JP6877564B2 - 有機着色微粒子、診断薬キット、及びインビトロ診断方法 - Google Patents
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Description
(1)検査対象物質である抗原に特異的に結合する抗体をニトロセルロース膜などのクロマトグラフ媒体の所定の部位に固定化し、クロマトグラフ媒体の任意の位置にテストライン(以下、「TL」ともいう。)と呼ばれる反応部位を形成する。
(2)酵素、発色粒子、蛍光発色粒子、磁性粒子などの標識物質に、検査対象物質と特異的に結合するリガンド(例えば、抗体)を担持させた検出試薬を調製し、コンジュゲートパッドなどにかかる検出試薬を塗布乾燥し、検出試薬含有部を形成させ、前記クロマトグラフ媒体と組み合わせてイムノクロマト診断キットを形成する。ここでいうリガンドとは、検査対象物質と特異的に結合するものであり、抗体や抗原、有機分子、タンパク質が例として挙げられる。
(3)抗原を含む検体そのもの、又はそれを任意の液体で希釈した溶液を、前記イムノクロマト診断キットの所定の位置に、例えば、サンプルパッドに滴下し、抗原と検出試薬をクロマトグラフ媒体上に展開させる。
これらの操作によって、反応部位においてクロマトグラフ媒体上に固定化された抗体に、抗原を介して標識物質が捕捉され、標識物質の信号を検出することでイムノクロマト診断キットによる診断を行う。一般的な診断は抗原の有無のみを検査する定性診断だが、近年ではその信号の強度を目視あるいは機械で検出することで定量診断を行うこともできる。
[1]平均粒子径が100〜650nmであり、発色強度が1.0〜10.0であり、粒子径400nm〜12000nmの範囲で、総個数100000個の粒子を検知したとき、粒子径700nm以上の粗大粒子の存在率が5%以下であり、かつ、長径(L)/短径(D)で表される真球度が1.0〜2.5であることを特徴とする、平均重合度(DP)50〜400の着色セルロース微粒子。
[2]前記着色セルロース微粒子の重量の10〜90重量%が着色成分である、前記[1]に記載の着色セルロース微粒子。
[3]前記着色成分が反応性染料である、前記[2]に記載の着色セルロース微粒子。
[4]前記反応性染料が、ピリミジン構造又はトリアジン構造を有する、前記[3]に記載の着色セルロース微粒子。
[5]前記着色セルロース微粒子の親水度は、1.0〜30.0である、前記[1]〜[4]のいずれかに記載の着色セルロース微粒子。
[6]物理吸着によりリガンドが結合されている、前記[1]〜[5]のいずれかに記載の着色セルロース微粒子。
[7]前記リガンドがカゼインによりコーティングされている、前記[6]に記載の着色セルロース微粒子。
[8]前記[1]〜[7]のいずれかに記載の着色セルロース微粒子を含む診断薬キット。
[9]イムノクロマトグラフキットである、前記[8]に記載の診断薬キット。
本発明は、有機着色微粒子の真球度及び粒子径700nm以上の粗大粒子を緻密にコントロールすることで、高い検出感度を維持しつつ、バックグランドが良好で、検査結果の再現性に優れることを見出し、これに基づいて完成された発明である。
特許文献3には、粒子径が大きく、色が濃い有機着色微粒子をイムノクロマトの発色粒子として使用することで、検出感度が向上することが開示されている。しかしながら、かかる微粒子は、真球度が低く、球形が歪であるために、ニトロセルロース膜に展開するとき、細孔中でひっかかってしまうため、バックグラウンド悪化に繋がるおそれがある。
他方、本願発明者らは、イムノクロマト用の発色粒子として展開する際に、粒子径が700nm以上の粗大粒子がバックグラウンド悪化の主原因であることを見出し粒子径が700nm以上の粒子を粗大粒子とした。特許文献3では、700nm以上の粗大粒子について何ら言及されておらず、当該文献中に示されているパラメータ(例えば、CV値)だけを管理していると、バックグランドが悪くなってしまう。バックグランドを改善する方法としては、展開液に界面活性剤、アミノ酸等の添加剤を加える手法もあるが、これらの手法では感度も低下させてしまうおそれがある。
本発明者らは、粒子の形状がより真球に近くなり、かつ、ニトロセルロース膜の細孔に詰まり易い粗大な粒子を減じることができれば、ニトロセルロース膜に着色せず展開する、換言すればバックグランドが良好になるのではないかと考えた。かかる仮説の下、実験を検討した結果、重合度を精密にコントロールして、ピリミジン構造又はトリアジン構造を有する反応性染料を用いて染色した粒子は、粒子の形状がより真球に近くなり、かつ、粒子径700nm以上の粗大粒子を減少させることができることを発見した。このような有機着色微粒子をイムノクロマトの発色粒子として使用すると、これまでの高い検出感度を維持しつつ、良好なバックグラウンドが得られる結果、TLとのコントラストも良くなり、発色の有無の判断もし易くなり、更には再現性も向上する。また、粒子表面の親疎水性を精密にコントロールすることで、粗大粒子が減じた分の検出感度が向上し、検査の再現性も大幅に向上する。
