WO2022163124A1 - イムノクロマトアッセイ用メンブレン、イムノクロマトアッセイ用テストストリップ、および検査方法 - Google Patents
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Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
Definitions
- the present invention relates to immunochromatographic assay membranes, immunochromatographic assay test strips, and testing methods.
- the immunochromatographic assay method is widely used as a simple immunoassay using antigen-antibody reaction. Immunochromatographic assays are easy to operate and can be measured in a short period of time, so they are widely used as POCT (Point of Care Testing) for clinical examinations and diagnoses that require prompt reporting, such as pregnancy diagnosis and confirmation of influenza infection. It is
- analytes are detected qualitatively or quantitatively as follows.
- a liquid sample dropped onto one end of the test strip moves through the strip by capillary action.
- binding between the labeled antibody that binds to the analyte and the analyte is promoted.
- the capture antibody that binds to the substance to be analyzed passes through the immobilized region, the antigen-antibody reaction captures the labeled antibody-antigen complex.
- the capture antibody-immobilized region exhibits coloration due to the labeling substance and can be optically detected.
- labeling substances proteins containing enzymes, metal colloids such as gold colloids, colored latex particles, etc. are generally used.
- immunochromatographic assays using these labeling substances are inferior to the gene amplification method (PCR method), which is known as a highly sensitive detection method, in terms of detection sensitivity. is desired.
- Fluorescence immunochromatography is an immunoassay method that uses a fluorescence-labeled antibody as the above-mentioned labeled antibody. After the labeled antibody-antigen complex is captured by the capture antibody, excitation light in the wavelength region at which the fluorescence-labeled substance emits fluorescence is irradiated. By detecting the fluorescence generated by the fluorescent labeling substance with a detector, the substance to be analyzed can be detected qualitatively or quantitatively with high sensitivity.
- fluorescence immunochromatography In fluorescence immunochromatography, a fluorescence immunochromatography reader equipped with an excitation light irradiation unit and a fluorescence detection unit is generally used.
- the fluorescence immunochromatographic assay method using such a fluorescence immunochromatographic reader along with irradiation of excitation light, not only the fluorescence from the fluorescent label that formed the antigen-antibody complex, but also the porous membrane and its Unwanted fluorescence is generated from autofluorescence and the like from the support and the backing sheet that supports them. Fluorescence from sources other than the antigen-antibody complex becomes background noise and lowers the signal/background ratio (S/B ratio), which is an obstacle when trying to detect a minute amount of the analyte. It's becoming
- Patent Document 2 As a measure to improve the signal/background ratio (S/B ratio), for example, in Patent Document 2, a fluorescent labeling substance in a color region different from autofluorescence is used, and a color sensor is used as a detector as fluorescence detection means. A method is proposed.
- Patent Document 3 a fluorescent substance that emits fluorescence when excited by light having a wavelength of 600 nm or more and 800 nm or less is used as a labeling substance to reduce the influence of background due to autofluorescence from a porous membrane, its support, or the like. Methods have been proposed for fluorescence detection in the reduced wavelength range.
- Patent Documents 2 and 3 above detect fluorescence in a wavelength region that avoids the peak wavelength of the autofluorescence from the porous membrane, its support, etc., but the porous membrane, its support, etc. The autofluorescence itself from is not reduced. There is a limit to detection sensitivity, and further improvements are needed to increase sensitivity for high-precision and rapid diagnosis.
- an object of the present invention is to provide an immunochromatographic assay membrane that provides a highly sensitive and detectable immunochromatographic assay test strip, a highly sensitive and detectable immunochromatographic assay test strip, and a highly sensitive testing method. .
- the present invention comprises a polymer film support and a porous membrane laminated on the polymer film support, wherein at least one of the polymer film support and the porous membrane is an autofluorescence-reducing
- the present invention also provides an immunochromatographic assay test strip comprising the immunochromatographic assay membrane described above as a chromatographic medium.
- the present invention is a method for examining a substance to be analyzed contained in a specimen, which method includes contacting the specimen with a fluorescently labeled substance using the immunochromatographic assay test strip described above.
- an immunochromatographic assay membrane from which a highly sensitive and detectable immunochromatographic assay test strip can be obtained, a highly sensitive and detectable immunochromatographic assay test strip, and a highly sensitive testing method can be provided.
- FIG. 1 is a schematic structural diagram of the immunochromatographic assay membrane of the present invention.
- FIG. 1 is a schematic structural diagram of an immunochromatographic assay test strip of the present invention.
- FIG. 1 is a schematic structural diagram of an immunochromatographic assay test strip of the present invention.
- FIG. 1 is a side view showing the configuration of the immunochromatographic assay membrane of the present invention.
- the immunochromatographic assay membrane 10 is a member used as a chromatographic medium in an immunochromatographic assay test strip, and comprises a polymer film support 12 and a porous membrane 14 laminated thereon.
- At least one of the polymer film support 12 and the porous membrane 14 is made of an autofluorescence reducing material.
- the immunochromatographic assay membrane 10 of the present invention preferably has a fluorescence quantum yield of 18% or less at an excitation wavelength of 365 nm, and a lightness L * (D65) of 60% or more when measured with a spectrophotometer. .
- the fluorescence quantum yield is measured with the pores of the immunochromatographic assay membrane 10 filled with water.
- the excitation wavelength of fluorescent labeling substances generally used is 365 nm.
- the fluorescence quantum yield at 365 nm is an index of autofluorescence
- the brightness L * (D65) is an index of the whiteness of immunochromatographic membranes. If the fluorescence quantum yield at 365 nm is 18% or less, autofluorescence is suppressed and sensitivity is improved when a test strip for immunochromatographic assay is prepared and tested. On the other hand, if the lightness L * (D65) is less than 60%, only the fluorescence of the labeling substance on the membrane surface is detected when a test strip for immunochromatographic assay is prepared and tested, leading to a decrease in sensitivity. .
- the fluorescence quantum yield at a wavelength of 365 nm of an immunochromatographic assay membrane can be reduced to 18% or less, and the brightness can be increased to 60% or more.
- the autofluorescence reducing material in the present invention may be either the polymer film support 12 or the porous membrane 14, and the autofluorescence reducing material may be used as both the polymer film support 12 and the porous membrane 14.
- a polymer film support 12 made of a polymer film containing a pigment that absorbs ultraviolet light or visible light is an autofluorescence reducing material.
- polymers used for polymer films containing pigments that absorb ultraviolet light or visible light include polyesters such as polyethylene terephthalate (PET), polyimides, and nylons.
- PET polyethylene terephthalate
- absorbing ultraviolet light or visible light specifically means absorbing 50% or more of light with a wavelength of 190 to 830 nm.
- the dye that absorbs ultraviolet light or visible light is not particularly limited, and examples thereof include black dyes.
- black used herein means that the CIE color coordinates are ⁇ 1.0 ⁇ a* ⁇ 2.5 and ⁇ 1.0 ⁇ a * ⁇ 2.5 and ⁇ 1. It is in the range of 0 ⁇ b * ⁇ 15.0, and the L * value is in the range of 0 ⁇ L * ⁇ 50.
- Black dye-containing polymer films include, for example, Lumirror #25-X30, #38-X30, #50-X30, #75-X30, #100-X30, #125-X30, #188-X30, #250-X30 , and #25-X36 (manufactured by Toray Industries, Inc.), Mordohar PIB025, PIB050, PIB075, PIB100, PIB125 (manufactured by Asahi Chemical Industry Co., Ltd.).
- Commercially available black dye-containing polymer films generally have a thickness of about 25 to 250 m, and have CIE color coordinates of ⁇ 1.0 ⁇ a * ⁇ 2.5 and ⁇ 1.0 ⁇ b * ⁇ 15. The black pigment is contained so that the L * value is in the range of 0 ⁇ L * ⁇ 50.
- the pigment that absorbs ultraviolet light or visible light is not limited to black pigment, and for example (a mixture of yellow pigment, cyan pigment, and magenta pigment) can also be used.
- the polymer film support 12 does not necessarily have to be an autofluorescence suppressing material.
- polymeric films that do not contain pigments that absorb ultraviolet or visible light can be used as the polymeric film support 12 .
- the polymer film support 12 and the porous membrane 14 may be adhered with an adhesive tape, or the membrane-forming solution may be heated by the method described later. It may be laminated by casting onto the molecular film support 12 .
- the thickness of the polymer film support 12 is not particularly limited, and can be within a normal range. Considering ease of handling, the thickness is preferably about 50 to 100 ⁇ m.
- the porous membrane 14 is mainly made of nitrocellulose such as nitrocellulose or a nitrocellulose mixture that has no reactivity with detection reagents, immobilization reagents, substances to be analyzed, etc. used in immunochromatographic assays and can bind proteins. can be used. Furthermore, membranes made of other materials, such as cellulose ester membranes, nylon membranes, polyethylene membranes, polypropylene membranes, etc., may also be used.
- a dye that absorbs ultraviolet light or visible light By incorporating a dye that absorbs ultraviolet light or visible light into the porous membrane 14 as described above, it can be used as an autofluorescence reducing material.
- Black dyes are representative of dyes that absorb ultraviolet light or visible light.
- the content in the porous membrane is preferably about 0.50% by mass or less, more preferably about 0.30% by mass or less.
- the color of the porous membrane changes from white to gray to black depending on the amount of black pigment added.
- black pigment is not particularly limited, and can be appropriately selected according to the purpose. Examples include dyes and pigments. Examples of pigments include Pigment Black 7, 28, and 26.
- Examples of commercially available products include Chromo Fine Black A-1103 (manufactured by Dainichiseika Kogyo Co., Ltd.), Colortex Black 702, U905 (manufactured by Sanyo Pigment Co., Ltd.), carbon black #2600, #2400, #2350, #2200, #1000, #990, #980, #970, #960, #950, #850 (manufactured by Mitsubishi Chemical Corporation) and the like.
- dyes for example, Savinyl Black RLSN (Clariant Japan Co., Ltd.), VALIFAST BLACK (Orient Chemical Industry Co., Ltd.), MS BLACK VPC (manufactured by Mitsui Chemicals, Inc.), AIZEN SOT BLACK-1, AIZEN SOT BLACK-5 (homogeneous Tsuchiya Chemical Co., Ltd.), Resorin Black GSN 200%, Resolin Black BS (Bayer Japan), KAYASET BLACK AN (Nippon Kayaku Co., Ltd.), DAIWA BLACK MSC (Daiwa Kasei Co., Ltd.), HSB- 202 (manufactured by Mitsubishi Kasei Co., Ltd.), NEPTUNE BLACK X60, NEOPEN BLACK X58 (manufactured by BASF Japan), Oleosol Fast BLACK RL (manufactured by Taoka Chemical Co., Ltd.), Chuo BLACK80, Chuo BLACK80-15 (manufactured by Chuo Synthetic Chemical Co.,
- a porous membrane containing a dye that absorbs ultraviolet light or visible light can be prepared by, for example, adding a black dye to a solvent in which a hydrophobic material is dissolved to prepare a film-forming solution, casting it in a smooth state, and adding the solvent. can be prepared by evaporating
- the porous membrane as the autofluorescence reducing material preferably has a lightness L * (D65) of 60% or more, more preferably 70% or more, when measured with a spectrophotometer.
- Lightness L * (D65) is a measure of the whiteness of a porous membrane.
- the present inventors have found that a porous membrane with a lightness L * (D65) of 60% or more does not greatly inhibit fluorescence from a fluorescent labeling substance when irradiated with excitation light, and has sensitivity suitable for fluorescence analysis. I found out.
