 최소제곱법에 의해 하기 식(1):

M(t)=M0·exp(-t/T2) ···식 (1)

{식 중, M(t): 어느 시간 t에 있어서의 신호 강도, M0: 신호 강도의 초기치, T2: 완화 시간.}에 의해 피팅했다. 식 (1)의 T2가 완화 시간이다.

측정한 완화 시간(T2)으로부터 친수도를 산출하기 위해서는, 종축에 완화 시간의 변화 비율(Rsp 값)을, 횡축에 미립자의 총 표면적 값(TSA 값)를 플롯한 그래피를 준비하여, 최소제곱법에 의해 근사 직선을 작성하고, 그 기울기로서 친수도를 구한다.

·Rsp 값의 계산 방법

Rsp 값=Rav÷Rb-1

{식 중, Rav: 평균 완화 시상수(시료의 완화 시간 역수), Rb: 벌크 물 분자의 완화 시상수(블랭크 물의 완화 시간 역수).}.

·TSA 값(㎡)의 계산 방법

TSA 값=SA×V×Ψp×ρ

{식 중, SA: 미립자의 비표면적(m²/g)=6÷(ρ×d), 여기서, ρ: 미립자 밀도(g/㎤)(여기서, 셀룰로오스 미립자 밀도: 1.4 g/㎤, 라텍스 입자 밀도: 1.0 g/㎤, 금 콜로이드 입자 밀도: 19.3 g/㎤), d: 미립자 직경(㎛), V: 라디오파가 조사되는 부분의 NMR 관 체적(㎤)(≒시료량), Ψp: 미립자 체적비(여기서, 미립자 체적(i)=미립자 농도(wt%)÷100÷미립자 밀도(ρ: 위와 같음), 물의 체적(ii)=(1-미립자 체적(i))÷물의 밀도(0.997 g/㎤), Ψp(미립자 체적비)=미립자 체적(i)÷물의 체적(ii)}.

예컨대, 도 2에 도시하는 것과 같이, A 미립자(TSA 값 0.5, Rsp 값 10)와 B 미립자(TSA 값 1, Rsp 값 5)의 수치를 그래피에 플롯하여, 최소제곱법에 의해 각각의 근사 직선을 작성한다. A 미립자의 경우는 Y=20x, B 미립자의 경우는 Y=5x가 된다. 근사 직선의 기울기(친수도)가 큰 쪽, 즉 A 미립자 쪽을 친수도가 크다고 판정한다.

[발색 입자의 입자 표면의 F 원소의 상대 원소 농도 측정]

발색 입자의 입자 표면의 F 원소의 상대 원소 농도는 XPS에 의해 측정한다. 발색 입자를, 1.5 mmΦ×0.2 mmt의 접시형 시료대에 얹어, 이하 조건에 의해 XPS 측정을 실시했다. XPS 측정에는, 서모피셔 ESCALAB 250를 이용하여 이하 조건에 의해 실시했다.

여기원: 단색화 A1Kα 15 kV×10 mA

분석 사이즈: 약 1 mm(형상은 타원)

광전자 취득 각도: 0°(분광기의 축과 시료면이 수직)

취득 영역

Survey scan: 0∼1,100 eV

Narrow Scan: C1s, N1s, S2p, O1s, Na1s, F1s, Si2p, Cl2p

Pass Energy

Survey Scan: 100 eV

Narrow Scan: 20 eV

본 측정에 의해 얻어진 C1s, N1s, S2p, O1s, Na1s, F1s, Si2p, Cl2p의 면적 강도 및 각 피크의 상대 감도 계수(C1s: 1.00, N1s: 1.68, S2p: 1.98, O1s: 2.72, Na1s: 10.2, F1s: 4.67, Si2p: 0.93, Cl2p: 2.285)로부터 이하의 식:

[F](atomic%)=100×(I_F1s/RSF_F1s)/(ΣI_j/RSF_j)

{식 중, I_F1s: F1s의 면적 강도(eV·cps), RSF_F1s: F1s의 상대 감도 계수, I_j: C1s, N1s, S2p, O1s, Na1s, F1s, Si2p, Cl2p의 면적 강도(eV·cps), RSF_j: C1s, N1s, S2p, O1s, Na1s, F1s, Si2p, Cl2p의 상대 감도 계수.}를 이용하여 F 원소의 상대 원소 농도([F])를 구한다.