本実施形態に係る有機着色微粒子は、平均粒子径が100〜650nmであり、発色強度が1.0〜10.0であり、粒子径400nm〜12000nmの範囲で総個数100000個の粒子を検知したとき、粒子径700nm以上の粗大粒子の存在率が5%以下であり、かつ、長径(L)/短径(D)で表される真球度が1.0〜2.5であることを特徴とする。
本実施形態における「有機着色粒子」とは、水、緩衝液などに不溶性であり、色素、染料等が担持された粒子状物質を指す。粒子を構成する素材は特に限定されないが、このような有機着色微粒子としては、例えば、ポリスチレンラテックス等のスチレン系ラテックスやアクリル酸系ラテックス等を着色した着色ラテックス粒子、ケイ素原子及び酸素原子からなる3次元構造体からなるシリカを着色した着色シリカ粒子、セルロースを着色した着色セルロース粒子などの着色成分をそのまま粒子化した発色粒子などが挙げられる。また、前記有機着色微粒子は蛍光発光性粒子でもかまわない。粒子径の調整、色の濃さの調整、色の種類の調整、粒子表面状態の調整などの粒子の特徴の調整のしやすさから、着色セルロース粒子が好ましい。セルロースは大量の水酸基を有するため、親水性が高く分散安定性に優れ、着色成分を大量に含有することができる。
反応性染料は、ピリミジン構造又はトリアジン構造を有することが好ましい。ここで、ピリミジン構造又はトリアジン構造が、粒子を疎水化し、後述する親水度に大きく影響することがわかった。反応性染料としては、ピリミジン構造又はトリアジン構造を持っているものであれば特に制限はなく、Sumifixシリーズ、Sumifix HFシリーズ、Sumifix Supraシリーズ(以上、登録商標、住友化学社製)、Levafixシリーズ(登録商標、ダイスター社製)等が好適に使用できる。これらの反応性染料は、高濃度の水酸化ナトリウムを用いた場合でも、好適に染色することができる。ピリミジン構造又はトリアジン構造を反応部位としていない反応性染料では、高濃度の水酸化ナトリウムを使用すると、セルロースの水酸基と反応する前に、反応部位が失活してしまい、所望の発色強度や親水度に達しない。本実施形態では、高濃度の水酸化ナトリウムと、ピリミジン構造又はトリアジン構造を反応部位とする反応性染料とを用いて有機粒子をうぃ染色することで、粒子全体が均一に染色され、粒子径が均一になり、かつ、後述の親水度が達成される。
粒子径の評価に体積平均を用いる理由として、イムノクロマト診断キットにおいてあまりに大きな粒子はニトロセルロースなどのクロマトグラフ媒体に詰まってしまうが、体積平均が大きい粒子が僅かに存在するだけでも、その影響が反映されるためである。粒子径の評価方法としては体積平均以外にも、数平均、面積平均など様々なものがあり、評価方法が異なると当然に粒子径の値も異なることになる。
濃度既知の有機着色微粒子の純水分散液を調製し、光路長10mmとして、400〜800nmの範囲で積分球を用いた可視吸光度測定を行い、得られた吸光度曲線のピーク値(ABS)を測定し、得られた値を有機着色微粒子の重量パーセントで割り返し、発色粒子0.01重量%辺りの吸光度に換算した値を求め、これを発色強度と定義する。例えば、調製した有機着色微粒子の濃度が0.0045%であり、吸光度曲線のピーク値が1.0であった場合、その発色強度は(1×0.01)÷0.0045=2.2となる。
粒子の色の濃さの測定に積分球を用いた可視吸光度測定を行う理由としては、液体に分散した状態の粒子の色の濃さを最も正確に測定できるためである。粒子の色の濃さを測る方法としては、粒子を乾燥させて得られた固体を測色計などで測定する方法もあるが、このような方法では粒子の色の濃さを正確に測定できない。例えば、金属コロイドなどは粒子径に応じて色調や最大波長が異なり、乾燥した凝集状態は液体に分散した状態の色の濃さを正確に反映できない。また、液体中に同じ粒子濃度で分散させても凝集が発生すると色の濃さは薄くなる。更に、可視吸光度測定を行う際に積分球を用いる理由は、粒子自体の散乱による影響を除去するためである。通常の可視吸光度測定は透過光を測定する方法であり、入射光に対し着色成分による吸収だけでなく粒子自体の散乱による影響も反映されてしまう。例えば、イムノクロマトに一般的に使われる金コロイドは、粒子径が40nm〜60nm、時には100nmのものが用いられる場合もあるがいずれも粒子径が小さいため散乱光の影響はほとんどない。それに対しポリスチレンラテックス粒子は粒子径が大きく明らかに散乱光の影響が大きい。上記のような理由から、粒子径や粒子素材が違う場合に粒子自体の色の濃さをより正確に反映するために、本実施形態では、積分球を用いた可視吸光度測定を採用する。
ここで、「粗大粒子」とは、一定の分布をもつ粒子のうち、粒子径700nm以上の粒子を指す。本願発明者らは、イムノクロマト診断キットにおける発色粒子を鋭意検討した結果、この粒子径700nm以上の粗大粒子が、ニトロセルロース膜のバックグランドを悪化させる要因の一つであることを突き止めた。理由としては単純に、粒子径700nm以上の粒子がニトロセルロース膜の細孔に詰まってしまうため、バックグラウンドを悪化させる。この粗大粒子の存在率が5%を超えると、著しくバックグランドを悪化させてしまい、その結果、TLとのコントラストが悪化してしまうため、誤診に繋がるおそれがある。イムノクロマト診断キットに展開させるという観点から、粗大粒子の存在率は、好ましくは4.5%以下であり、より好ましくは4.0%以下である。
