JP2000028610A

JP2000028610A - 免疫学的検査方法および免疫学的検査キット

Info

Publication number: JP2000028610A
Application number: JP10192150A
Authority: JP
Inventors: Masaru Sato; 賢佐藤; Kenjiro Mori; 健二郎森
Original assignee: Nitto Denko Corp
Current assignee: Nitto Denko Corp
Priority date: 1998-07-07
Filing date: 1998-07-07
Publication date: 2000-01-28
Anticipated expiration: 2018-07-07
Also published as: JP3841558B2

Abstract

(57)【要約】【解決手段】吸水性基材上で、固定化された免疫化学
成分と標識された免疫化学的成分（第一標識体）とで検
査対象物をサンドイッチして形成される標識免疫複合体
に、第二の標識体が結合することによりシグナルを増幅
させる免疫クロマトグラフ法において、第一標識体と第
二標識体との結合が介在物質を介して達成されることを
特徴とする免疫学的検査方法、特に第二標識体を保持す
る標識相が吸水性基材に設けられていることを特徴とす
る当該方法、並びにそのためのキット。【効果】本発明の方法および本発明のキットの使用に
よれば、従来より高感度に被検試料中の検査対象物を検
出することが可能となる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、簡便、迅速に且つ
高精度、高感度で被検試料中の検査対象物の検出を行い
得る免疫学的検査方法およびそのためのキットに関す
る。より詳細には、本発明は検出シグナルを増幅させる
工程を含む免疫クロマトグラフ法に関する。

【０００２】

【従来の技術】生体試料等の免疫学的分析法において、
迅速且つ簡便にその検査を行う方法として免疫クロマト
グラフ法が挙げられる。この方法は、一般に以下のよう
な工程を含む。すなわち、検査対象物と特異的に結合し
得る抗体を固定化した固定相を有する吸水性基材からな
る検査片の一端より、該検査対象物に特異的に結合し得
る標識された抗体と被検液との混合物を吸収させて展開
すると、該混合物中で形成された標識抗体−検査対象物
複合体は固定化された抗体と結合して固定相上に捕捉さ
れる。したがって、該固定相に結合した標識抗体を測定
することにより被検液中の検査対象物を測定することが
できる。

【０００３】また、上記免疫クロマトグラフ法の検出シ
グナルをより高感度で得るための方法として、特開平１
０−０６２４１９号において、二種の標識抗体を用いる
方法が開示されている。つまり、検査対象物と特異的に
結合し得る抗体を標識した第一標識抗体と、該抗体に特
異的に結合し得る二次抗体を標識した第二標識抗体と
を、検査片中の被検試料滴下部と固定相（該検査対象物
と特異的に結合し得る別の抗体が固定化されている）の
間に標識相としてそれぞれ設置した（吸収させた）構成
である。試料中の検査対象物は、第一標識抗体と複合体
を形成した後、さらに第二標識抗体が第一標識抗体に結
合して（被検物−第一標識抗体−第二標識抗体）の複合
体を形成する。該免疫複合体は固定相上に固定化された
抗体により捕捉される。したがって、固定相上で第二標
識抗体により増幅させたシグナルが検出される。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、上記の
シグナル増幅免疫クロマトグラフ法によってもまだ十分
な検出感度が得られていないのが現状である。さらに、
被検試料が糞便、尿、血液等の場合、前処理として試料
を適当な緩衝液に懸濁する工程、および／または被検試
料中の夾雑物質を分離除去する部分精製工程等の付加的
な操作が必要となり、迅速性に欠けるといった問題点も
ある。したがって、本発明の目的は、免疫クロマトグラ
フ法に関し、より迅速に、且つ高感度で検査対象物を検
出することが可能な免疫学的検査方法およびそのための
キットを提供することである。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記の目
的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、検査対象物と特
異的に結合する第二の抗体とともに検査対象物とは結合
しない抗体を標識物質に結合して第一標識体とし、さら
にこの検査対象物とは結合しない抗体と介在物質を介し
て特異的に結合し得る免疫化学的成分（具体的には、例
えば、検査対象物とは結合しない抗体により認識される
抗原を介して結合する、該抗原を認識する抗体）に標識
物質を結合して第二標識体とし、これらを用いて免疫ク
ロマトグラフ法を行い、吸水性基材の固定相上におい
て、（固定化された抗体−検査対象物−第一標識体−介
在物質−第二標識体）の免疫複合体を形成させることに
より、固定相上での検出シグナルが従来よりも効率よく
増幅され、より高感度に検査対象物を検出できることを
見出した。特に、吸水性基材の被検試料滴下部と固定相
との間に、第二標識体を水との接触によって脱離可能な
形態で保持した標識相を設け、この吸水性基材に被検試
料、第一標識体および該介在物質を展開して免疫クロマ
トグラフ法を行うことにより、迅速且つ高感度に検査対
象物を検出することに成功した。また、被検試料を予め
吸水性基材の固定相と該固定相より標識相により近い方
の一端との間に供給し、該吸水性基材の該一端から第二
標識体および介在物質を展開させる（以下、被検試料、
第二標識体および介在物質を滴下する吸水性基材の一端
を、吸液部と称する場合もある）ことにより、被検試料
を希釈する前処理を省略できることを見出して、測定時
間を短縮することに成功した。さらに、吸液部と固定相
との間に、特に吸液部と標識相との間に、被検試料中の
検査対象物と他の物質とを分離するための分離相を設け
ることにより、被検試料の部分精製などの前処理を省略
でき、より迅速で、高精度且つ高感度の測定を行うこと
に成功して本発明を完成するに至った。

