JP6847077B2 - 標識物質、免疫学的測定法、免疫学的測定用試薬、アナライトの測定方法、アナライト測定用キット、及び、ラテラルフロー型クロマト用テストストリップ - Google Patents
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Description
そのため、標識物質の標識能力は、イムノアッセイにおける検出能力を左右する重要な要素であるといえる。上記に例示したイムノアッセイにおいても、標識物質として、赤血球(HAの場合)、ラテックス粒子(LIAの場合)、蛍光色素(FIAの場合)、放射性元素(RIAの場合)、酵素(EIAの場合)、化学発光物質(CLIAの場合)等が用いられている。
しかし、上記コロイド状粒子は、粒子径及び調製条件によって色調が決定されてしまうため、所望の鮮明な濃い色調のものを得難い、つまり視認性が不十分であるという問題がある。
また、上記着色したラテックス粒子は、色素による着色の効果が低く、目視判定性が不十分であるという問題がある。なお、この問題を解消するために色素の着色量を増やそうとすると、色素がラテックスの表面を覆い、ラテックス粒子本来の表面状態が損なわれるため、抗原又は抗体を結合させるのが困難になるという問題があった。また、メンブランフィルター等のクロマトグラフ媒体の細孔内に詰まったり、ラテックス粒子が非特異凝集を起こしたりして、色素の着色量を増やすことにより濃く着色することが、必ずしも、性能の向上に結び付かない、という問題もあった。
(A)前記樹脂−金属複合体の平均粒子径が300nmを超える;
又は、
(B)前記金属粒子の平均粒子径が20nmを超え70nm未満の範囲内である;
を備えていることを特徴とする。
本発明のアナライトの測定方法は、メンブレン、及び当該メンブレンに前記アナライトと特異的に結合する捕捉リガンドが固定されてなる判定部を含むラテラルフロー型クロマト用テストストリップを用いる。
そして、本発明のアナライトの測定方法は、下記工程(I)〜(III);
工程(I):試料に含まれる前記アナライトと、該アナライトに特異的に結合する抗体を、上記いずれかの標識物質で標識した標識抗体と、を接触させる工程、
工程(II):前記判定部にて、工程(I)において形成された、アナライトと標識抗体とを含む複合体を、捕捉リガンドに接触させる工程、
工程(III):前記標識物質における前記樹脂−金属複合体の局在型表面プラズモン共鳴に由来する発色強度を測定する工程、
を含む工程を行うことを特徴とする。
本発明のアナライト測定用キットは、メンブレン、及び当該メンブレンに、前記アナライトと特異的に結合する捕捉リガンドが固定されてなる判定部を含むラテラルフロー型クロマト用テストストリップと、
前記アナライトに特異的に結合する抗体を、上記いずれかの標識物質で標識した標識抗体を含む検出試薬と、
を含むものである。
本発明のラテラルフロー型クロマト用テストストリップは、
メンブレンと、
前記メンブレンに、前記試料が展開する方向において、前記アナライトと特異的に結合する捕捉リガンドが固定されてなる判定部と、
当該判定部よりも上流側に、前記アナライトに特異的に結合する抗体を上記いずれかの標識物質で標識した標識抗体が含まれる反応部と、
を含むものである。
本発明の第1の実施の形態に係る標識物質は、樹脂粒子に金属粒子が固定化された構造を有する樹脂−金属複合体を備えた標識物質であって、前記樹脂−金属複合体の平均粒子径が300nmを超えるものである。図1は、本実施の形態に係る標識物質を構成する樹脂−金属複合体の断面模式図である。樹脂−金属複合体100は、樹脂粒子10と、金属粒子20と、を備えている。樹脂−金属複合体100を有する本実施の形態の標識物質は、例えば免疫学的測定用試薬又はその材料として好ましく用いることができる。
一方、金属イオンを吸着することが可能な置換基を構造に有する含窒素ポリマー以外の樹脂粒子、例えばポリスチレン等の場合、前記金属イオンを樹脂内部に吸着しにくい。その結果、生成した金属粒子20の大部分は、表面吸着金属粒子50となる。上記のとおり、表面吸着金属粒子50は、樹脂粒子10との接触面積が小さいため、樹脂と金属の接着力が小さく、樹脂粒子10から金属粒子20が脱離する影響が大きい傾向にある。
上記含窒素ポリマーは、主鎖または側鎖に窒素原子を有する樹脂であり、例えば、ポリアミン、ポリアミド、ポリペプチド、ポリウレタン、ポリ尿素、ポリイミド、ポリイミダゾール、ポリオキサゾール、ポリピロール、ポリアニリン等がある。これらの中でも、好ましくは、ポリ−2−ビニルピリジン、ポリ−3−ビニルピリジン、ポリ−4−ビニルピリジン等のポリアミンである。また、側鎖に窒素原子を有する場合は、例えば、アクリル樹脂、フェノール樹脂、エポキシ樹脂等幅広く利用することが可能である。
本発明の第2の実施の形態の標識物質は、樹脂粒子に金属粒子が固定化された構造を有する樹脂−金属複合体を備えた標識物質であって、前記金属粒子の平均粒子径が20nmを超え70nm未満の範囲内である。本実施の形態に係る標識物質を構成する樹脂−金属複合体は、金属粒子の平均粒子径の範囲、及び樹脂−金属複合体の平均粒子径の範囲が異なる以外は、第1の実施の形態(図1)の樹脂−金属複合体100と同様である。以下、図1も参照しながら、第1の実施の形態との相違点を中心に説明する。
上記第1及び第2の実施の形態の標識物質に使用される樹脂−金属複合体100の製造方法は、特に限定されない。例えば、乳化重合法により製造した樹脂粒子10の分散液に、金属イオンを含有する溶液を加えて、金属イオンを樹脂粒子10に吸着させる(以下、「金属イオン吸着樹脂粒子」という。)。さらに、金属イオン吸着樹脂粒子を還元剤溶液中に加えることで、金属イオンを還元して金属粒子20を生成させ、樹脂−金属複合体100を得る。
また、金属イオンを含有する溶液の溶媒として、水の代わりに、メタノール、エタノール、n−プロパノール、イソプロパノール、n−ブタノール、sec−ブタノール、t−ブタノール等の含水アルコール又はアルコール、塩酸、硫酸、硝酸等の酸等を用いても良い。