「有機着色微粒子の着色成分の割合の算出方法」としては、着色前後の重量変化から算出することができる。また、重量変化からの算出が困難な場合は、着色成分を粒子から分離する操作を行い着色成分又は粒子を単離し算出することができる。例えば、セルロース粒子を反応性染料で染色した場合、酸やアルカリなどでセルロースと染料の共有結合を切断し、遠心分離によりセルロース粒子を回収することで算出することができる。また、セルラーゼを用いセルロースだけを分解することで算出することもできる。
「有機着色微粒子のセルロース由来成分の算出方法」は、前記の有機着色微粒子の着色成分の割合から計算できる。すなわち、「有機着色微粒子のセルロース由来成分の割合」=100%−(有機着色微粒子の着色成分の割合)の計算式によって計算できる。有機着色微粒子のセルロース由来成分の割合は90〜10重量%が好ましい。この範囲にあると、セルロース粒子の分散安定性が維持できる。また、前記着色成分の割合で記載した理由により、有機着色微粒子のセルロース由来成分の下限としては15重量%以上がより好ましく、特に好ましくは20重量%以上であり、上限は80重量%以下がより好ましく、特に好ましくは70重量%以下である。
本実施形態の有機着色微粒子の親水度は1.0〜30.0の範囲であることが好ましい。親水度がこの範囲にあると、粒子表面が疎水的なために、有機着色微粒子表面へのタンパク質、抗体等の吸着量が増加する。セルロースは親水性であり、タンパク質や抗体は一般的に吸着しにくいため、タンパク質や抗体を吸着させるためには、粒子の表面を疎水化することが必要となる。逆に言えば、疎水化の程度をこの指標でコントロールすることで、吸着量についても同様にコントロールすることができる。つまり、イムノクロマト診断キットにおいて、再現性に優れた有機着色微粒子を作製することができる。特許文献3では、この指標について何ら管理されておらず、再現性に欠けるデータを示すことがあった。親水度が30.0以上であると微粒子表面は親水的となるため、微粒子表面にタンパク質や抗体等の吸着が阻害されてしまい、感度が低下したり、再現性に乏しい結果になってしまったりする。また、1.0未満であると、疎水性が強くなりすぎてしまい、ニトロセルロース膜に吸着し、バックグランドを悪化させてしまう。以上の点から、親水度の上限は、より好ましくは27.0が好ましく、さらにより好ましくは25.0である。他方また、親水度の下限はより好ましくは1.5が好ましく、さらにより好ましくは2.0である。
図1中(a)で示すように、「サンプルパッド」とは、イムノクロマトにおいて測定対象である検体を最初に受け取る部分である。一般的なサンプルパッドとしては、セルロース濾紙、紙、ガラス繊維、グラスファイバー、アクリル繊維、ナイロン繊維、各種織物、などが挙げられる。
サンプルパッドは、必要に応じて前処理を行っても構わない。例えば、緩衝液、界面活性剤、タンパク、検体試料中の夾雑物をトラップする試薬、防腐剤、抗菌剤、酸化防止剤、吸湿剤、などを予め含ませるなどの処理を行っても構わない。また、サンプルパッドの形状は特に限定されないが、例えば、サンプルパッドのサイズとして、長さ(液が流れる長さ)は、検体液からの結びつき性や診断時間を考慮すると10〜25mm程度であることが好ましく、幅(液の流れに対して垂直)は、コンジュゲートパッドの巾より大きければ問題はない。幅が狭すぎるとサンプルパッドの端部より検査液が回り込んでしまう可能性がある。
〔セルロース粒子の作製方法〕
セルロースリンターをセルロースの良溶媒に溶解させる。本発明では良溶媒として公知の方法で調製した銅アンモニア溶液を用いる。そして凝固液としては有機溶媒+水+アンモニア混合系を主に用いる。この凝固液を攪拌しながら、調製しておいた銅アンモニアセルロ−ス溶液を加えて凝固を行う。
ここで、銅アンモニアセルロース溶液を予め空気存在下でインキュベートさせて、銅アンモニアセルロース溶液中のセルロースの平均重合度を調整することがポイントとなってくる。セルロースの平均重合度(DP)が調整されていないと、粒子径700nm以上の粗大粒子の割合が5%以下にならない。そのため、本実施形態では銅アンモニアセルロース溶液中のセルロースの平均重合度(DP)は50〜400に調整する。平均重合度が50未満であると、粒子形状を形成しにくくなり、目標の真球度にならない。一方、平均重合度(DP)が400を超えると、粗大粒子量が多くなってしまい、イムノクロマトで使用した時に、展開不良が起こり、バックグラウンドが悪くなる。その結果、TLとのコントラストが悪化してしまうため、誤診に繋がる可能性がある。平均重合度(DP)の下限としては、粒子形成の観点から60以上が好ましく、更に好ましくは70以上である。粗大粒子発生抑制の観点から、上限としては、350以下が好ましく、より好ましくは300以下である。
粘度式:[η]=3.85×10−2×MW 0.76
換算式:DP=MW/162