[면역크로마토그래피 진단 키트의 진단 시간과 재현성의 측정]

5 mm 폭으로 컷트한 면역크로마토그래피 진단 키트를 플라스틱의 하우징에 넣었다. 얻어진 하우징에서의 진단 키트를, 하마마쯔호토닉스사 제조의 이뮤노크로마토리더 C10066-10을 이용하여 측정했다. 이용하는 입자의 색에 따라서 장치를 설정했다. 검사 대상 물질에는 인간 융모성(絨毛性) 고나도트로핀(이하 「hCG」라고 한다.)을 이용하여, hCG를, 1 중량%의 소혈청 알부민(이하 「BSA」라고 한다.)을 포함하는 66 mM, PH 7.4의 인산 완충액(이하 「PBS」라고 한다.)으로 희석하여, hCG 농도가 10 mIU/ml인 양성 검체를 조제했다. 이 양성 검체 120 μl를 진단 키트의 샘플 적하부에 적하하고, 이후 20초마다 이뮤노크로마토리더로 측정하여, TL의 발색 시간의 측정을 행했다. 여기서 20초마다로 한 이유는, 측정 1회 당 20초 못미치게 필요하기 때문이다. 이뮤노크로마토리더로 얻어지는 TL의 발색 강도(단위는 mABS)가 20 mABS 이상으로 된 시간을 측정했다. 여기서 20 mABS로 한 이유는, 개인차도 있지만 20 mABS 이상으로 되면 눈으로 보아도 TL의 존재를 확인할 수 있기 때문이다. 이 측정을 20회 행하여, 얻어진 값의 평균치를 진단 시간, 그 표준편차를 진단 시간 표준편차로 했다. 재현성을 나타내는 지표 %CV는 하기 식:

%CV={진단 시간 표준편차/진단 시간}×100

에 의해 산출했다:

[면역크로마토그래피 진단 키트의 감도와 재현성의 측정]

마찬가지로 120 μl의 양성 검체를 진단 키트의 샘플 적하부에 적하하여, 15분 경과 후의 TL의 발색 강도를 이뮤노크로마토리더로 측정했다. 이 측정을 20회 행하여, 얻어진 값의 평균치를 TL 강도, 그 표준편차를 TL 강도 표준편차로 했다. 재현성을 나타내는 지표 %CV는, 하기 식:

%CV={TL 강도 표준편차/TL 강도}×100

에 의해 산출했다.

[면역크로마토그래피 진단 키트의 백그라운드 판정]

마찬가지로 120 μl의 양성 검체를 진단 키트의 샘플 적하부에 적하하여, 15분 경과 후의 TL의 2 mm 상류 측의 백그라운드 강도와 2 mm 하류 측의 백그라운드 강도를 이뮤노크로마토리더로 측정했다. 그 평균치를 백그라운드 강도로 했다.

[면역크로마토그래피 진단 키트의 위양성(僞陽性) 측정]

1 중량% BSA를 포함하는 66 mM, pH 7.4의 PBS를 조정하여 음성 검체를 조제했다. 120 μl의 음성 검체를 진단 키트의 샘플 적하부에 적하하여, 15분 경과 후의 TL의 발색 강도를 이뮤노크로마토리더로 측정했다. 이 측정을 5회 행하여, 얻어진 값의 평균치가 5 mABS 이하이면 위양성은 없다고 판단했다. 여기서 5 mABS로 한 이유는, 개인차도 있지만, 5 mABS 이하이면 눈으로 봐서는 TL의 존재를 확인할 수 없기 때문이다.

[면역크로마토그래피 진단 키트의 검출 한계의 측정]

hCG 농도를 3.20 mIU/ml, 1.60 mIU/ml, 0.80 mIU/ml, 0.40 mIU/ml, 0.20 mIU/ml, 0.10 mIU/ml, 0.05 mIU/ml, 0.025 mIU/ml로 단계적으로 얇게 해 간 양성 검체를 조제했다. 상기한 것과 마찬가지로 120 μl를 진단 키트의 샘플 적하부에 적하하여, 15분 경과 후의 TL의 발색 강도를 이뮤노크로마토리더로 측정했다. 이 측정을 각 농도로 5회 행하여, 얻어진 값의 평균치가 음성 검체를 측정했을 때의 값+20 mABS 이상인 경우는 양성 판정, 이하인 경우는 검출 한계라고 간주했다. 이 양성 판정이 얻어지는 하한의 hCG 농도를 검출 한계로 했다.