また、前記溶液に、必要に応じて、例えば、ポリビニルアルコール等の水溶性高分子化合物、界面活性剤、アルコール類;テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル等のエーテル類;アルキレングリコール、ポリアルキレングリコール、これらのモノアルキルエーテル又はジアルキルエーテル、グリセリン等のポリオール類;アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類等の各種水混和性有機溶媒等の添加剤を添加してもよい。このような添加剤は、金属イオンの還元反応速度を促進し、また生成される金属粒子20の大きさを制御するのに有効となる。
さらに還元剤溶液の温度により、金属イオンの還元速度を調整することで、形成する金属粒子の粒径をコントロールすることが出来る。
さらにホウ酸やリン酸等の緩衝剤、塩酸や硫酸などの酸、水酸化ナトリウムや水酸化カリウムなどのアルカリによりpHを調整し、分散性を保持することが出来る。
まず、図2を参照しながら、本発明の一実施の形態に係るラテラルフロー型クロマト用テストストリップ(テストストリップ)について説明する。このテストストリップ200は、後述するように、本発明の一実施の形態のアナライトの測定方法に好ましく使用できるものである。
テストストリップ200に使用されるメンブレン110としては、一般的なテストストリップにおいてメンブレン材料として使用されるものを適用可能である。メンブレン110は、例えば毛管現象を示し、試料を添加すると同時に、試料が展開するような微細多孔性物質からなる不活性物質(アナライト160、各種リガンドなどと反応しない物質)で形成されているものである。メンブレン110の具体例としては、ポリウレタン、ポリエステル、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリフッ化ビニリデン、ナイロン、セルロース誘導体等で構成される繊維状又は不織繊維状マトリクス、膜、濾紙、ガラス繊維濾紙、布、綿等が挙げられる。これらの中でも、好ましくはセルロース誘導体やナイロンで構成される膜、濾紙、ガラス繊維濾紙等が用いられ、より好ましくはニトロセルロース膜、混合ニトロセルロースエステル(ニトロセルロースと酢酸セルロースの混合物)膜、ナイロン膜、濾紙が用いられる。
テストストリップ200は、アナライト160を含む試料を添加するための試料添加部120を有していてもよい。試料添加部120は、テストストリップ200に、アナライト160を含む試料を受け入れるための部位である。試料添加部120は、試料が展開する方向において、判定部130よりも上流側のメンブレン110に形成されていてもよいし、あるいは、例えばセルロース濾紙、ガラス繊維、ポリウレタン、ポリアセテート、酢酸セルロース、ナイロン、綿布などの材料で構成された試料添加パッドがメンブレン110に設けられて試料添加部120を構成していてもよい。
判定部130には、アナライト160と特異的に結合する捕捉リガンド131が固定されている。捕捉リガンド131は、アナライト160と特異的な結合を形成するものであれば特に制限なく使用でき、例えばアナライト160に対する抗体などを好ましく用いることができる。捕捉リガンド131は、テストストリップ200に試料を提供した場合においても、判定部130から移動することないように不動化している。捕捉リガンド131は、物理的又は化学的な結合や吸着等によって、メンブレン110に直接的又は間接的に固定されていればよい。
吸液部140は、例えば、セルロ−ス濾紙、不織布、布、セルロースアセテート等の吸水性材料のパッドにより形成される。添加された試料の展開前線(フロントライン)が吸液部140に届いてからの試料の移動速度は、吸液部140の材質、大きさなどにより異なるものとなる。従って、吸液部140の材質、大きさなどの選定により、アナライト160の検出・定量に最適な速度を設定することができる。なお、吸液部140は任意の構成であり、省略してもよい。
図示は省略するが、テストストリップ200には、メンブレン110に、標識抗体150を含む反応部が形成されていてもよい。反応部は、試料が流れる方向において、判定部130よりも上流側に設けることができる。なお、図2における試料添加部120を反応部として利用してもよい。テストストリップ200が反応部を有する場合、アナライト160を含む試料を、反応部又は試料添加部120に供すると、反応部において、試料に含まれるアナライト160と標識抗体150とを接触させることができる。この場合、試料を、単に反応部又は試料添加部120に供することで、アナライト160と標識抗体150とを含む複合体170を形成させることができるので、いわゆる1ステップ型のイムノクロマトグラフが可能になる。
図示は省略するが、テストストリップ200は、メンブレン110に、試料が展開する方向において、標識抗体150と特異的に結合する捕捉リガンドが固定されてなるコントロール部が形成されていてもよい。判定部130とともに、コントロール部でも発色強度が測定されることにより、テストストリップ200に供した試料が展開して、反応部及び判定部130に到達し、検査が正常に行われたことを確認することができる。なお、コントロール部は、捕捉リガンド131の代わりに、標識抗体150と特異的に結合する別の種類の捕捉リガンドを用いることを除いては、上述の判定部130と同様にして作製され、同様の構成を採ることができる。
次に、テストストリップ200を用いて行われる本発明の一実施の形態のアナライト160の測定方法について説明する。
工程(I):試料に含まれる前記アナライト160と、該アナライト160に特異的に結合する抗体を、樹脂粒子10に複数の金属粒子20が固定化された構造を有する樹脂−金属複合体100で標識した標識抗体150と、を接触させる工程、
工程(II):判定部130にて、工程(I)において形成された、アナライト160と標識抗体150とを含む複合体を、捕捉リガンド131に接触させる工程、
工程(III):樹脂−金属複合体100の局在型表面プラズモン共鳴に由来する発色強度を測定する工程、
を含むことができる。
工程(I)は、試料に含まれるアナライト160を、標識抗体150に接触させる工程である。アナライト160と標識抗体150とを含む複合体170を形成する限り、接触の態様は特に限定されるものではない。例えば、テストストリップ200の試料添加部120又は反応部(図示省略)に試料を供し、当該反応部においてアナライト160を標識抗体150に接触させてもよいし、テストストリップ200に試料を供する前に、試料中のアナライト160を標識抗体150に接触させてもよい。