- the porous membrane 14 does not necessarily have to be the autofluorescence reducing material.
- a porous membrane itself that does not contain dyes that absorb ultraviolet light or visible light may be laminated on the polymeric film support 12 .
- Both the polymeric film support 12 and the porous membrane 14 can also be autofluorescence reducing materials.
- the thickness of the porous membrane 14 in the immunochromatographic assay membrane 10 of the present invention is preferably 100 ⁇ m or more, more preferably 110 to 160 ⁇ m, from the viewpoint of the developability of the labeled antibody and the retention capacity of the capture antibody solution.
- the immunochromatographic assay membrane 10 of the present invention preferably has a capillary flow time of 300 seconds/4 cm or less, more preferably 250 seconds/4 cm or less, and 180 seconds/4 cm or less from the viewpoint of high-precision rapid diagnosis. It is particularly preferred to have
- the immunochromatographic assay membrane 10 of the present invention preferably contains a substance that promotes capillary action.
- a substance is a substance that lowers the surface tension of the membrane surface and imparts hydrophilicity, does not affect the movement of the target substance in immunochromatography, and does not affect the color development of the labeling substance.
- a material that does not contain Examples include cationic surfactants, anionic surfactants, zwitterionic surfactants, and nonionic surfactants.
- cationic surfactants include higher amine halides, alkylpyridinium halides, and quaternary ammonium salts.
- anionic surfactants include higher fatty acid alkali salts, polyoxyethylene alkyl ether sulfonic acid ester salts, polyoxyethylene alkyl ether phosphonates, alkyl sulfates, alkylbenzene sulfates, alkyl sulfonates, alkylaryl sulfonates, sulfosuccinate ester salts, and the like.
- alkylbenzenesulfonates are preferable, and sodium dodecylbenzenesulfonate (SDBS) is particularly preferable.
- zwitterionic surfactants include alkylbetaine-based compounds, imidazoline-based compounds, alkylamine oxides, and bisoxyborate-based compounds.
- nonionic surfactants include polyoxyethylene alkyl ethers, polyoxyethylene alkylphenyl ethers, polyoxyethylene alkylallyl ethers, glycerin, glycerin fatty acid esters, polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters, sorbitan fatty acid esters, and the like. is mentioned.
- the surfactant as described above can be incorporated into the immunochromatographic assay membrane 10 by a technique such as dipping. Depending on the type of surfactant used, the desired effect can be exhibited if the immunochromatographic assay membrane 10 contains the surfactant in an amount of about 0.5 to 2.0 ⁇ g/mm 3 .
- the immunochromatographic assay test strip of the present invention comprises an immunochromatographic assay membrane 10 as a chromatographic medium. Immunochromatographic assay strips are used to detect liquid samples that may contain substances to be detected.
- the shape and width of the immunochromatographic assay strip are not particularly limited, and can be appropriately selected in terms of actual operation and observation of reaction results.
- FIG. 2 A schematic configuration diagram of an example of an immunochromatographic assay strip is shown in FIG.
- the immunochromatographic assay strip 20 includes an elongated rectangular chromatographic medium 22, a sample pad 24 provided at one end of the chromatographic medium 22 via a conjugate pad 26, and a chromatographic An absorbent pad 28 is provided at the other end of the media 22 and these members are supported by a backing sheet 30 .
- the chromatographic medium 22 consists of the immunochromatographic assay membrane 10 of the present invention.
- the sample pad 24 can be constructed using any material as long as it is a porous body or non-woven fabric normally used for immunochromatographic assay.
- the sample pad 24 is a porous material made of glass fiber or cellulose that absorbs and holds the sample. A sample is dropped onto the sample pad 24 when performing an immunochromatographic assay.
- the conjugate pad 26 is composed of a porous body made of glass fiber or cellulose, non-woven fabric, or the like.
- the conjugate pad 26 contains in advance a labeling substance bound to an antibody that binds to the substance to be analyzed. As the analyte moves through the conjugate pad 26, it binds to the antibody and is labeled.
- the absorbent pad 28 is made of a material that can absorb the developing solution, and porous bodies, non-woven fabrics, etc. used in conventional immunochromatographic assays can be used.
- the absorbent pad 28 can be made of cellulose filter paper or the like.
- the backing sheet 30 can be a sheet-like material of any material with an adhesive layer to support the chromatographic medium 22, sample pad 24, conjugate pad 26, and absorbent pad .
- sheets made of polyester or polystyrene can be used.
- the immunochromatographic assay test strip 20 configured as described above can be used as it is or, if necessary, it can be accommodated in a housing made of plastic.
- the immunochromatographic assay test strip 20 can be produced, for example, by the following method.
- a dispersion liquid of labeled particles adjusted to a predetermined concentration is prepared, a buffer solution and an antibody are added, and the mixture is stirred for a certain period of time while adjusting the temperature to allow the labeled particles to adsorb the antibody.
- the labeled particles are blocked by further adding a blocking agent and stirring for a certain period of time while adjusting the temperature.
- Blocking is an operation of coating particles alone or particles carrying antibodies or antigens.
- various blocking agents can be used according to the composition of the substance to be tested, the sample, or the solution for diluting it.
- Casein is particularly preferred for blocking labeled particles.
- casein coats the surface of the antibody and labeling particles in the labeling particles carrying the antibodies.
- centrifugation is performed to separate the supernatant containing excess antibody and blocking agent from the sedimented particles, and the supernatant is removed by decantation.
- a liquid such as a buffer solution is added to the sedimented particles, and if necessary, ultrasonic waves are used to disperse the particles.
- Washing by a series of operations of sedimentation by centrifugation, removal of the supernatant, and addition of the liquid is repeated as many times as necessary to prepare a dispersion liquid containing the antibody-adsorbed and blocked particles at a predetermined concentration.
- Proteins, surfactants, and sugars such as sucrose and trehalose are added to the resulting dispersion as necessary, and a certain amount of the resulting solution is applied to a polyethylene conjugate pad and dried to prepare a detection reagent-containing portion. do.
- the regenerated cellulose continuous filament nonwoven fabric is coated with a buffer solution, surfactant, protein, a reagent for trapping contaminants in the specimen sample, a preservative, an antibacterial agent, an antioxidant, a moisture absorbent, etc., and dried. to prepare the sample pad.
- a chromatographic medium made of porous nitrocellulose membrane on which antibodies are immobilized at predetermined positions and an absorption pad made of cellulose filter paper for absorbing the sample are prepared. Immunochromatographic assay test strips are obtained by immobilizing them on a mount having an adhesive site called a backing sheet and cutting them into a predetermined size.
- a test method using the immunochromatographic assay test strip 20 of the present invention will be described below.
- a reaction site is formed in which a substance that specifically binds to the substance to be analyzed, such as an antibody, is immobilized as an immobilization reagent at an arbitrary position.
- Immobilized reagents can be directly immobilized to the chromatographic medium 22 by physical or chemical means. Alternatively, immobilized reagents may be physically or chemically bound to microparticles, such as latex particles, and the microparticles captured by chromatographic medium 22 to be indirectly immobilized.
- Physical adsorption can be used to directly immobilize the immobilization reagent.
- An immobilization reagent may be immobilized to the chromatographic medium 22 by covalent bonding. In the case of nitrocellulose membranes, physical adsorption can take place.
- cyanogen bromide, glutaraldehyde, carbodiimide, etc. are generally used to activate the chromatographic medium 22, but any method can be used.
- a method of indirect immobilization includes a method of immobilizing insoluble fine particles bound with an immobilization reagent on the chromatographic medium 22 .
- insoluble fine particles those having a size that can be captured by the chromatographic medium 22 but cannot move can be selected, and fine particles having an average particle diameter of about 5 ⁇ m or less are preferable.
- Various particles used for antigen-antibody reactions are known as such particles, and such particles can also be used in the present invention.
- Organic polymers such as organic polymer latex particles obtained by emulsion polymerization, for example, polystyrene, styrene-butadiene copolymer, styrene-methacrylic acid copolymer, polyglycidyl methacrylate, acrolein-ethylene glycol dimethacrylate copolymer
- examples include fine particles of substances, fine particles such as gelatin, bentonite, agarose, and crosslinked dextran, inorganic oxides such as silica, silica-alumina, and alumina, and inorganic particles obtained by introducing functional groups into inorganic oxides by silane coupling treatment or the like. .
- direct immobilization is preferable due to ease of sensitivity adjustment.
- various methods can be adopted for immobilizing the immobilized reagent on the chromatographic medium 22 .
- a variety of techniques can be used, eg, microsyringes, pens with adjustable pumps, ink jet printing, and the like.
- the form of the reaction site is not particularly limited, it can be fixed as a circular spot, a line extending perpendicularly to the developing direction of the chromatographic medium 22, a number, a letter, a symbol (+, -, etc.), or the like.
- the chromatographic medium 22 can be blocked by a known method, if necessary, in order to prevent the accuracy of analysis from deteriorating due to nonspecific adsorption.
- proteins such as bovine serum albumin, skimmed milk, casein and gelatin are preferably used for blocking treatment.
- one or a combination of two or more surfactants such as Tween 20, Triton X-100 and SDS may be used for washing.
- the detection reagent used in the present invention is a substance that specifically binds to the substance to be analyzed, such as an antibody, and is labeled with a labeling substance.
- a labeling substance such as insoluble carriers and enzymes are generally used for labeling detection reagents in immunochromatographic assays.
- labeling substances fluorescent labeling substances such as insoluble carriers and enzymes containing fluorophores are used.
- a labeled detection reagent is prepared by sensitizing the detection reagent to a fluorescent labeling substance.
- a fluorescent labeling substance is a labeling substance suitable for detecting the presence of the substance to be analyzed with high accuracy and sensitivity, and the fluorescence generated by the irradiation of the excitation light can be used as a label.
- organic latex particles, inorganic colloidal particles, etc. used in technical fields such as test drugs can be used.
- the material of the particles is not limited, but examples thereof include those used as materials for solid phase carriers that bind proteins such as antibodies, antigens, ligands and receptors in technical fields such as test drugs.
- organic latex particles include particles made of polystyrene, styrene copolymers such as styrene-acrylic acid copolymers, polycarbonate, polymethylene methacrylate (PMMA), polyvinyl toluene, cellulose, and the like.
- examples of inorganic colloidal particles include silica nanoparticles.
- An insoluble carrier made of a substance capable of emitting fluorescence can also be used.
- examples of such particles include M I M II O 4 or M I Al 5 O 12 ( MI is yttrium (Y), lanthanum ( La) or gadolinium (Gd); dot.
- the type of fluorescent material contained in the fluorescent labeling substance is not limited, and those used in the field of test drugs and the like can be used.
- fluorescent organic dyes such as fluorescein, rhodamine, coumarin, Cydye, Alexa (registered trademark) Fluor, EvoBlue, oxazine, Carbopyronin, napthalene, biphenyl, anthracene, phenenthrene, pyrene, and carbazole as a basic skeleton. and derivatives of fluorescent dyes thereof.
- Rare earth complexes such as europium (Eu 3+ ) chelate and terbium (Tb 3+ ) chelate can also be used.
- ATBTA-Eu 3+ having an amino group can be used as a europium (Eu 3+ ) chelate.
- fluorescent proteins such as Green Fluorescent Protein (GFP) can also be used.