[실시예 1]

종래 공지된 방법으로, 셀룰로오스 농도 0.37 wt%, 구리 농도 0.13 wt%, 암모니아 농도 1.00 wt%의 구리암모니아 셀룰로오스 용액을 조제했다. 얻어진 구리암모니아 셀룰로오스 용액을 공기 존재 하에서 천천히 교반하고, 12시간 걸쳐 중합도를 조정했다. 또한 테트라히드로푸란 농도 89.00 wt%, 물 농도 11.00 wt%의 응고액을 조제했다. 마그네틱 스터러를 이용하여 응고액 5000 g을 천천히 교반하면서, 조제해 둔 구리암모니아 셀룰로오스 용액 500 g을 첨가했다. 5초 정도 교반을 계속한 후, 10 wt%의 황산 1000 g을 가하여 중화, 재생을 행하여, 셀룰로오스 미립자를 함유한 슬러리 6500 g를 얻었다.

얻어진 슬러리를 10000 rpm의 속도로 10분간 원심분리했다. 침전물을 경사분리에 의해 취출하고, 증류수를 주입하여 교반하여, 다시 원심분리했다. pH가 6.0∼7.0이 될 때까지 이 조작을 수회 반복하고, 그 후, 고압 호모게나이저에 의한 분산 처리를 행하여, 셀룰로오스 미립자 분산액 150 g을 얻었다. 얻어진 셀룰로오스 미립자의 평균 입경을 측정한 결과, 261 nm였다. 또한, 상기 미립자의 중합도를 측정한 바, 110이었다.

이어서, 상기한 것과 같이 하여 조제한 셀룰로오스 미립자의 염색을 행했다. 미립자 농도를 1.00 wt%로 조정한 셀룰로오스 미립자 분산체 100 g에 대하여, 황산나트륨 30 g, 트리아진 구조를 갖는 반응성 염료(다이스타가부시키가이샤 제조 Levafix Red CA GR.(등록상표)) 1.00 g을 가하여 교반시키면서 항온조를 이용하여 60℃까지 승온했다. 60℃로 승온한 후에 수산화나트륨 10 g을 가하여, 2시간 염색을 행했다. 얻어진 거친 착색 미립자를 탈이온수로 세정하여, 원심분리로 회수하고, 그 후 원심분리로 회수한다고 하는 일련의 조작을 1회 사이클로 하여, 같은 조작을 합계 5회 사이클까지 실시하여, 착색 셀룰로오스 미립자를 얻었다. 이 미립자의 평균 입경은 352 nm, CV치는 21%, 발색 강도는 2.9 ABS, 착색 성분의 비율은 49%, 진구도는 1.2이며, 조대 입자는 1.4%였다. 얻어진 착색 셀룰로오스 미립자의 전자현미경 화상을 도 3에 도시한다.

[항체 감작 착색 셀룰로오스 입자의 조제]

기지의 방법으로 조제한 1.0 중량%의 착색 셀룰로오스 입자 1(평균 입자경 352 nm, 발색 강도 2.9 ABS, 착색 성분의 비율 49%, 진구도는 1.2, 조대 입자의 비율 1.4%) 60 μl을 15 ml의 원심관에 넣고, 또한 트리스 완충액(10 mM, pH 7.0)을 540 μl, 0.1%의 항hCG-α 마우스 항체(Fitzgerald사 제조, 10-C25C)를 60 μl 가하여, 볼텍스로 10초 교반했다. 이어서 37℃로 조정한 건조기 내에 넣어 120분간 정치했다. 이어서 1.0 중량%의 카제인(와코쥰야쿠고교사 제조, 030-01505)을 함유하는 블로킹액(100 mM 붕산, pH 8.5)을 7.2 ml 가하고, 또 37℃의 건조기 내에서 60분간 정치했다. 이어서 원심분리기(구보타쇼지사 제조, 6200)와 원심분리 로터(구보타쇼지사 제조, AF-5008C)를 이용하여, 10,000 g의 원심을 15분간 행하여, 감작 입자를 침강시킨 후에 상청액을 제거했다. 이어서 붕산 완충액(50 mM 붕산, pH 10.0)을 7.2 ml 가하여, 초음파 분산기(에스엠티사 제조, UH-50)로 10초간 처리했다. 이어서 10,000 g의 원심을 15분간 행하여, 감작 입자를 침강시킨 후에 상청액을 제거했다. 또한, 별도로 수크로오스(와코쥰야쿠고교사 제조, 196-00015) 1.8 g과 1.0 중량%의 카제인 블로킹액 2.4 g을, 붕산 완충액(50 mM 붕산, PH 10.0) 7.2 ml에 용해시켜 얻은 완충액을 이용하여, 감작 입자의 분산액의 중량을 1.58 g으로 조정하고, 0.038 중량%의 항체 감작 착색 셀룰로오스 입자 분산액을 조정하여, 초음파 분산기로 10초간 처리했다.