【０００６】すなわち、本発明は以下の通りである。１．吸水性基材の表面上の任意の領域に設けた固定相に
固定化された、検査対象物と特異的に結合し得る第一の
免疫化学的成分と、検査対象物と特異的に結合し得る第
二の免疫化学的成分および検査対象物とは結合しない第
三の免疫化学的成分に標識物質（特に着色粒子、就中、
着色されたラテックス粒子または金コロイド粒子）が結
合してなる標識体（第一標識体）とで、被検試料中の検
査対象物をサンドイッチした免疫複合体を該固定相上に
形成させて、固定相上の標識物質のシグナルを測定する
免疫学的検査方法であって、該第三の免疫化学的成分と
介在物質を介して特異的に結合し得る第四の免疫化学的
成分に標識物質（特に着色粒子、就中、着色されたラテ
ックス粒子または金コロイド粒子）が結合してなる標識
体（第二標識体）が、該介在物質を介して上記サンドイ
ッチ型免疫複合体中の第三の免疫化学的成分に結合した
免疫複合体を形成させて標識物質のシグナルを増幅する
ことを特徴とする方法。２．該吸水性基材の一端と固定相との間に、第一および
第二標識体の少なくとも１つが、水との接触によって脱
離し得る形態で保持される標識相が設けられていること
を特徴とする上記１の方法。３．該吸水性基材の一端と固定相との間に、第二標識体
が水との接触によって脱離し得る形態で保持される標識
相が設けられている上記２の方法であって、且つ以下の
工程を含むことを特徴とする方法： (1) 該吸水性基材の該一端から、被検試料を含有する
液、第一標識体を含有する液および該介在物質を含有す
る液の混合物を展開し、(2) 該吸水性基材上で形成され
る検査対象物、第一標識体、介在物質および第二標識体
からなる免疫複合体を固定相に固定化された第一の免疫
化学的成分に結合させて捕捉した後、(3) 該固定相上の
標識物質のシグナルを測定することにより該検査対象物
を検出する。４．該吸水性基材の一端と固定相との間に、第二標識体
が水との接触によって脱離し得る形態で保持される標識
相が設けられている上記２の方法であって、且つ以下の
工程を含むことを特徴とする方法： (1) 該吸水性基材の該一端と固定相との間の任意の領域
に被検試料を供給し、(2) 該吸水性基材の該一端から、
第一標識体を含有する液と該介在物質を含有する液との
混合物を展開し、(3) 該吸水性基材上で形成される検査
対象物、第一標識体、介在物質および第二標識体からな
る免疫複合体を固定相に固定化された第一の免疫化学的
成分に結合させて捕捉した後、(4) 該固定相上の標識物
質のシグナルを測定することにより該検査対象物を検出
する。５．該吸水性基材の該一端と該固定相との間の任意の領
域（但し、被検試料を該吸水性基材の該一端と固定相と
の間の任意の領域に供給する場合は、その領域を含めて
それより固定相側の領域）、特に該吸水性基材の該一端
と標識相との間の任意の領域に、検査対象物と被検試料
中の他の物質とを分離し得る分離相がさらに設けられて
いることを特徴とする上記３または４の方法。６．該介在物質が抗原抗体反応により第三および第四の
免疫化学的成分と特異的に結合する物質である上記１〜
５のいずれかの方法。７．検査対象物と特異的に結合し得る第一の免疫化学的
成分を固定化した固定相を表面上の任意の領域に設けた
吸水性基材、検査対象物と特異的に結合し得る第二の免
疫化学的成分および検査対象物とは結合しない第三の免
疫化学的成分に標識物質（特に着色粒子、就中、着色さ
れたラテックス粒子または金コロイド粒子）が結合して
なる標識体（第一標識体）、該第三の免疫化学的成分と
介在物質を介して特異的に結合し得る第四の免疫化学的
成分に標識物質（特に着色粒子、就中、着色されたラテ
ックス粒子または金コロイド粒子）が結合してなる標識
体（第二標識体）、並びに第三および第四の免疫化学的
成分の結合を仲介する介在物質を含む免疫学的検査キッ
ト。８．該吸水性基材の一端と固定相との間に、第一および
第二標識体の少なくとも１つが、水との接触によって脱
離し得る形態で保持される標識相が設けられていること
を特徴とする上記７のキット。９．該吸水性基材の一端と固定相との間に、第二標識体
が水との接触によって脱離し得る形態で保持される標識
相が設けられている上記７のキットであって、且つ以下
の（ａ）および（ｂ）の免疫学的検査方法に使用され得
ることを特徴とするキット：方法（ａ） (1) 該吸水性基材の該一端から、被検試料を含有する
液、第一標識体を含有する液および該介在物質を含有す
る液の混合物を展開し、(2) 該吸水性基材上で形成され
る検査対象物、第一標識体、介在物質および第二標識体
からなる免疫複合体を固定相に固定化された第一の免疫
化学的成分に結合させて捕捉した後、(3) 該固定相上の
標識物質のシグナルを測定することにより該検査対象物
を検出する。方法（ｂ） (1) 該吸水性基材の該一端と固定相との間の任意の領域
に被検試料を供給し、(2) 該吸水性基材の該一端から、
第一標識体を含有する液と、該介在物質を含有する液と
の混合物を展開し、(3) 該吸水性基材上で形成される検
査対象物、第一標識体、介在物質および第二標識体から
なる免疫複合体を固定相に固定化された第一の免疫化学
的成分に結合させて捕捉した後、(4) 該固定相上の標識
物質のシグナルを測定することにより該検査対象物を検
出する。１０．該吸水性基材の該一端と固定相との間の任意の領
域（但し、被検試料を該吸水性基材の該一端と固定相と
の間の任意の領域に供給する場合は、その領域を含めて
それより固定相側の領域）、特に該吸水性基材の該一端
と標識相との間の任意の領域に、検査対象物と被検試料
中の他の物質とを分離し得る分離相がさらに設けられて
いることを特徴とする上記９のキット。１１．該介在物質が抗原抗体反応により第三および第四
の免疫化学的成分と特異的に結合する物質である請求項
７〜１０のいずれのキット。

