KR100804202B1 - 크로마토그래피 측정 시스템 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 표지화된 특이적 결합 파트너는 저장소 영역 및 적어도 하나의 화학적 성분이 고정된 흡수막 위의 지역에 흡수되는 적어도 하나의 저장소 영역과 흡수막을 가진 분석물질 검출 장치에 관한 것이다.
크로마토그래피 측정 시스템, 분석물질 검출 장치

Description

크로마토그래피 측정 시스템{Chromatographic assay system}
본 발명은 분자, 특히 생체분자의 고감도 검출 분야에 관한 것이다. 본 발명은 또한 형광 표지의 용도에 관한 것이다.
매우 복잡한 샘플 내에 극미량의 특정 화합물들 측정하기 위해 고감도 면역측정법이 개발되어 임상 진단에 사용된다. 비록 측정법의 민감도, 신뢰성, 신속성, 단순성 및 비용은 점진적으로 개량되고 있지만, 개량이 여전히 필요하고 가능하다(햄플 제이(Hample J) 등., Upconverting phosphor reporters in chromatographic assay. Analytical Biochemistry, 2001;288, 176-187; 엉거 엠(Unger M) 등., Single-molecule fluorescence observed with mercury lamp illumination. Biotechniques 1999;27:1008-1014; 및 웨이스 에스(Weiss S). Fluorescence spectroscopy of single biomolecules. Science 1999;283:1676-1683). 소형화, 다중분석법을 지향하는 현 추세는 면역측정기술에 대한 도전과 필요를 불러일으켰다(테일러 제이알(Taylar JR) 등., Probing specific sequences of single DNA molecules with bioconjugated fluorescent nanoparticles. Anal chem 2000;72:1979-1986; 및 질만스(Zijlmans) 등, Detection of cell and tissue surface antigens using up-converting phosphors: a new reporter technology. Anal Biochem 1999; 267:30-36). 새로운 표지 기술에 대한 관심은 특별히 증가됐는데, 이는 통상적으로 사용된 직접 또는 효소-증폭 방사선, 비색, 발광 또는 형광 지시자(reporter)가 특이적 활성, 크기, 비독성, 비용, 안정성, 국소화 및 검출을 포함하는 이상적인 표지를 위한 모든 필요조건들을 충족시키지 못하기 때문이다. 형광발색단과 같은 직접 검출가능한 표지는 민감도가 제한되고 효소-증폭 또는 분리-향상법은 공간 정보를 상실한다.
최근에, 양자점, 발광 무기 결정, 업-컨버팅(up-converting) 형광체, 형광 나노입자 및 플라즈몬 공명 입자와 같은 고특이적 활성 미립자 표지를 기초로 한 새로운 검출법이 임상 진단 및 생물학적, 유전학적 및 약학적 연구에 대한 장래의 요구에 부응하기 위해 도입되었다. 마이크로미터 이하의 크기의 표지들은 핵산 프로브, 리셉터, 렉틴, 효소 및 항체와 같은 특이적 결합 시약(binding reagent)과 결합하여, 현재 사용가능한 최고의 표지와 동등하거나 더 우수한 감도를 가지고 특이적 분자들을 검출한다. 큰 분자 크기와 명백한 입체 장애(steric problem)에도 불구하고, 이런 특별한 표지들은 고체상 면역측정법에서 성공적으로 사용되고 있다. 그러나, 입자-단백질 바이오접합체(bioconjugate)의 생산, 콜로이드 안정성 및 비특이적 결합은 더 개선이 필요하다고 인식되고 있다.
시간 분해 형광법과 란탄족 표지는 면역측정법을 위해 20년 전에 도입되었다. 그 이후에, 분해-향상 란탄족 형광면역측정(Dissociation Enhanced Lanthanide FluoroImmunoAssay(DELFIA®) 기술은 가장 민감하고 신뢰할 수 있는 면역측정 플랫폼의 하나로 알려져 왔다. 고유발광성이고, 불활성이며, 안전한 란탄족 킬레이트 및 주머니형 화합물(cryptate) 표지에 대한 연구는 일상적인 임상 진단에 도입될 것으로 예상되는 신규한 동형 및 이형 측정법의 개발로 이어졌다. 또한, 유로퓸(III), 테르븀(III), 사마륨(III) 및 디스프로슘(III)의 장수명 형광을 증폭시키는 란탄족 공동형광을 기초로 한 최신 분해-향상 기술이 알려져 있다. 란탄족 킬레이트 형광의 독특한 특징인 다중 표지화에 의한 자가-소광 효과의 부재로 인해 이들은 염색된 라텍스 나노입자와 같은 고밀도 클러스터 표지에 이상적이고 적합하다. DELFIA 기술에 사용된 고형광 킬레이트는 형광 란탄족(III) 킬레이트 나노입자에 사용될 수 있는데, 이는 라텍스 내부의 소수성 환경이 형광 킬레이트를 용매 소광과 같은 환경의 영향으로부터 보호하고 반응속도론적으로 약한 착물을 안정화시키기 때문이다. 네 개의 란탄족 모두에 대해 적절하게 킬레이트를 적용시키면, 매우 낮은 검출 한계와 직접 표면 판독 측정으로 나노입자-기초, 4중(quadruple)-표지화 기술을 가능하게 할 수 있다.
통상적인 형광물질을 사용하는 샘플에서 낮은 수준의 표적 마커 검출은, 특이적 형광 신호는 낮고 주로 비특이적 신호가 혼합되기 때문에 때때로 어렵고 에러가 발생된다. 또한, 표본에서 발생된 자가형광은 간섭을 일으킬 수 있다. 란탄족 원소-예를 들어, 유로퓸(EU)-의 착물 킬레이트의 형광 반감기는 통상적인 형광 표지보다 6배 길다. 결과적으로, 란탄족 킬레이트로부터의 방출은 적절한 딜레이, 카운팅 및 사이클 횟수를 통해 시간 분해 형광분석기를 사용하여 백그라운드 형광(짧은 소멸 반감기)과 구별될 수 있다. 이 독특한 염료는 발광이 일반적으로 50ns 미만의 소멸 시간을 갖는 통상적인 형광 프로브 또는 자가형광 샘플의 소멸 시간보다 더 긴 500㎲ 초과의 소멸 시간을 갖게 한다. 따라서, 시간 분해 형광법은 자가형광을 실제로 제거할 수 있다.
이런 유로퓸 발광 염료는 여기피크(~365nm)와 잘 분리되는 장파장 방출(~610nm)을 특징으로 한다. 이렇게 특이하게 큰 스톡스 이동(Stokes shift)은 원하는 형광 신호를 효과적으로 분리하는 필터를 조합해서 사용할 수 있게 한다(하마(Harma) 등., Europium nanoparticles and time-resolved fluorescence of ultrasensitive detection of prostate-specific antigen. 2001;47:561-568). DELFIA 시스템에서, 란탄족 이온들은 킬레이트 구조로부터 형광 강화 용액 속으로 분해된다. 이런 추가의 개량 단계는 소광수(quenching water)를 효과적으로 제거하고 에너지를 란탄족 이온들에 더 전달하는 에너지 흡수 킬레이트 화합물을 포함하는 환경을 제공하는 것이 필요하다. 란탄족 형광체는 물-보호 결정 구조 때문에 어떤 강화 단계 없이 바로 검출될 수 있다. 란탄족 형광체 사용의 단점은 흡수한 에너지를 란탄족 이온에 효과적으로 전달하는 광흡수 그룹이 없다는 것이다. 프랭크와 선드버그는 1970대 후반에 이런 특성들을 라텍스 입자에 혼합하여, 매우 높은 특이적 활성을 가진 형광 입자를 제조할 수 있다는 것을 알았다. 이들은 소광 효과를 갖지 않으나 입자 내에 광흡수 그룹을 가진 입자를 제공하는 트라이-n-옥틸포스핀 산화물과 착화된 테오닐트라이플루오르아세테이트 란탄족 킬레이트(트라이-n-옥틸포스핀 산화물과 착화된 DELFIA 기술에서 나프토닐트라이플루오르아세톤)를 함유하는 라텍스 입자를 제조하였다. 폴리머 덮개는 소수성 환경을 만듦으로써 킬레이트의 주변으로부터 형광-소광수를 효과적으로 제거한다. 매우 민감한 측정법은 이런 입자 표지를 사용하여 수행할 수 있다(하르마(Harma) 등., 2001, 소우카(Soukka) 등., 2001a). 이런 나노크기 폴리머 표지는 β-다이케톤에 의해 포획된 30,000-2,000,000개의 유로퓸 분자를 함유하는데, 이들은 공지된 란탄족 킬레이트의 가장 높은 양자수율 중 하나를 가진다(하마(Harma) 등., Europium nanoparticles and time-resolved fluorescence of ultrasensitive detection of prostate-specific antigen. 2001;47:561-568). 이런 캡슐화는 형광 효율에 나쁜 영향을 미치지 않는다. 100nm 크기의 유로퓸 입자의 경우, 형광 수율은 플루오레신 분자 약 3,000개와 동일하다. 피코빌리프로틴 B-PE(공지된 것 중 가장 형광성인 물질)은 플루오레신 분자 약 30개와 동일한 형광 수율을 가진다. 100nm 입자는 피코빌린프로틴 B-PE의 지름의 약 10배이고 부피/질량이 1000배 이상이기 때문에, 유로퓸 입자들은 몰을 기준으로 B-PE보다 100배 더 형광성을 나타낸다. 큰 형광성, 넓은 스토크 이동 및 장수명의 발광 때문에 이 입자는 측정법에 초민감도를 제공할 것이다. 캡슐화: 단일 입자 내에 30,000-2,000,000개의 유로퓸 분자.