工程(II)は、テストストリップ200の判定部130において、工程(I)において形成された、アナライト160と標識抗体150とを含む複合体170を、捕捉リガンド131に接触させる。複合体170を、捕捉リガンド131に接触させると、捕捉リガンド131は、複合体170のアナライト160に特異的に結合する。その結果、複合体170が判定部130において捕捉される。
工程(III)は、樹脂−金属複合体100の局在型表面プラズモン共鳴に由来する発色強度を測定する工程である。上記工程(II)又は必要に応じて洗浄工程を実施した後、テストストリップ200において、樹脂−金属複合体100の局在型表面プラズモン共鳴に由来する発色強度を測定する。
本実施の形態のアナライトの測定方法における試料は、アナライト160として、蛋白質などの抗原となり得る物質を含むものである限り特に限定されるものではない。例えば、目的のアナライト160を含む生体試料(すなわち、全血、血清、血漿、尿、唾液、喀痰、鼻腔又は咽頭拭い液、髄液、羊水、乳頭分泌液、涙、汗、皮膚からの浸出液、組織や細胞及び便からの抽出液等)や食品の抽出液等が挙げられる。必要に応じて、標識抗体150及び捕捉リガンド131とアナライト160との特異的な結合反応が生じやすくするために、上記工程(I)に先立って、試料に含まれるアナライト160を前処理してもよい。ここで、前処理としては、酸、塩基、界面活性剤等の各種化学薬品等を用いた化学的処理や、加熱・撹拌・超音波等を用いた物理的処理が挙げられる。特に、アナライト160がインフルエンザウィルスNP抗原等の、通常は表面に露出していない物質である場合、界面活性剤等による処理を行うことが好ましい。この目的に使用される界面活性剤として、特異的な結合反応、例えば、抗原抗体反応等のリガンドとアナライト160との結合反応性を考慮して、非イオン性界面活性剤を用いることができる。
標識抗体150は、工程(I)において、試料に含まれるアナライト160に接触させて、アナライト160と標識抗体150とを含む複合体170を形成するために使用される。標識抗体150は、アナライト160に特異的に結合する抗体を、樹脂粒子10に複数の金属粒子20が固定化された構造を有する樹脂−金属複合体100で標識化してなるものである。ここで、「標識化」とは、工程(I)〜(III)において、標識抗体150から樹脂−金属複合体100が脱離しない程度に、抗体に樹脂−金属複合体100が直接的に又は間接的に、化学的又は物理的な結合や吸着等で固定されていることを意味する。例えば、標識抗体150は、抗体に樹脂−金属複合体100が直接結合してなるものであってもよいし、抗体と樹脂−金属複合体100とが、任意のリンカー分子を介して結合してなるものや、それぞれが不溶性粒子に固定されてなるものであってもよい。
次に、標識抗体150の好ましい作製方法を挙げて説明する。標識抗体150の製造は、少なくとも、次の工程A;
工程A)樹脂−金属複合体100を第1のpH条件で抗体と混合して結合させることによって、標識抗体150を得る工程
を含み、好ましくは、さらに工程B;
工程B)標識抗体150を第2のpH条件で処理する工程
を含むことができる。
工程Aでは、樹脂−金属複合体100を第1のpH条件で抗体と混合して標識抗体150を得る。工程Aは、固体状の樹脂−金属複合体100を液相中に分散させた状態で抗体と接触させることが好ましい。第1のpH条件は、樹脂−金属複合体100における金属粒子20の金属種によって異なる。
工程Bでは、工程Aで得られた標識抗体150を第2のpH条件で処理することによって、標識抗体150への非特異的な吸着を抑制するブロッキングを行う。この場合、固液分離手段によって分取しておいた標識抗体150を、第2のpH条件で液相中に分散させる。このブロッキングの条件は、樹脂−金属複合体100における金属粒子20の金属種によって異なる。
洗浄処理は、固液分離手段によって分取した標識抗体150に洗浄用緩衝液を添加し、洗浄用緩衝液中で標識抗体150を均一に分散させる。分散には、例えば超音波処理などの分散手段を用いることが好ましい。洗浄用緩衝液としては、特に限定されるものではないが、例えばpH8〜9の範囲内に調整した所定濃度の、トリス(Tris)緩衝液、グリシンアミド緩衝液、アルギニン緩衝液などを用いることができる。洗浄用緩衝液のpHの調整は、例えば塩酸、水酸化ナトリウムなどを用いて行うことができる。標識抗体150の洗浄処理は、必要に応じて複数回を繰り返し行うことができる。
保存処理は、固液分離手段によって分取した標識抗体150に保存用緩衝液を添加し、保存用緩衝液中で標識抗体150を均一に分散させる。分散には、例えば超音波処理などの分散手段を用いることが好ましい。保存用緩衝液としては、例えば、洗浄用緩衝液に、所定濃度の凝集防止剤及び/又は安定剤を添加した溶液などを用いることができる。凝集防止剤としては、例えば、スクロース、マルトース、ラクトース、トレハロースに代表される糖類や、グリセリン、ポリビニルアルコールに代表される多価アルコールなどを用いることができる。安定剤としては、特に限定されるものではないが、例えば牛血清アルブミン、卵白アルブミン、カゼイン、ゼラチンなどの蛋白質を用いることができる。このようにして標識抗体150の保存処理を行うことができる。
本発明の一実施の形態に係るアナライト測定用キットは、例えばラテラルフロー型クロマト用テストストリップ200を用いて、本実施の形態のアナライトの測定方法に基づき、試料中に含まれるアナライト160の検出又は定量するためのキットである。
メンブレン110と
メンブレン110に、前記アナライト160と特異的に結合する捕捉リガンドが固定されてなる判定部130を含むラテラルフロー型クロマト用テストストリップ200と、
アナライト160に特異的に結合する抗体を樹脂粒子10に複数の金属粒子20が固定化された構造を有する樹脂−金属複合体100で標識した標識抗体150を含む検出試薬と、
を含んでいる。本実施の形態のキットは、必要に応じて、さらにその他の構成要素を含むものであってもよい。
樹脂−金属複合体の吸光度は、光学用白板ガラス製セル(光路長10mm)に0.01wt%に調製した樹脂−金属複合体分散液(分散媒:水)を入れ、瞬間マルチ測光システム(大塚電子社製、MCPD−3700)を用いて、金の場合570nmの吸光度を測定した。金の場合570nmでの吸光度が0.9以上を○(良好)、0.5〜0.9未満を△(可)、0.5未満を×(不可)とした。