【０００７】

【発明の実施の形態】本発明の方法により検出され得る
検査対象物は、免疫化学的反応（すなわち抗原抗体反
応）により第一の免疫化学的成分および第二の免疫化学
的成分と結合してサンドイッチ免疫複合体を形成し得る
ものであれば特に制限されない。例えば、細菌（特に大
腸菌Ｏ−１５７、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌等の病
原性細菌）、放線菌、酵母、かび、ウイルス（特に、Ｈ
ＩＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ等）などの微生物もしくは表面抗
原等の該微生物の構成蛋白質、またはそれらに対する抗
体、あるいは腫瘍マーカー抗原などの生体試料中の抗原
性ペプチド等が挙げられる。

【０００８】本発明の方法において、固定相に固定化さ
れる第一の免疫化学的成分と、第一標識体として用いる
第二の免疫化学的成分は、いずれも抗原抗体反応により
検査対象物と特異的に結合し得る物質であれば特に制限
はない。検査対象物が抗原（例えば、蛋白質、ペプチ
ド、ハプテンなど）であれば、第一および第二の免疫化
学的成分は、該抗原と特異的に結合し得る抗体である。
該抗体はモノクローナル抗体であってもポリクローナル
抗体であってもよい。また本発明における抗体とは、検
査対象物との特異的親和性を保持する抗体の断片物、例
えばＨ鎖、Ｌ鎖、Ｆab、Ｆ(ab')₂、Ｖ_H、Ｖ_L等も含む
ものとする。一方、検査対象物が抗体である場合には、
第一および第二の免疫化学的成分は、該抗体と特異的に
結合し得る抗原もしくは該抗体を抗原として特異的に結
合し得る二次抗体である。第一の免疫化学的成分および
第二の免疫化学的成分は、検査対象物に応じてサンドイ
ッチ法などで用いられる自体公知のものを適宜選択すれ
ばよい。また、該免疫化学的成分が抗体であれば、単離
された検査対象物を感作抗原として、公知の抗体作製技
術を用いて調製することもできる。第一および第二の免
疫化学的成分がいずれも抗体の場合、第一の抗体および
第二の抗体は、同一のものであっても異なるものであっ
てもよい。また、異なる抗体としては、同一の抗原決定
基を認識する二種の抗体を用いることも、あるいは異な
る抗原決定基を認識する二種の抗体を用いることもでき
る。

【０００９】本発明において、第一標識体として用いる
第三の免疫化学的成分、および第二標識体として用いる
第四の免疫化学的成分は、介在物質を介して特異的に結
合し合える抗体（モノクローナル抗体であってもポリク
ローナル抗体であってもよい。また、Ｈ鎖、Ｌ鎖、Ｆa
b、Ｆ(ab')₂、Ｖ_H、Ｖ_L等の断片化された抗体であっ
てもよい）または抗原（例えば、蛋白質、ペプチド、ハ
プテンなど）であり、且つ検査対象物および固定化され
た第一の免疫化学的成分とは特異的親和性を有しないも
のである。好ましくは、これらの免疫化学的成分は、さ
らに第二の免疫化学的成分とも特異的親和性を有しない
ものである。

【００１０】第三および第四の免疫化学的成分の結合を
仲介する本発明の介在物質は、第三および第四の免疫化
学的成分に同時に結合して（第三の免疫化学的成分−介
在物質−第四の免疫化学的成分）の複合体を形成し得る
物質であれば特に限定されないが、好ましくは、抗原抗
体反応により第三および第四の免疫化学的成分と特異的
に結合し得る免疫化学的成分である。すなわち、第三の
免疫化学的成分が抗体であれば、介在物質は該抗体によ
り認識される抗原もしくは該抗体と特異的に結合し得る
二次抗体であり、第四の免疫化学的成分は該抗原と特異
的に結合し得る抗体もしくは該二次抗体により認識され
る抗原であることが好ましい。このとき、第三および第
四の免疫化学的成分がともに抗体であれば、それらは同
一の抗体であっても異なるものであってもよい。一方、
第三の免疫化学的成分が抗原であれば、介在物質は該抗
原と特異的に結合し得る抗体であり、第四の免疫化学的
成分は該抗体により認識される抗原もしくは該抗体と特
異的に結合し得る二次抗体である。第三および第四の免
疫化学的成分がともに抗原であれば、それらは同一の抗
原であっても、介在物質である抗体と交叉反応性のある
異なる抗原であってもよい。第三および第四の免疫化学
的成分、並びに介在物質は、サンドイッチ法等で用いら
れている公知のものを適宜選択して使用することができ
る。

【００１１】本発明において用いられる吸水性基材は、
検査対象物を含有する被検試料、例えば、食品から抽出
した溶液やその培養上清、血清や血液、尿、便、唾液
等、あるいはそれらを適当な希釈溶媒によって希釈して
なる希釈液、第一標識体、第二標識体および介在物質を
それぞれ含有する液を吸収できるものであれば特に限定
されない。本発明においては、被検試料中の検査対象物
が第一標識体や固定相に固定化された第一の免疫化学的
成分と十分な反応を行うための、並びに第一標識体が介
在物質を介して第二標識体と十分な反応を行うための時
間を確保できるような吸水性基材が好ましく用いられ
る。

【００１２】吸水性基材が吸水性に劣る場合には、後述
するように被検試料が固定相に到達するのに長時間を要
し、その結果、迅速な測定を行うことができない。一
方、吸水性基材の吸水性があまりに高すぎる場合には、
被検試料中の検査対象物が標識体や固定相の第一免疫化
学的成分と十分な反応を行うために必要な時間が不足す
るので、正確な測定を行うことが困難である。