- a detection reagent made by sensitizing latex particles made of a synthetic polymer containing a fluorescent substance with an antibody is prepared by surface-modifying the surface of the latex particles with a reactive group, and then adding an antibody and a cross-linking agent to a solution in which the surface-modified latex particles are dispersed. After chemically binding the antibody, the antibody is prepared by adding a bovine serum albumin solution or the like to block the particle surface where the antibody is not bound.
- the detection reagent labeled with an insoluble carrier can be dispersed in the developing liquid that constitutes the mobile phase and applied.
- an insoluble It can also be applied in the presence of carrier-labeled detection reagents.
- the detection reagent When the detection reagent is present on the immunochromatographic assay test strip 20, it is preferable to support the detection reagent so that the detection reagent can quickly dissolve in the developing solution and move freely by capillary action.
- a sugar such as saccharose, maltose or lactose, or a sugar alcohol such as mannitol may be added to the support site and applied. These substances may be pre-coated on the part to be supported.
- the detection reagent When the detection reagent is present on the immunochromatographic assay test strip 20 by coating, drying, etc., it can be directly coated, dried, etc. on the immunochromatographic assay test strip 20 on which the immobilized reagent is immobilized.
- another porous material such as cellulose filter paper, glass fiber filter paper, or nylon nonwoven fabric is coated with a detection reagent and dried to form a detection reagent holding member, and then an immunochromatographic assay test in which the immobilization reagent is immobilized. It may be arranged so as to be in capillary contact with the strip 20 .
- the substance to be analyzed to be detected by the method of the present invention is not particularly limited as long as it contains a substance that specifically binds thereto. sugar moieties of lipids, etc.), complex carbohydrates, and the like.
- Binding specifically means binding based on the affinity possessed by biomolecules. Such affinity-based binding includes binding between antigens and antibodies, binding between sugars and lectins, binding between hormones and receptors, binding between enzymes and inhibitors, binding between complementary nucleic acids and between nucleic acids and nucleic acid binding proteins. and the like.
- a polyclonal antibody or monoclonal antibody can be exemplified as a substance that specifically binds to the substance to be analyzed.
- a lectin protein can be exemplified as a substance that specifically binds to the substance to be analyzed.
- Specific substances to be detected include, for example, carcinoembryonic antigen (CEA), HER2 protein, prostate-specific antigen (PSA), CA19-9, ⁇ -fetoprotein (AFP), immunosuppressive acidic protein (IPA), CA15- 3, CA125, estrogen receptor, progesterone receptor, fecal occult blood, troponin I, troponin T, CK-MB, CRP, human chorionic gonadotropin (hCG), luteinizing hormone (LH), follicle stimulating hormone (FSH), syphilis antibody, Influenza virus, human hemoglobin, chlamydia antigen, group A ⁇ -hemolytic streptococcal antigen, HBs antibody, HBs antigen, rotavirus, adenovirus, albumin, glycated albumin, etc., but not limited to these.
- Specimens containing analytes include, for example, biological samples, i.e., whole blood, serum, plasma, urine, saliva, sputum, nasal or pharyngeal swabs, cerebrospinal fluid, amniotic fluid, nipple discharge, tears, sweat, skin exudates, extracts from tissues, cells, and stools, extracts from milk, eggs, wheat, beans, beef, pork, chicken, and foods containing them.
- biological samples i.e., whole blood, serum, plasma, urine, saliva, sputum, nasal or pharyngeal swabs, cerebrospinal fluid, amniotic fluid, nipple discharge, tears, sweat, skin exudates, extracts from tissues, cells, and stools, extracts from milk, eggs, wheat, beans, beef, pork, chicken, and foods containing them.
- a developing solution may be used if necessary.
- the developing liquid is a liquid that constitutes the mobile phase in the immunochromatographic assay method, and moves on the immunochromatographic assay test strip 20, which is the stationary phase, together with the sample containing the substance to be detected and the labeled detection reagent. Any developing liquid may be used as long as it is such a developing liquid.
- a membrane for immunochromatographic assay was prepared and its physical properties were measured.
- the applied measurement methods are as follows.
- the thickness of the immunochromatographic assay membrane was obtained by measuring six points with a contact-type film thickness meter (manufactured by Mitutoyo Corporation) and averaging the results.
- a contact-type film thickness meter manufactured by Mitutoyo Corporation
- the contact terminal a cylindrical terminal having a bottom surface of 1 cm in diameter was used. The measuring force was 0.4 N or less.
- capillary flow time The capillary flow time of the immunochromatographic assay membrane was measured by the following water absorption test.
- test piece with a width of 10 mm and a length of 50 mm was cut out, water (pure water) was sucked up from one end in the length direction of the test piece by capillary action, and the time for water to be sucked up to a height of 40 mm was measured.
- Six test pieces were prepared, a water absorption test was conducted on each, and the average value of capillary flow time was obtained.
- Fluorescence quantum yield Quantaurus-QY manufactured by Hamamatsu Photonics Co., Ltd. was used to determine the fluorescence quantum yield of the immunochromatographic assay membrane at an excitation wavelength of 365 nm.
- the surface of the immunochromatographic assay membrane was measured at two points using a spectrophotometer (manufactured by Konica Minolta Japan, Inc.) using a 6 mm target mask, and the average value of lightness L * (D65) was obtained.
- Example 1 4.6% by weight nitrocellulose resin, 0.2% by weight cellulose acetate resin, 43.7% by weight acetone, 46.1% by weight propanol, 2.0% by weight isopropyl alcohol, and 3.4% by weight water were added to the tank. It was accommodated and stirred to obtain a uniform membrane-forming solution. Thereafter, in an atmosphere adjusted to a temperature of 33° C. and a relative humidity of 55% RH, the film-forming solution was cast onto a PET film containing a black pigment (thickness: 100 ⁇ m) heated to 33° C., and the solvent was evaporated. to solidify the membrane-forming solution. Then, it was dried to obtain a membrane. Sodium dodecylbenzenesulfonate was added to the resulting porous membrane to prepare an immunochromatographic assay membrane of Example 1.
- Comparative example 1 An immunochromatographic assay membrane of Comparative Example 1 was prepared in the same manner as in Example 1, except that the polymer film support was changed to a colorless and transparent (black dye-free) PET film (thickness: 100 ⁇ m).
- Example 2 Example except that the acetone in the film-forming solution was changed to an acetone solution of a black dye (Savinyl Black RLSN), and the polymer film support was changed to a colorless and transparent (not containing a black dye) PET film (thickness: 100 ⁇ m).
- a porous membrane containing a black dye was prepared in the same manner as in 1. The black dye concentration in the porous membrane is as shown in Table 1 below.
- Sodium dodecylbenzenesulfonate was added to each porous membrane in the same manner as in Example 1 to prepare immunochromatographic assay membranes of Examples 2 and 3 and Comparative Examples 2 and 3.
- the immunochromatographic assay membranes of Examples 1 to 3 are provided with an autofluorescence reducing material as a polymeric film support or porous membrane. Therefore, the immunochromatographic assay membranes of Examples 1 to 3 have a maximum fluorescence quantum yield at an excitation wavelength of 365 nm of 12.4% and a brightness L * (D65) of 60% or more.
- the immunochromatographic assay membrane of Comparative Example 1 does not include an autofluorescence reducing material. Therefore, the fluorescence quantum yield reaches 19% at an excitation wavelength of 365 nm.
- the immunochromatographic assay membrane of Comparative Example 2 has a fluorescence quantum yield of 18% or more at an excitation wavelength of 365 nm, and the immunochromatographic assay membrane of Comparative Example 3 has a brightness L * (D65) of less than 60%.
- immunochromatographic assay test strips were prepared and evaluated. Influenza antigen was used as the analyte of the test strip for immunochromatographic assay. All operations not specifically described were performed under an environment of a temperature of 23° C. and a relative humidity of 55% RH.
- antibody-sensitized labeled particles were prepared by the following method. Using 2-morpholinoethanesulfonic acid (hereinafter referred to as “MES”, M0606 manufactured by Tokyo Kasei Co., Ltd.), caustic soda, and pure water, an MES buffer solution having a pH of 6.0 and a concentration of 100 mM was prepared. 693.3 ⁇ L of the resulting MES buffer, 26.7 ⁇ L of 2.7 wt % dispersion of labeled particles, 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (hereinafter referred to as “EDC”, manufactured by Tokyo Kasei Co., Ltd.
- MES 2-morpholinoethanesulfonic acid
- EDC 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride
- N-hydroxysuccinimide (hereinafter referred to as “NHS”, manufactured by Tokyo Kasei Co., Ltd., B0249) were placed in a container and allowed to stand at room temperature. placed.
- centrifugation was performed at 20000 g for 30 minutes to precipitate the antibody-bound labeled particles. The supernatant was discarded.
- an ultrasonic disperser manufactured by SMT Co., Ltd., UH-50
- Antibody-bound labeled particles (hereinafter also referred to as "detection reagent") were obtained by the above method.
- a polyethylene conjugate pad (Pall, 6613) was immersed in a large excess of 0.05% by weight of Tween-20 (registered trademark, Sigma-Aldrich, T2700), and excess liquid was removed. After drying at 50° C. for 60 minutes, it was cut into a shape with a height of 10 mm and a length of 300 mm. Then, using a micropipette, 795 ⁇ L of detection reagent was evenly applied and dried at 37° C. for 30 minutes.
- Tween-20 registered trademark, Sigma-Aldrich, T2700
- Pretreatment of sample pad Regenerated cellulose continuous filament nonwoven fabric (Microline S-06, manufactured by Asahi Kasei Corporation), 6.0 wt% skim milk (190-12865, manufactured by Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) and 1.0 wt% BSA (manufactured by Sigma-Aldrich Co., Ltd. , A7906) and 2.0 wt% Tween-20, immersed in a large excess of PBS buffer (66 mM, pH 7.4), removed excess liquid, and dried at 50 ° C. for 120 minutes. rice field. Then, it was cut into a shape with a height of 22 mm and a length of 210 mm.
- PBS buffer 66 mM, pH 7.4
- test strip for immunochromatographic assay A backing card (Adhesives Research, AR9020) was pasted with the capture antibody-coated membrane obtained as described above, an absorbent pad (Pall, 66211), a conjugate pad containing a detection reagent, and a sample pad. . Then, it was cut to a width of 5 mm with a cutter to obtain test strips for immunochromatographic assay of Examples 4 to 6 and Comparative Examples 4 to 6 having a width of 5 mm and a height of 60 mm.
- the resulting digital photograph was image-analyzed to determine the intensity of color development. Specifically, using image analysis software (ImageJ, National Institutes of Health, USA), a region of width 3 mm ⁇ length 12.5 mm including the detection part is measured with the horizontal axis being the position in the length direction and the vertical axis being 0 to 255. was graphed as the luminance of A peak area value of the detection part was obtained, and this peak area value was taken as the color development intensity. Table 2 shows the analysis results.
- the immunochromatographic assay test strip of the present invention is capable of highly sensitive detection.
- the immunochromatographic assay test strip of the present invention can reduce background noise due to autofluorescence from the porous membrane and the backing sheet, thereby improving the fluorescence immunochromatographic assay method. sensitivity can be improved.