得られたセルロース粒子のスラリーに、高濃度の水酸化ナトリウム水溶液を加えたところに、ピリミジン構造又はトリアジン構造を有する反応性染料を加え、マグネティックスターラーで撹拌しながら恒温槽で所定の温度に昇温する。所定時間経過後に目的の染色セルロース粒子を含有したスラリーを得ることができる。この工程を踏むことで、個々の粒子を各々均一に染色することができるため、特許文献3で得られた粒子は、不規則な輪郭を有していたり、表面がぎざぎざでなっていたが、本実施形態で得られる粒子は、不規則な輪郭や表面のぎざぎざは大きく改善され、真球度が格段に良くなる。前記した反応性染料による染色方法で、染色すると、粒子全体をまるで表面コーティングの様に染色できることを見出した。また同時に、この方法では、個々の粒子が均一にコーティングされるためか、均一に粒子径が大きくなる、即ち極端に粒子径が大きい粒子の発生を抑制できることがわかった。また、粒子表面にF元素も残存することが分かった。これに反し、特許文献3では、高濃度の水酸化ナトリウムではなく、炭酸ナトリウムを用いて染色を行っていたが、水酸化ナトリウムと比べて炭酸ナトリウムは、セルロースの膨潤させる力が弱いため、膨潤しやすい粒子の最表面だけが膨潤し、反応性染料と反応してしまうために、粒子全体からみて均一な反応が起こっていなかった。また、特許文献3では、一度染色した後に、水酸化ナトリウムで洗浄するために、一部染料の脱離反応が見られ、表面の均一性を余計に失っていた。このように、特許文献3では、先に述べた染料の表面コーティングが均一になされておらず、満足できる真球度が得られておらず、また、親水性のセルロースも表面に露出していたため、親水度を下げることができていなかった。更に、炭酸ナトリウムを用いて染色すると、不均一で表面積の大きい即ち粒子径の大きい粒子から染色されてしまうせいか、粗大粒子の量も増えてしまうことが分かった。また、度々アルカリで洗浄するために粒子表面のF元素も脱離してしまう。それゆえ、本願発明者らは、粒子の芯から表面まで、個々の粒子全体を均一に染色することができる高濃度の水酸化ナトリウムを用いる染色方法を採用した。その結果、粒子を染料で均一に染色することができ、粒子の真球度が格段に改善し、親水度を低下させ、粗大粒子を減少させることができた。
所定の濃度に調整した着色セルロース粒子の分散液を準備し、緩衝液、抗体を加え、温度調整を行いながら一定時間撹拌し、着色セルロース粒子に抗体を吸着させる。一定時間撹拌後、更にブロッキング剤を加え温度調整を行いながら一定時間撹拌することで、着色セルロース粒子のブロッキングを行う。ここでいうブロッキングとは、粒子単体、または抗体や抗原を担持させた粒子等をコーティングする操作である。ブロッキング剤としては、検査対象物質や検体又はそれを希釈する溶液の組成などに応じ様々なブロッキング剤を用いることができる。カゼインは、着色セルロース粒子のブロッキングに特に好ましい。この場合、カゼインが、抗体を担持した着色セルロース粒子中の抗体及び着色セルロース粒子の表面をコーティングしている。抗体吸着とブロッキング後の着色セルロース粒子を洗浄するため、遠心分離を行い、余剰な抗体とブロッキング剤が含まれた上澄み液と沈降した粒子を分離し、上澄み液をデカンテーションにて除去する。沈降した粒子に緩衝液などの液体を加え、必要に応じ超音波などで分散処理を行う。この遠心分離による沈降、上澄みの除去、液体の添加という一連の操作による洗浄を必要回数行い、抗体吸着とブロッキングを行った粒子を所定の濃度含有した分散液を調整する。この分散液に必要に応じタンパク質、界面活性剤、スクロースやトレハロースなどの糖を加え、得られた溶液をポリエチレン製のコンジュゲートパッドに一定量塗布し、乾燥させ、検出試薬含有部を調整する。また、再生セルロース連続長繊維不織布に必要に応じ緩衝液、界面活性剤、タンパク、検体試料中の夾雑物をトラップする試薬、防腐剤、抗菌剤、酸化防止剤、吸湿剤、などを塗布し、乾燥させ、サンプルパッドを調製する。更に所定の位置に抗体を固定化したニトロセルロース多孔膜製のクロマトグラフ媒体、検体を吸収するためのセルロース濾紙製の吸収パッドを調製する。それらをバッキングシートと呼ばれる接着部位を有する台紙に固定化し、所定のサイズに裁断することでイムノクロマト診断キットを作製する。
〔セルロース微粒子の平均重合度の測定〕
セルロースの平均重合度(DP)とは、前記したように、セルロース微粒子をカドキセンに溶解した希薄セルロース溶液の比粘度をウベローデ型粘度計で測定し、その極限粘度数[η]から、参考文献:Eur.Polym.J.,1,1(1996)に記載される以下の粘度式と換算式により算出した値である。
[η]=3.85×10−2×MW 0.76
DP=MW/162
装置としては日機装社製のナノトラック粒度分布測定装置UPA−EX150(動的光散乱式)を用いた。測定サンプルとして、着色有機微粒子(発色粒子)が0.01重量%、純水99.99重量%のサンプルを用いた。測定条件としては積算回数を30回、1測定辺りの測定時間を30秒とし、体積平均の粒子径分布を用いそのメジアン径を平均粒子径とした。また、30回の積算によって得られた粒度分布の標準偏差と平均粒子径を用いCV値を算出した。