磁製るつぼに濃度調整前の分散液1gを入れ、70℃、3時間熱処理を行った。熱処理前後の重量を測定し、下記式により固形分濃度を算出した。
金属担持量(wt%)=
[500℃加熱処理後の重量(g)/500℃加熱処理前の重量(g)]×100
ディスク遠心式粒度分布測定装置(CPS Disc Centrifuge DC24000 UHR、CPS instruments, Inc.社製)を用いて測定した。測定は、樹脂−金属複合体を水に分散させた状態で行った。
各実施例等で作製した樹脂−金属複合体標識抗体分散液を用いて、下記に示すイムノクロマト法での測定を行って樹脂−金属複合体分散液の性能を評価した。
(評価方法)
評価は、インフルエンザA型評価用モノクロスクリーン(アドテック社製)を用い、5分後、10分後、15分後の発色レベルを比較した。性能評価において、抗原はインフルエンザA型陽性コントロール(APC)の2倍希釈列(1倍〜1024倍)を用いた(APC希釈前のウィルスの濃度は5000FFU/ml)。
(評価手順)
96ウェルプレートの各ウェルに、樹脂−金属複合体標識抗体分散液を3μlずつ入れ、APCの2倍希釈列(1倍〜1024倍)及び陰性コントロールを、それぞれ100μlを混和した。次に、インフルエンザA型評価用モノクロスクリーンに50μl添加し、5分後、10分後、15分後の発色レベルを評価した。発色レベルは金コロイド判定用色見本(アドテック社製)を用いて判定した。
金属粒子の平均粒子径の測定は、樹脂−金属複合体分散液をカーボン支持膜付き金属性メッシュへ滴下して作製した基板を、電界放出形走査電子顕微鏡(FE−SEM;日立ハイテクノロジーズ社製、SU−9000)により観測した画像から、金属粒子の面積平均径を測定した。
<樹脂粒子の合成>
Aliquat 336[アルドリッチ社製](1.00g)及びポリエチレングリコールメチルエーテルメタクリレート(PEGMA、2.00g)を80gの純水に溶解した後、2−ビニルピリジン(2−VP、9.90g)及びジビニルベンゼン(DVB、0.100g)を加え、窒素気流下において250rpm、60℃で30分間撹拌した。撹拌後、9.00gの純水に溶解した2,2−アゾビス(2−メチルプロピオンアミジン)二塩酸塩(AIBA、0.100g)を5分かけて滴下し、250rpm、60℃で6時間撹拌することで、平均粒子径0.45μmの樹脂粒子を得た。この樹脂粒子を遠心分離(9000rpm、10分)により沈殿させ、上澄みを除去した後、純水に再度分散させ、10wt%の樹脂粒子分散液を得た。
前記樹脂粒子分散液(3.05g)に30mM塩化金酸水溶液(80g)を加え、室温で24時間放置した。その後、遠心分離(3000rpm、10分)により樹脂粒子を沈殿させ、上澄みを除去することで余分な塩化金酸を除去した後、55gの純水に再度分散させ、金イオン吸着樹脂粒子分散液を調製した。この金イオン吸着樹脂粒子分散液45gを10mMのジメチルアミンボラン水溶液(450ml)に8分かけて滴下した後、室温で2時間撹拌することで、平均粒子径0.6μmの樹脂−金複合体を得た。この樹脂−金複合体を遠心分離(3000rpm、120分)により沈殿させ、上澄みを除去した後、37gの純水に再度分散させ、限外濾過膜により精製することで、1wt%の樹脂−金複合体分散液を得た。この樹脂−金複合体分散液中の樹脂−金複合体の吸光度は上記方法に従って測定した結果、1.20であった。また、樹脂−金複合体における金粒子の平均粒子径は22.0nm、金の担持量は49.4wt%であった。作製した樹脂−金複合体の走査型電子顕微鏡(SEM)写真を図3に示した。
実施例1で得た樹脂粒子分散液(3.05g)に10mMの塩化金酸水溶液(56g)を加えた他は、実施例1と同様の方法で、金イオン吸着樹脂粒子分散液、平均粒子径0.6μmの樹脂−金複合体及び1wt%の樹脂−金複合体分散液を得た。この樹脂−金複合体分散液中の樹脂−金複合体の吸光度は1.04であった。また、樹脂−金複合体における金粒子の平均粒子径は7.61nm、金の担持量は36.8wt%であった。
<樹脂粒子の合成>
2−VP(9.90g)及びDVB(0.100g)を450gの純水に加え、窒素気流下において250rpm、60℃で30分間撹拌した。30分撹拌した後、9.00gの純水に溶解したAIBA(0.100g)を5分かけて滴下し、250rpmで6時間撹拌することで平均粒子径0.10μmの樹脂粒子を得た。この樹脂粒子を遠心分離(9000rpm、20分)により沈殿させ、上澄みを除去した後、純水に再度分散させ、10wt%の樹脂粒子分散液を得た。
<樹脂−金属複合体の合成>
樹脂粒子分散液(5.0g)に30mMの塩化金酸水溶液(198g)を加え、室温で24時間放置した。その後、遠心分離(3000rpm、10分)により樹脂粒子を沈殿させ、上澄みを除去することで余分な塩化金酸を除去した後、1.5gの純水に再度分散させ、金イオン吸着樹脂粒子分散液を調製した。この金イオン吸着樹脂粒子分散液(1.5g)を10mMのジメチルアミンボラン水溶液(65ml)に2分かけて滴下した後、室温で2時間撹拌することで、平均粒子径0.22μmの樹脂−金複合体を得た。この樹脂−金複合体に10wt%の分散剤(BYK194)600μlを加え1時間撹拌した後、遠心分離(9000rpm、10分)により沈殿させ、上澄みを除去した。その後、適量の純水を加え再度分散させ、限外濾過膜により精製し、1wt%の樹脂−金複合体分散液を得た。この樹脂−金複合体分散液中の樹脂−金複合体の吸光度は1.12であった。また、樹脂−金複合体における金粒子の平均粒子径は22.6nm、金の担持量は37.0wt%であった。
<イムノクロマトの評価>
着色ラテックス(メルクミリポア社製、着色Estapor機能性粒子、K1030、平均粒子径;392nm、570nmでの吸光度は0.83、400nmでの吸光度は1.11)1ml(0.1wt%)にインフルエンザ抗体を100μg混合し、室温で約3時間攪拌して着色ラテックスに抗体を結合させた。終濃度が1%となるように牛血清アルブミン溶液を添加し、室温にて2時間攪拌して着色ラテックスをブロックした。12000rpm、4℃で5分間遠心分離を行って回収し、0.2%牛血清アルブミンを含む緩衝液に懸濁して着色ラテックス標識抗体を作製した。
作製した着色ラテックス標識抗体を用いて、下記に示すイムノクロマト法での測定を行って着色ラテックスの性能を評価した。