【００１３】したがって、本発明における吸水性基材の
好ましい吸水性の程度は、５ｍｍ幅の短冊状に裁断した
吸水性基材の片端部を水に浸漬し、１分間経過後の吸水
距離が０．５〜５ｃｍ程度である。

【００１４】本発明の吸水性基材の好ましい具体例とし
ては、不織布、濾紙、ガラス繊維布、ガラスフィルタ
ー、ニトロセルロースフィルター、多孔質材料などが挙
げられる。これらの基材は適度な吸水速度を有するとと
もに、標識物質が着色粒子の場合、着色粒子が結合して
発色した際の目視確認性に優れるなどの利点を有するも
のである。

【００１５】また、これらの基材の吸水性を調整するた
めに、基材の表面に親水性重合体や界面活性剤を被覆
し、あるいは含浸させることもできる。さらに、本発明
においては吸水性基材として同一材料からなる基材を用
いてもよいし、あるいは異種の材料からなるものを任意
の接着手段によって接合して得られる連続した基材を用
いることもできる。

【００１６】本発明において、吸水性基材の形状は、被
検試料を展開できる形状であれば特に限定されるもので
はなく、例えば、矩形のシート状（片状）やロッド状な
どが好ましい。

【００１７】本発明において、固定相とは、検査対象物
と特異的に結合し得る第一の免疫化学的成分が吸水性基
材上に固定化された領域を意味する。第一の免疫化学的
成分を吸水性基材上に固定化する方法（固定化相の作製
方法）も特に限定されるものではないが、従来から知ら
れている物理吸着法や共有結合法によるのが好適であ
り、特に、該免疫化学的成分が基材から脱離しにくいと
いう点で共有結合法によるのが好ましい。吸水性基材が
上記共有結合法のための官能基を有しないときは、例え
ば適当な官能基を有する重合体を用いて基材を作製し、
吸水性基材の吸水性を阻害しない程度に付着させること
ができる。また、第一の免疫化学的成分および親水性重
合体を含む溶液を吸水性基材に塗布した後、上記親水性
重合体を凝固させる凝固溶剤に浸漬することで固定相を
作製することもできる。上記親水性重合体としては、ヒ
ドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアルコ
ール、ヒドロキシエチルセルロースなどが用いられる。
また、上記凝固溶剤としては、アセトン、エタノール、
メタノール、エーテルなどを用いることができる。

【００１８】本発明において、上記固定相と、吸水性基
材の一端の、被検試料含有液、第二標識体含有液、介在
物質含有液等の吸収が開始される部位（すなわち吸液
部）との間の距離は特に限定されないが好ましくは１〜
６ｃｍ、より好ましくは３〜４ｃｍ程度である。距離が
あまりに遠すぎると、固定相まで被検試料が到達しなか
ったり、検出シグナル感度が強すぎたり、あるいは測定
に時間がかかる等の問題を生じるおそれがある。一方、
距離が近すぎると固定相上に捕捉される標識物質が均一
ではなくまばらになったり、検出シグナル感度が低すぎ
るという問題を生じるおそれがある。

【００１９】吸液部としては、被検試料、標識体、並び
に介在物質をそれぞれ含有する液の吸水性基材への移動
を妨げるものでなければ特に限定されず、基材と兼用し
たものであっても、新たに不織布や織布等を該吸水性基
材に接着させたものであってもよい。本発明において、
検査対象物に特異的に結合し得る第一の免疫化学的成分
が固定化された固定相、並びに吸液部を有する吸水性基
材を、以下、本発明の免疫学的検査片または単に検査片
という場合もある。

【００２０】本発明の方法における第一標識体は、検査
対象物に特異的に結合し得る免疫化学的成分（第二の免
疫化学的成分）および検査対象物とは結合しない第三の
免疫化学的成分に標識物質を結合させたものであり、ま
た、第二標識体は、該第三の免疫化学的成分と介在物質
を介して特異的に結合し得る免疫化学的成分（第四の免
疫化学的成分）に標識物質を結合させたものである。こ
こで用いられる標識物質は、免疫化学的測定法において
常套的に使用されるいかなる標識物質であってもよく、
例えば着色粒子、酵素（アルカリホスファターゼ、ペル
オキシダーゼ等）、蛍光物質（ＦＩＴＣ、ローダミン
等）などが挙げられるが、効率のよい検出シグナルの増
幅を達成するためには、第一および第二標識体に使用さ
れる標識物質は同一のものであることが好ましい。本発
明の方法では、迅速な検出を行う意味で、標識物質とし
て着色粒子が好ましく使用される。着色粒子は肉眼で検
出可能なものであれば特に制限はなく、例えば、金、
銀、銅などの金属からなるコロイド粒子、スダンブルー
やスダンレッドIV、スダンIII 、オイルオレンジ、キニ
ザリングリーン等に代表される顔料や染料などでラテッ
クスを着色してなる着色ラテックスなどを用いることが
できる。目視確認性の点からは、金コロイドや青、赤、
緑もしくはオレンジ色に着色した着色ラテックスの使用
が好ましく、また、分散安定性や検査対象物の検出感度
の調節が容易であるなどの点を考慮すると、青色、赤色
等に着色された水分散型高分子重合体粒子からなる着色
ラテックスを使用することがさらに望ましい。

【００２１】着色粒子の粒径は、検出の際の発色がよく
且つ吸水性基材の吸水性を低下させない程度の該基材中
での移動性を有するものであれば特に制限はないが、保
存安定性や調製が容易であるなどの点から、好ましくは
０．０１〜５μｍ、より好ましくは０．０５〜３μｍの
範囲が例示される。粒径があまりに小さすぎると、１粒
子あたりの着色の程度が少ないので、固定相に結合して
も発色の程度が悪く目視確認性に劣るようになる。ま
た、粒径が大きすぎると、着色粒子わずかに凝集しただ
けで吸水性基材に目詰まりを起こして吸水性を低下させ
たり、非特異的発色を生じたりすることがある。