Abstract
本発明のイムノクロマトアッセイ用メンブレン（１０）は、高分子フィルム支持体（１２）と、前記高分子フィルム支持体（１２）上に積層された多孔質メンブレン（１４）とを備え、前記高分子フィルム支持体（１２）および前記多孔質メンブレン（１４）の少なくとも一方は、自家蛍光低減材からなることを特徴とする。
Description
本発明は、イムノクロマトアッセイ用メンブレン、イムノクロマトアッセイ用テストストリップ、および検査方法に関する。
抗原抗体反応を利用した簡易な免疫測定として、イムノクロマトアッセイ法が広く普及している。イムノクロマトアッセイ法は、操作が簡便であり、短時間で測定可能であることから、ＰＯＣＴ（Point of Care Testing）として妊娠診断やインフルエンザの感染確認など速報性を要する場合の臨床検査や診断に広く用いられている。
このようなイムノクロマトアッセイを行うテストストリップでは、分析対象物質は、次のようにして定性的または定量的に検出される。テストストリップの一端に滴下された液体の検体は、毛細管現象によりストリップ中を移動する。この過程で、分析対象物質に結合する標識抗体と分析対象物質との結合が促される。分析対象物質と結合する捕捉抗体が固定された領域を通過する際、抗原抗体反応により標識抗体抗原複合体が捕捉される。当該捕捉抗体固定領域で標識物質による呈色を示し、光学的に検出することができる。
標識物質としては、酵素を含む蛋白質、金コロイドなどの金属コロイド、着色ラテックス粒子等が一般的に使用されている。しかしながら、これらの標識物質を使用したイムノクロマトアッセイでは検出感度の面において、高感度検出法として知られている遺伝子増幅法（ＰＣＲ法）と比べて劣っており、高精度迅速診断のために高感度化が望まれている。
高感度化を達成する手段として、蛍光標識物質を使用した蛍光イムノクロマトアッセイ法が提供されている（例えば、特許文献１参照）。
蛍光イムノクロマトアッセイ法は、前述の標識抗体に蛍光標識抗体を使用したイムノアッセイ法であり、捕捉抗体に標識抗体抗原複合体が捕捉後、前記蛍光標識物質が蛍光発光する波長領域の励起光を照射し、前記蛍光標識物質が発生させた蛍光を検出器で検出することにより、分析対象物質を高感度に定性的あるいは定量的に検出することができる。
蛍光イムノクロマトアッセイ法は、前述の標識抗体に蛍光標識抗体を使用したイムノアッセイ法であり、捕捉抗体に標識抗体抗原複合体が捕捉後、前記蛍光標識物質が蛍光発光する波長領域の励起光を照射し、前記蛍光標識物質が発生させた蛍光を検出器で検出することにより、分析対象物質を高感度に定性的あるいは定量的に検出することができる。
蛍光イムノクロマトアッセイ法では、励起光照射部と蛍光検出部とを備えた蛍光イムノクロマトリーダーが一般的に使用される。このような蛍光イムノクロマトリーダーを使用した蛍光イムノクロマトアッセイ法では、励起光の照射に伴い、抗原抗体複合体を形成した蛍光標識からの蛍光だけでなく、イムノクロマトアッセイの展開部位である多孔質メンブレンやその支持体、また、それらを支持するバッキングシートからの自家蛍光等からの不要な蛍光が生じる。このような抗原抗体複合体以外からの蛍光は、バックグラウンドのノイズとなりシグナル／バックグラウンド比（Ｓ／Ｂ比）を低下させるため、より微少量の分析対象物質を検出しようとする際の障害となっている。
シグナル／バックグラウンド比（Ｓ／Ｂ比）を向上する方策としては、例えば、特許文献２では、自家蛍光と異なる色領域の蛍光標識物質を使用し、蛍光検出手段として検出器にカラーセンサを用いる手法が提案されている。
また、特許文献３では、６００ｎｍ以上８００ｎｍ以下の波長を有する光で励起されて蛍光を生じる蛍光物質を標識物質として使用し、多孔質メンブレンやその支持体等からの自家蛍光によるバックグラウンドの影響を低減した波長領域において蛍光検出する方法が提案されている。
しかしながら、上記特許文献２および特許文献３の技術は、多孔質メンブレンやその支持体等からの自家蛍光のピーク波長を避けた波長領域での蛍光検出となるが、多孔質メンブレンやその支持体等からの自家蛍光自体は低減していない。検出感度には限界があり、高精度迅速診断のための高感度化にはさらなる改善の必要がある。
そこで本発明は、高感度で検出可能なイムノクロマトアッセイ用テストストリップが得られるイムノクロマトアッセイ用メンブレン、高感度で検出可能なイムノクロマトアッセイ用テストストリップ、および高感度な検査方法を提供することを目的とする。
以上の目的を達成するため、本発明者らは鋭意研究を重ねた結果、特定の自家蛍光低減材を備えたイムノクロマトアッセイ用メンブレンを用いることによって、高感度で検出可能なイムノクロマトアッセイ用テストストリップが得られることを見出した。
すなわち、本発明は、高分子フィルム支持体と、前記高分子フィルム支持体上に積層された多孔質メンブレンとを備え、前記高分子フィルム支持体および前記多孔質メンブレンの少なくとも一方は、自家蛍光低減材からなることを特徴とするイムノクロマトアッセイ用メンブレンである。
また本発明は、前述のイムノクロマトアッセイ用メンブレンをクロマトグラフ媒体として備えるイムノクロマトアッセイ用テストストリップである。
さらに本発明は、検体中に含まれる分析対象物質の検査方法であって、前述のイムノクロマトアッセイ用テストストリップを用い、蛍光標識物質に検体を接触させることを含む検査方法である。
すなわち、本発明は、高分子フィルム支持体と、前記高分子フィルム支持体上に積層された多孔質メンブレンとを備え、前記高分子フィルム支持体および前記多孔質メンブレンの少なくとも一方は、自家蛍光低減材からなることを特徴とするイムノクロマトアッセイ用メンブレンである。
また本発明は、前述のイムノクロマトアッセイ用メンブレンをクロマトグラフ媒体として備えるイムノクロマトアッセイ用テストストリップである。
さらに本発明は、検体中に含まれる分析対象物質の検査方法であって、前述のイムノクロマトアッセイ用テストストリップを用い、蛍光標識物質に検体を接触させることを含む検査方法である。
本発明によれば、高感度で検出可能なイムノクロマトアッセイ用テストストリップが得られるイムノクロマトアッセイ用メンブレン、高感度で検出可能なイムノクロマトアッセイ用テストストリップ、および高感度な検査方法を提供することができる。
以下、図面を参照して、本発明のイムノクロマトアッセイ用メンブレンについて詳細に説明する。
図１は、本発明のイムノクロマトアッセイ用メンブレンの構成を示す側面図である。イムノクロマトアッセイ用メンブレン１０は、イムノクロマトアッセイ用テストストリップにおけるクロマトグラフ媒体として用いられる部材であり、高分子フィルム支持体１２と、この上に積層された多孔質メンブレン１４とを備える。
図１は、本発明のイムノクロマトアッセイ用メンブレンの構成を示す側面図である。イムノクロマトアッセイ用メンブレン１０は、イムノクロマトアッセイ用テストストリップにおけるクロマトグラフ媒体として用いられる部材であり、高分子フィルム支持体１２と、この上に積層された多孔質メンブレン１４とを備える。
高分子フィルム支持体１２および多孔質メンブレン１４の少なくとも一方は、自家蛍光低減材からなる。さらに、本発明のイムノクロマトアッセイ用メンブレン１０は、励起波長３６５ｎｍにおける蛍光量子収率が１８％以下、かつ分光測色計で測定した場合の明度Ｌ＊（Ｄ６５）が６０％以上であることが好ましい。なお、蛍光量子収率は、イムノクロマトアッセイ用メンブレン１０の空孔内が水で満たされた状態で測定される。
蛍光イムノクロマト法において、一般的に使用されている蛍光標識物質の励起波長は３６５ｎｍである。３６５ｎｍにおける蛍光量子収率は自家蛍光の指標であり、明度Ｌ＊（Ｄ６５）はイムノクロマトアッセイ用メンブレンの白色度の指標である。３６５ｎｍにおける蛍光量子収率が１８％以下であれば、イムノクロマトアッセイ用テストストリップを作製して検査を行った際の自家蛍光が抑えられ、感度が向上する。一方、明度Ｌ＊（Ｄ６５）が６０％未満であると、イムノクロマトアッセイ用テストストリップを作製して検査を行った際に、メンブレン表面上の標識物質の蛍光のみが検出されて感度の低下につながる。
したがって、明度Ｌ＊（Ｄ６５）が６０％以上であることにより、感度向上につながる。本発明者らは、特定の自家蛍光低減材を用いることによって、イムノクロマトアッセイ用メンブレンの波長３６５ｎｍにおける蛍光量子収率を１８％以下にするとともに、明度を６０％以上にできることを見出した。
本発明における自家蛍光低減材は、高分子フィルム支持体１２および多孔質メンブレン１４のいずれであってもよく、高分子フィルム支持体１２および多孔質メンブレン１４の両方として自家蛍光低減材を用いることもできる。例えば、紫外光または可視光を吸収する色素を含有する高分子フィルムからなる高分子フィルム支持体１２は、自家蛍光低減材である。
紫外光または可視光を吸収する色素を含有する高分子フィルムに用いる高分子としては、例えば、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）等のポリエステルやポリイミド、ナイロン等が挙げられる。本明細書において「紫外光または可視光を吸収する」とは、具体的には、波長が１９０～８３０ｎｍの光を５０％以上吸収することをいう。紫外光または可視光を吸収する色素は特に限定されず、例えば黒色色素が挙げられる。
なお、本明細書における「黒色」とは、ＪＩＳＺ８７０１－１９９９に準拠して測定した、Ｃ光源、視野角２ｄｅｇによるＣＩＥ系色座標が、－１．０≦ａ*≦２．５かつ－１．０≦ｂ*≦１５．０の範囲であり、Ｌ*値については、０＜Ｌ*≦５０の範囲にある色味をいう。
黒色色素含有高分子フィルムは、例えば、ルミラー＃２５－Ｘ３０、＃３８－Ｘ３０、＃５０－Ｘ３０、＃７５－Ｘ３０、＃１００－Ｘ３０、＃１２５－Ｘ３０、＃１８８－Ｘ３０、＃２５０－Ｘ３０、および＃２５－Ｘ３６（東レ株式会社製）、Ｍｏｒｄｏｈａｒ ＰＩＢ０２５、ＰＩＢ０５０、ＰＩＢ０７５、ＰＩＢ１００、ＰＩＢ１２５（旭化学工業株式会社製）などとして市販されている。市販の黒色色素含有高分子フィルムは、通常、２５～２５０ｍ程度の厚さであり、ＣＩＥ系色座標にて－１．０≦ａ*≦２．５かつ－１．０≦ｂ*≦１５．０の範囲であり、Ｌ*値については、０＜Ｌ*≦５０範囲となるよう、黒色色素が含有されている。
紫外光または可視光を吸収する色素は黒色色素に限定されず、例えば（黄色色素、シアン色素、マゼンタ色素の混合物）等を用いることもできる。
高分子フィルム支持体１２の上に積層される多孔質メンブレン１４として自家蛍光低減材を用いる場合には、高分子フィルム支持体１２は必ずしも自家蛍光抑制材である必要はない。例えば、紫外光または可視光を吸収する色素を含有しない高分子フィルムを、高分子フィルム支持体１２として用いることができる。