본 발명은 측면 흐름 측정법의 바람직한 태양을 지속하는 동안 향상된 감도를 보장하며, 측면 흐름 측정법에 사용되는 시간-분해 형광 염료를 포함하나, 이에 한정되지 않는 고감도 측정 시스템에 관한 것이다.
한 태양에서, 본 발명은 고민감성 유로퓸 입자를 표지로 사용하는 크로마토그래피 검사 시스템에 관한 것이다. 크로마토그래피 측정법은 알맞은 민감도로 편리하게(대부분 한 단계) 빠른 결과를 얻을 수 있다. 다른 태양에서, 본 발명은 민감성 핵산 검출 장치 및 이의 시스템에 관한 것이다. 매트릭스 속에 혼합된 형광 희토류 킬레이트의 사용은 고감도 측정법을 제공한다.
다른 태양에서, 본 발명은 비중합효소 연쇄 반응, 또는 중합효소 연쇄 반응 핵산-기초법을 통해 RNA 바이러스, DNA 바이러스, 세포 성분의 RNA 또는 DNA와 같은 분석물질의 존재를 위한 유전물질 검출 시스템에 관한 것이다. 이 검출 시스템은 사용이 빠르고, 편리하며 고민감도와 특이성을 가진다.
본 발명의 장점은 다음과 같다:
본 시스템은 매우 민감하여, 분석물질의 검출에 필수적이다.
본 발명의 생성물은 온-사이트(on-site)에서 사용할 수 있어서, 샘플을 오프-사이트(off-site) 장소로 이동할 할 필요가 감소한다.
본 발명의 제품으로 샘플을 제조한 후 약 15분 내에 긍정적인 결과를 즉각적으로 알리는 것이 가능하다. 본 발명의 시스템의 장점들 중 하나는 검출 시스템의 신속성이지만, 본 발명은 결과를 얻는 특정한 시간에 한정되지 않는다. 결과는 여러 조건에 따라 대략 20분, 30분, 40분 또는 더 긴 시간 후에 얻을 수 있다.
상기 원-스텝 방법에 따른 측정법은 수행하기 쉽고 검사 결과가 15분 내외에 판독되며 더 이상의 추가 단계가 필요하지 않다.
본 발명의 제품은 높은 교육이나 전문 기술이 없이 개인이 수행할 수 있다.
본 발명의 제품은 실온에서 저장할 수 있으나 다른 상업용 제품은 일반적으로 냉장이 필요하다.
본 발명의 다른 태양에서, 본 발명은 1) 공정이 단순하고, 2) 현장에서 사용할 수 있으며, 3) 안정한 시약을 사용할 수 있고, 4) 특별한 저장이 필요 없고, 5) 결과가 빠르기 때문에 다양한 분석물질의 현장 검사 또는 검사의 다양한 환경에 사용될 수 있다.
본 발명은 적어도 하나의 저장소 및 흡수막을 가진 분석물질 검출 장치에 관한 것이고, 표지화된 특이적 결합 파트너는 저장소 영역; 및 적어도 하나의 화학 성분이 고정된 흡수막 위의 지역에 흡수된다. 장치에 사용될 때, 표지는 희토류 킬레이트, 특히 란탄족(III) 킬레이트일 수 있고, 구체적으로 표지는 유로퓸(III), 테리븀(III), 사마륨(III) 또는 디스프로슘(III) 또는 이의 조합일 수 있다.
장치에서, 분석물질은 제한 없이 항원, 항체, 핵산 또는 하프텐일 수 있다. 특이적 결합 파트너는 제한 없이 항원, 항체, 핵산, 비오틴 또는 비오틴 유사체, 스트렙타비딘, 아비딘 또는 하프텐일 수 있다. 화학 성분은 항원, 항체, 핵산, 비오틴 또는 비오틴 유사체, 스트렙타비딘, 아비딘 또는 하프텐일 수 있다.
본 발명의 한 태양에서, 장치는 측면 흐름 측정 포맷 장치일 수 있다.
본 발명의 다른 태양에서, 본 발명은 상당량의 샘플을 상기 장치에 사용하는 것을 포함하여 샘플 내에 적어도 한 형태의 분석물질의 존재를 결정하는 방법에 관한 것이고, 만일 분석물질의 적어도 한 타입이 샘플 내에 존재한다면, 샘플은 화학 반응이 일어나는 흡수막으로 이동하고, 여기서 신호의 존재는 분석물질이 샘플 내에 존재한다는 것을 나타낸다. 본 발명의 실시에서, 신호는 희토류 킬레이트, 특히 란탄족(III) 킬레이트에 의해 발생할 수 있고, 구체적으로 표지는 유로퓸(III), 테리븀(III), 사마륨(III) 또는 디스프로슘(III) 또는 이의 조합일 수 있다.
본 발명에서, 샘플은 생물학적 샘플일 수 있다. 또한, 샘플은 제한 없이 혈액, 혈청, 원형질, 소변, 타액, 땀 및 생물학적 또는 환경적 샘플을 가공한 액체 배지일 것이다. 검출되는 분석물질은 항원, 항체, 핵산 또는 하프텐일 수 있다. 화학 반응은 항원, 항체, 핵산, 비오틴 또는 비오틴 유사체, 스트렙타비딘, 아비딘 또는 하프텐과 일어날 수 있다. 샘플에서 여러 분석물질이 검출될 수 있다. 이 방법에 사용되는 장치는 제한 없이 측면 흐름 측정 포맷 장치일 수 있다. 분석물질은 병원체에 특이적일 수 있다.
또한 본 발명은 상기 장치를 포함하는 부품을 가지는 키트 및 상기 장치를 앞서 언급한바 대로 사용하기 위한 지침에 관한 것이다.
또한 본 발명은 고민감도 핵산 검출 시스템에 관한 것이다. 본 발명의 핵산기초 검출 시스템은 생물학적 샘플로부터 저농도의 특이적 게놈 DNA 또는 RNA 서열로부터의 신호를 증폭할 수 있다. 본 방법은 독특하고, 특이적이며, 단순하고, 증폭 시스템은 현장-장착가능한 검출 모듈에서 작동하기 쉽다.
시간 분해 형광분석 기술은 올리고뉴클레오티드, 펩티드 핵산(PNA), 항원 또는 항체와 결합된 마이크로 입자가 채워진 유로퓸을 기초로 한 시스템이다.
검출을 위해 고감도 장치를 요하는 임의의 질병 마커 또는 환경 물질은 이 기술을 사용할 수 있다.
본 발명의 이런 목적과 다른 목적은 본 발명의 다음 설명, 첨부된 도면과 청구항을 통해 더 완전히 이해될 것이다.
본 출원에서, "a" 및 "an"은 하나 및 여러 대상을 나타내는데 사용된다.
본 명세서에 사용된 "기저 부재"는 검사지를 위한 지지체 및 결합을 제공하는 고체 물질을 의미한다. 이 지지체는 전체 측정 내용물을 포함하는 적절한 크기로 절단되어 사용하기 편리한 박판의 유리, 종이 또는 플라스틱으로 제조될 수 있다.
본 명세서에 사용된 "마른 다공성 담체" 또는 "흡수막"은 액체를 이동시키기에 충분한 구멍을 가지고 저장소 영역에 인접한 물질을 의미한다. 마른 다공성 담체에 사용되는 전형적인 물질은 나일론, 셀룰로오스, 폴리술폰, 폴리바이닐리덴 다이플루오라이드, 셀룰로오스 아세테이트, 폴리우레탄, 섬유유리 및 나이트로셀룰로오스를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 명세서에 사용된 "필터"는 임의의 수의 필터 재료로 제조될 수 있다. 사용되는 전형적인 필터 재료는 셀룰로오스, 폴리에스터, 폴리우레탄, 나일론 및 섬유유리를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 이런 섬유 영역은 저장소 패드와 흡수 패드를 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용된 "형광 희토류 킬레이트"는 전문이 참조로 본 명세서에 포함된 미국특허 제 4,259,313호 및 4,283,382호에 기술되었다. 따라서, 본 발명은 희토류 금속, 바람직하게는 유로퓸 및 테리븀의 킬레이트를 라텍스 입자와 같은 폴리머 기질 속에 혼합하여 제조한 장수명 형광 조성물의 사용법을 기술한다. 킬레이트화제는 빛을 강하게 흡수하여 에너지를 금속에 효과적으로 전달한다. 라텍스 형태는 종래에 수용액에서의 소광에 영향을 받은 형광 희토류 킬레이트에 수성 안정성을 제공한다. 라텍스에서 유도되고 라텍스에 혼합된 희토류 금속 킬레이트를 가진 폴리머 비즈는 항원, 항체, 식물 렉틴, 탄수화물 또는 지질 및 핵산과 같은 다른 단백질 화합물을 폴리머 라텍스 비즈의 표면에 흡수시키거나 공유결합시켜 표지화된 시약을 형성하기 위해 형광 표지로 사용될 수 있다.