【００２２】第二および第三の免疫化学的成分の両方、
並びに第四の免疫化学的成分を、このような着色粒子で
標識する方法としては、従来公知の方法、例えば共有結
合法、物理的吸着法、イオン結合法等を使用することが
できるが、免疫化学的成分からの着色粒子の脱離がなく
安定であるという点から共有結合法がより好ましく用い
られる。

【００２３】本発明の方法において、被検試料中の複数
の検査対象物を検出するために、対応する複数の免疫化
学的成分をそれぞれ別の着色粒子で標識することができ
るが、この際に用いられる着色粒子は同一色であっても
異なる色であってもよい。同一色の着色粒子を用いる場
合、各検査対象物にそれぞれ特異的に結合し得る免疫化
学的成分を固定化した固定相を識別可能な程度に離して
設置することが望ましい。

【００２４】標識物質が酵素や蛍光物質の場合には、固
定相の標識物質の検出は、ＥＩＡや蛍光抗体法（ＦＩ
Ａ）で従来使用されている検出手段が適宜選択される。

【００２５】本発明において、標識相とは、吸水性基材
の吸液部と固定相との間に設けられた、第一標識体およ
び／または第二標識体を水との接触によって脱離し得る
形態で保持する領域を意味する。第一および第二標識体
の両方を保持する場合、第一標識体を保持する第一標識
相と第二標識体を保持する第二標識相を別個に作製して
も、あるいは第一および第二標識体を混合して１つの標
識相に保持してもよい。

【００２６】本発明の一態様においては、標識相は、第
二標識体のみを保持するものである。

【００２７】標識相の作製方法としては特に制限はない
が、例えば、標識体を含有する液を吸水性基材の吸液部
と固定相との間の任意の領域に塗布し、適当な条件下で
乾燥させる（例えば、凍結乾燥）方法が挙げられる。ま
た、水溶性重合体もしくはサッカロース溶液中に標識体
を分散させ、該分散液を吸水性基材上に塗布して同様に
乾燥させてもよい。この方法は、水溶性重合体またはサ
ッカロースが容易に水溶化し、標識体が速やかに基材か
ら脱離して被検試料中の検査対象物および／または介在
物質を介してもう一方の標識体と反応し得るとともに、
水溶性重合体やサッカロースの濃度を調整することによ
り吸水性基材の所定の領域に標識体を保持させるのに適
当な粘度を得ることができ、さらに乾燥に際して標識体
の凝集や変性を防ぎ、また乾燥後に標識体が吸水性基材
から脱離しにくいという点で有利である。

【００２８】上記水溶性重合体としては、例えば、ポリ
ビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリエチレ
ングリコール、セルロースエステル（例えば、メチルセ
ルロース、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロ
ース、カルボキシエチルセルロース、オキシエチルセル
ロース、シアンエチルセルロース等）、ゼラチンなどが
好ましく用いられる。

【００２９】第一標識体含有液、第二標識体含有液およ
び介在物質含有液は、標識体または介在物質を適当な分
散媒（溶媒）中に分散（溶解）させることにより調製さ
れる。標識体または介在物質を分散させる分散媒は、検
査対象物と第一標識体、第一標識体と介在物質および介
在物質と第二標識体の特異的結合反応を阻害しないもの
であれば特に制限はないが、好ましくは該抗原抗体反応
に適したｐＨおよび塩濃度の有する緩衝液、例えばリン
酸緩衝液、酢酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、トリス塩酸緩衝
液等を適宜選択して使用することができる。シグナル検
出時の各標識体濃度は０．００５〜５％、好ましくは
０．０１〜０．５％の範囲である。濃度があまりに低す
ぎると、固定相に結合する粒子数が少なく検出感度が悪
くなる。また、濃度が高すぎると、不経済なばかりでな
く過剰の標識物質が固定相以外に残留し、固定相のシグ
ナルを不明瞭にする等の問題を生じる。

【００３０】本発明の方法の好ましい一態様としては、
以下の方法が例示される。すなわち、吸水性基材の一端
（すなわち吸液部）から、被検試料を含有する液、第一
標識体を含有する液、並びに第三および第四の免疫化学
的成分の結合を仲介する介在物質を含有する液の混合物
（該混合物中で被検試料中の検査対象物が第一標識体中
の第二の免疫化学的成分と、また第一標識体中の第三の
免疫化学的成分が介在物質と特異的に結合して複合体を
形成する）を滴下して展開すると、該複合体は液の移動
とともに吸水性基材上を移動する。液が標識相に到達す
ると、そこに保持されていた第二標識体は水との接触に
よって標識相から脱離する。さらに、第二標識体中の第
四の免疫化学的成分が介在物質を介して第一標識体中の
第三の免疫化学的成分と結合して、さらに吸水性基材上
を移動する。そして、形成された免疫複合体は、固定相
に固定化された第一の免疫化学的成分と結合して固定相
上に捕捉される。このようにして、第一および第二標識
体を構成する標識物質が固定相上に集合、結合して検出
シグナルが増幅され、それによってより高感度に検査対
象物の存在を検出することが可能となる。

【００３１】本発明の方法の別の態様としては、上記の
方法において、被検試料を吸液部から滴下する代わり
に、吸液部と固定相との間に滴下または塗布した後、第
一標識体を含有する液と介在物質を含有する液との混合
物を吸液部に滴下して展開する方法が挙げられる。この
場合、該混合液が被検試料を滴下または塗布した領域に
達すると、被検試料中の検査対象物は、第一標識体と介
在物質との複合体と結合して吸水性基材上を移動する。
液が標識相に到達すると、そこに保持されていた第二標
識体は水との接触によって標識相から脱離する。さら
に、第二標識体中の第四の免疫化学的成分が介在物質を
介して第一標識体中の第三の免疫化学的成分と結合し
て、さらに吸水性基材上を移動する。そして、形成され
た免疫複合体は、固定相に固定化された第一の免疫化学
的成分と結合して固定相上に捕捉される。