高分子フィルム支持体１２の上に多孔質メンブレン１４を積層するには、高分子フィルム支持体１２と多孔質メンブレン１４を接着テープにより接着してもよいし、後述の方法で製膜溶液を高分子フィルム支持体１２の上に流延することで積層してもよい。
本発明のイムノクロマトアッセイ用メンブレン１０において、高分子フィルム支持体１２の厚さは特に制限されず、通常の範囲とすることができる。取り扱いの容易さを考慮すると、５０～１００μｍ程度であることが好ましい。
多孔質メンブレン１４としては、イムノクロマトアッセイで使用される検出試薬、固定化試薬、分析対象出物質などと反応性を有さず、タンパク質を結合できるニトロセルロースやニトロセルロース混合品などニトロセルロースを主材とするメンブレンを使用することができる。さらに、他の材料からなるメンブレン、例えばセルロースエステル類メンブレン、ナイロンメンブレン、ポリエチレンメンブレン、ポリプロピレンメンブレンなどを用いてもよい。
上述したような多孔質メンブレン１４に紫外光または可視光を吸収する色素を含有させることにより、自家蛍光低減材とすることができる。紫外光または可視光を吸収する色素としては黒色色素が代表的である。黒色色素（Ｓａｖｉｎｙｌ Ｂｌａｃｋ ＲＬＳＮ）の場合、多孔質メンブレンにおける含有量は、０．５０質量％以下程度が好ましく、０．３０質量％以下程度がより好ましい。なお、黒色色素の添加量により、白色～灰色～黒色のように多孔質メンブレンの色が変化する。
黒色色素の種類は特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができる。例えば染料、顔料が挙げられる。顔料としては、例えば、Ｐｉｇｍｅｎｔ Ｂｌａｃｋ ７、２８、２６などが挙げられる。
市販品としては、例えば、クロモファインブラックＡ－１１０３（大日精化工業株式会社製）、Ｃｏｌｏｒｔｅｘ Ｂｌａｃｋ ７０２、Ｕ９０５（山陽色素株式会社製）、カーボンブラック＃２６００、＃２４００、＃２３５０、＃２２００、＃１０００、＃９９０、＃９８０、＃９７０、＃９６０、＃９５０、＃８５０（三菱化学株式会社製）などが挙げられる。
染料としては、例えば、Ｓａｖｉｎｙｌ Ｂｌａｃｋ ＲＬＳＮ（クラリアントジャパン株式会社）、ＶＡＬＩＦＡＳＴ ＢＬＡＣＫ（オリエント化学工業株式会社）、ＭＳ ＢＬＡＣＫ ＶＰＣ（三井化学株式会社製）、ＡＩＺＥＮ ＳＯＴ ＢＬＡＣＫ－１、ＡＩＺＥＮ ＳＯＴ ＢＬＡＣＫ－５（保土谷化学株式会社製）、ＲＥＳＯＲＩＮ ＢＬＡＣＫ ＧＳＮ ２００％、ＲＥＳＯＬＩＮ ＢＬＡＣＫ ＢＳ（バイエルジャパン社製）、ＫＡＹＡＳＥＴ ＢＬＡＣＫ Ａ－Ｎ（日本化薬株式会社製）、ＤＡＩＷＡ ＢＬＡＣＫ ＭＳＣ（ダイワ化成株式会社製）、ＨＳＢ－２０２（三菱化成株式会社製）、ＮＥＰＴＵＮＥ ＢＬＡＣＫ Ｘ６０、ＮＥＯＰＥＮ ＢＬＡＣＫ Ｘ５８（ＢＡＳＦジャパン社製）、Ｏｌｅｏｓｏｌ Ｆａｓｔ ＢＬＡＣＫ ＲＬ（田岡化学工業株式会社製）、Ｃｈｕｏ ＢＬＡＣＫ８０、Ｃｈｕｏ ＢＬＡＣＫ８０－１５（中央合成化学株式会社製）などが挙げられる。
紫外光または可視光を吸収する色素を含有する多孔質メンブレンは、例えば、疎水性材料を溶解させた溶媒中に黒色色素を添加して製膜溶液を作製して平滑状に流延し、溶媒を蒸発させることより作製することができる。
自家蛍光低減材としての多孔質メンブレンは、分光測色計で測定した場合の明度Ｌ*（Ｄ６５）が６０％以上であることが好ましく、７０％以上であることがより好ましい。分光測色計で測定した場合の明度Ｌ*（Ｄ６５）は、多孔質メンブレンの白色度の指標である。本発明者らは、明度Ｌ*（Ｄ６５）が６０％以上の多孔質メンブレンは、励起光を照射した際に蛍光標識物質からの蛍光を大きく阻害することなく、蛍光分析に適した感度を持つことを見出した。
多孔質メンブレン１４を支持する高分子フィルム支持体１２として自家蛍光低減材を用いる場合には、多孔質メンブレン１４は必ずしも自家蛍光低減材である必要はない。例えば、紫外光または可視光を吸収する色素を含有しない多孔質メンブレンそのものを、高分子フィルム支持体１２上に積層してもよい。高分子フィルム支持体１２および多孔質メンブレン１４の両方として、自家蛍光低減材を用いることもできる。
本発明のイムノクロマトアッセイ用メンブレン１０における多孔質メンブレン１４の厚さは、標識抗体の展開性や捕捉抗体溶液の保持容量などの観点から、１００μｍ以上が好ましく、１１０～１６０μｍであることがより好ましい。
本発明のイムノクロマトアッセイ用メンブレン１０は、高精度迅速診断の観点からキャピラリーフロータイムが３００秒／４ｃｍ以下であることが好ましく、２５０秒／４ｃｍ以下であることがより好ましく、１８０秒／４ｃｍ以下であることが特に好ましい。
さらに、本発明のイムノクロマトアッセイ用メンブレン１０には、毛細管現象を促進させる物質を含有させることが好ましい。このような物質としては、膜面の表面張力を低下させ、親水性をもたらす物質であって、イムノクロマトアッセイ上での分析対象物質の移動に影響を及ぼさず、標識物質の発色にも影響を及ぼさない物質が好ましい。例えば、陽イオン系界面活性剤、陰イオン系界面活性剤、両性イオン系界面活性剤、および非イオン系界面活性剤が挙げられる。
陽イオン系界面活性剤としては、例えば高級アミンハロゲン酸塩、ハロゲン化アルキルピリジニウム、および第四級アンモニウム塩などが挙げられる。
陰イオン系界面活性剤としては、例えば、高級脂肪酸アルカリ塩、ポリオキシエチレンアルキルエーテルスルホン酸エステル塩、ポリオキシエチレンアルキルエーテルホスホン酸塩、アルキル硫酸塩、アルキルベンゼン硫酸塩、アルキルスルホン酸塩、アルキルアリールスルホン酸塩、およびスルホコハク酸エステル塩などが挙げられる。中でもアルキルベンゼンスルホン酸塩が好ましく、特にドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム（ＳＤＢＳ）が好ましい。
両性イオン系界面活性剤としては、例えばアルキルベタイン系化合物、イミダゾリン系化合物、アルキルアミンオキサイド、およびビスオキシボレート系化合物などが挙げられる。
非イオン系界面活性剤としては、例えばポリオキシエチレンアルキルエーテル類、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル類、ポリオキシエチレンアルキルアリルエーテル類、グリセリン、グリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル等が挙げられる。
上述したような界面活性剤は、例えばディッピング等の手法によってイムノクロマトアッセイ用メンブレン１０に含有させることができる。用いる界面活性剤の種類にもよるが、通常、０．５～２．０μｇ/ｍｍ3程度の量でイムノクロマトアッセイ用メンブレン１０に含有されていれば、所望の効果が発揮される。
本発明のイムノクロマトアッセイ用テストストリップは、イムノクロマトアッセイ用メンブレン１０をクロマトグラフ媒体として備えている。イムノクロマトアッセイ用ストリップは、被検出物質を含有する可能性のある液体状のサンプルの検出に用いられる。イムノクロマトアッセイ用ストリップの形状および幅は、特に限定されず、実際の操作の点および反応結果の観察の点において適切に選択することができる。
イムノクロマトアッセイ用ストリップの一例の模式構成図を、図２に示す。
図２に示されるように、イムノクロマトアッセイ用ストリップ２０は、細長な矩形状のクロマトグラフ媒体２２と、コンジュゲートパッド２６を介してクロマトグラフ媒体２２の一端に設けられたサンプルパッド２４と、クロマトグラフ媒体２２の他端に設けられた吸収パッド２８とを備え、これら部材がバッキングシート３０で支持される。クロマトグラフ媒体２２は、本発明のイムノクロマトアッセイ用メンブレン１０からなる。
図２に示されるように、イムノクロマトアッセイ用ストリップ２０は、細長な矩形状のクロマトグラフ媒体２２と、コンジュゲートパッド２６を介してクロマトグラフ媒体２２の一端に設けられたサンプルパッド２４と、クロマトグラフ媒体２２の他端に設けられた吸収パッド２８とを備え、これら部材がバッキングシート３０で支持される。クロマトグラフ媒体２２は、本発明のイムノクロマトアッセイ用メンブレン１０からなる。
サンプルパッド２４は、イムノクロマトアッセイに通常使用される多孔体や不織布であれば、任意の素材を用いて構成することができる。例えば、試料を吸収保持するグラスファイバーやセルロースからなる多孔体が、サンプルパッド２４に使用される。イムノクロマトアッセイを行う際には、サンプルパッド２４上にサンプルが滴下される。
コンジュゲートパッド２６は、グラスファイバーやセルロースからなる多孔体や不織布などから構成される。コンジュゲートパッド２６には、分析対象物質と結合する抗体に結合した標識物質が予め含有されている。コンジュゲートパッド２６内を分析対象物質が移動する際に抗体と結合して、標識化される。
吸収パッド２８は、展開液を吸収できる材質により構成され、従来のイムノクロマトアッセイで採用されている多孔体、不織布などを用いることができる。例えば、セルロース製の濾紙などにより吸収パッド２８を構成することができる。
バッキングシート３０は、クロマトグラフ媒体２２、サンプルパッド２４、コンジュゲートパッド２６、吸収パッド２８を支持するため、接着層を備えた任意の素材のシート状材料を使用することができる。例えば、ポリエステルやポリスチレンからなるシートを使用することができる。
以上のように構成されたイムノクロマトアッセイ用テストストリップ２０はそのまま、あるいは必要に応じてプラスチックで成形したハウジングに収容して使用することができる。
以上のように構成されたイムノクロマトアッセイ用テストストリップ２０はそのまま、あるいは必要に応じてプラスチックで成形したハウジングに収容して使用することができる。
イムノクロマトアッセイ用テストストリップ２０は、例えば、以下のような手法により作製することができる。
まず、所定の濃度に調整した標識粒子の分散液を準備し、緩衝液、抗体を加え、温度調整を行いながら一定時間撹拌して、標識粒子に抗体を吸着させる。一定時間撹拌後、さらにブロッキング剤を加え温度調整を行いながら一定時間撹拌することで、標識粒子のブロッキングを行う。ブロッキングとは、粒子単体、または抗体や抗原を担持させた粒子等をコーティングする操作である。ブロッキング剤としては、検査対象物質や検体またはそれを希釈する溶液の組成などに応じ様々なブロッキング剤を用いることができる。