본 명세서에 사용된 "흡수된"은 측정 시스템에 포함된 시약을 의미하고, 여기서 시약은 측정 시스템 위 또는 속에서 건조 또는 동결건조된다.
본 명세서에 사용된 "폴리머 입자"는 다양한 크기의 구형 또는 비구형 폴리머 입자를 의미한다. 바람직하게는, 크기는 지름이 약 0.05-0.5㎛이다. 그러나, 본 발명은 폴리머 입자의 임의의 특정한 형태의 사용에 한정되지 않는다. 넓은 의미로, 형광 염료를 캡슐화할 수 있는 임의의 물질 또는 입자는 본 발명에 포함된다.
본 명세서에 사용된 "특이적 결합 시약(specific binding reagent)" 또는 "특이적 결합제(specific binder)" 또는 "특이적 결합 파트너(specific binding partner)"는 항체, 항원, 하프텐, 하프텐-거대분자(예를 들어, 소혈청 알부민) 접합체, 아비딘, 스트렙타비딘, 비오틴, 비오틴-거대분자(예를 들어, 소혈청 알부민) 접합체, 올리고뉴클레오티드, 펩티드 핵산 및 핵산 유전 물질을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 명세서에 사용된 "태그"는 시간 분해 형광 염료로 표지화되어 특이적 결합물질에 표지화된 물질을 의미한다. 태그는 고체상에 고정된 특이적 결합제와 특이적으로 반응한다. 특히, 고체상에 고정된 특이적 결합제가 아비딘 또는 스트렙타비딘일 때 태그는 비오틴일 수 있다. 고체상에 고정된 특이적 결합제가 태그의 하프텐에 특이적인 항체일 때 태그는 하프텐일 수 있다.
본 명세서 사용된 "시간 분해 형광분석기"는 방출 파장의 함수로 만들어질 수 있는 짧은 여기 펄스 이후의 형광 밀도의 시간 의존도를 측정하는 기구를 의미한다.
크로마토그래피 증폭
한 태양에서, 본 발명은 빠른 크로마토그래피 검사에 적절한 장치에 관한 것이다.
본 발명의 검사는 최소의 훈련을 받은 일반인이 현장에서 수행할 수 있고 일회용 검사기 또는 카드 또는 검사지에 샘플을 한두 방울 첨가한 후 빠르게 결과를 얻을 수 있다. 이 결과는 추가의 처리 없이 눈으로 읽을 수 있다. 본 발명의 한 태양에서, 제안된 검사의 순서는 다음과 같다. 단지 논의를 위해서, 검사는 항원/항체 반응에 관하여 논의할 것이다. 그러나, 측정법은 항원/항체 착물에 제한되는 것은 아니라는 것을 알아야 한다. 특이적 결합 파트너가 공지된, 임의의 관심 분자의 경우, 특이적 결합제를 사용하여 장치 속에 흡수시켜 관심 분자의 존재를 측정한다. 이런 관심 분자 및 이의 특이적 결합 파트너는 항원/항체, 리간드/수용체, 핵산/핵산, 핵산/항체, 지질/항체와 같은 특이적 결합 파트너, 탄수화물/항체와 같은 특이적 결합 파트너 등을 제한 없이 포함할 수 있다. 단지 설명을 위해서, 다음 논의에서, 항원/항체 및 핵산/핵산 상호 작용이 주로 논의되고, 특이적 결합 파트너를 사용하는 원리는 어떤 샘플 소스의 분자의 임의의 형태에 적용할 수 있다.
액체 샘플은 검사 장치 또는 카드 또는 검사지에 첨가된다. 액체가 흡수되고 카드를 따라 이동할 때 표적 항원은 염색 패드에 포함된 표지화된 특이적 항체와 반응한다. 물질은 적어도 하나의 구별된 지역(들)에 비표지화된 항체 집단이 고정된 막 속으로 흐른다. 항원-표지화 항체 착물은 유지되고/캡쳐되어 판독을 위한 소정의 라인(들)을 형성한다. 이 라인은 시간 분해 형광이 장착된 리더기 또는 임의의 적절한 검출 장치에 의해 검출될 수 있다. 개개의 제어 지역에서, 검사기 내 과량의 표지화된 항체는 포함된 비특이적 항체와 반응하여 주요 검사 성분이 적절하게 작용하여, 양성 대조군으로서 유용하다는 확신을 제공한다. 검사의 제한되지 않는 원리는 도 1에서 더 볼 수 있다.
액체 샘플은 검사 장치 또는 카드 또는 검사지에 첨가된다. 액체가 흡수되어 카드를 따라 이동할 때 표적 항원은 염색 패드에 포함된 표지화된 특이적 항체와 반응한다. 물질은 적어도 하나의 구별된 지역(들)에 비표지화된 항체 집단이 고정된 막 속으로 흐른다. 항원-표지화 항체 착물은 유지되고/캡쳐되어 판독을 위한 소정의 라인(들)을 형성한다. 이 라인은 시간 분해 형광이 장착된 리더기 또는 임의의 적절한 검출 장치에 의해 검출될 수 있다.
예를 들어, 측면 흐름 측정법 형태의 크로마토그래피 측정법은 증폭 시스템이다. 액체 샘플에서 표적 항원은 삼투압에 의해 막을 통해 이동할 때 막에 고정된 고친화력 항체에 의해 점진적으로 모인다. 그 결과, 비록 항원이 실제 샘플에서는 매우 낮은 농도일 수 있지만, 검사 라인 또는 검사 지역에 포획된 항원의 농도는 샘플보다 더욱 높다. 또한, 삼투압 이동은 표적 항원을 고정된 항체에 연속적으로 공급한다.
주로, 포획 항체가 항원과 통상적인 측정법에서 착물을 형성할 때, 고체상에 고정된 포획 항체 주위의 미세-환경성 항원 농도는 감소한다. 일반적으로, 고체상에 고정된 항체 주위의 항원의 이런 감소는 특히 미세판 측정법 및 칩-기초 측정법에 의한 측정 민감도에서 큰 문제점들의 하나인데, 이는 이런 감소가 항체 주위의 항원 농도의 실제의 감소를 일으키기 때문이다.
다른 실시예에서, 흡수막(예를 들어, 나이트로셀룰로오스)의 3차원 구조는 고체상과 결합하는 항체를 위한 표면적을 더 제공한다. 때문에 크로마토그래피 측정법이 다른 2차원 측정 시스템(예를 들어, 미세판 측정법)보다 현저하게 많은 포획 능력을 갖는다.
또한 본 발명은, 단지 1회 샘플링으로 수행되며 본 발명의 크로마토그래피 측정법에 의한 다른 단계가 필요없는 다중 분석물질 검출 시스템에 관한 것이다. 만일 다양한 항체-염료 접합체가 염료 패드 지역에 포함되고 각 항원에 특이적인 항체가 막 위의 분리된 지역에 개별적으로 고정된다면, 각 검사 라인은 특이적 항원에 대한 특유한 정보를 각각의 특이적 항원에 제공한다(도 2). 상기 장치는 한 형태 이상의 분석물질을 검출할 수 있다고 판단된다. 예를 들어, 도 2를 참조하면, 검사 지역 1은 항원을 검출하기 위해 항체에 흡수될 수 있고; 검사 지역 2는 리간드를 검출하기 위해 수용체에 흡수될 수 있고; 검사 지역 3은 서열 특이적 결합을 위해 핵산에 흡수될 수 있다.
한 태양에서, 본 발명은 단일 입자에 약 30,000-1,000,000개의 유로퓸 원자를 함유하는 형광 유로퓸 입자를 사용하는 단일 증폭 시스템에 관한 것이다. 이 시스템은 1) 검사법이 단순하고, 2) 현장 사용이 가능하며, 3) 안정한 시약을 사용하고, 4) 특별한 저장이 필요하지 않고, 5) 결과가 빠르다는 장점을 가진 개량된 크로마토그래피 측정법일 것이다. 증폭된 신호는 정량적 결과 또는 정성적 결과를 제공하는 소형의 휴대용 리더기에 의해 검출될 수 있다.