[콘주게이트 패드에의 항체 감작 착색 셀룰로오스 입자의 함침, 건조]

폴리에틸렌제 콘주게이트 패드(Pall사 제조, 6613)를 대과잉의 0.05 중량%의 Tween-20(등록상표, 시그마 알드리치사 제조, T2700)에 침지하여, 여분의 액을 제거한 후에 50℃에서 60분 건조시켰다. 이어서 높이 10 mm, 길이 300 mm의 형상으로 컷트했다. 이어서 마이크로핀셋을 이용하여 0.038 중량%의 항체 감작 착색 셀룰로오스 입자 분산액 780 μl를 균등하게 도포하여, 50℃에서 60분 건조시켰다.

[샘플 패드의 전처리]

기지의 방법으로 조정한 셀룰로오스제 샘플 패드(Millipore사 제조, C083)를, 대과잉의 2.0 중량%의 BSA(시그마 알드리치사 제조, A7906)와 2.0 중량%의 Tween-20을 함유하는 PBS 완충액(66 mM, PH 7.4)에 함침하여, 여분의 액을 제거한 후에 50℃에서 60분 건조시키고, 이것을 높이 20 mm, 길이 300 mm의 형상으로 컷트했다.

[포착 항체 도포 니트로셀룰로오스막의 조제]

니트로셀룰로오스막(Millipore사 제조, SHF0900425)을 높이 25 mm, 길이 300 mm의 형상으로 컷트했다. 액체 도포 장치(무사시엔지니어링사 제조, 300DS)를 이용하여, 0.1 중량% 항hCG-β 마우스 항체(MedixBiochemica사 제조, 6601)를 포함하는 PBS 용액(66 mM, pH 7.4)을 0.1 μl/mm의 비율로 높이 7 mm의 부분에 도포했다. 이어서 0.1 중량%의 항마우스-토끼 항체(Daco사 제조, Z0259)를 포함하는 PBS 용액(66 mM, pH 7.4)을 0.1 μl/mm의 비율로 높이 12 mm의 부분에 도포하고, 이어서 37℃에서 30분 건조시켰다.

[면역크로마토그래피 진단 키트의 조제]

백킹 카드(Adhesives Research사 제조, AR9020)에, 조정한 포착 항체 도포 니트로셀룰로오스막, 흡수 패드(Millipore사 제조, C083), 항체 감작 착색 셀룰로오스 입자를 함유한 콘주게이트 패드, 재생 셀룰로오스 연속 장섬유 부직포 샘플 패드를, 도 1에 도시하는 레이아웃으로 접합하고, 이어서 재단기로 5 mm의 폭으로 컷트하여, 폭 5 mm, 높이 60 mm의 면역크로마토그래피 진단 키트를 얻었다.

[면역크로마토그래피 진단 키트의 성능 평가]

얻어진 면역크로마토그래피 진단 키트의 성능을 평가했다. 결과를 이하의 표 1에 나타낸다.

[실시예 2∼6]

셀룰로오스 미립자를 이하의 표 1에 기재한 중합도로 조정한 것 이외에는, 실시예 1과 같은 방법으로 발색 입자를 제작하고, 면역크로마토그래피 진단 키트를 조제하여, 그 성능을 평가했다. 결과를 이하의 표 1에 나타낸다.

[실시예 7∼9]

셀룰로오스 미립자를, 피리미딘 구조를 갖는 반응성 염료(다이스타가부시키가이샤 제조 Levafix Rubine CA GR.(실시예 7, 등록상표), 다이스타가부시키가이샤 제조 Levafix Navy Blue E-BNA CA GR.(실시예 8, 등록상표), 다이스타가부시키가이샤 제조 Levafix Navy CA GR.(실시예 9, 등록상표))를 이용하여 염색한 것 이외에는, 실시예 1과 같은 방법으로 발색 입자를 제작하고, 면역크로마토그래피 진단 키트를 조제하여, 그 성능을 평가했다. 결과를 이하의 표 1에 나타낸다.