装置としては日本分光社製の紫外可視近赤外分光光度計JASCO V−650(光学系:シングルモノクロメータ、ツェルニターナマウント、ダブルビーム方式 光源:重水素ランプ(190〜350nm)、ハロゲンランプ(330〜900nm))に同社製の積分球ユニットISV−722を取り付けた装置を用いた。測定するサンプルは、任意の濃度の発色粒子の水分散液又は乾燥粒子を、分散媒として蒸留水を用いて発色粒子が0.01重量%、純水99.99重量%になるよう濃度を調整したものを使用した。この濃度調整した水分散液を、光路長10mmの石英セル(容量:3.5mL 光路幅:10mm)に2.5mL加え、この石英セルを紫外可視近赤外分光光度計のサンプルフォルダにセットし、その後、測定を実施した。得られた吸光度ピークのうち、400〜800nm可視光範囲での最大値(ABS)を発色強度とした。
所定回数の着色操作を行った後の発色粒子の重量と、着色前の粒子の重量から計算し算出した。例えば、1.0gのセルロース粒子を着色し、2.5gの着色セルロース粒子を得た場合の着色成分は2.5g−1.0g=1.5gとして計算した。この場合の着色成分の割合は1.5g÷2.5g×100=60.0重量%となる。
〔発色粒子のセルロース由来成分の割合の算出〕
前記の通り、「発色粒子のセルロース由来成分の割合」=100%−(発色粒子の着色成分の割合)の計算式によって計算した。
装置としては日本電子株式社製の走査型電子顕微鏡JSM-6700を用いた。発色粒子が0.01重量%、純水99.99重量%のサンプルを雲母板に滴下し、10秒経過させることで発色粒子を雲母板上に吸着させ、キムワイプで余分な液体を吸い取り乾燥させた。得られた雲母板をプラチナでコーティングし、電子顕微鏡測定用のサンプルを調製した。加速電圧1.6kV、測定倍率5万倍で観測を行い、粒子画像が100個以上になるように必要枚数の画像を撮影し、それぞれの粒子の長径(L)と短径(D)を測定し、粒子100個のL/Dの平均値を算出した。
装置はBECHMAN COULTER社製のMultisizer4(コールターカウンター式)で、アパチャーはAP20を用いて測定を行った。尚、電解液は、同じくBECHMAN COULTER社製のアイソトンII−PC希釈液(塩化ナトリウム7.93g/L、フッ化ナトリウム0.30g/L、商品番号:8546719)を使用した。測定サンプルとして、発色粒子が1.00重量%、純水99.00重量%のサンプルを用いた。まず、200mLビーカーに100mLのアイソトンII希釈液を加える。このビーカーに、更にアイソトンII−PC希釈液中の発色粒子濃度が5%程度になるように、発色粒子を加える。Multisizer4付属のスターラーで攪拌しながら、測定を行った。測定条件としては、400nm〜12000nmの範囲で、粒子の総個数が100000個の粒子を検知した時の粒子径700nm以上の粒子の個数(A)から粗大粒子の存在率(X)を以下の式から算出する。
粗大粒子の存在率(X)(%)={粒子径700nm以上の粒子の個数(A)/100000}×100
例えば、100000個のうち、粒子径700nm以上の粒子が7000個存在した場合は、7.0%となる。 操作条件の詳細を以下に示す。
・アパチャー電流値:800μA
・校正係数Kd:29.764
・増幅率:4
・測定粒子径範囲:400nm〜12000nm
・測定粒子個数:100000個
・測定時におけるアイソトンII−PC希釈液中の発色粒子濃度:5%
親水度はパルスNMR法により測定する。パルスNMR法は、微粒子分散液にラジオ波を照射して水分子のプロトンを励起させた後、基底状態に戻るまでの時間(緩和時間)を測定する分析手法である。微粒子表面に吸着している水分子は運動性が制限されるため緩和時間が短く、バルク水分子(微粒子表面と吸着していない水分子)は運動性に制限が少なく自由に運動できるため緩和時間が長い。したがって、パルスNMR法により得られる微粒子分散液の緩和時間は、微粒子表面に吸着している水分子とバルク水分子の比率により変化する。すなわち、微粒子表面の親水性が高いほど、より多くの水分子を吸着できるため緩和時間は短くなる。
パルスNMRの測定には、ブルカー社製のMinispec mq20装置を用いる。濃度1%(wt/vol)の微粒子分散液を撹拌後、0.5mLを外径10mmのガラス製NMR管に移し、30℃に設定されたパルスNMR装置に設置し、各種パラメータを以下の通りに設定し測定する。
・観測核:1H
・測定する緩和時間:横緩和時間T2(ms)
・測定モード:CPMG法
・積算回数:32回
・Recycle Delay:10(s)
・90°−180°Pulse Separation(τ):2(ms)
・Total Number of Acquired Echoes:2000点。
得られた磁化減衰曲線(磁化強度の経時変化を示す曲線)を、Microsoft Excelの指数近似機能を用いて最小二乗法により下記式(1):
M(t)=M0・exp(−t/T2)・・・式(1)
{式中、M(t):ある時間tにおける信号強度、M0:信号強度の初期値、T2:緩和時間。}によりフィッティングした。式(1)のT2が緩和時間である。
・Rsp値の計算方法
Rsp値=Rav÷Rb−1
{式中、Rav:平均緩和時定数(試料の緩和時間逆数)、Rb:バルク水分子の緩和時定数(ブランク水の緩和時間逆数)。}。
・TSA値(m2)の計算方法
TSA値=SA×V×Ψp×ρ