검사지는 바람직하게는 일회용 플라스틱인 케이스로 덮일 수 있고, 내용물을 안전하게 함유할 수 있는 임의의 물질로 제조될 수 있다. 검사 키트는 다수의 창, 바람직하게는 적어도 두 개의 창 또는 개구부를 포함할 수 있는데, 적어도 하나는 대조 및/또는 검사 라인 또는 검사 밴드를 보기 위한 것이고 다른 하나는 샘플을 받기 위한 구멍을 제공한다(도 3). 도 4를 참조하면, 장치 내부는 바람직하게는 두 개의 패드를 가진 검사지일 수 있다. 첫 번째 패드, 제 1 저장소 영역(1) 또는 샘플 구멍은 샘플을 흡수하고 샘플로부터 방해 물질을 제거하는데 사용될 수 있다. 또한, 첫 번째 패드는 특별히 제작된 버퍼 시스템에 유로퓸 입자-특이적 결합 파트너 접합체(3)를 함유할 수 있다. 저장소 지역 속에 흡수된 표지화된 특이적 결합 시약은 샘플 내 분석물질과 결합할 수 있고 분석물질/특이적 결합 파트너 착물은 검사 밴드(4)가 형성될 때까지 흡수막(6)을 통해 흡수되고, 분석물질의 다른 특이적 결합제는 분석물질/특이적 결합 파트너 착물을 포획하여 검사 밴드를 형성한다. 상기 샘플은 더욱 흡수되어 흡수막 내에 흡수된 특이적 결합 파트너에 대한 결합 파트너와 만나고 대조 밴드(5)가 만들어진다. 두 번째 패드(7), 흡수 패드는 반응막을 이미 통과한 과량의 액체를 제거하는데 사용될 수 있다. 첫 번째 패드, 두 번째 패드 및 흡수막은 플라스틱 판(2)으로 연결된다.
두 가지 형태의 시약은 얇은 라인 또는 밴드 상에서 개별적으로 고정될 수 있다. 접합 항체에 특이적인 항체는 대조창에 고정될 수 있고, 생명위협 물질 또는 검출하기 원하는 임의의 물질과 같은 분석물질에 특이적인 항체는 검사창에 고정될 수 있다(도 3 및 4).
크로마토그래피 측정법 원리
본 발명의 검사 키트는 자가 수행 장치로 설계되었다. 도 1에 도시한 대로 샘플 첨가 후 검사 결과를 얻기 위해 정확한 양의 모든 시약과 성분을 포함할 수 있다. 샘플은 다양한 물질을 함유하는 저장소 패드를 먼저 통과한다. 샘플의 pH를 최적화하기 위해 버퍼(들)를 함유할 수 있고, 샘플에 모든 성분들을 현탁시키기 위해 희석제(들)를 함유할 수 있고 장치를 통해 적절한 흐름을 발생시키기 위해 다공성 필터(들)를 함유할 수 있다. 샘플은 삼투압 작용 또는 확산에 의해 연속적으로 바람직하게는 검사 물질에 특이적인 유로퓸 입자-표지로 표지화된 특이적 결합제와 결합하는 염료 지역 또는 염료 패드로 이동한다. 그런 후에 반응 착물은 흡수막을 통해 이동하고, 흡수막에서 검사 물질의 미반응 결합 위치는 고정화된 특이적 결합제와 반응하여, 검사창에 라인 또는 밴드를 형성한다. 사용된 샘플 및 미결합 염료 착물의 잔여물은 접합 항체에 특이적인 항체가 고정되어 염료 착물을 유지하고 대조 라인을 형성하는 대조창으로 계속해서 이동한다. 반응 착물은 검사 영역에 도달하기 전에 대조 지역과 만날 수 있다.
본 발명의 한 태양에서, 결과는 생체 물질의 정성 검출 또는 정량 검출을 위한 고체상 크로마토그래피 측정법이다. 검사법에서, 약 60㎕의 액체 샘플은 샘플 사용 지역에 첨가될 수 있고 결과는 약 15분 정도 내에서 장치에 의해 제공될 수 있다. 측정의 빠르기는 본 발명의 시스템의 장점이나, 결과를 얻기 위한 정확한 시간은 상태와 샘플에 매우 의존할 수 있다. 따라서, 본 발명은 임의의 특정한 측정시간에 한정되지 않는다.
본 발명은, 상세한 설명과 본 발명의 설명을 위할 뿐 제한하려는 것이 아닌 도면을 통해 더 완전히 이해될 것이다.
도 1은 본 발명의 장치를 개략적으로 도시한다.
도 2는 여러 분석 물질을 검출하기 위한 본 발명의 장치를 도시한다.
도 3은 검사 장치를 도시한다.
도 4는 빠른 크로마토그래피 검출 시스템의 형태를 도시한다.
도 5a 및 5b는 (a) 콜로이드 금 항체 접합체의 영상, (b) 유로퓸 입자의 영상을 도시한다.
도 6은 빠른 핵산 검출 시스템의 외형을 도시한다.
도 7은 생물학적 병원체와 같은 샘플에서 특이적 DNA 서열의 검출을 위한 측정 원리의 도식을 도시한다.
도 8은 시간 분해 란탄족 방출 물질을 측정하기 위한 장치를 도시한다(자오, 엠 및 셀빈, 피알. 시간 분해 란탄족 방출과 공명 에너지 전달하기 위한 개량 장치. Review of scientific instruments 1999;70(10):3877-81).
도 9는 검사 장치를 도시한다.
도 10은 검사지의 예를 도시한다.
도 11은 검사지의 예를 도시한다.
도 12는 검사지의 예를 도시한다.
도 13은 검사지의 예를 도시한다.
도 14는 검사지의 예를 도시한다.
도 15는 검사지의 예를 도시한다.
도 16은 검사지의 예를 도시한다.
도 17은 검사지의 예를 도시한다.
도 18은 검사지의 예를 도시한다.
도 19는 검사지의 예를 도시한다.
양태 1
검출 장치의 한 양태에서, 장치는 다음 특징들을 포함한다:
폴리머 입자(3) 속에 혼합된 형광 희토류 킬레이트를 포함하는 형광 표지로 표지화된 특이적 결합 시약(들)을 하나 이상 흡수한 적어도 하나의 제 1 저장소 영역(1); 및
액체를 이동시키기에 충분한 구멍이 있고 저장소 영역에 인접한 흡수막(6)(예를 들어, 나이트로셀룰로오스 막), 여기서 적어도 하나의 특이적 결합 시약은 흡수막의 적어도 하나의 지역에 고정된다(도 10).
양태 2
검출 장치의 다른 양태에서, 장치는 다음 특징을 포함한다:
폴리머 입자(3) 속에 혼합된 형광 희토류 킬레이트를 포함하는 형광 표지로 표지화된 특이적 결합 시약(들)을 하나 이상 갖는 적어도 하나의 제 1 저장소 영역(1);
저장소 영역과 흡수막 사이에 삽입되고 액체를 이동시키기에 충분한 구멍이 있는 적어도 하나의 제 2 저장소 영역(11); 및
액체를 이동시키기에 충분한 구멍이 있고 제 2 저장소 영역과 인접한 흡수막(6)(예를 들어, 나이트로셀룰로오스 막), 여기서 적어도 하나의 특이적 결합 시약은 흡수막의 적어도 하나의 지역에 고정된다(도 11).
양태 3
검출 장치의 다른 양태에서, 장치는 다음 특징을 포함한다:
제 2 저장소 영역과 흡수막 사이에 삽입되고 액체를 이동시키기에 충분한 구멍이 있고 폴리머 입자(3) 속에 혼합된 형광 희토류 킬레이트를 포함하는 형광 표지로 표지화된 특이적 결합 시약(들)을 하나 이상 흡수하는 하나의 제 1 저장소 영역(1);
제 1 저장소 영역과 인접하고 액체를 이동시키기에 충분한 구멍이 있는 적어도 하나의 제 2 저장소 영역(11); 및
액체를 이동시키기에 충분한 구멍이 있고 제 2 저장소 영역과 인접한 흡수막(6)(예를 들어, 나이트로셀룰로오스 막), 여기서 적어도 하나의 특이적 결합 시약은 흡수막의 적어도 하나의 지역에 고정된다(도 12).
양태 4
검출 장치의 다른 양태에서, 장치는 다음 특징을 포함한다:
기저 부재(2);
기저 부재(2) 위에 배치된 어레이, 어레이는 다음을 포함한다:
폴리머 입자(3) 속에 혼합된 형광 희토류 킬레이트를 포함하는 형광 표지로 표지화된 특이적 결합 시약(들)을 하나 이상 흡수하는 하나의 제 1 저장소 영역(1); 및
액체를 이동시키기에 충분한 구멍이 있고 제 1 저장소 영역과 인접한 흡수막(6)(예를 들어, 나이트로셀룰로오스 막), 여기서 적어도 하나의 특이적 결합 시약은 흡수막의 적어도 하나의 지역에 고정된다(도 13).
양태 5
검출 장치의 다른 양태에서, 장치는 다음 특징을 포함한다:
기저 부재(2);
기저 부재(2) 위에 배치된 어레이, 어레이는 다음을 포함한다:
폴리머 입자(3) 속에 혼합된 형광 희토류 킬레이트를 포함하는 형광 표지로 표지화된 특이적 결합 시약(들)을 하나 이상 흡수하는 하나의 제 1 저장소 영역(1); 및
제 1 저장소 영역(1)과 흡수막(6) 사이에 배치되고 액체를 이동시키기에 충분한 구멍이 있는 적어도 하나의 제 2 저장소 영역(11);
액체를 이동시키기에 충분한 구멍이 있고 제 2 저장소 영역과 인접한 흡수막(6)(예를 들어, 나이트로셀룰로오스 막), 여기서 적어도 하나의 특이적 결합 시약은 흡수막의 적어도 하나의 지역에 고정된다(도 14).