【００３２】本発明の免疫学的検査用キットは、本発明
の免疫学的検査方法に好ましく用いることができる。該
キットは、少なくとも下記の内容を含むものである。 (a) 検査対象物と特異的に結合し得る第一の免疫化学的
成分を固定化した固定相を表面上の任意の領域に設けた
吸水性基材 (b) 検査対象物と特異的に結合し得る第二の免疫化学的
成分および検査対象物とは結合しない第三の免疫化学的
成分に標識物質が結合してなる標識体（第一標識体） (c) 該第三の免疫化学的成分と介在物質を介して特異的
に結合し得る第四の免疫化学的成分に標識物質が結合し
てなる標識体（第二標識体） (d) 第三および第四の免疫化学的成分の結合を仲介する
介在物質該吸水性基材、第一および第二標識体、並びに介在物質
の好ましい態様は、上記したような本発明の方法におい
て好ましく用いられるものである。

【００３３】本発明のキットに用いられる吸水性基材
は、好ましくは、その一端（すなわち吸液部）と固定相
との間の任意の領域に、第一および第二標識体の少なく
とも１つが水との接触によって脱離し得る形態で保持さ
れる標識相がさらに設けられたものである。特に、上記
した本発明の方法の好ましい態様において用いられる吸
水性基材は、吸液部と固定相の間の任意の領域に、第二
標識体が水との接触によって脱離し得る形態で保持され
る標識相がさらに設けられたものである。

【００３４】本発明のキットに用いられる吸水性基材の
さらに好ましい態様の１つとして、吸液部と固定相との
間の任意の領域（但し、被検試料を該吸水性基材の一端
と固定相との間の任意の領域に滴下または塗布する場合
はその領域を含めてそれより固定相側の領域）、特に吸
液部と標識相との間に、検査対象物と被検試料中の他の
物質とを分離し得る分離相をさらに設けたものが挙げら
れる。

【００３５】本発明において、分離相は、分離しようと
する方向の孔径が検査対象物、各標識体、並びに介在物
質よりも大きく、分離除去しようとする被検試料中の他
の物質よりも小さいことが望ましい。また、分離方向と
しては、標識体が吸水性基材上を展開する方向であって
も、あるいはその方向と垂直の方向であってもよく、さ
らに、検査対象物を被検試料中の他の物質から分離した
後は、該分離相を除去して後の測定を行ってもよい。

【００３６】分離相の材質としては、例えば、レーヨ
ン、ポリエステル等の不織布、濾紙、ガラス繊維布、ガ
ラスフィルター、ニトロセルロースフィルター、ポリス
ルホンフィルター、多孔質材料等が挙げられる。

【００３７】本発明のキットは、上記の内容物以外に、
本発明の免疫学的検査方法において好ましく使用され得
る付加的な内容物を含んでいてもよい。例えば、第一お
よび第二標識体、並びに介在物質を分散（溶解）させる
のに好ましく使用される上記の緩衝液などが挙げられ
る。

【００３８】

【実施例】以下に実施例を挙げて本発明をより詳細に説
明するが、これら実施例は本発明の範囲を何ら限定する
ものではない。

【００３９】実施例１免疫学的検査用キット構成物の作製（１）水分散型高分子重合体粒子からなる着色ラテック
スの作製スチレンモノマー５０ｇ、アクリル酸０．５ｇ、トリエ
チレングリコールジメタクリレート０．２ｇ、及び蒸留
水４４０ｇを窒素気流下で温度７５℃にて攪拌しなが
ら、これに過硫酸カリウム０．２５ｇを水１０ｇに溶解
した水溶液を加え、１０時間重合させて、平均粒子径
０．２２μｍの水分散型高分子重合体粒子の水分散液を
得た。この重合体粒子分散液をアルカリ、酸、蒸留水の
順序にて遠心洗浄した後、固形分濃度１０重量％に調整
した（担体粒子分散液）。スダンブルー０．２ｇをトル
エン２０ｍｌに溶解し、これにドデシル硫酸ナトリウム
０．２ｇ、及び蒸留水１００ｍｌを加え、超音波分散機
でこの混合液を乳化した。この液に上記担体粒子分散液
（固形分濃度１０重量％）３０ｍｌを加え、室温にて２
４時間攪拌した。この液をエバポレータにてトルエンを
除去した後、０．０１Ｍほう酸緩衝液（ｐＨ７．５）に
て遠心洗浄を行い、固形分濃度５重量％となるように調
整した。この液５０ｍｌに、１−エチル−３−（３−ジ
メチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩水溶液
（１０ｍｇ／ｍｌ）５ｍｌ、及び０．０３Ｍｍ−キシレ
ンジアミン水溶液５０ｍｌを加え、室温にて５時間反応
させた。この液を７５℃にて５時間加熱処理した後、前
記と同じ緩衝液にて遠心洗浄を行い、固形分濃度１重量
％となるように調整した（スダンブルー染色キシレンジ
アミンスペーサ化粒子分散液）。