{式中、SA:微粒子の比表面積(m2/g)=6÷(ρ×d)、ここで、ρ:微粒子密度(g/cm3)(ここで、セルロース微粒子密度:1.4g/cm3、ラテックス粒子密度:1.0g/cm3、金コロイド粒子密度:19.3g/cm3)、d:微粒子直径(μm)、V:ラジオ波が照射される部分のNMR管体積(cm3)(≒試料量)、Ψp:微粒子体積比(ここで、微粒子体積(i)=微粒子濃度(wt%)÷100÷微粒子密度(ρ:同上)、水の体積(ii)=(1−微粒子体積(i))÷水の密度(0.997g/cm3)、Ψp(微粒子体積比)=微粒子体積(i)÷水の体積(ii)}。
発色粒子の粒子表面のF元素の相対元素濃度はXPSにより測定する。発色粒子を、1.5mmΦ×0.2mmtの皿型試料台に載せて、以下条件によりXPS測定を実施した。XPS測定には、サーモフィッシャー ESCALAB250を用いて以下条件により実施した。
励起源:単色化A1Kα 15kV×10mA
分析サイズ:約1mm (形状は楕円)
光電子取込み角:0°(分光器の軸と試料面が垂直)
取込領域
Survey scan:0〜1,100eV
Narrow Scan:C1s、N1s、S2p、O1s、Na1s、F1s、Si2p、Cl2p
Pass Energy
Survey Scan:100eV
Narrow Scan:20eV
[F](atomic%)=100× (IF1s/RSFF1s)/(ΣIj/RSFj)
{式中、IF1s:F1sの面積強度(eV・cps)、RSFF1s:F1sの相対感度係数、Ij:C1s、N1s、S2p、O1s、Na1s、F1s、Si2p、Cl2pの面積強度(eV・cps)、RSFj:C1s、N1s、S2p、O1s、Na1s、F1s、Si2p、Cl2pの相対感度係数。}を用いてF元素の相対元素濃度([F])を求める。
5mm幅にカットしたイムノクロマト診断キットをプラスチックのハウジングに入れた。得られたハウジング入りの診断キットを、浜松ホトニクス社製のイムノクロマトリーダーC10066−10を用い測定した。用いる粒子の色に応じて装置の設定を行った。検査対象物質にはヒト絨毛性ゴナドトロピン(以下「hCG」という。)を用い、hCGを、1重量%の牛血清アルブミン(以下「BSA」という。)を含む66mM、PH7.4のリン酸緩衝液(以下「PBS」という。)で希釈し、hCG濃度が10mIU/mlの陽性検体を調製した。この陽性検体120μlを診断キットのサンプル滴下部に滴下し、以降20秒毎にイムノクロマトリーダーで測定を行い、TLの発色時間の測定を行った。ここで20秒毎とした理由は、測定1回につき20秒弱が必要なためである。イムノクロマトリーダーで得られるTLの発色強度(単位はmABS)が20mABS以上になった時間を測定した。ここで20mABSとした理由は、個人差もあるが20mABS以上になれば目視でもTLの存在を確認できるからである。この測定を20回行い、得られた値の平均値を診断時間、その標準偏差を診断時間標準偏差とした。再現性を表す指標%CVは下記式:
%CV={診断時間標準偏差/診断時間}×100
により算出した:
同様に120μlの陽性検体を診断キットのサンプル滴下部に滴下し、15分経過後のTLの発色強度をイムノクロマトリーダーで測定した。この測定を20回行い、得られた値の平均値をTL強度、その標準偏差をTL強度標準偏差とした。再現性を表す指標%CVは、下記式:
%CV={TL強度標準偏差/TL強度}×100
により算出した。
同様に120μlの陽性検体を診断キットのサンプル滴下部に滴下し、15分経過後のTLの2mm上流側のバックグラウンド強度と2mm下流側のバックグランウンド強度をイムノクロマトリーダーで測定した。その平均値をバックグラウンド強度とした。
1重量%BSAを含む66mM、pH7.4のPBSを調整し陰性検体を調製した。120μlの陰性検体を診断キットのサンプル滴下部に滴下し、15分経過後のTLの発色強度をイムノクロマトリーダーで測定した。この測定を5回行い、得られた値の平均値が5mABS以下であれば偽陽性はないと判断した。ここで5mABSとした理由は、個人差もあるが5mABS以下であれば目視ではTLの存在が確認できないからである。
hCG濃度を3.20mIU/ml、1.60mIU/ml、0.80mIU/ml、0.40mIU/ml、0.20mIU/ml、0.10mIU/ml、0.05mIU/ml、0.025mIU/mlと段階的に薄くしていった陽性検体を調製した。前記同様に120μlを診断キットのサンプル滴下部に滴下し、15分経過後のTLの発色強度をイムノクロマトリーダーで測定した。この測定を各濃度で5回行い、得られた値の平均値が陰性検体を測定した時の値+20mABS以上の場合は陽性判定、以下の場合は検出限界以下と見なした。この陽性判定が得られる下限のhCG濃度を検出限界とした。
従来公知の方法で、セルロース濃度0.37wt%、銅濃度0.13wt%、アンモニア濃度1.00wt%の銅アンモニアセルロース溶液を調製した。得られた銅アンモニアセルロース溶液を空気存在下でゆっくり撹拌し、12時間かけて重合度を調整した。さらにテトラヒドロフラン濃度89.00wt%、水濃度11.00wt%、の凝固液を調製した。マグネティックスターラーを用い凝固液5000gをゆっくり攪拌しながら、調製しておいた銅アンモニアセルロース溶液500gを添加した。5秒程度攪拌を継続した後、10wt%の硫酸1000gを加え中和、再生を行い、セルロース微粒子を含有したスラリー6500gを得た。