양태 6
검출 장치의 다른 양태에서, 장치는 다음 특징을 포함한다:
기저 부재(2);
기저 부재(2) 위에 배치된 어레이, 어레이는 다음을 포함한다:
제 2 저장소 영역(1)과 흡수막(6) 사이에 삽입되고 액체를 이동시키기에 충분한 구멍이 있고, 폴리머 입자(3) 속에 혼합된 형광 희토류 킬레이트를 포함하는 형광 표지로 표지화된 특이적 결합 시약(들)을 하나 이상 흡수하는 적어도 하나의 제 1 저장소 영역(1); 및
제 1 저장소 영역(1)과 인접하고 액체를 이동시키기에 충분한 구멍이 있는 적어도 하나의 제 2 저장소 영역(11); 및
액체를 이동시키기에 충분한 구멍이 있고 제 1 저장소 영역과 인접한 흡수막(6)(예를 들어, 나이트로셀룰로오스 막), 여기서 적어도 하나의 특이적 결합 시약은 흡수막의 적어도 하나의 지역에 고정된다(도 15).
양태 7
검출 장치의 다른 양태에서, 장치는 다음 특징을 포함한다:
폴리머 입자(3) 속에 혼합된 형광 희토류 킬레이트를 포함하는 형광 표지로 표지화된 특이적 결합 시약(들)을 하나 이상 흡수하는 적어도 하나의 제 1 저장소 영역(1);
흡수막(6)에 고정된 특이적 결합 시약에 특이적으로 반응하는 태그로 표지화된 하나 이상의 특이적 결합 시약(들)을 흡수하고, 제 1 저장소 영역(1)과 흡수막(6) 사이에 삽입되고 액체를 이동시키기에 충분한 구멍을 가진 적어도 하나의 제 2 저장소 영역(11); 및
액체를 이동시키기에 충분한 구멍이 있고 제 2 저장소 영역과 인접한 흡수막(6)(예를 들어, 나이트로셀룰로오스 막), 여기서 적어도 하나의 특이적 결합 시약은 흡수막의 적어도 하나의 지역에 고정된다(도 16).
양태 8
검출 장치의 다른 양태에서, 장치는 다음 특징을 포함한다:
제 2 저장소 영역(11)와 흡수막(6) 사이에 삽입되고 액체를 이동시키기에 충분한 구멍을 가지고, 폴리머 입자(3) 속에 혼합된 형광 희토류 킬레이트를 포함하는 형광 표지로 표지화된 특이적 결합 시약(들)을 하나 이상 흡수하는 적어도 하나의 제 1 저장소 영역(1);
흡수막(6)에 고정된 특이적 결합 시약에 특이적으로 반응하는 태그로 표지화된 하나 이상의 특이적 결합 시약(들)을 흡수하고, 제 1 저장소 영역(1)에 인접하고 액체를 이동시키기에 충분한 구멍을 가진 적어도 하나의 제 2 저장소 영역(11); 및
액체를 이동시키기에 충분한 구멍이 있고 제 1 저장소 영역과 인접한 흡수막(6)(예를 들어, 나이트로셀룰로오스 막), 여기서 적어도 하나의 특이적 결합 시약은 흡수막의 적어도 하나의 지역에 고정된다(도 17).
양태 9
검출 장치의 다른 양태에서, 장치는 다음 특징을 포함한다:
기저 부재(2);
기저 부재(2) 위에 배치된 어레이, 어레이는 다음을 포함한다:
폴리머 입자(3) 속에 혼합된 형광 희토류 킬레이트를 포함하는 형광 표지로 표지화된 특이적 결합 시약(들)을 하나 이상 흡수하는 하나의 제 1 저장소 영역(1); 및
흡수막(6)에 고정된 특이적 결합 시약에 특이적으로 반응하는 태그로 표지화된 특이적 결합 시약(들)을 하나 이상 흡수하고, 제 1 저장소 영역(1)과 흡수막(6) 사이에 삽입되고 액체를 이동시키기에 충분한 구멍을 가진 적어도 하나의 제 2 저장소 영역(11); 및
액체를 이동시키기에 충분한 구멍이 있고 제 2 저장소 영역과 인접한 흡수막(6)(예를 들어, 나이트로셀룰로오스 막), 여기서 적어도 하나의 특이적 결합 시약은 흡수막의 적어도 하나의 지역에 고정된다(도 18).
양태 10
검출 장치의 다른 양태에서, 장치는 다음 특징을 포함한다:
기저 부재(2);
기저 부재(2) 위에 배치된 어레이, 어레이는 다음을 포함한다:
제 2 저장소 영역(11)와 흡수막(6) 사이에 삽입되고 액체를 이동시키기에 충분한 구멍을 가지고, 폴리머 입자(3) 속에 혼합된 형광 희토류 킬레이트를 포함하는 형광 표지로 표지화된 특이적 결합 시약(들)을 하나 이상 흡수하는 적어도 하나의 제 1 저장소 영역(1);
흡수막(6)에 고정된 특이적 결합 시약에 특이적으로 반응하는 태그로 표지화된 특이적 결합 시약(들)을 하나 이상 흡수하고, 제 1 저장소 영역(1)과 인접하고 액체를 이동시키기에 충분한 구멍을 가진 적어도 하나의 제 2 저장소 영역(11); 및
액체를 이동시키기에 충분한 구멍이 있고 제 2 저장소 영역과 인접한 흡수막(6)(예를 들어, 나이트로셀룰로오스 막), 여기서 적어도 하나의 특이적 결합 시약은 흡수막의 적어도 하나의 지역에 고정된다(도 19).
샌드위치 측정법
항체-항체 샌드위치
고체상에 고정된 특이적 결합제: 단클론 항체 및/또는 다클론 항체.
형광 염료로 표지화된 특이적 결합 시약: 형광 염료로 표지화된 단클론 항체 및/또는 다클론 항체.
항체-항원 샌드위치
항체-항원 샌드위치 1
고체상에 고정된 특이적 결합제: 샘플의 분석 항체에 특이적인 항원(예를 들어, 인간 항-HIV-1 gp41 항체에 특이적으로 반응하는 HIV-1 gp41 항원).
형광 염료로 표지화된 특이적 결합 시약: 형광 염료로 표지화된 이차 단클론 항체 및/또는 다클론 항체. 이 항체는 샘플 내의 일차 항체에 특이적이다.
항체-항원 샌드위치 2
고체상에 고정된 특이적 결합제: 이차 단클론 항체 및/또는 다클론 항체. 이 항체는 샘플 내의 일차 항체에 특이적이다.
형광 염료로 표지화된 특이적 결합 시약: 샘플 내의 분석 항체에 특이적인 ( 형광 염료로 표지화된)항원(예를 들어, 인간 항-HIV-1 gp41 항체에 특이적으로 반응하는 HIV-1 gp41 항원)
항원-항원 샌드위치
고체상에 고정된 특이적 결합제: 샘플의 분석 항체에 특이적인 항원(예를 들어, 인간 항-HIV-1 gp41 항체에 특이적으로 반응하는 HIV-1 gp41 항원)
형광 염료로 표지화된 특이적 결합 시약: 샘플 내의 분석 항체에 특이적인 (형광 염료로 표지화된)항원(예를 들어, 인간 항-HIV-1 gp41 항체에 특이적으로 반응하는 HIV-1 gp41 항원)
이 포맷(format)은 고체상에 고정된 특이적 결합제(예를 들어, 아비딘 또는 스트렙타비딘); 고체상에 고정된 특이적 접합제와 특이적으로 반응하는 태그(들)로 표지화된 특이적 결합 시약; 형광 염료로 표지화된 특이적 결합 시약을 포함한다.
이 포맷은 고체상에 고정된 특이적 결합제를 고체상에 고정된 특이적 결합제(예를 들어, 아비딘 또는 스트렙타비딘) 및 태그로 표지화된 특이적 결합 시약로 대체함으로써 상기한 모든 측정 포맷에 사용가능하다.
경합 측정법(Competition Assay)
포맷 1
형광 염료로 표지화된 특이적 결합 시약(예를 들어, 하프텐에 특이적인 항체): 샘플 내에 관심 분석물질과 결합하여 반응 착물을 형성한다.
고체상에 고정된 특이적 결합제(예를 들어, 하프텐): 형광 염료로 표지화된 자유 특이적 결합 시약과 반응할 수 있고 반응 착물로부터 분석물질을 경쟁적으로 치환할 수 있고 형광 염료로 표지화된 특이적 결합 시약과 반응할 수 있다.
포맷 2
고체상에 고정된 특이적 결합 시약(예를 들어, 하프텐에 특이적인 항체): 샘플 내의 관심 분석물질과 경쟁적으로 결합할 수 있다 또는 형광 염료로 표지화된 특이적 결합제(예를 들어, 하프텐).