(評価方法)
評価は、インフルエンザA型評価用モノクロスクリーン(アドテック社製)を用い、5分後、10分後、15分後の発色レベルを比較した。性能評価において、抗原はインフルエンザA型陽性コントロール(APC)の2倍希釈列(1倍〜1024倍)を用いた(APC希釈前のウィルスの濃度は5000FFU/ml)。
(評価手順)
96ウェルプレートの各ウェルに、着色ラテックス標識抗体を3μlずつ入れ、APCの2倍希釈列(1倍〜1024倍)及び陰性コントロールを、それぞれ100μlを混和した。次に、インフルエンザA型評価用モノクロスクリーンに50μl添加し、5分後、10分後、15分後の発色レベルを評価した。その結果を以下に示した。
〈金コロイドの合成〉
500ml三つ口丸底フラスコに1mM 塩化金酸水溶液を250ml入れ、加熱還流装置を用い、激しく攪拌しながら沸騰させ、沸騰後38.8mMクエン酸ナトリウム水溶液を25ml添加し、溶液が淡黄色から濃紅色に変化することを確認した。攪拌しながら10分間加熱を続けた後、室温で30分程度攪拌放冷をおこなった。孔径2μmのメンブランフィルターを用いて溶液をろ過し、三角フラスコに移し冷暗所で保存した。作製した粒子の平均粒径は12.3nmであった。
得られた金コロイド1ml(OD=10)にインフルエンザ抗体を100μg混合し、室温で約3時間攪拌して金コロイドに抗体を結合させた。終濃度が1%となるように牛血清アルブミン溶液を添加し、室温にて2時間攪拌して金コロイド表面をブロックした。12000rpm、4℃で5分間遠心分離を行って回収し、0.2%牛血清アルブミンを含む緩衝液に懸濁して金コロイド標識抗体を作製した。
作製した金コロイド標識抗体を用いて、下記に示すイムノクロマト法での測定を行って金コロイドの性能を評価した。
(評価方法)
評価は、インフルエンザA型評価用モノクロスクリーン(アドテック社製)を用い、5分後、10分後、15分後の発色レベルを比較した。性能評価において、抗原はインフルエンザA型陽性コントロール(APC)の2倍希釈列(1倍〜1024倍)を用いた(APC希釈前のウィルスの濃度は5000FFU/ml)。
(評価手順)
96ウェルプレートの各ウェルに、金コロイド標識抗体を3μlずつ入れ、APCの2倍希釈列(1倍〜1024倍)及び陰性コントロールを、それぞれ100μlを混和した。次に、インフルエンザA型評価用モノクロスクリーンに50μl添加し、5分後、10分後、15分後の発色レベルを評価した。その結果を以下に示した。
<樹脂粒子の合成>
Aliquat 336[アルドリッチ社製](5.00g)及びポリエチレングリコールメチルエーテルメタクリレート(PEGMA、10.00g)を389.5gの純水に溶解した後、2−ビニルピリジン(2−VP、48.00g)及びジビニルベンゼン(DVB、2.00g)を加え、窒素気流下において150rpm、30℃で50分、次いで60℃で30分間撹拌した。撹拌後、50.00gの純水に溶解した2,2−アゾビス(2−メチルプロピオンアミジン)二塩酸塩(AIBA、0.500g)を2分かけて滴下し、150rpm、60℃で3.5時間撹拌することで、平均粒子径200nmの樹脂粒子を得た。遠心分離(9000rpm、60分)により沈殿させ、上澄みを除去した後、純水に再度分散させる操作を3回行った後、透析処理により不純物を除去した。その後、濃度調整を行い10wt%の樹脂粒子分散液を得た。
得られた樹脂―金複合体分散液1ml(0.1wt%)にインフルエンザ抗体を100μg混合し、室温で約3時間攪拌して樹脂−金複合体に抗体を結合させた。終濃度が1%となるように牛血清アルブミン溶液を添加し、室温にて2時間攪拌して樹脂−金複合体表面をブロックした。12000rpm、4℃で5分間遠心分離を行って回収し、0.2%牛血清アルブミンを含む緩衝液に懸濁して樹脂−金複合体標識抗体分散液を作製した。
作製した樹脂−金複合体標識抗体分散液を用いて、イムノクロマト法での測定を行って当該樹脂−金複合体分散液の性能を評価した。その結果を以下に示した。
Aliquat 336[アルドリッチ社製](1.00g)及びポリエチレングリコールメチルエーテルメタクリレート(PEGMA、10.00g)を300gの純水に溶解した後、2−ビニルピリジン(2−VP、48.00g)及びジビニルベンゼン(DVB、2.00g)を加え、窒素気流下において150rpm、30℃で50分、次いで60℃で30分間撹拌した。撹拌後、18.00gの純水に溶解した2,2−アゾビス(2−メチルプロピオンアミジン)二塩酸塩(AIBA、0.500g)を0.5分かけて滴下し、150rpm、60℃で3.5時間撹拌することで、平均粒子径500nmの樹脂粒子を得た。遠心分離(9000rpm、40分)により沈殿させ、上澄みを除去した後、純水に再度分散させる操作を3回行った後、透析処理により不純物を除去した。その後、濃度調整を行い10wt%の樹脂粒子分散液を得た。
得られた樹脂―金複合体分散液1ml(0.1wt%)にインフルエンザ抗体を100μg混合し、室温で約3時間攪拌して樹脂−金複合体に抗体を結合させた。終濃度が1%となるように牛血清アルブミン溶液を添加し、室温にて2時間攪拌して樹脂−金複合体表面をブロックした。12000rpm、4℃で5分間遠心分離を行って回収し、0.2%牛血清アルブミンを含む緩衝液に懸濁して樹脂−金複合体標識抗体分散液を作製した。
作製した樹脂−金複合体標識抗体分散液を用いて、イムノクロマト法での測定を行って当該樹脂−金複合体分散液の性能を評価した。その結果を以下に示した。
Aliquat 336[アルドリッチ社製](0.50g)及びポリエチレングリコールメチルエーテルメタクリレート(PEGMA、10.00g)を300gの純水に溶解した後、2−ビニルピリジン(2−VP、48.00g)及びジビニルベンゼン(DVB、2.00g)を加え、窒素気流下において150rpm、30℃で50分、次いで60℃で30分間撹拌した。撹拌後、18.00gの純水に溶解した2,2−アゾビス(2−メチルプロピオンアミジン)二塩酸塩(AIBA、0.500g)を0.5分かけて滴下し、150rpm、60℃で3.5時間撹拌することで、平均粒子径613nmの樹脂粒子を得た。遠心分離(9000rpm、40分)により沈殿させ、上澄みを除去した後、純水に再度分散させる操作を3回行った後、透析処理により不純物を除去した。その後、濃度調整を行い10wt%の樹脂粒子分散液を得た。