【００４０】（２）第一標識体含有液の作製上記（１）で調製したスダンブルー染色キシレンジアミ
ンスペーサ化粒子分散液１０ｍｌにグルタルアルデヒド
水溶液（０．１ｍｇ／ｍｌ）１ｍｌを加え、室温にて２
時間反応させた後、前記と同じ緩衝液にて遠心洗浄し、
固形分濃度１重量％の分散液に調整した。この分散液１
０ｍｌに第三の免疫化学的成分として抗ヒトヘモグロビ
ン抗体（ウサギＩｇＧ，１０ｍｇ／ｍｌ）を１ｍｌ、第
二の免疫化学的成分として抗ヒトＨＢｓ抗体（ウサギＩ
ｇＧ，５ｍｇ／ｍｌ）を１ｍｌ、それぞれ加え、１０℃
にて２４時間攪拌した。これを前記と同じ緩衝液で遠心
洗浄し、固形分濃度１重量％となるように再分散させ、
共有結合で抗体を結合したスダンブルー染色粒子標識抗
ヒトヘモグロビン抗体−抗ヒトＨＢｓ抗体（第一標識
体）含有液を得た。

【００４１】（３）第二標識体含有液の作製上記（１）で調製したスダンブルー染色キシレンジアミ
ンスペーサ化粒子分散液１０ｍｌにグルタルアルデヒド
水溶液（０．１ｍｇ／ｍｌ）１ｍｌを加え、室温にて２
時間反応させた後、前記と同じ緩衝液にて遠心洗浄し、
固形分濃度１重量％の分散液に調整した。この分散液１
０ｍｌに、第四の免疫化学的成分として抗ヒトヘモグロ
ビン抗体（ウサギＩｇＧ，１０ｍｇ／ｍｌ）２ｍｌ、を
加え、１０℃にて２４時間攪拌した。これを前記と同じ
緩衝液で遠心洗浄し、固形分濃度１重量％となるように
再分散させ、共有結合で抗体を結合したスダンブルー染
色粒子標識抗ヒトヘモグロビン抗体（第二標識体）含有
液を得た。

【００４２】（４）免疫学的検査片の作製第一の免疫化学的成分として抗ヒトＨＢｓ抗体（ウサギ
ＩｇＧ）を、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）にて
希釈し、最終濃度１ｍｇ／ｍｌの水溶液に調整した。こ
の水溶液に、ニトロセルロースメンブランフィルター
（東洋ろ紙、５×１００ｍｍ）の一端から５０ｍｍ部位
に１０μｌ塗布した後、直ちに３７℃で１時間静置した
後、ニトロセルロースメンブランフィルターを取り出
し、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％Ｔｗｅｅｎ
２０の水溶液に１時間浸漬させた。その後、ニトロセル
ロースメンブランフィルターを取り出し、室温で３時間
静置し、抗ヒトＨＢｓ抗体を有するニトロセルロースメ
ンブランフィルターを得た。次に、上記の抗ヒトＨＢｓ
抗体固定化ニトロセルロースメンブランフィルターの試
験片の一端（吸液部）の近傍に血球分離相（東洋ろ紙Ｎ
ｏ．２、５×１０ｍｍ）を設け、固定相および血球分離
相を有するニトロセルロースメンブランフィルターから
なる検査片を得た。５重量％ポリビニルピロリドン（粘
度平均分子量２５０００）水溶液１ｍｌに、実施例１の
（３）で作製した第二標識体含有液０．１ｍｌを加えて
十分混合した後、この溶液１０μｌを上記検査片の固定
相の位置から２０〜３０ｍｍの位置に塗布し、これをデ
シケーター内で２日間乾燥して、標識相を設けた免疫学
的検査片を得た。

【００４３】実施例２免疫学的検査用キットによるヒ
トＨＢｓ抗原の検出実施例１の（４）で作製した検査片の血球分離相に、ヒ
トＨＢｓ抗原を生理食塩水溶液に溶解させた被検液１０
μｌを滴下した。その後、直ちにヘモグロビン抗原溶液
（蛋白質濃度２００ｎｇ／ｍｌ）および実施例１の
（２）で作製した第一標識体含有液（固形分濃度０．２
重量％）の混合液１００μｌを吸液部に滴下して展開し
た（図１Ａ）。１０分後の固定相上での発色を目視観察
した（図１Ｂ）。その結果を表１に示す。

【００４４】

【表１】

【００４５】比較例実施例１の（２）で調製した第一標識体だけを用い、第
二標識体および介在物質であるヘモグロビン抗原を用い
ない以外は実施例２と同様にヒトＨＢｓ抗原の測定を行
った。すなわち、実施例１の（４）で作製した検査片の
血球分離相に、ヒトＨＢｓ抗原を生理食塩水溶液に溶解
させた被検液１０μｌを滴下した後、直ちに第一標識体
含有液（固形分濃度０．２重量％）５０μｌを吸液部に
滴下して展開し、１０分後の固定相での発色を目視観察
した。その結果を表２に示す。