형광 염료로 표지화된 특이적 접합제(예를 들어, 하프텐): 샘플 내의 관심 분석물질과 경쟁할 수 있다.
포맷 3
이 포맷은 고체상에 고정된 특이적 결합제(예를 들어, 아비딘 또는 스트렙타비딘); 고체상에 고정된 특이적 결합제와 특이적으로 반응하는 태그(들)로 표지화된 특이적 결합 시약; 형광 염료로 표지화된 특이적 결합 시약(하프텐)을 포함한다.
이 포맷은 고체상에 고정된 특이적 접합제를 고체상에 고정된 특이적 결합제(예를 들어, 아비딘 또는 스트렙타비딘) 및 태그로 표지화된 특이적 결합 시약으로 대체함으로써 상기한 모든 측정 포맷에 사용가능하다.
여러 분석물질의 검출
본 발명의 다른 양태는 하나 이상의 특이한 형태의 표지 물질 및 동일한 수의 형태의 상응하는 고정 물질의 존재에 의해 단일 유체 샘플에 여러 분석물질의 검출을 허용한다. 장치는 저장소 영역을 전체에 흡수된 여러 표지 물질 및 흡수막 위의 여러 측정 표시 지역에 형성된 여러 상응하는 고정 물질과 한방향으로 설정될 수 있다. 한 방향 또는 여러 방향의 양태에서, 저장소 영역 및 흡수막와 같은 부품들의 하나 이상의 세트는 공통의 저장소와 결합된다.
키트 및 키트 사용을 위한 지침
본 발명은 본 발명의 검출 장치를 사용하기 위한 키트를 포함한다. 이 키트는 보드지, 플라스틱 또는 임의의 다른 고체 물체 또는 플라스틱 가방으로 제조된 컨테이너를 포함할 수 있고, 검출 장치를 수용할 수 있다. 키트에는 어떻게 키트를 사용하는 지에 대한 지침이 들어있다. 이런 지침은 컨테이너에 쓰거나 종이 지침 시트와 같은 컨테이너 내부에 위치한 문서 형태일 것이다. 키트 및 검출 장치를 사용하기 위한 지침은 문서 형태 이외에 또는 문서 형태를 대체한 웹 사이트의 전자적 형태일 수 있다.
실시예 1: 유로퓸 킬레이트 나노입자를 사용하는 트로포닌 I 검사지의 제조
항-트로포닌 I 코팅 나노입자의 제조
유로퓸 킬레이트 나노입자의 카복실기를 10mmol/L N-(3-다이메틸아미노프로필)-N'-에틸카보다이이미드와 100mmol/L N-하이드록시설포숙신이미드로 30분 동안 활성화하였다. 활성 입자를 pH 6.1의 50mM MES 버퍼로 한 번 세척하고, 20mM/L 항-트로포닌 I 항체를 첨가하였다. 2시간의 배양 후, 항체 코팅 나노입자를 pH 6.1의 50mM MES 버퍼로 3회 세척하였다.
염료 패드의 제조
유리 섬유 필터를 항-트로포닌 I 항체 코팅 나노입자, 0.2% 트윈-20, 0.25% 소혈청 알부민, 0.5% 수크로오스, pH 7.5의 10mM 인산 나트륨을 포함하는 용액에 흡수시켜 8mm x 305mm의 사각형 조각으로 제조하였고 냉동건조기에서 일정한 진공하에서 건조시켰다. 패드를 사용할 때까지 건조기에서 건조시켜 보관하였다.
필터 패드의 제조
유리 섬유 필터를 0.05% 트윈-20, 2%의 수크로오스, 1%의 BSA 및 pH 7.4의 100mM 인산 나트륨의 용액으로 처리하고 실온에서 공기로 건조시켰다.
막에 항체의 고정
양면 투명 테이프(305mm x 25mm 크기)를 얇은 플라스틱 판(305 x 60mm)의 바닥으로부터 20mm에 붙였다. 나이트로셀룰로오스 막을 305mm x 25mm 크기로 잘랐고 양면 테이프의 바로 위에 붙였다. 트로포닌 I을 위한 고정 검사 라인의 측정 표시 지역은 pH 7.5의 10mM 속의 1mg/ml 염소 항-트로포닌 I 항체 용액 30㎕를 분무하여 막의 바닥으로부터 9mm에 형성하였다. 대조 밴드의 경우, 1mg/ml의 다클론 항-마우스 IgG 항체를 분무하여 막의 바닥으로부터 13mm에 형성하였다. 분무 후에, 막을 대략 12시간 동안 주위 온도에서 건조하였다. 기저막 및 흡수막을 추가로 처리할 때까지 건조기에서 저장하였다.
검사지 형성
염료 패드를 셀룰로오스 막의 바닥 바로 아래의 플라스틱 기부에 부착하였고 필터 패드를 염료 패드와 인접하게 부착하였다. 그런 후에 플라스틱 판을 각각 나이트로셀룰로오스, 염료 패드 및 필터 패드의 직선 어레이를 함유하도록 길이 60mm와 넓이 4mm의 여러 개의 검사지로 잘랐다.
측정 방법 및 결과:
70㎕의 샘플을 필터 패드에 첨가하였을 때, 검출 신호는 배양 후 검사지를 자외선에 노출시켰을 때 측정 표시 지역에 나타나기 시작하였다.
실시예 2: 콜로이드 금을 사용하는 트로포닌 I 검사지의 제조
금 솔의 제조
1400ml의 탈이온수를 끓였다. 하이드로아루리산(Hydroauric acid)(299 내지 305mg)을 첨가하였고, 5분 동안 계속 끓였다. 10ml의 증류수에 용해된 시트르산 나트륨(440mg)을 금 용액에 붓고 용액을 10분 동안 끓였다. 용액을 주위 실온으로 냉각하였다.
표지의 제조
금 솔의 pH를 40mM 중탄산칼륨으로 6.8로 조절하였다. 예 1에서 사용된 동일한 단클론 항체를 주위온도에서 30분 동안 격렬히 교반한 50ml의 금 용액에 첨가하였다. 1ml의 50% 소혈청 알부민을 첨가하였고, 용액을 주위온도에서 대략 15분 동안 연속적으로 교반하였다. 콜로이드 금-단클론 항체 접합체를 1시간 동안 GSA에서 10,000rpm에서 원심분리하여 회수하였고 상청액을 버리고 얻어진 알갱이를 pH 7.5의 10mM 인산나트륨 속의 25ml의 2% 소혈청 알부민에 현탁시켰다. 현탁액을 GSA 로터에서 1시간 동안 10,000rpm에서 회전시켰다. 상청액을 다시 한 번 버리고 알갱이를 pH 7.5의 10mM 인산나트륨 속의 6ml의 2% 소혈청 알부민에 현탁시켰다.
염료 패드의 제조
유리 섬유 필터를 항-트로포닌 I 항체 코팅 나노입자, 0.2% 트윈-20, 0.25% 소혈청 알부민, 0.5% 수크로오스, pH 7.5의 10mM 인산 나트륨을 포함하는 용액에 흡수시켜 8mm x 305mm의 사각형 조각으로 제조하였고 냉동건조기에서 일정한 진공하에서 건조시켰다. 패드를 사용할 때까지 건조기에서 건조시켜 보관하였다.
필터 패드의 제조
유리 섬유 필터를 0.05% 트윈-20, 2%의 수크로오스, 1%의 BSA 및 pH 7.4의 100mM 인산 나트륨의 용액으로 처리하고 실온에서 공기로 건조시켰다.
막에 항체의 고정
양면 투명 테이프(305mm x 25mm 크기)를 얇은 플라스틱 판(305 x 60mm)의 바닥으로부터 20mm에 붙였다. 나이트로셀룰로오스 막을 305mm x 25mm 크기로 잘랐고 양면 테이프의 바로 위에 붙였다. 트로포닌 I을 위한 고정 검사 라인의 측정 표시 지역은 pH 7.5의 10mM 속의 1mg/ml 염소 항-트로포닌 I 항체 용액 30㎕를 분무하여 막의 바닥으로부터 9mm에 형성하였다. 대조 밴드의 경우, 1mg/ml의 다클론 항-마우스 IgG 항체를 분무하여 막의 바닥으로부터 13mm에 형성하였다. 분무 후에, 막을 대략 12시간 동안 주위 온도에서 건조하였다. 기저막 및 흡수막을 추가로 처리할 때까지 건조기에서 저장하였다.
검사지 형성
염료 패드를 셀룰로오스 막의 바닥 바로 아래의 플라스틱 기부에 부착하였고 필터 패드를 염료 패드와 인접하게 부착하였다. 그런 후에 플라스틱 판을 각각 나이트로셀룰로오스, 염료 패드 및 필터 패드의 직선 어레이를 함유하도록 길이 60mm와 넓이 4mm의 여러 개의 검사지로 잘랐다.