得られたスラリーを10000rpmの速度で10分間遠心分離した。沈殿物をデカンテーションにより取り出し、蒸留水を注入して攪拌し、再び遠心分離した。pHが6.0〜7.0になるまでこの操作を数回繰り返し、その後、高圧ホモジナイザーによる分散処理を行い、セルロース微粒子分散液150gを得た。得られたセルロース微粒子の平均粒径を測定した結果、261nmであった。尚、当該微粒子の重合度を測定したところ、110だった。
次に、前記のようにして調製したセルロース微粒子の染色を行った。微粒子濃度を1.00wt%に調整したセルロース微粒子分散体100gに対し、硫酸ナトリウム30g、トリアジン構造を有する反応性染料(ダイスター株式会社製Levafix Red CA GR.(登録商標))1.00g、を加え攪拌させながら恒温槽を用いて60℃まで昇温した。60℃に昇温後に水酸化ナトリウム10gを加え、2時間染色を行った。得られた粗着色微粒子を脱イオン水で洗浄し、遠心分離で回収し、その後遠心分離で回収するという一連の操作を1サイクルとし、同様の操作を計5サイクルまで実施し、着色セルロース微粒子を得た。当該微粒子の平均粒径は352nm、CV値は21%、発色強度は2.9ABS、着色成分の割合は49%、真球度は1.2で、粗大粒子は1.4%だった。得られた着色セルロース微粒子の電子顕微鏡画像を図3に示す。
既知の方法で調製した1.0重量%の着色セルロース粒子1(平均粒子径352nm、発色強度2.9ABS、着色成分の割合49%、真球度は1.2、粗大粒子の割合1.4%)60μlを15mlの遠心管に入れ、更にトリス緩衝液(10mM、pH7.0)を540μl、0.1%の抗hCG-αマウス抗体(Fitzgerald社製、10-C25C)を60μl加え、ボルテックスで10秒撹拌した。続いて37℃に調整した乾燥機内に入れ120分間静置した。続いて1.0重量%のカゼイン(和光純薬工業社製、030−01505)を含有するブロッキング液(100mMホウ酸、pH8.5)を7.2ml加え、更に37℃の乾燥機内で60分間静置した。続いて遠心分離機(クボタ商事社製、6200)と遠心分離ローター(クボタ商事社製、AF−5008C)を用い、10,000gの遠心を15分間行い、感作粒子を沈降させた後に上澄みを除去した。続いてホウ酸緩衝液(50mMホウ酸、pH10.0)を7.2ml加え、超音波分散機(エスエムテー社製、UH−50)で10秒間処理した。続いて10,000gの遠心を15分間行い、感作粒子を沈降させた後に上澄みを除去した。また、別途スクロース(和光純薬工業社製、196−00015)1.8gと1.0重量%のカゼインブロッキング液2.4gを、ホウ酸緩衝液(50mMホウ酸、PH10.0)7.2mlに溶解させて得た緩衝液を用いて、感作粒子の分散液の重量を1.58gに調整し、0.038重量%の抗体感作着色セルロース粒子分散液を調整し、超音波分散機で10秒間処理した。
ポリエチレン製コンジュゲートパッド(Pall社製、6613)を大過剰の0.05重量%のTween−20(登録商標、シグマアルドリッチ社製、T2700)に浸漬し、余分な液を取り除いた後に50℃で60分乾燥させた。続いて高さ10mm、長さ300mmの形状にカットした。続いてマイクロピペットを用い0.038重量%の抗体感作着色セルロース粒子分散液780μlを均等に塗布し、50℃で60分乾燥させた。
既知の方法で調整したセルロース製サンプルパッド(Millipore社製、C083)を、大過剰の2.0重量%のBSA(シグマアルドリッチ社製、A7906)と2.0重量%のTween−20を含有するPBS緩衝液(66mM、PH7.4)に含浸し、余分な液を取り除いた後に50℃で60分乾燥させ、これを高さ20mm、長さ300mmの形状にカットした。
ニトロセルロース膜(Millipore社製、SHF0900425)を高さ25mm、長さ300mmの形状にカットした。液体塗布装置(武蔵エンジニアリング社製、300DS)を用い、0.1重量%抗hCG-βマウス抗体(MedixBiochemica社製、6601)を含むPBS溶液(66mM、pH7.4)を0.1μl/mmの割合で高さ7mmの部分に塗布した。続いて0.1重量%の抗マウス-ウサギ抗体(Daco社製、Z0259)を含むPBS溶液(66mM、pH7.4)を0.1μl/mmの割合で高さ12mmの部分に塗布し、続いて37℃で30分乾燥させた。
バッキングカード(Adhesives Research社製、AR9020)に、調整した捕捉抗体塗布ニトロセルロース膜、吸収パッド(Millipore社製、C083)、抗体感作着色セルロース粒子を含有したコンジュゲートパッド、再生セルロース連続長繊維不織布サンプルパッドを、図1に示すレイアウトで貼り合わせ、続いて裁断機にて5mmの幅にカットし、幅5mm、高さ60mmのイムノクロマト診断キットを得た。
得られたイムノクロマト診断キットの性能を評価した。結果を以下の表1に示す。
セルロース微粒子を以下の表1に記載の重合度に調整した以外は、実施例1と同様の方法で発色粒子を作製し、イムノクロマト診断キットを調製し、その性能を評価した。結果を以下の表1に示す。