カゼインは、標識粒子のブロッキングに特に好ましい。この場合、カゼインが、抗体を担持した標識粒子中の抗体及び標識粒子の表面をコーティングしている。抗体吸着とブロッキング後の標識粒子を洗浄するため、遠心分離を行い、余剰な抗体とブロッキング剤が含まれた上澄み液と沈降した粒子を分離し、上澄み液をデカンテーションにて除去する。沈降した粒子に緩衝液などの液体を加え、必要に応じ超音波などで分散処理を行う。この遠心分離による沈降、上澄みの除去、液体の添加という一連の操作による洗浄を必要回数行い、抗体吸着とブロッキングを行った粒子を所定の濃度含有した分散液を調製する。
得られた分散液に必要に応じタンパク質、界面活性剤、スクロースやトレハロースなどの糖を加え、得られた溶液をポリエチレン製のコンジュゲートパッドに一定量塗布し、乾燥させ、検出試薬含有部を調製する。また、再生セルロース連続長繊維不織布に必要に応じ緩衝液、界面活性剤、タンパク、検体試料中の夾雑物をトラップする試薬、防腐剤、抗菌剤、酸化防止剤、吸湿剤などを塗布し、乾燥させてサンプルパッドを調製する。さらに、所定の位置に抗体を固定化したニトロセルロース多孔膜製のクロマトグラフ媒体、検体を吸収するためのセルロース濾紙製の吸収パッドを調製する。
それらをバッキングシートと呼ばれる接着部位を有する台紙に固定化し、所定のサイズに裁断することでイムノクロマトアッセイ用テストストリップが得られる。
それらをバッキングシートと呼ばれる接着部位を有する台紙に固定化し、所定のサイズに裁断することでイムノクロマトアッセイ用テストストリップが得られる。
本発明のイムノクロマトアッセイ用テストストリップ２０を用いた検査方法について、以下に説明する。
本発明のイムノクロマトアッセイ用テストストリップ２０におけるクロマトグラフ媒体２２上には、分析対象物質と特異的に結合する物質、例えば抗体が固定化試薬として任意の位置に固定化された反応部位が形成される。固定化試薬は、物理的または化学的手段によって、クロマトグラフ媒体２２に直接的に固定化することができる。あるいは、固定化試薬をラテックス粒子などの微粒子に物理的または化学的に結合し、この微粒子をクロマトグラフ媒体２２に捕捉して間接的に固定化してもよい。
本発明のイムノクロマトアッセイ用テストストリップ２０におけるクロマトグラフ媒体２２上には、分析対象物質と特異的に結合する物質、例えば抗体が固定化試薬として任意の位置に固定化された反応部位が形成される。固定化試薬は、物理的または化学的手段によって、クロマトグラフ媒体２２に直接的に固定化することができる。あるいは、固定化試薬をラテックス粒子などの微粒子に物理的または化学的に結合し、この微粒子をクロマトグラフ媒体２２に捕捉して間接的に固定化してもよい。
固定化試薬を直接的に固定化するには、物理吸着を利用することができる。共有結合によって、固定化試薬をクロマトグラフ媒体２２に固定化してもよい。ニトロセルロースメンブレンの場合には、物理吸着を行うことができる。共有結合ではクロマトグラフ媒体２２の活性化には一般的に臭化シアン、グルタルアルデヒド、カルボジイミド等が用いられるが、いずれの方法も用いることができる。
間接的に固定化する方法としては、固定化試薬を結合させた不溶性微粒子を、クロマトグラフ媒体２２に固定化する方法が挙げられる。不溶性微粒子としては、クロマトグラフ媒体２２に捕捉されるが移動できないサイズのものを選択することができ、平均粒径５μｍ程度以下の微粒子が好ましい。このような粒子としては、抗原抗体反応に使用されるものが種々知られており、本発明でもこうした微粒子を使用することができる。
例えば、ポリスチレン、スチレン－ブタジエン共重合体、スチレン－メタクリル酸共重合体、ポリグリシジルメタクリレート、アクロレイン－エチレングリコールジメタクリレート共重合体などの乳化重合法によって得られる有機高分子ラテックス粒子などの有機高分子物質の微粒子、ゼラチン、ベントナイト、アガロース、架橋デキストランなどの微粒子、シリカ、シリカ－アルミナ、アルミナなどの無機酸化物や無機酸化物にシランカップリング処理などで官能基を導入した無機粒子等が挙げられる。
本発明においては、感度調整の容易さ等から直接固定化の方が好ましい。また、クロマトグラフ媒体２２への固定化試薬の固定化には、種々の方法を採用できる。例えば、マイクロシリンジ、調節ポンプ付きペン、インキ噴射印刷等、種々の技術が使用可能である。反応部位の形態としては特に限定されないが、円形のスポット、クロマトグラフ媒体２２の展開方向に直交して延びるライン、数字、文字、記号（＋，－など）等として固定化することもできる。
固定化試薬を固定化した後、非特異的な吸着により分析の精度が低下することを防止するため、必要に応じて、クロマトグラフ媒体２２に、公知の方法でブロッキング処理を行うことができる。一般にブロッキング処理は、ウシ血清アルブミン、スキムミルク、カゼイン、ゼラチン等の蛋白質が好適に用いられる。ブロッキング処理後、必要に応じて、Ｔｗｅｅｎ２０、ＴｒｉｔｏｎＸ－１００、ＳＤＳ等の界面活性剤を１つまたは２つ以上組み合わせて洗浄してもよい。
本発明で用いられる検出試薬は、分析対象物質と特異的に結合する物質、例えば抗体であり、標識物質により標識化される。イムノクロマトアッセイ法における検出試薬の標識には、一般に不溶性担体や酵素等の物質が使用されるが、標識物質としては、蛍光体を含有する不溶性担体や酵素等の蛍光標識物質が使用される。本発明においては、検出試薬を蛍光標識物質に感作することにより標識化した検出試薬を調製する。
蛍光標識物質は、分析対象物質の存在を高精度高感度に検出するのに適した標識物質であり、励起光の照射により発生する蛍光を標識として利用することができる。
不溶性担体としては、検査薬等の技術分野で用いられる有機ラテックス粒子や無機コロイド粒子などを用いることができる。粒子の材質は限定されないが、例えば、検査薬等の技術分野で抗体、抗原、リガンド、レセプター等のタンパク質を結合する固相担体の材料に用いられるものが挙げられる。有機ラテックス粒子としては、例えば、ポリスチレン、スチレン－アクリル酸共重合体などのスチレン共重合体、ポリカーボネート、ポリメチレンメタアクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリビニルトルエン、セルロース等からなる粒子が挙げられる。無機コロイド粒子としては、シリカナノ粒子等が挙げられる。
また、蛍光を発し得る物質からなる不溶性担体も用いることもできる。このような粒子として、例えば、ユウロピウム（Ｅｕ）、テルビウム（Ｔｂ）等の希土類元素が付活されたＭIＭIIＯ4またはＭIＡｌ5Ｏ12（ＭIはイットリウム（Ｙ）、ランタン（Ｌａ）またはガドリニウム（Ｇｄ）、ＭIIはニオブ（Ｎｂ）、リン（Ｐ）またはバナジウム（Ｖ））からなる粒子や例えば、ＣｄＳｅ、ＣｄＴｅ、ＩｎＰ、ＩｎＮ、ＩｎＡｓ、ＣｄＳ、Ｓｉ、Ｇｅからなる量子ドットが挙げられる。
蛍光標識物質に含有する蛍光体の種類は限定されず、検査薬等の分野で用いられているものを用いることができる。例えば、フルオレセイン（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）、ローダミン(ｒｈｏｄａｍｉｎｅ)、クマリン、Ｃｙ ｄｙe、Ａｌｅｘａ（登録商標） Ｆｌｕｏｒ、ＥｖｏＢｌｕｅ、オキサジン、Ｃａｒｂｏｐｙｒｏｎｉｎ、ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ、ｂｉｐｈｅｎｙｌ、ａｎｔｈｒａｃｅｎｅ、ｐｈｅｎｅｎｔｈｒｅｎｅ、ｐｙｒｅｎｅ、ｃａｒｂａｚｏｌｅ等を基本骨格として有する有機蛍光色素やその蛍光色素の誘導体が挙げられる。また、ユウロピウム（Ｅｕ3+)キレートやテルビウム（Ｔｂ3+)キレート等の希土類錯体も用いることができる。ユウロピウム（Ｅｕ3+)キレートとしてアミノ基を有するＡＴＢＴＡ－Ｅｕ3+等を用いることができる。さらに、Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＧＦＰ）等の蛍光タンパク質も用いることができる。
検出試薬を蛍光標識物質に感作する方法としては、物理吸着や化学結合などの公知の方法が使用できる。例えば、蛍光体を含む合成高分子よりなるラテックス粒子に抗体を感作した検出試薬は、ラテックス粒子表面に反応性基を表面修飾し、表面修飾ラテックス粒子が分散した溶液に抗体と架橋剤を加えて化学結合させた後、牛血清アルブミン溶液などを添加して抗体が未結合である粒子表面をブロッキングすることにより調製する。
実際のイムノクロマトアッセイ法の実施において、不溶性担体により標識化した検出試薬は、移動相を構成する展開液に分散して適用することができる。あるいは、固定相を構成するイムノクロマトアッセイ用テストストリップ２０における移動相の展開移動経路上、すなわち、イムノクロマトアッセイ用テストストリップ２０の移動相が適用される端部と反応部位との間の領域に、不溶性担体により標識化した検出試薬を存在させて適用することもできる。
イムノクロマトアッセイ用テストストリップ２０上に検出試薬を存在させる場合、検出試薬が展開液に速やかに溶解して毛管作用により自由に移動できるように、検出試薬を支持させるのが好ましい。検出試薬が感作された不溶性担体の再溶解性を高めるため、支持させる部位にサッカロース、マルトース、ラクトース等の糖類、マンニトール等の糖アルコールを添加して塗布しておくことができる。これらの物質を、支持させる部位に予めコーティングしておいてもよい。
検出試薬を塗布・乾燥等によりイムノクロマトアッセイ用テストストリップ２０上に存在させる際には、固定化試薬が固定化されたイムノクロマトアッセイ用テストストリップ２０に直接、塗布・乾燥等することができる。あるいは、別の多孔性物質、例えばセルロース濾紙、ガラス繊維濾紙、ナイロン不織布に、検出試薬を塗布・乾燥等して検出試薬保持部材を形成した後、固定化試薬が固定化されたイムノクロマトアッセイ用テストストリップ２０と毛管で繋がるように配置してもよい。
本発明の方法により検出される分析対象物質としては、それに特異的に結合する物質が存在するものであれば特に限定されず、例えば蛋白質、ペプチド、核酸、糖（特に糖タンパク質の糖部分、糖脂質の糖部分等）、複合糖質などが挙げられる。「特異的に結合する」とは、生体分子が持つ親和力に基づいて結合することを意味する。このような親和力に基づく結合としては、抗原と抗体との結合、糖とレクチンとの結合、ホルモンと受容体との結合、酵素と阻害剤との結合、相補的核酸同士及び核酸と核酸結合蛋白質との結合などが挙げられる。
したがって、分析対象物質が抗原性を有する場合、分析対象物質に特異的に結合する物質としてはポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を例示することができる。また、分析対象物質が糖の場合には、分析対象物質に特異的に結合する物質としてはレクチンタンパク質を例示することもできる。