측정 방법 및 결과:
70㎕의 샘플을 필터 패드에 첨가하였을 때, 검출 신호는 배양 후 검사지를 자외선에 노출시켰을 때 측정 표시 지역에 나타나기 시작하였다.
실시예 3: 각각의 방법을 사용하여 제조한 검사지의 민감도 비교
예 1에서 제조한 검사지와 예 2에서 제조한 검사지를 검사하여 민감도를 비교하였다. 예 1에서 제조한 검사지는 0.025 나노그램/ml의 민감도를 보였고 예 2에서 제조한 검사지는 0.5 나노그램/ml의 민감도를 보였다. 유로퓸 나노입자를 사용하여 제조한 검사지는 콜로이드 금을 사용하여 제조한 검사지보다 20배 높은 민감도를 나타내었다.
실시예 4: 유로퓸 나노입자를 사용한 hCG 검사지의 제조
항-hCG 코팅 나노입자의 제조
유로퓸 킬레이트 나노입자의 카복실기를 10mmol/L N-(3-다이메틸아미노프로필)-N'-에틸카보다이이미드와 100mmol/L N-하이드록시설포숙신이미드로 30분 동안 활성화하였다. 활성 입자를 pH 6.1의 50mM MES 버퍼로 한 번 세척하고, 20mM/L 항-hCG 항체를 첨가하였다. 2시간의 배양 후, 항체 코팅 나노입자를 pH 6.1의 50mM MES 버퍼로 3회 세척하였다.
염료 패드의 제조
유리 섬유 필터를 항-hCG 항체 코팅 나노입자, 0.2% 트윈-20, 0.25% 소혈청 알부민, 0.5% 수크로오스, pH 7.5의 10mM 인산 나트륨을 포함하는 용액에 흡수시켜 8mm x 305mm의 사각형 조각으로 제조하였고 냉동건조기에서 일정한 진공하에서 건조시켰다. 패드를 사용할 때까지 건조기에서 건조시켜 보관하였다.
필터 패드의 제조
유리 섬유 필터를 0.05% 트윈-20, 2%의 수크로오스, 1%의 BSA 및 pH 7.4의 100mM 인산 나트륨의 용액으로 처리하고 실온에서 공기로 건조시켰다.
막에 항체의 고정
양면 투명 테이프(305mm x 25mm 크기)를 얇은 플라스틱 판(305 x 60mm)의 바닥으로부터 20mm에 붙였다. 나이트로셀룰로오스 막을 305mm x 25mm 크기로 잘랐고 양면 테이프의 바로 위에 붙였다. hCG를 위한 고정 검사 라인의 측정 표시 지역은 pH 7.5의 10mM 속의 1mg/ml 단클론 항-hCG 항체 용액 30㎕를 분무하여 막의 바닥으로부터 9mm에 형성하였다. 대조 밴드의 경우, 1mg/ml의 다클론 항-마우스 IgG 항체를 분무하여 막의 바닥으로부터 13mm에 형성하였다. 분무 후에, 막을 대략 12시간 동안 주위 온도에서 건조하였다. 기저막 및 흡수막을 추가로 처리할 때까지 건조기에서 저장하였다.
검사지 형성
염료 패드를 셀룰로오스 막의 바닥 바로 아래의 플라스틱 기부에 부착하였고 필터 패드를 염료 패드와 인접하게 부착하였다. 그런 후에 플라스틱 판을 각각 나이트로셀룰로오스, 염료 패드 및 필터 패드의 직선 어레이를 함유하도록 길이 60mm와 넓이 4mm의 여러 개의 검사지로 잘랐다.
측정 방법 및 결과:
70㎕의 샘플을 필터 패드에 첨가하였을 때, 검출 신호는 배양 후 검사지를 자외선에 노출시켰을 때 측정 표시 지역에 나타나기 시작하였다.
실시예 5: 콜로이드 금을 사용한 hCG 검사지의 제조
금 솔의 제조
1400ml의 탈이온수를 끓였다. 하이드로아루리산(Hydroauric acid)(299 내지 305mg)을 첨가하였고, 5분 동안 계속 끓였다. 10ml의 증류수에 용해된 시트르산 나트륨(440mg)을 금 용액에 붓고 용액을 10분 동안 끓였다. 용액을 주위 실온으로 냉각하였다.
표지의 제조
금 솔의 pH를 40mM 중탄산칼륨으로 6.8로 조절하였다. 예 1에서 사용된 동일한 단클론 항체를 주위온도에서 30분 동안 격렬히 교반한 50ml의 금 용액에 첨가하였다. 1ml의 50% 소혈청 알부민을 첨가하였고, 용액을 주위온도에서 대략 15분 동안 연속적으로 교반하였다. 콜로이드 금-단클론 항체 접합체를 1시간 동안 GSA에서 10,000rpm에서 원심분리하여 회수하였고 상청액을 버리고 얻어진 알갱이를 pH 7.5의 10mM 인산나트륨 속의 25ml의 2% 소혈청 알부민에 현탁시켰다. 현탁액을 GSA 로터에서 1시간 동안 10,000rpm에서 회전시켰다. 상청액을 다시 한 번 버리고 알갱이를 pH 7.5의 10mM 인산나트륨 속의 6ml의 2% 소혈청 알부민에 현탁시켰다.
염료 패드의 제조
유리 섬유 필터를 항-hCG 항체 코팅 나노입자, 0.2% 트윈-20, 0.25% 소혈청 알부민, 0.5% 수크로오스, pH 7.5의 10mM 인산 나트륨을 포함하는 용액에 흡수시켜 8mm x 305mm의 사각형 조각으로 제조하였고 냉동건조기에서 일정한 진공하에서 건조시켰다. 패드를 사용할 때까지 건조기에서 건조시켜 보관하였다.
필터 패드의 제조
유리 섬유 필터를 0.05% 트윈-20, 2%의 수크로오스, 1%의 BSA 및 pH 7.4의 100mM 인산 나트륨의 용액으로 처리하고 실온에서 공기로 건조시켰다.
막에 항체의 고정
양면 투명 테이프(305mm x 25mm 크기)를 얇은 플라스틱 판(305 x 60mm)의 바닥으로부터 20mm에 붙였다. 나이트로셀룰로오스 막을 305mm x 25mm 크기로 잘랐고 양면 테이프의 바로 위에 붙였다. hCG을 위한 고정 검사 라인의 측정 표시 지역은 pH 7.5의 10mM 속의 1mg/ml 염소 항-트로포닌 I 항체 용액 30㎕를 분무하여 막의 바닥으로부터 9mm에 형성하였다. 대조 밴드의 경우, 1mg/ml의 다클론 항-마우스 IgG 항체를 분무하여 막의 바닥으로부터 13mm에 형성하였다. 분무 후에, 막을 대략 12시간 동안 주위 온도에서 건조하였다. 기저막 및 흡수막을 추가로 처리할 때까지 건조기에서 저장하였다.
검사지 형성
염료 패드를 셀룰로오스 막의 바닥 바로 아래의 플라스틱 기부에 부착하였고 필터 패드를 염료 패드와 인접하게 부착하였다. 그런 후에 플라스틱 판을 각각 나이트로셀룰로오스, 염료 패드 및 필터 패드의 직선 어레이를 함유하도록 길이 60mm와 넓이 4mm의 여러 개의 검사지로 잘랐다.
측정 방법 및 결과:
70㎕의 샘플을 필터 패드에 첨가하였을 때, 검출 신호는 배양 후 검사지를 자외선에 노출시켰을 때 측정 표시 지역에 나타나기 시작하였다.
실시예 6: 각각의 방법을 사용하여 제조한 검사지의 민감도 비교
예 4에서 제조한 검사지와 예 5에서 제조한 검사지를 검사하여 민감도를 비교하였다. 예 4에서 제조한 검사지는 1.5 mIU/ml의 민감도를 보였고 예 5에서 제조한 검사지는 15 mIU/ml의 민감도를 보였다. 유로퓸 나노입자를 사용하여 제조한 검사지는 콜로이드 금을 사용하여 제조한 검사지보다 10배 높은 민감도를 나타내었다.
실시예 7: 유로퓸 킬레이트 나노입자를 사용한 뎅기열 바이러스 검사지의 제조
올리고뉴클레오티드 코팅 나노입자의 제조
유로퓸 킬레이트 나노입자의 카복실기를 10mmol/L N-(3-다이메틸아미노프로필)-N'-에틸카보다이이미드와 100mmol/L N-하이드록시설포숙신이미드로 30분 동안 활성화하였다. 활성 입자를 pH 6.1의 50mM MES 버퍼로 한 번 세척하고, 소혈청 알부민과 같은 담체를 가진 20mM/L 올리고뉴클레오티드를 첨가하였다. 2시간의 배양 후, 올리고뉴클레오티드 코팅 입자를 pH 6.1의 50mM MES 버퍼로 3회 세척하였다.
염료 패드의 제조
유리 섬유 필터를 항-hCG 항체 코팅 나노입자, 0.2% 트윈-20, 0.25% 소혈청 알부민, 0.5% 수크로오스, pH 7.5의 10mM 인산 나트륨을 포함하는 용액에 흡수시켜 8mm x 305mm의 사각형 조각으로 제조하였고 냉동건조기에서 일정한 진공하에서 건조시켰다. 패드를 사용할 때까지 건조기에서 건조시켜 보관하였다.