[실시예 10∼13]

셀룰로오스 미립자의 제조 조건을 조정하여 이하의 표 1에 기재한 입경의 발색 입자를 제조한 것 이외에는, 실시예 1과 같은 방법으로 면역크로마토그래피 진단 키트를 조제하여, 그 성능을 평가했다. 결과를 이하의 표1 에 나타낸다.

[실시예 14∼18]

발색 입자의 제조 조건을 조정하여, 이하의 표 1에 기재한 발색 강도의 발색 입자를 제조한 것 이외에는, 실시예 1과 같은 방법으로 면역크로마토그래피 진단 키트를 조제하여, 그 성능을 평가 했다. 결과를 이하의 표 1에 나타낸다.

[실시예 19∼22]

발색 입자를 혼합하여, 이하의 표 1에 기재한 조대 입자 비율의 발색 입자를 제작한 것 이외에는, 실시예 1과 같은 방법으로 면역크로마토그래피 진단 키트를 조제하여, 그 성능을 평가했다. 결과를 이하의 표 1에 나타낸다.

[실시예 23, 24]

발색 입자를 혼합하여, 이하의 표 1에 기재한 CV치와 조대 입자 비율의 발색 입자를 제작한 것 이외에는, 실시예 1과 같은 방법으로 면역크로마토그래피 진단 키트를 조제하여, 그 성능을 평가했다. 결과를 이하의 표 1에 나타낸다.

[비교예 1, 2]

셀룰로오스 미립자를 이하의 표 2에 기재한 중합도로 조정하고, 또 응고액의 테트라히드로푸란 농도를 조정하여, 이하의 표 2에 기재한 진구도의 발색 입자를 제작한 것 이외에는, 실시예 1과 같은 방법으로 면역크로마토그래피 진단 키트를 조제하여, 그 성능을 평가했다. 결과를 이하의 표 2에 나타낸다.

[비교예 3]

셀룰로오스 미립자를 이하의 표 2에 기재한 중합도로 조정하여, 이하의 표 2기재한 진구도의 발색 입자를 제작한 것 이외에는, 실시예 1과 같은 방법으로 면역크로마토그래피 진단 키트를 조제하여, 그 성능을 평가했다. 결과를 이하의 표 2에 나타낸다.

[비교예 4∼6]

염색 시에, 특허문헌 3과 같은 방법으로 또한 사용하는 염료량을 조정하여 발색 강도를 조정하면서 염색한 것 이외에는, 실시예 1과 같은 방법으로 면역크로마토그래피 진단 키트를 조제하여, 그 성능을 평가했다. 결과를 이하의 표 2에 나타낸다.

[비교예 7]

염색 시에, 수산화나트륨 대신에 12 g의 탄산나트륨을 가하여 염색한 것 이외에는, 실시예 1과 같은 방법으로 면역크로마토그래피 진단 키트를 조제하여, 그 성능을 평가했다. 결과를 이하의 표 2에 나타낸다.

[비교예 8, 9]

염색 시에, 염료를 피리미딘 구조 또는 트리아진 구조를 갖고 있지 않은 반응성 염료(C. I. Reactive Orange 16(실시예 8), C. I. Reactive Blue 19(실시예 9))를 사용한 것 이외에는, 실시예 1과 같은 방법으로 면역크로마토그래피 진단 키트를 조제하여, 그 성능을 평가했다. 결과를 이하의 표 2에 나타낸다.

[비교예 10, 11]

셀룰로오스 입자의 제작 시에, 응고액의 테트라히드로푸란의 농도를 조정하여, 이하의 표 2에 기재한 평균 입경의 발색 입자를 제조한 것 이외에는, 실시예 1과 같은 방법으로 면역크로마토그래피 진단 키트를 조제하여, 그 성능을 평가했다. 결과를 이하의 표 2에 나타낸다.

[비교예 12]

발색 입자의 제조 조건을 조정하여, 이하의 표 2에 기재한 발색 강도의 발색 입자를 제조한 것 이외에는, 실시예 1과 같은 방법으로 면역크로마토그래피 진단 키트를 조제하여, 그 성능을 평가했다. 결과를 이하의 표 2에 나타낸다.

[비교예 13∼15]

실시예 20과 비교예 3의 발색 입자를 소정의 비율로 혼합, 조정하여, 이하의 표 2에 기재한 조대 입자량의 발색 입자를 제조한 것 이외에는, 실시예 1과 같은 방법으로 면역크로마토그래피 진단 키트를 조제하여, 그 성능을 평가했다. 결과를 이하의 표 2에 나타낸다.