得られた樹脂―金複合体分散液1ml(0.1wt%)にインフルエンザ抗体を100μg混合し、室温で約3時間攪拌して樹脂−金複合体に抗体を結合させた。終濃度が1%となるように牛血清アルブミン溶液を添加し、室温にて2時間攪拌して樹脂−金複合体表面をブロックした。12000rpm、4℃で5分間遠心分離を行って回収し、0.2%牛血清アルブミンを含む緩衝液に懸濁して樹脂−金複合体標識抗体分散液を作製した。
Aliquat 336[アルドリッチ社製](1.00g)及びポリエチレングリコールメチルエーテルメタクリレート(PEGMA、10.00g)を300gの純水に溶解した後、4−ビニルピリジン(4−VP、48.00g)及びジビニルベンゼン(DVB、2.00g)を加え、窒素気流下において150rpm、30℃で50分、次いで60℃で30分間撹拌した。撹拌後、18.00gの純水に溶解した2,2−アゾビス(2−メチルプロピオンアミジン)二塩酸塩(AIBA、0.500g)を2分かけて滴下し、150rpm、60℃で3.5時間撹拌することで、平均粒子径438nmの樹脂粒子を得た。遠心分離(9000rpm、45分)により沈殿させ、上澄みを除去した後、純水に再度分散させる操作を3回行った後、透析処理により不純物を除去した。その後、濃度調整を行い10wt%の樹脂粒子分散液を得た。
得られた樹脂―金複合体分散液1ml(0.1wt%)にインフルエンザ抗体を100μg混合し、室温で約3時間攪拌して樹脂−金複合体に抗体を結合させた。終濃度が1%となるように牛血清アルブミン溶液を添加し、室温にて2時間攪拌して樹脂−金複合体表面をブロックした。12000rpm、4℃で5分間遠心分離を行って回収し、0.2%牛血清アルブミンを含む緩衝液に懸濁して樹脂−金複合体標識抗体分散液を作製した。
Aliquat 336[アルドリッチ社製](1.00g)及びポリエチレングリコールメチルエーテルメタクリレート(PEGMA、10.00g)を300gの純水に溶解した後、3−ビニルピリジン(3−VP、48.00g)及びジビニルベンゼン(DVB、2.00g)を加え、窒素気流下において150rpm、30℃で50分、次いで60℃で30分間撹拌した。撹拌後、18.00gの純水に溶解した2,2−アゾビス(2−メチルプロピオンアミジン)二塩酸塩(AIBA、0.500g)を2分かけて滴下し、150rpm、60℃で3.5時間撹拌することで、平均粒子径429nmの樹脂粒子を得た。遠心分離(9000rpm、45分)により沈殿させ、上澄みを除去した後、純水に再度分散させる操作を3回行った後、透析処理により不純物を除去した。その後、濃度調整を行い10wt%の樹脂粒子分散液を得た。
得られた樹脂―金複合体分散液1ml(0.1wt%)にインフルエンザ抗体を100μg混合し、室温で約3時間攪拌して樹脂−金複合体に抗体を結合させた。終濃度が1%となるように牛血清アルブミン溶液を添加し、室温にて2時間攪拌して樹脂−金複合体表面をブロックした。12000rpm、4℃で5分間遠心分離を行って回収し、0.2%牛血清アルブミンを含む緩衝液に懸濁して樹脂−金複合体標識抗体分散液を作製した。
2−(ジイソプロピルアミノ)エチルメタクリレート(DPA、10.3g)、ポリ(プロピレングリコール)ジアクリレート(0.2g)とポリエチレングリコールメチルエーテルメタクリレート(PEGMA、2.0g)を85gの純水に溶解した後、窒素気流下において150rpm、30℃で50分、次いで70℃で30分間撹拌した。撹拌後、2.00gの純水に溶解したペルオキソ二硫酸アンモニウム(APS、0.10g)を2分かけて滴下し、150rpm、70℃で3.5時間撹拌することで、平均粒子径338nmの樹脂粒子を得た。遠心分離(9000rpm、45分)により沈殿させ、上澄みを除去した後、純水に再度分散させる操作を3回行った後、透析処理により不純物を除去した。その後、濃度調整を行い10wt%の樹脂粒子分散液を得た。
得られた樹脂―金複合体分散液1ml(0.1wt%)にインフルエンザ抗体を100μg混合し、室温で約3時間攪拌して樹脂−金複合体に抗体を結合させた。終濃度が1%となるように牛血清アルブミン溶液を添加し、室温にて2時間攪拌して樹脂−金複合体表面をブロックした。12000rpm、4℃で5分間遠心分離を行って回収し、0.2%牛血清アルブミンを含む緩衝液に懸濁して樹脂−金複合体標識抗体分散液を作製した。
<樹脂粒子の合成>
Aliquat 336[アルドリッチ社製](3.00g)及びポリエチレングリコールメチルエーテルメタクリレート(PEGMA、10.00g)を300gの純水に溶解した後、2−ビニルピリジン(2−VP、49.50g)及びジビニルベンゼン(DVB、0.50g)を加え、窒素気流下において150rpm、30℃で50分、次いで60℃で30分間撹拌した。撹拌後、18.00gの純水に溶解した2,2−アゾビス(2−メチルプロピオンアミジン)二塩酸塩(AIBA、0.250g)を2分かけて滴下し、150rpm、60℃で3.5時間撹拌することで、平均粒子径370nmの樹脂粒子を得た。遠心分離(9000rpm、60分)により沈殿させ、上澄みを除去した後、純水に再度分散させる操作を3回行った後、透析処理により不純物を除去した。その後、濃度調整を行い10wt%の樹脂粒子分散液を得た。
得られた樹脂―金複合体分散液1ml(0.1wt%)にインフルエンザ抗体を100μg混合し、室温で約3時間攪拌して樹脂−金複合体に抗体を結合させた。終濃度が1%となるように牛血清アルブミン溶液を添加し、室温にて2時間攪拌して樹脂−金複合体表面をブロックした。12000rpm、4℃で5分間遠心分離を行って回収し、0.2%牛血清アルブミンを含む緩衝液に懸濁して樹脂−金複合体標識抗体分散液を作製した。
<樹脂粒子の合成>
Aliquat 336[アルドリッチ社製](2.00g)及びポリエチレングリコールメチルエーテルメタクリレート(PEGMA、10.00g)を300gの純水に溶解した後、2−ビニルピリジン(2−VP、48.00g)及びジビニルベンゼン(DVB、2.00g)を加え、窒素気流下において150rpm、30℃で50分、次いで60℃で30分間撹拌した。撹拌後、18.00gの純水に溶解した2,2−アゾビス(2−メチルプロピオンアミジン)二塩酸塩(AIBA、0.500g)を2分かけて滴下し、150rpm、60℃で3.5時間撹拌することで、平均粒子径380nmの樹脂粒子を得た。遠心分離(9000rpm、60分)により沈殿させ、上澄みを除去した後、純水に再度分散させる操作を3回行った後、透析処理により不純物を除去した。その後、濃度調整を行い10wt%の樹脂粒子分散液を得た。