具体的な被検出物質としては、例えば、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＨＥＲ２タンパク、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、ＣＡ１９－９、α－フェトプロテイン（ＡＦＰ）、免疫抑制酸性タンパク（ＩＰＡ）、ＣＡ１５－３、ＣＡ１２５、エストロゲンレセプター、プロゲステロンレセプター、便潜血、トロポニンＩ、トロポニンＴ、ＣＫ－ＭＢ、ＣＲＰ、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、梅毒抗体、インフルエンザウイルス、ヒトヘモグロビン、クラミジア抗原、Ａ群β溶連菌抗原、ＨＢｓ抗体、ＨＢｓ抗原、ロタウイルス、アデノウイルス、アルブミン、糖化アルブミン等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
分析対象物質を含む検体としては、例えば、生体試料、即ち、全血、血清、血漿、尿、唾液、喀痰、鼻腔または咽頭拭い液、髄液、羊水、乳頭分泌液、涙、汗、皮膚からの浸出液、組織や細胞及び便からの抽出液等の他、牛乳、卵、小麦、豆、牛肉、豚肉、鶏肉などやそれらを含む食品等の抽出液等が挙げられる。
本発明では、必要であれば展開液を用いても良い。展開液は、イムノクロマトアッセイ法において移動相を構成する液体であり、固定相であるイムノクロマトアッセイ用テストストリップ２０上を、被検出物質を含む試料及び標識化した検出試薬と共に移動する。このような展開液であれば、どのようなものであっても良い。
以下に実施例を挙げて、本発明を具体的に説明する。以下の実施例に示す材料、使用量、割合、処理手順等は、本発明の趣旨を逸脱しない限り適宜変更することができる。したがって、本発明の範囲は、以下に示す具体例により限定的に解釈されるべきではない。
イムノクロマトアッセイ用メンブレンを作製し、その物性を測定した。適用した測定方法は、以下のとおりである。
（厚さ）
イムノクロマトアッセイ用メンブレンの厚さは、接触式の膜厚計（株式会社ミツトヨ製）にて６点測定し、これを平均することで求めた。接触端子は底面が直径１ｃｍの円柱状の端子を用いた。測定力は０．４Ｎ以下とした。
イムノクロマトアッセイ用メンブレンの厚さは、接触式の膜厚計（株式会社ミツトヨ製）にて６点測定し、これを平均することで求めた。接触端子は底面が直径１ｃｍの円柱状の端子を用いた。測定力は０．４Ｎ以下とした。
（キャピラリーフロータイム）
以下の吸水試験により、イムノクロマトアッセイ用メンブレンのキャピラリーフロータイムを測定した。
以下の吸水試験により、イムノクロマトアッセイ用メンブレンのキャピラリーフロータイムを測定した。
幅１０ｍｍ、長さ５０ｍｍの試験片を切り出し、試験片の長さ方向の一方の端から水（純水）を毛細管現象により吸い上げ、４０ｍｍの高さまで水が吸い上がる時間測定した。試験片を６個準備し、それぞれについて吸水試験を実施し、キャピラリーフロータイムの平均値を求めた。
（蛍光量子収率）
イムノクロマトアッセイ用メンブレンの蛍光量子収率は浜松ホトニクス株式会社製Ｑｕａｎｔａｕｒｕｓ－ＱＹを用い、励起波長３６５ｎｍの蛍光量子収率を求めた。
イムノクロマトアッセイ用メンブレンの蛍光量子収率は浜松ホトニクス株式会社製Ｑｕａｎｔａｕｒｕｓ－ＱＹを用い、励起波長３６５ｎｍの蛍光量子収率を求めた。
（明度）
イムノクロマトアッセイ用メンブレンの表面を分光測色計（コニカミノルタジャパン株式会社製）にて、６ｍｍのターゲットマスクを使用して２点測定し、明度Ｌ*（Ｄ６５）の平均値を求めた。
イムノクロマトアッセイ用メンブレンの表面を分光測色計（コニカミノルタジャパン株式会社製）にて、６ｍｍのターゲットマスクを使用して２点測定し、明度Ｌ*（Ｄ６５）の平均値を求めた。
高分子フィルム支持体および多孔質メンブレンを組み合わせて、実施例および比較例のイムノクロマトアッセイ用メンブレンを作製した。
（実施例１）
ニトロセルロース樹脂４．６質量％、酢酸セルロース樹脂０．２質量％、アセトン４３．７質量％、プロパノール４６．１質量％、イソプロピルアルコール２．０質量％、及び水３．４質量％をタンクに収容し、攪拌して均一な製膜溶液とした。その後、温度を３３℃、相対湿度を５５％ＲＨに調節した雰囲気中にて、製膜溶液を３３℃に加熱した黒色色素含有ＰＥＴフィルム（厚さ：１００μｍ）上に流延し、溶媒を蒸発させて製膜溶液を凝固させた。その後、乾燥させてメンブレンを得た。
得られた多孔質メンブレンにドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウムを添加して、実施例１のイムノクロマトアッセイ用メンブレンを作製した。
ニトロセルロース樹脂４．６質量％、酢酸セルロース樹脂０．２質量％、アセトン４３．７質量％、プロパノール４６．１質量％、イソプロピルアルコール２．０質量％、及び水３．４質量％をタンクに収容し、攪拌して均一な製膜溶液とした。その後、温度を３３℃、相対湿度を５５％ＲＨに調節した雰囲気中にて、製膜溶液を３３℃に加熱した黒色色素含有ＰＥＴフィルム（厚さ：１００μｍ）上に流延し、溶媒を蒸発させて製膜溶液を凝固させた。その後、乾燥させてメンブレンを得た。
得られた多孔質メンブレンにドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウムを添加して、実施例１のイムノクロマトアッセイ用メンブレンを作製した。
（比較例１）
高分子フィルム支持体を無色透明（黒色色素を含有しない）ＰＥＴフィルム（厚さ：１００μｍ）に変更した以外は実施例１と同様にして、比較例１のイムノクロマトアッセイ用メンブレンを作製した。
高分子フィルム支持体を無色透明（黒色色素を含有しない）ＰＥＴフィルム（厚さ：１００μｍ）に変更した以外は実施例１と同様にして、比較例１のイムノクロマトアッセイ用メンブレンを作製した。
（実施例２～３、比較例２～３）
製膜溶液のアセトンを、黒色色素（Ｓａｖｉｎｙｌ Ｂｌａｃｋ ＲＬＳＮ）アセトン溶液に変更し、高分子フィルム支持体を無色透明（黒色色素を含有しない）ＰＥＴフィルム（厚さ：１００μｍ）に変更した以外は実施例１と同様にして、黒色色素を含有する多孔質メンブレンを作製した。多孔質メンブレン中の黒色色素濃度は、下記表１のとおりである。
各多孔質メンブレンに実施例１と同様にドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウムを添加して、実施例２～３、比較例２～３のイムノクロマトアッセイ用メンブレンを作製した。
製膜溶液のアセトンを、黒色色素（Ｓａｖｉｎｙｌ Ｂｌａｃｋ ＲＬＳＮ）アセトン溶液に変更し、高分子フィルム支持体を無色透明（黒色色素を含有しない）ＰＥＴフィルム（厚さ：１００μｍ）に変更した以外は実施例１と同様にして、黒色色素を含有する多孔質メンブレンを作製した。多孔質メンブレン中の黒色色素濃度は、下記表１のとおりである。
各多孔質メンブレンに実施例１と同様にドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウムを添加して、実施例２～３、比較例２～３のイムノクロマトアッセイ用メンブレンを作製した。
実施例および比較例のイムノクロマトアッセイ用メンブレンについて、上述した手法により物性を調べた。その結果を、各イムノクロマトアッセイ用メンブレンの構成とともに、下記表１にまとめる。
実施例１～３のイムノクロマトアッセイ用メンブレンは、高分子フィルム支持体または多孔質メンブレンとして自家蛍光低減材を備えている。このため、実施例１～３のイムノクロマトアッセイ用メンブレンは、励起波長３６５ｎｍにおける蛍光量子収率は、最大でも１２．４％であり、かつ明度Ｌ*（Ｄ６５）が６０％以上である。
一方、比較例１のイムノクロマトアッセイ用メンブレンは、自家蛍光低減材を備えていない。このため、励起波長３６５ｎｍにおける蛍光量子収率が１９％に達している。また、比較例２のイムノクロマトアッセイ用メンブレンは、励起波長３６５ｎｍにおける蛍光量子収率が１８％以上であり、比較例３のイムノクロマトアッセイ用メンブレンは、明度Ｌ*（Ｄ６５）が６０％未満である。
一方、比較例１のイムノクロマトアッセイ用メンブレンは、自家蛍光低減材を備えていない。このため、励起波長３６５ｎｍにおける蛍光量子収率が１９％に達している。また、比較例２のイムノクロマトアッセイ用メンブレンは、励起波長３６５ｎｍにおける蛍光量子収率が１８％以上であり、比較例３のイムノクロマトアッセイ用メンブレンは、明度Ｌ*（Ｄ６５）が６０％未満である。
前記実施例１～３および比較例１～３のイムノクロマトアッセイ用メンブレンを用いてイムノクロマトアッセイ用テストストリップを作製し、評価を行った。イムノクロマトアッセイ用テストストリップの分析対象物質は、インフルエンザ抗原とした。特に記載のない全ての操作は温度２３℃、相対湿度５５％ＲＨの環境下で行った。
まず、以下の手法により抗体感作標識粒子を調製した。
２－モルホリノエタンスルホン酸（以下、「ＭＥＳ」という、東京化成社製、Ｍ０６０６）、苛性ソーダ、純水を用いて、ｐＨ＝６．０、濃度が１００ｍＭのＭＥＳ緩衝液を調製した。得られたＭＥＳ緩衝液６９３．３μＬ、標識粒子２．７ｗｔ％分散液２６．７μＬ、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（以下、「ＥＤＣ」という、東京化成社製、Ｄ１６０１）の４．０ｗｔ％溶液９．０μＬ、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（以下、「ＮＨＳ」という、東京化成社製、Ｂ０２４９）の４．０ｗｔ％溶液１８．０μＬを容器に収容し、室温で静置した。
２－モルホリノエタンスルホン酸（以下、「ＭＥＳ」という、東京化成社製、Ｍ０６０６）、苛性ソーダ、純水を用いて、ｐＨ＝６．０、濃度が１００ｍＭのＭＥＳ緩衝液を調製した。得られたＭＥＳ緩衝液６９３．３μＬ、標識粒子２．７ｗｔ％分散液２６．７μＬ、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（以下、「ＥＤＣ」という、東京化成社製、Ｄ１６０１）の４．０ｗｔ％溶液９．０μＬ、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（以下、「ＮＨＳ」という、東京化成社製、Ｂ０２４９）の４．０ｗｔ％溶液１８．０μＬを容器に収容し、室温で静置した。