필터 패드의 제조
유리 섬유 필터를 0.05% 트윈-20, 20%의 수크로오스, 1%의 BSA 및 pH 7.4의 100mM 인산 나트륨의 용액으로 처리하고 실온에서 공기로 건조시켰다.
막에 항체의 고정
양면 투명 테이프(305mm x 25mm 크기)를 얇은 플라스틱 판(305 x 60mm)의 바닥으로부터 20mm에 붙였다. 나이트로셀룰로오스 막을 305mm x 25mm 크기로 잘랐고 양면 테이프의 바로 위에 붙였다. 뎅기열 바이러스 특이적 올리고뉴클레오티드를 위한 고정 검사 라인의 측정 표시 지역은 pH 7.5의 10mM 속의 1mg/ml 올리고뉴클레오티드-BSA 접합체 용액 30㎕를 분무하여 막의 바닥으로부터 9mm에 형성하였다. 분무 후에, 막을 대략 12시간 동안 주위 온도에서 건조하였다. 기저막 및 흡수막을 추가로 처리할 때까지 건조기에서 저장하였다.
검사지 형성
염료 패드를 셀룰로오스 막의 바닥 바로 아래의 플라스틱 기부에 부착하였고 필터 패드를 염료 패드와 인접하게 부착하였다. 그런 후에 플라스틱 판을 각각 나이트로셀룰로오스, 염료 패드 및 필터 패드의 직선 어레이를 함유하도록 길이 60mm와 넓이 4mm의 여러 개의 검사지로 잘랐다.
측정 방법 및 결과:
70㎕의 샘플을 필터 패드에 첨가하였을 때, 검출 신호는 배양 후 검사지를 자외선에 노출시켰을 때 측정 표시 지역에 나타나기 시작하였다.
실시예 8: 중합 연쇄 반응에 의해 유로퓸 킬레이트 나노입자를 사용하는 뎅기열 바이러스 검사지의 제조
스트렙타비딘 코팅 나노입자의 제조
유로퓸 킬레이트 나노입자의 카복실기를 10mmol/L N-(3-다이메틸아미노프로필)-N'-에틸카보다이이미드와 100mmol/L N-하이드록시설포숙신이미드로 30분 동안 활성화하였다. 활성 입자를 pH 6.1의 50mM MES 버퍼로 한 번 세척하고, 20mM/L 스트렙타비딘를 첨가하였다. 2시간의 배양 후, 스트렙타비딘 코팅 입자를 pH 6.1의 50mM MES 버퍼로 3회 세척하였다.
염료 패드의 제조
유리 섬유 필터를 스트렙타비딘 코팅 나노입자, 0.2% 트윈-20, 0.25% 소혈청 알부민, 0.5% 수크로오스, pH 7.5의 10mM 인산 나트륨을 포함하는 용액에 흡수시켜 8mm x 305mm의 사각형 조각으로 제조하였고 냉동건조기에서 일정한 진공하에서 건조시켰다. 패드를 사용할 때까지 건조기에서 건조시켜 보관하였다.
필터 패드의 제조
유리 섬유 필터를 0.05% 트윈-20, 20%의 수크로오스, 1%의 BSA 및 pH 7.4의 100mM 인산 나트륨의 용액으로 처리하고 실온에서 공기로 건조시켰다.
막에 항체의 고정
양면 투명 테이프(305mm x 25mm 크기)를 얇은 플라스틱 판(305 x 60mm)의 바닥으로부터 20mm에 붙였다. 나이트로셀룰로오스 막을 305mm x 25mm 크기로 잘랐고 양면 테이프의 바로 위에 붙였다. 항-하프텐 항체를 위한 고정 검사 라인의 측정 표시 지역은 pH 7.5의 10mM 속의 1mg/ml 스트렙타비딘 올리고뉴클레오티드-BSA 접합체 용액 30㎕를 분무하여 막의 바닥으로부터 9mm에 형성하였다. 분무 후에, 막을 대략 12시간 동안 주위 온도에서 건조하였다. 기저막 및 흡수막을 추가로 처리할 때까지 건조기에서 저장하였다.
검사지 형성
염료 패드를 셀룰로오스 막의 바닥 바로 아래의 플라스틱 기부에 부착하였고 필터 패드를 염료 패드와 인접하게 부착하였다. 그런 후에 플라스틱 판을 각각 나이트로셀룰로오스, 염료 패드 및 필터 패드의 직선 어레이를 함유하도록 길이 60mm와 넓이 4mm의 여러 개의 검사지로 잘랐다.
측정 방법 및 결과:
2㎕ 샘플과 70㎕의 전개액을 필터 패드에 첨가하였을 때, 검출 신호는 배양 후 검사지를 자외선에 노출시켰을 때 측정 표시 지역에 나타나기 시작하였다.
본 명세서에 인용된 모든 참조문헌은 전문이 참조로 포함된다.
당업자는 일상적 실험을 사용하여, 구체적으로 기술한 본 발명의 특정한 실시예와 동일한 많은 실시예를 인식할 것이고 또는 확신할 수 있다.
본 발명의 내용 중에 있음

Claims (20)

  1. 란탄족(III) 킬레이트를 포함하는 입자로 표지화된 특이적 결합 파트너가 흡수된 적어도 하나의 저장소 영역; 및
    적어도 하나의 화학적 또는 생물학적 성분이 고정되고 저장소 영역에 인접한 흡수막;
    을 가지며, 분석 대상이 되는 분석물질이 항원, 항체, 핵산 및 하프텐(hapten)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되고,
    존재할 경우, 분석물질은 상기 특이적 결합 파트너와 결합하며,
    존재할 경우, 상기 화학적 또는 생물학적 성분은 상기 분석물질 또는 상기 분석물질 및 특이적 결합 파트너의 조합과 결합하는, 분석물질 검출장치.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 란탄족(III) 킬레이트가 유로퓸(III), 테르븀(III), 사마륨(III) 또는 디스프로슘(III)의 킬레이트 또는 이들의 조합을 포함하는 분석물질 검출 장치.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 제 1 항에 있어서,
    상기 특이적 결합 파트너는 항원, 항체, 핵산, 비오틴 또는 비오틴 유사체, 스트렙타비딘, 아비딘 및 하프텐으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 분석물질 검출 장치.
  7. 제 1 항에 있어서,
    적어도 하나의 화학적 성분은 항원, 항체, 핵산, 비오틴 또는 비오틴 유사체, 스트렙타비딘, 아비딘 및 하프텐으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 분석물질 검출 장치.
  8. 제 1 항에 있어서,
    분석물질 검출 장치는 측면 흐름 포맷 장치(lateral flow assay format apparatus)인 분석물질 검출 장치.
  9. 제 1 항에 따른 장치에 다량의 샘플을 사용하는 단계를 포함하고, 샘플은 화학반응이 일어나는 흡수막으로 이동하며, 신호의 존재가 분석물질이 샘플 내에 존재한다는 것을 나타내는 분석물질의 존재를 결정 또는 검출하는 방법.
  10. 제 9 항에 있어서,
    신호는 상기 분석물질과 착물을 이루는 입자 내의 란탄족(III) 킬레이트에 의해 발생되는 방법.
  11. 제 10 항에 있어서,
    란탄족(III) 킬레이트는 입자당 30,000 - 1,000,000개의 유로퓸(III) 킬레이트를 포함하는 방법.
  12. 제 11 항에 있어서,
    란탄족(III) 킬레이트는 유로퓸(III), 테르븀(III), 사마륨(III) 또는 디스프로슘(III)의 킬레이트 또는 이들의 조합을 포함하는 방법.
  13. 제 9 항에 있어서,
    샘플은 생물학적 샘플인 방법.
  14. 제 13 항에 있어서,
    샘플은 혈액, 혈청, 원형질, 소변, 타액, 땀 및 생물학적 또는 환경적 샘플을 가공한 액체 배지로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  15. 제 9 항에 있어서,
    분석물질은 항원, 항체, 핵산 및 하프텐으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  16. 제 9 항에 있어서,
    화학 반응은 항원, 항체, 핵산, 비오틴 또는 비오틴 유사체, 스트렙타비딘, 아비딘 및 하프텐으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 화학물질과 일어나는 방법.
  17. 제 9 항에 있어서,
    샘플 내의 여러 형태의 분석물질이 검출되는 방법.
  18. 제 9 항에 있어서,
    장치는 측면 흐름 측정 포맷 장치인 방법.
  19. 제 9 항에 있어서,
    분석물질은 병원체에 특이적인 방법.
  20. 제 1 항에 따른 장치를 포함하는 컨테이너; 및
    키트 사용에 대한 지침;
    을 포함하는 키트.
KR1020057020838A 2003-05-02 2004-05-03 크로마토그래피 측정 시스템 KR100804202B1 (ko)

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US46771703P 2003-05-02 2003-05-02
US60/467,717 2003-05-02

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