[비교예 16, 17]

발색 입자로서 금 콜로이드(비교예 16), 라텍스(비교예 17)를 이용한 것 이외에는, 실시예 1과 같은 방법으로, 면역크로마토그래피 진단 키트를 조제하여, 그 성능을 평가했다. 결과를 이하의 표 2에 나타낸다.

본 발명에 따른 유기 착색 미립자를 이용한 면역크로마토그래피 진단 키트는, 양호한 백그라운드와 검사 결과의 재현성을 가지며, 충분한 검출 감도를 갖는 진단약으로서 적합하게 이용할 수 있다.

(a) 샘플 패드
(b) 항체 감작 발색 입자를 포함하는 콘주게이트 패드
(c) 검출부 A(TL)
(d) 검출부 B(컨트롤 라인)
(e) 크로마토그래피 매체
(f) 흡수 패드
(g) 대지

Claims (13)

1. 평균 입자경이 100∼650 nm이고, 발색 강도가 1.0∼10.0이며, 입자경 400 nm∼12000 nm의 범위에서 총 개수 100000개의 입자를 검지했을 때, 입자경 700 nm 이상의 조대 입자의 존재율이 5% 이하이고, 또한 장경(L)/단경(D)으로 표시되는 진구도가 1.0∼2.5이고, 착색 셀룰로오스 입자인 것을 특징으로 하며, 상기 발색 강도는 광로 길이 10 mm로 하여, 400∼800nm의 범위에서 적분구를 이용한 가시 흡광도 측정을 행하여 얻어진 흡광도 곡선의 피크치(ABS)를 측정하고, 얻어진 값을 유기 착색 미립자의 중량 퍼센트로 나누고, 발색 입자 0.01 중량% 당 흡광도로 환산한 값인, 유기 착색 미립자.
2. 제1항에 있어서, 상기 유기 착색 미립자의 중량의 10∼90 중량%가 착색 성분인 유기 착색 미립자.
3. 제2항에 있어서, 상기 착색 성분이 반응성 염료인 유기 착색 미립자.
4. 제3항에 있어서, 상기 반응성 염료가 피리미딘 구조 또는 트리아진 구조를 갖는 유기 착색 미립자.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유기 착색 미립자의 친수도는 1.0∼30.0이고, 상기 친수도는 하기 식 1에 의해 구해지는 완화 시간의 변화 비율(Rsp 값)을 종축에, 하기 식 2에 의해 구해지는 미립자의 총 표면적 값(TSA 값)을 횡축에 플롯한 그래프에서 최소제곱법으로 작성되는 근사직선의 기울기인, 유기 착색 미립자:
   Rsp 값 = Rav÷Rb-1 (식 1)
   {식 1 중, Rav: 평균 완화 시상수(펄스 NMR에 의해 측정한 유기 착색 미립자 분산액의 완화 시간의 역수), Rb: 벌크 물 분자의 완화 시상수(펄스 NMR에 의해 측정한 블랭크 물의 완화 시간의 역수)},
   TSA 값 = SA×V×Ψp×ρ (식 2)
   {식 2 중, SA: 미립자의 비표면적(m²/g) = 6÷(ρ×d), 여기서, ρ: 미립자 밀도(g/㎤), d: 미립자 직경(㎛), V: 라디오파가 조사되는 부분의 NMR 관 체적(㎤), Ψp: 미립자 체적비 (여기서, 미립자 체적(i) = 미립자 농도(wt%)÷100÷미립자 밀도(ρ: 위와 같음), 물의 체적(ii) = (1-미립자 체적(i))÷물의 밀도(0.997 g/㎤), Ψp(미립자 체적비) = 미립자 체적(i)÷물의 체적(ii)}.
6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 물리 흡착에 의해 리간드가 결합되어 있는 유기 착색 미립자.
7. 제6항에 있어서, 상기 리간드가 카제인에 의해 코팅되어 있는 유기 착색 미립자.
8. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 기재한 유기 착색 미립자를 포함하는 진단약 키트.
9. 제8항에 있어서, 면역크로마토그래피 키트인 진단약 키트.
10. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 기재한 유기 착색 미립자를 사용하는 공정을 포함하는 인비트로 진단 방법.
11. 제10항에 있어서, 면역크로마토그래피 방법인 인비트로 진단 방법.
12. 제5항에 있어서, 물리 흡착에 의해 리간드가 결합되어 있는 유기 착색 미립자.
13. 제12항에 있어서, 상기 리간드가 카제인에 의해 코팅되어 있는 유기 착색 미립자.
    

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