１５分後、遠心分離により上澄み液を除去して未反応のＥＤＣ、ＮＨＳを除去した。ＭＥＳ緩衝液７２０．０μＬを入れ、微粒子を分散させた後、標識粒子に対して１０．０ｗｔ％となるように抗インフルエンザウイルスＡ型抗体（バイオマトリックス研究所社製、ＢＭＲｉａ０４２）を添加し、３７℃で２時間反応させた。ここに、１．０ｗｔ％カゼイン（和光純薬工業社製、０３０－０１５０５）を含有するブロッキング溶液（１００ｍＭ ホウ酸緩衝液、ｐＨ＝８．５）８６４０．０μＬを添加し、３７℃の恒温機内で１時間静置した。１時間後、遠心分離機（クボタ商事社製、６２００）と遠心分離ローター（クボタ商事社製、ＡＦ－５００８Ｃ）を用い、２００００ｇの遠心を３０分間行い、抗体結合標識粒子を沈降させた後、上澄み液を廃棄した。
次いで、ホウ酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ＝１０．０）８６４０．０μＬを加え、超音波分散機（エスエムテー社製、ＵＨ－５０）で１０秒間処理し、抗体結合標識粒子を分散させた。十分に分散させた後、２００００ｇの遠心を２０分間行い、上澄み液を廃棄した。抗体結合標識粒子の濃度が０．０７６ｗｔ％となるようにホウ酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ＝１０．０）を添加し、超音波分散機により十分に分散させた。以上の方法により、抗体結合標識粒子（以下、「検出試薬」ともいう。）を得た。
［コンジュゲートパッドへの検出試薬の含浸と乾燥］
ポリエチレン製コンジュゲートパッド（Ｐａｌｌ社製、６６１３）を大過剰の０．０５重量％のＴｗｅｅｎ－２０（登録商標、シグマアルドリッチ社製、Ｔ２７００）に浸漬し、余分な液を取り除いた。５０℃で６０分乾燥させた後、高さ１０ｍｍ、長さ３００ｍｍの形状にカットした。次いで、マイクロピペットを用いて、検出試薬７９５μＬを均等に塗布し、３７℃で３０分乾燥させた。
ポリエチレン製コンジュゲートパッド（Ｐａｌｌ社製、６６１３）を大過剰の０．０５重量％のＴｗｅｅｎ－２０（登録商標、シグマアルドリッチ社製、Ｔ２７００）に浸漬し、余分な液を取り除いた。５０℃で６０分乾燥させた後、高さ１０ｍｍ、長さ３００ｍｍの形状にカットした。次いで、マイクロピペットを用いて、検出試薬７９５μＬを均等に塗布し、３７℃で３０分乾燥させた。
［サンプルパッドの前処理］
再生セルロース連続長繊維不織布（旭化成社製、Ｍｉｃｒｏｌｉｎｅ Ｓ－０６）を、６．０ｗｔ％のスキムミルク（富士フィルム和光純薬社製、１９０－１２８６５）と、１．０ｗｔ％のＢＳＡ（シグマアルドリッチ社製、Ａ７９０６）と、２．０ｗｔ％のＴｗｅｅｎ－２０とを含有する、大過剰のＰＢＳ緩衝液（６６ｍＭ、ｐＨ７．４）に含浸し、余分な液を取り除いた後、５０℃で１２０分乾燥させた。次いで、高さ２２ｍｍ、長さ２１０ｍｍの形状にカットした。
再生セルロース連続長繊維不織布（旭化成社製、Ｍｉｃｒｏｌｉｎｅ Ｓ－０６）を、６．０ｗｔ％のスキムミルク（富士フィルム和光純薬社製、１９０－１２８６５）と、１．０ｗｔ％のＢＳＡ（シグマアルドリッチ社製、Ａ７９０６）と、２．０ｗｔ％のＴｗｅｅｎ－２０とを含有する、大過剰のＰＢＳ緩衝液（６６ｍＭ、ｐＨ７．４）に含浸し、余分な液を取り除いた後、５０℃で１２０分乾燥させた。次いで、高さ２２ｍｍ、長さ２１０ｍｍの形状にカットした。
［捕捉抗体塗布メンブレンの調製］
前記実施例１～３および比較例１～３のイムノクロマトアッセイ用メンブレンを幅２５ｍｍ、長さ１５０ｍｍの形状にカットした。液体塗布装置（武蔵エンジニアリング社製、３００ＤＳ）を用い、０．１ｗｔ％抗インフルエンザウイルスＡ型抗体（バイオマトリックス研究所社製、ＢＭＲｉａ０４６）を含むＰＢＳ溶液（６６ｍＭ、ｐＨ７．４）を、０．１μＬ／ｍｍの割合で高さ１５ｍｍの部分に塗布した。次いで、５０℃で２４時間乾燥させた。
前記実施例１～３および比較例１～３のイムノクロマトアッセイ用メンブレンを幅２５ｍｍ、長さ１５０ｍｍの形状にカットした。液体塗布装置（武蔵エンジニアリング社製、３００ＤＳ）を用い、０．１ｗｔ％抗インフルエンザウイルスＡ型抗体（バイオマトリックス研究所社製、ＢＭＲｉａ０４６）を含むＰＢＳ溶液（６６ｍＭ、ｐＨ７．４）を、０．１μＬ／ｍｍの割合で高さ１５ｍｍの部分に塗布した。次いで、５０℃で２４時間乾燥させた。
［イムノクロマトアッセイ用テストストリップの調製］
バッキングカード（Ａｄｈｅｓｉｖｅｓ Ｒｅｓｅｒｃｈ社製、ＡＲ９０２０）に、上述のようにして得た捕捉抗体塗布メンブレン、吸収パッド（Ｐａｌｌ社製、６６２１１）、検出試薬を含有したコンジュゲートパッド、及びサンプルパッドを貼り合わせた。次いで、裁断機にて５ｍｍの幅にカットして、幅５ｍｍ、高さ６０ｍｍの実施例４～６および比較例４～６のイムノクロマトアッセイ用テストストリップを得た。
バッキングカード（Ａｄｈｅｓｉｖｅｓ Ｒｅｓｅｒｃｈ社製、ＡＲ９０２０）に、上述のようにして得た捕捉抗体塗布メンブレン、吸収パッド（Ｐａｌｌ社製、６６２１１）、検出試薬を含有したコンジュゲートパッド、及びサンプルパッドを貼り合わせた。次いで、裁断機にて５ｍｍの幅にカットして、幅５ｍｍ、高さ６０ｍｍの実施例４～６および比較例４～６のイムノクロマトアッセイ用テストストリップを得た。
実施例４～６および比較例４～６のイムノクロマトアッセイ用テストストリップを以下の方法により試験して、その性能を評価した。
（発色強度）
Ａ型インフルエンザＨ１Ｎ１亜型抗原（ＨｙＴｅｓｔ社製）を所定濃度になるように、２００ｍＭの塩化ナトリウム、１．５質量％のＴｒｉｔｏｎＸ－１００、０．５質量％のＴｗｅｅｎ－２０を含む２００ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．０）で希釈し、サンプルを調製した。抗原濃度は、０．０５μｇ／ｍＬおよび０．０２μｇ／ｍＬの２種類とした。サンプル１００μＬを 実施例４～６および比較例４～６のイムノクロマトアッセイ用テストストリップのサンプルパッドに滴下して展開させ、滴下１０分後に、励起光ピーク波長が３６５ｎｍ付近であるＬＥＤ光源（オプティクス・エフエー株式会社製ＯＰＤＲ－１１０－６０ＵＶ３７５Ｐ）を備えたリーダー（武蔵オプティカルシステム株式会社製）を用いて、励起光強度２５６／２５６においてデジタル写真を撮影した。
Ａ型インフルエンザＨ１Ｎ１亜型抗原（ＨｙＴｅｓｔ社製）を所定濃度になるように、２００ｍＭの塩化ナトリウム、１．５質量％のＴｒｉｔｏｎＸ－１００、０．５質量％のＴｗｅｅｎ－２０を含む２００ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．０）で希釈し、サンプルを調製した。抗原濃度は、０．０５μｇ／ｍＬおよび０．０２μｇ／ｍＬの２種類とした。サンプル１００μＬを 実施例４～６および比較例４～６のイムノクロマトアッセイ用テストストリップのサンプルパッドに滴下して展開させ、滴下１０分後に、励起光ピーク波長が３６５ｎｍ付近であるＬＥＤ光源（オプティクス・エフエー株式会社製ＯＰＤＲ－１１０－６０ＵＶ３７５Ｐ）を備えたリーダー（武蔵オプティカルシステム株式会社製）を用いて、励起光強度２５６／２５６においてデジタル写真を撮影した。
得られたデジタル写真を画像解析して、発色強度を求めた。具体的には、画像解析ソフトウェア（ＩｍａｇｅＪ、米国国立衛生研究所）を用いて、検出部を含む幅３ｍｍ×長さ１２．５ｍｍの領域を横軸が長さ方向位置、縦軸が０から２５５の輝度としてグラフ化した。検出部のピーク面積値を取得して、このピーク面積値を発色強度とした。解析結果を表２に示す。
前記実施例１～３のイムノクロマトアッセイ用メンブレンを使用した実施例４～６のイムノクロマトアッセイ用テストストリップでは、抗原濃度が０．０５μｇ／ｍＬおよび０．０２μｇ／ｍＬいずれの場合もピークが検出された。これに対し、前記比較例１のイムノクロマトアッセイ用メンブレンを使用した比較例４のイムノクロマトアッセイ用テストストリップでは抗原濃度０．０２μｇ／ｍＬでピークが検出されなかった。また、前記比較例２および比較例３のイムノクロマトアッセイ用メンブレンを使用した比較例５および比較例６のイムノクロマトアッセイ用テストストリップでは抗原濃度が０．０５μｇ／ｍＬおよび０．０２μｇ／ｍＬのいずれでもピークが検出されなかった。
本発明のイムノクロマトアッセイ用テストストリップは、高感度な検出が可能であることが確認された。
本発明のイムノクロマトアッセイ用テストストリップは、本発明のイムノクロマトアッセイ用メンブレンを用いることにより、多孔質メンブレンやバッキングシートからの自家蛍光によるバックグラウンドノイズを低減することができ、これにより、蛍光イムノクロマトアッセイ法における感度を向上させることができる。
１０…イムノクロマトアッセイ用メンブレン １２…高分子フィルム支持体
１４…多孔質メンブレン
２０…イムノクロマトアッセイ用テストストリップ ２２…クロマトグラフ媒体
２４…サンプルパッド ２６…コンジュゲートパッド ２８…吸収パッド
３０…バッキングシート
１４…多孔質メンブレン
２０…イムノクロマトアッセイ用テストストリップ ２２…クロマトグラフ媒体
２４…サンプルパッド ２６…コンジュゲートパッド ２８…吸収パッド
３０…バッキングシート
Claims (7)
- 高分子フィルム支持体と、前記高分子フィルム支持体上に積層された多孔質メンブレンとを備え、前記高分子フィルム支持体および前記多孔質メンブレンの少なくとも一方は、自家蛍光低減材からなることを特徴とするイムノクロマトアッセイ用メンブレン。
- 励起波長３６５ｎｍにおける蛍光量子収率が１８％以下、かつ明度Ｌ＊（Ｄ６５）が６０％以上であることを特徴とする請求項１記載のイムノクロマトアッセイ用メンブレン。
- 前記高分子フィルム支持体は、紫外光または可視光を吸収する色素を含有するフィルムからなる自家蛍光低減材である請求項１または２記載のイムノクロマトアッセイ用メンブレン。
- 前記高分子フィルム支持体の材質がポリエチレンテレフタレートである請求項１～３のいずれか１項に記載のイムノクロマトアッセイ用メンブレン。
- 前記多孔質メンブレンは、紫外光または可視光を吸収する色素を含有する自家蛍光低減材である請求項１～４のいずれか記載のイムノクロマトアッセイ用メンブレン。
- 請求項１～５のいずれか１項に記載のイムノクロマトアッセイ用メンブレンをクロマトグラフ媒体として備えるイムノクロマトアッセイ用テストストリップ。
- 検体中に含まれる分析対象物質の検査方法であって、
請求項６に記載のイムノクロマトアッセイ用テストストリップを用い、蛍光標識物質に検体を接触させることを含む検査方法。
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