得られた樹脂―金複合体分散液1ml(0.1wt%)にインフルエンザ抗体を100μg混合し、室温で約3時間攪拌して樹脂−金複合体に抗体を結合させた。終濃度が1%となるように牛血清アルブミン溶液を添加し、室温にて2時間攪拌して樹脂−金複合体表面をブロックした。12000rpm、4℃で5分間遠心分離を行って回収し、0.2%牛血清アルブミンを含む緩衝液に懸濁して樹脂−金複合体標識抗体分散液を作製した。
<樹脂粒子の合成>
Aliquat 336[アルドリッチ社製](1.00g)及びポリエチレングリコールメチルエーテルメタクリレート(PEGMA、2.00g)を80gの純水に溶解した後、2−ビニルピリジン(2−VP、9.90g)及びジビニルベンゼン(DVB、0.100g)を加え、窒素気流下において250rpm、60℃で30分間撹拌した。撹拌後、9.00gの純水に溶解した2,2−アゾビス(2−メチルプロピオンアミジン)二塩酸塩(AIBA、0.100g)を5分かけて滴下し、250rpm、60℃で6時間撹拌することで、平均粒子径0.36μmの樹脂粒子A−1を得た。前記A−1を遠心分離(9000rpm、10分)により沈殿させ、上澄みを除去した後、純水に再度分散させ、2.1wt%の樹脂粒子分散液B−1を得た。
前記B−1(19.09g)に30mM塩化金酸水溶液(106.6g)を加え、室温で24時間放置した。その後、遠心分離(3000rpm、10分)により樹脂粒子を沈殿させ、上澄みを除去することで余分な塩化金酸を除去した後、40gの純水に再度分散させ、金イオン吸着樹脂粒子分散液C−1を調製した。前記C−1(20g)を3.3mMのジメチルアミンボラン水溶液(600ml)に4分かけて滴下した後、8℃で1時間撹拌し、さらに室温で5時間撹拌することで、平均粒子径0.38μmの樹脂−金複合体D−1を得た。前記D−1を遠心分離(3000rpm、120分)により沈殿させ、上澄みを除去した後、適量の純水を加えて再度分散させ、限外濾過膜により精製することで、1wt%の樹脂−金複合体分散液E−1を得た。E−1中の樹脂−金複合体F−1の吸光度は上記方法に従って測定した結果、1.0であった。また、F−1における金粒子の平均粒子径は22.0nm、金の担持量は49.1wt%であった。
試験例、参考試験例では以下の試薬等を使用した。
抗インフルエンザA型モノクローナル抗体(7.15mg/mL/PBS):アドテック株式会社製
結合用緩衝液a:100mM ホウ酸溶液をHClでpH≒3に調整した。
結合用緩衝液b:100mM ホウ酸溶液をHClでpH≒4に調整した。
結合用緩衝液c:100mM ホウ酸溶液をHClでpH≒5に調整した。
結合用緩衝液d:100mM ホウ酸溶液 pH≒6.5
結合用緩衝液e:100mM ホウ酸溶液をNaClでpH≒7.5に調整した。
結合用緩衝液f:100mM ホウ酸溶液をNaClでpH≒8.5に調整した。
結合用緩衝液g:50mM 2−モルフォリノエタンスルホン酸溶液 pH≒3.8
ブロック用緩衝液a:1重量%牛血清アルブミン溶液をHClでpH≒5に調整した。
ブロック用緩衝液b:1重量%牛血清アルブミン溶液をHClでpH≒7に調整した。
ブロック用緩衝液c:1重量%牛血清アルブミン溶液をHClでpH≒8.5に調整した。
ブロック用緩衝液d:1重量%牛血清アルブミン溶液をHClでpH≒9.5に調整した。
洗浄用緩衝液:5mMトリス溶液をHClでpH≒8.5に調整した。
保存用緩衝液:洗浄用緩衝液に、スクロースを10重量%濃度になるように添加した。
インフルエンザA型陽性コントロール(APC):インフルエンザA型ウィルス不活化抗原(アドテック株式会社製)を、検体処理液(アドテック株式会社製)を用いて100倍希釈して調製した。APCの抗原濃度は、5000FFU/mlに相当する。
陰性コントロール:検体処理液(アドテック株式会社製)
AuNCPビーズ:作製例1で得た樹脂−金複合体(1重量%;平均粒子径380nm)
マイクロチューブ[アイビス(登録商標;アズワン社製)2mL]に、樹脂−金属複合体としてAuNCPビーズ0.1mLを投入し、結合用緩衝液a0.9mLを添加した。転倒混和によって十分に混合した後、抗インフルエンザA型モノクローナル抗体100μgを添加し、室温で3時間かけて転倒撹拌を行い、樹脂−金属複合体で標識した抗インフルエンザA型モノクローナル抗体を含む標識抗体含有液A−1を得た。
次に、標識抗体含有液A−1を氷冷後、12000rpmで5分間かけて遠心分離を行い、上澄みを除去した後、固形分残渣にブロック用緩衝液a1mLを添加し、10〜20秒間かけて超音波分散処理を行い、さらに、室温で2時間かけて転倒撹拌を行い、標識抗体含有液B−1を得た。
次に、標識抗体含有液B−1を氷冷後、12000rpmで5分間かけて遠心分離を行い、上澄みを除去した後、固形分残渣に洗浄用緩衝液1mLを添加し、10〜20秒間かけて超音波分散処理を行った。この操作を3回繰り返し、洗浄処理とした。
次に、氷冷後、12000rpmで5分間かけて遠心分離を行い、上澄みを除去した後、固形分残渣に保存用緩衝液1mLを添加し、10〜20秒間かけて超音波分散処理を行うことによって、標識抗体含有液C−1を得た。
試験例1の結合工程で結合用緩衝液aの代わりに結合用緩衝液bを用いる以外は試験例1と同様にして、標識抗体含有液A−2,B−2、C−2を得た。
試験例1の結合工程で結合用緩衝液aの代わりに結合用緩衝液cを用いる以外は試験例1と同様にして、標識抗体含有液A−3,B−3,C−3を得た。
試験例1の結合工程で結合用緩衝液aの代わりに結合用緩衝液dを用いる以外は試験例1と同様にして、標識抗体含有液A−4,B−4、C−4を得た。
試験例1の結合工程で結合用緩衝液aの代わりに結合用緩衝液eを用いた場合、樹脂−金属複合体が凝集してしまうため、標識抗体含有液を得ることが困難であった。
試験例1の結合工程で結合用緩衝液aの代わりに結合用緩衝液fを用いた場合、樹脂−金属複合体が凝集してしまうため、標識抗体含有液を得ることが困難であった。
試験例1のブロック工程でブロック用緩衝液aの代わりにブロック用緩衝液bを用いる以外は試験例1と同様にして、標識抗体含有液B−5、C−5を得た。