【００４６】

【表２】

【００４７】

【発明の効果】本発明の方法（および本発明のキットの
使用）は、シグナルを増幅する工程を含む免疫クロマト
グラフ法において、介在物質を介して第一標識体と第二
標識体を結合させることにより、従来より効率よく検出
シグナルを増幅させることができる。また、本発明の方
法の好ましい態様においては、便や血液等の検査におい
て従来必要とされた被検試料の前処理の工程を省略する
ことができるので、より迅速に検査対象物を測定するこ
とが可能となる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の免疫学的検査キットを用いたヒトＨＢ
ｓ抗原の測定の各工程における抗原抗体反応の様子を示
す模式図である。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】吸水性基材の表面上の任意の領域に設け
た固定相に固定化された、検査対象物と特異的に結合し
得る第一の免疫化学的成分と、検査対象物と特異的に結
合し得る第二の免疫化学的成分および検査対象物とは結
合しない第三の免疫化学的成分に標識物質が結合してな
る標識体（第一標識体）とで、被検試料中の検査対象物
をサンドイッチした免疫複合体を該固定相上に形成させ
て、固定相上の標識物質のシグナルを測定する免疫学的
検査方法であって、該第三の免疫化学的成分と介在物質
を介して特異的に結合し得る第四の免疫化学的成分に標
識物質が結合してなる標識体（第二標識体）が、該介在
物質を介して上記サンドイッチ型免疫複合体中の第三の
免疫化学的成分に結合した免疫複合体を形成させて標識
物質のシグナルを増幅することを特徴とする方法。
【請求項２】該吸水性基材の一端と固定相との間に、
第一および第二標識体の少なくとも１つが、水との接触
によって脱離し得る形態で保持される標識相が設けられ
ていることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】該吸水性基材の一端と固定相との間に、
第二標識体が水との接触によって脱離し得る形態で保持
される標識相が設けられている請求項２記載の方法であ
って、且つ以下の工程を含むことを特徴とする方法： (1) 該吸水性基材の該一端から、被検試料を含有する
液、第一標識体を含有する液および該介在物質を含有す
る液の混合物を展開し、 (2) 該吸水性基材上で形成される検査対象物、第一標識
体、介在物質および第二標識体からなる免疫複合体を固
定相に固定化された第一の免疫化学的成分に結合させて
捕捉した後、 (3) 該固定相上の標識物質のシグナルを測定することに
より該検査対象物を検出する。
【請求項４】該吸水性基材の一端と固定相との間に、
第二標識体が水との接触によって脱離し得る形態で保持
される標識相が設けられている請求項２記載の方法であ
って、且つ以下の工程を含むことを特徴とする方法： (1) 該吸水性基材の該一端と固定相との間の任意の領域
に被検試料を供給し、 (2) 該吸水性基材の該一端から、第一標識体を含有する
液と該介在物質を含有する液との混合物を展開し、 (3) 該吸水性基材上で形成される検査対象物、第一標識
体、介在物質および第二標識体からなる免疫複合体を固
定相に固定化された第一の免疫化学的成分に結合させて
捕捉した後、 (4) 該固定相上の標識物質のシグナルを測定することに
より該検査対象物を検出する。
【請求項５】該吸水性基材の該一端と該固定相との間
の任意の領域（但し、被検試料を該吸水性基材の該一端
と固定相との間の任意の領域に供給する場合は、その領
域を含めてそれより固定相側の領域）に、検査対象物と
被検試料中の他の物質とを分離し得る分離相がさらに設
けられていることを特徴とする請求項３または４記載の
方法。
【請求項６】該分離相が、該吸水性基材の該一端と標
識相との間の任意の領域に存在する請求項５記載の方
法。
【請求項７】該介在物質が抗原抗体反応により第三お
よび第四の免疫化学的成分と特異的に結合する物質であ
る請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】該標識物質が着色粒子である請求項１〜
７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】該着色粒子が着色されたラテックス粒子
または金コロイド粒子である請求項８記載の方法。
【請求項１０】検査対象物と特異的に結合し得る第一
の免疫化学的成分を固定化した固定相を表面上の任意の
領域に設けた吸水性基材、検査対象物と特異的に結合し
得る第二の免疫化学的成分および検査対象物とは結合し
ない第三の免疫化学的成分に標識物質が結合してなる標
識体（第一標識体）、該第三の免疫化学的成分と介在物
質を介して特異的に結合し得る第四の免疫化学的成分に
標識物質が結合してなる標識体（第二標識体）、並びに
第三および第四の免疫化学的成分の結合を仲介する介在
物質を含む免疫学的検査キット。
【請求項１１】該吸水性基材の一端と固定相との間
に、第一および第二標識体の少なくとも１つが、水との
接触によって脱離し得る形態で保持される標識相が設け
られていることを特徴とする請求項１０記載のキット。
【請求項１２】該吸水性基材の一端と固定相との間
に、第二標識体が水との接触によって脱離し得る形態で
保持される標識相が設けられている請求項１１記載のキ
ットであって、且つ以下の（ａ）および（ｂ）の免疫学
的検査方法に使用され得ることを特徴とするキット：方法（ａ） (1) 該吸水性基材の該一端から、被検試料を含有する
液、第一標識体を含有する液および該介在物質を含有す
る液の混合物を展開し、 (2) 該吸水性基材上で形成される検査対象物、第一標識
体、介在物質および第二標識体からなる免疫複合体を固
定相に固定化された第一の免疫化学的成分に結合させて
捕捉した後、 (3) 該固定相上の標識物質のシグナルを測定することに
より該検査対象物を検出する。方法（ｂ） (1) 該吸水性基材の該一端と固定相との間の任意の領域
に被検試料を供給し、 (2) 該吸水性基材の該一端から、第一標識体を含有する
液と、該介在物質を含有する液との混合物を展開し、 (3) 該吸水性基材上で形成される検査対象物、第一標識
体、介在物質および第二標識体からなる免疫複合体を固
定相に固定化された第一の免疫化学的成分に結合させて
捕捉した後、 (4) 該固定相上の標識物質のシグナルを測定することに
より該検査対象物を検出する。
【請求項１３】該吸水性基材の該一端と固定相との間
の任意の領域（但し、被検試料を該吸水性基材の該一端
と固定相との間の任意の領域に供給する場合は、その領
域を含めてそれより固定相側の領域）に、検査対象物と
被検試料中の他の物質とを分離し得る分離相がさらに設
けられていることを特徴とする請求項１２記載のキッ
ト。
【請求項１４】該分離相が、該吸水性基材の該一端と
標識相との間の任意の領域に存在する請求項１３記載の
キット。
【請求項１５】該介在物質が抗原抗体反応により第三
および第四の免疫化学的成分と特異的に結合する物質で
ある請求項１０〜１４のいずれかに記載のキット。
【請求項１６】該標識物質が着色粒子である請求項１
０〜１５のいずれかに記載のキット。
【請求項１７】該着色粒子が着色されたラテックス粒
子または金コロイド粒子である請求項１６記載のキッ
ト。