セルロース微粒子を、ピリミジン構造を有する反応性染料(ダイスター株式会社製Levafix Rubine CA GR.(実施例7、登録商標)、ダイスター株式会社製Levafix Navy Blue E−BNA CA GR.(実施例8、登録商標)、ダイスター株式会社製Levafix Navy CA GR.(実施例9、登録商標))を用いて染色した以外は、実施例1と同様の方法で発色粒子を作製し、イムノクロマト診断キットを調製し、その性能を評価した。結果を以下の表1に示す。
セルロース微粒子の製造条件を調整して以下の表1に記載の粒径の発色粒子を製造した以外は、実施例1と同様の方法で、イムノクロマト診断キットを調製し、その性能を評価した。結果を以下の表1に示す。
発色粒子の製造条件を調整して、以下の表1に記載の発色強度の発色粒子を製造した以外は、実施例1と同様の方法で、イムノクロマト診断キットを調製し、その性能を評価した。結果を以下の表1に示す。
発色粒子を混合して、以下の表1に記載の粗大粒子割合の発色粒子を作製した以外は、実施例1と同様の方法で、イムノクロマト診断キットを調製し、その性能を評価した。結果を以下の表1に示す。
発色粒子を混合して、以下の表1に記載のCV値と粗大粒子割合の発色粒子を作製した以外は、実施例1と同様の方法で、イムノクロマト診断キットを調製し、その性能を評価した。結果を以下の表1に示す。
セルロース微粒子を以下の表2に記載の重合度に調整し、更に凝固液のテトラヒドロフランの濃度を調整して、以下の表2に記載の真球度の発色粒子を作製した以外は、実施例1と同様の方法で、イムノクロマト診断キットを調製し、その性能を評価した。結果を以下の表2に示す。
セルロース微粒子を以下の表2に記載の重合度に調整し、以下の表2記載の真球度の発色粒子を作製した以外は、実施例1と同様の方法で、イムノクロマト診断キットを調製し、その性能を評価した。結果を以下の表2に示す。
染色時に、特許文献3と同様の方法で、かつ使用する染料量を調整して発色強度を調整しながら染色した以外は、実施例1と同様の方法で、イムノクロマト診断キットを調製し、その性能を評価した。結果を以下の表2に示す。
染色時に、水酸化ナトリウムの代わりに12gの炭酸ナトリウムを加えて染色した以外は、実施例1と同様の方法で、イムノクロマト診断キットを調製し、その性能を評価した。結果を以下の表2に示す。
染色時に、染料をピリミジン構造又はトリアジン構造を有していない反応性染料(C.I.Reactive Orange16(実施例8)、C.I.Reactive Blue19(実施例9))を使用した以外は、実施例1と同様の方法で、イムノクロマト診断キットを調製し、その性能を評価した。結果を以下の表2に示す。
セルロース粒子の作製時、凝固液のテトラヒドロフランの濃度を調整して、以下の表2に記載の平均粒径の発色粒子を製造した以外は、実施例1と同様の方法で、イムノクロマト診断キットを調製し、その性能を評価した。結果を以下の表2に示す。
発色粒子の製造条件を調整して、以下の表2に記載の発色強度の発色粒子を製造した以外は、実施例1と同様の方法で、イムノクロマト診断キットを調製し、その性能を評価した。結果を以下の表2に示す。
実施例20と比較例3の発色粒子を所定の比率で混合、調整して、以下の表2に記載の粗大粒子量の発色粒子を製造した以外は、実施例1と同様の方法で、イムノクロマト診断キットを調製し、その性能を評価した。結果を以下の表2に示す。
発色粒子として、金コロイド(比較例16)、ラテックス(比較例17)を用いた以外は、実施例1と同様の方法で、イムノクロマト診断キットを調製し、その性能を評価した。結果を以下の表2に示す。
(b) 抗体感作発色粒子を含むコンジュゲートパッド
(c) 検出部A(TL)
(d) 検出部B(コントロールライン)
(e) クロマトグラフ媒体
(f) 吸収パッド
(g) 台紙
Claims (9)
- 平均粒子径が100〜650nmであり、発色強度が1.0〜10.0であり、粒子径400nm〜12000nmの範囲で、総個数100000個の粒子を検知したとき、粒子径700nm以上の粗大粒子の存在率が5%以下であり、かつ、長径(L)/短径(D)で表される真球度が1.0〜2.5であることを特徴とする、平均重合度(DP)50〜400の着色セルロース微粒子。
- 前記着色セルロース微粒子の重量の10〜90重量%が着色成分である、請求項1に記載の着色セルロース微粒子。
- 前記着色成分が反応性染料である、請求項2に記載の着色セルロース微粒子。
- 前記反応性染料が、ピリミジン構造又はトリアジン構造を有する、請求項3に記載の着色セルロース微粒子。
- 前記着色セルロース微粒子の親水度は、1.0〜30.0である、請求項1〜4のいずれか1項に記載の着色セルロース微粒子。
- 物理吸着によりリガンドが結合されている、請求項1〜5のいずれか1項に記載の着色セルロース微粒子。
- 前記リガンドがカゼインによりコーティングされている、請求項6に記載の着色セルロース微粒子。
- 請求項1〜7のいずれか1項に記載の着色セルロース微粒子を含む診断薬キット。
- イムノクロマトグラフキットである、請求項8に記載の診断薬キット。
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