試験例1のブロック工程でブロック用緩衝液aの代わりにブロック用緩衝液cを用いる以外は試験例1と同様にして、標識抗体含有液B−6、C−6を得た。
試験例1のブロック工程でブロック用緩衝液aの代わりにブロック用緩衝液dを用いたところ、結合工程後の標識抗体は良好な分散性を示したが、ブロック工程後に標識抗体が凝集してしまい、標識抗体含有液を得ることが困難であった。
試験例1の結合工程で結合用緩衝液aの代わりに結合用緩衝液gを用いる以外は試験例1と同様にして、標識抗体含有液A−7,B−7、C−7を得た。
評価は、インフルエンザA型評価用モノクロスクリーン(アドテック社製)を用い、5分後、10分後、15分後の発色レベルを比較した。発色レベルは金コロイド判定用色見本(アドテック社製)を用いて判定した。スクリーニング評価において、抗原はインフルエンザA型陽性コントロール(APC)を用いた。性能評価において、抗原はAPCの2倍希釈列(1倍〜1024倍希釈)を用いた。
96ウェルプレートの7ウェルに、試験例1〜7で得られた標識抗体含有液C−1〜7を3μLずつ入れ、それぞれにAPC100μLを混和した。次に、インフルエンザA型評価用モノクロスクリーンに50μLずつ添加し、5分後、10分後、15分後の発色レベルを評価した。その結果を表11に示した。なお、表11における数値が大きい程、発色レベルが高い(発色が強い)ことを意味する。
96ウェルプレートの12ウェルに、試験例1で得られた標識抗体含有液C−1を3μLずつ入れ、APCの2倍希釈列(1倍〜1024倍希釈、それぞれAPC×1〜APC×1024と表す)及び陰性コントロールを、それぞれ100μLを混和した。次に、インフルエンザA型評価用モノクロスクリーンに50μL添加し、5分後、10分後、15分後の発色レベルを評価した。その結果を表12に示した。なお、表12における数値が大きい程、発色レベルが高い(発色が強い)ことを意味する。
Claims (15)
- 樹脂粒子に金粒子又はパラジウム粒子から選ばれる金属粒子(単体もしくは合金等の複合体)が固定化された構造を有する樹脂−金属複合体を備えた標識物質であって、
以下の(A)、(B)のいずれかの構成:
(A)前記樹脂−金属複合体の平均粒子径が300nmを超える;
又は、
(B)前記金属粒子の平均粒子径が20nmを超え70nm未満の範囲内である;
を備えているとともに、
前記樹脂粒子が、金属イオンを吸着することが可能な置換基を構造に有するポリマー粒子であって、主鎖または側鎖に窒素原子を有する樹脂である含窒素ポリマー粒子であり、
前記金属粒子が、前記樹脂粒子内に埋包された部位及び前記樹脂粒子外に露出した部位を有する金属粒子を含むとともに、少なくとも一部の金属粒子が、前記樹脂粒子の表層部において三次元的に分布しており、さらに、前記樹脂粒子の表面に吸着している金属粒子の量が前記金属粒子に対して20重量%以下であることを特徴とする標識物質。 - 前記金属粒子が、さらに前記樹脂粒子に完全に内包された金属粒子を含んでいることを特徴とする、請求項1に記載の標識物質。
- 前記金属粒子の担持量が樹脂−金属複合体の重量に対して5wt%〜70wt%の範囲内であることを特徴とする、請求項1または2に記載の標識物質。
- 前記(A)のとき、前記金属粒子の平均粒子径が1nm以上80nm以下の範囲内であることを特徴とする、請求項1〜3のいずれか1項に記載の標識物質。
- 前記(A)のとき、前記樹脂−金属複合体の平均粒子径が300nmを超え1000nm以下の範囲内であることを特徴とする、請求項1〜4のいずれか1項に記載の標識物質。
- 前記金属粒子が、金粒子である請求項5に記載の標識物質。
- 前記(B)のとき、前記樹脂−金属複合体の平均粒子径が100nm以上1000nm以下の範囲内であることを特徴とする、請求項1〜3のいずれか1項に記載の標識物質。
- 前記金属粒子が、金粒子である請求項7に記載の標識物質。
- 前記樹脂−金属複合体を水に分散したことを特徴とする、請求項1〜8のいずれか1項に記載の標識物質。
- 前記樹脂−金属複合体の表面に、抗原または抗体を吸着させて使用するものである、請求項1〜9のいずれか1項に記載の標識物質。
- 請求項1〜10のいずれか1項に記載の標識物質を用いることを特徴とする、免疫学的測定法。
- 請求項1〜10のいずれか1項に記載の標識物質を備えた免疫学的測定用試薬。
- 試料中に含まれるアナライトを検出又は定量するアナライトの測定方法であって、
メンブレン、及び当該メンブレンに前記アナライトと特異的に結合する捕捉リガンドが固定されてなる判定部を含むラテラルフロー型クロマト用テストストリップを用い、下記工程(I)〜(III);
工程(I):試料に含まれる前記アナライトと、該アナライトに特異的に結合する抗体を、請求項1〜10のいずれか1項に記載の標識物質で標識した標識抗体と、を接触させる工程、
工程(II):前記判定部にて、工程(I)において形成された、アナライトと標識抗体とを含む複合体を、捕捉リガンドに接触させる工程、
工程(III):前記標識物質における前記樹脂−金属複合体の局在型表面プラズモン共鳴に由来する発色強度を測定する工程、
を含む工程を行うことを特徴とするアナライトの測定方法。 - ラテラルフロー型クロマト用テストストリップを用いて、試料中に含まれるアナライトを検出又は定量するためのアナライト測定用キットであって、
メンブレン、及び当該メンブレンに、前記アナライトと特異的に結合する捕捉リガンドが固定されてなる判定部を含むラテラルフロー型クロマト用テストストリップと、
前記アナライトに特異的に結合する抗体を、請求項1〜10のいずれか1項に記載の標識物質で標識した標識抗体を含む検出試薬と、
を含むアナライトを検出又は定量するためのアナライト測定用キット。 - 試料中に含まれるアナライトを検出又は定量するためのラテラルフロー型クロマト用テストストリップであって、
メンブレンと、
前記メンブレンに、前記試料が展開する方向において、前記アナライトと特異的に結合する捕捉リガンドが固定されてなる判定部と、
当該判定部よりも上流側に、前記アナライトに特異的に結合する抗体を請求項1〜10のいずれか1項に記載の標識物質で標識した標識抗体が含まれる反応部と、
を含むラテラルフロー型クロマト用テストストリップ。
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