CN103308489B - 利用时间分辨上转换发光技术的侧向流动免疫测定法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于检测和量化分析物的免疫层析测定装置，利用上转换发光探针来检测时间分辨发光信号。利用时间分辨上转换发光技术的侧向流层析测定方法比传统的荧光侧向流层析测定方法更具有吸引力。可设计一种简单而又低成本的读数装置，用于测量长寿命的上转换延迟发光，而无需使用昂贵的滤光片和反射镜。例如，读数装置可利用IR？LED激光来产生脉冲IR光子，从一侧激发在侧向流层析装置上捕获的探针；利用硅光电二极管在一定时段的延迟之后在另一侧检测可见光区域中的长寿命发光信号。
Description
技术领域
本发明属于检测技术领域，具体涉及一种利用时间分辨上转换发光检测技术进行侧向流免疫层析测定的方法及其装置，更具体的涉及一种用于检测分析物在样品中是否存在及其含量的测定方法。
背景技术
基于膜的侧向流动免疫测定(lateralflowimmunoassays,LFA)已被商品化而用于对大量分析物的测定。基于侧向流动免疫测定技术平台的医疗诊断产品的实例包括妊娠测试和药物滥用测试。目前，这些测试由于其成本低和使用方便而主要用于即时检测(pointofcare,POC)和非处方(overthecounter,OTC)测试市场。大多数使用该平台的现有商品可提供定性和半定量结果。最近，已开发出一些能够提供定量测量的侧向流层析测定技术。这些技术使用一些与侧向流层析测定格式相结合的检测技术。已报道的检测技术包括吸光率或反射率；传统的荧光、磷光、时间分辨荧光和磷光、磁场、表面增强拉曼光谱、以及上转换荧光。这些不同检测技术的关键是使用了不同类型的可被测量的探针。例如，使用诸如金颗粒和染色胶乳颗粒的有色颗粒来进行吸光率或反射率测量。可使用诸如封装有荧光染料的量子点和胶乳颗粒的荧光颗粒作为探针来进行荧光测量。已报道可使用具有长发射寿命的磷光颗粒来进行侧向流动免疫测定，以通过使用时间分辨发光测量来量化分析物。半导体纳米颗粒通常作为探针而用于对侧向层析分析物的表面增强拉曼测量中。磁性颗粒也已作为探针而与侧向流动免疫测定相结合，用于通过测量颗粒磁场而量化分析物。虽然所有这些检测技术都具有其各自的优点，但就检测性能和成本而言均不完美。例如，基于吸光率或反射率的LFA技术可相对简单且制造成本低。它们均具有灵敏度低的明显缺点。此外，基于颜色的检测技术不能检测基于血液的样品，而需在测量前进行样品处理，以除去红细胞。传统的基于荧光的侧向流层析测定已显示出高的灵敏度。然而，该技术由于需要诸如带通滤波片和反射镜的昂贵的光学元件而显得相当复杂而又昂贵。基于表面拉曼的侧向流层析测定系统也相当复杂而又昂贵。基于表面拉曼的侧向流层析测定系统已报道具有良好的检测灵敏度，且还由于低背景干扰而可提供更好的特异性。基于磁场的LFA技术具有良好的灵敏度和特异性。然而，侧向层析装置的检测区域和校准区域对于检测器必须是透明的。这很不方便，且由于试剂和装置未与用户完全隔开而易于受到污染。时间分辨荧光侧向层析最近也已报道具有良好的灵敏度和特异性。该系统据报道比诸如传统的荧光和表面增强拉曼的其它侧向层析检测系统成本低。然而，只有有限数量的现有探针适用于该检测平台。这些探针通常需要紫外线或近紫外线激发源，而这些激发源通常可能干扰诸如血样的分析物和样品基质。
更近以来，已开发出整合到侧向流层析测定装置内的上转换磷光体颗粒，用于对分析物的高灵敏度检测。该检测平台的优点包括由于样品基质的最小背景干扰而具有潜在的高检测灵敏度、以及近红外激发更深地穿入到组织和其它样品基质内。该平台的一个最大缺点是难以获得高度均匀且表面官能化的上转换磷光体纳米颗粒。该平台的另一缺点是需要使用强大的激发红外激光和昂贵的滤光器，用于将可见荧光与强的红外激光激发分离开。该组合使得使用透射模式来进行荧光测量不切实际，而使用透射模式进行荧光测量是优选的测量模式，与反射测量模式相比可简化读数装置和降低成本。因此，目前需要一种用于量化分析物的简单、便宜、使用方便而又灵敏度高的基于膜的测定系统。本发明因此而来。
发明内容
本发明目的在于提供一种用于检测分析物在样品中是否存在及其含量的测定方法，解决了现有技术中激发光在近紫外线区域中被分析物本身和液态样品基质吸收而导致显著降低了结果的准确性等问题。
为了解决现有技术中的这些问题，本发明提供的技术方案是：
一种用于检测分析物的侧向流层析测定装置，包括：
(1)叠置在固相支持垫上的多孔滤膜，所述多孔滤膜设置有检测区域；所述检测区域固定有第一特异性结合部；
(2)结合物释放垫，与所述多孔滤膜流体连通，且沉积有结合物探针；其中所述结合物探针具有由第二特异性结合部改性的时间分辨上转换发光探针。
优选的，沿所述液体流动方向还设置有而与所述检测区域物理性分离的校准区域，所述校准区域固定有第三特异性结合部。
优选的，还包括吸收垫，用于收集流经所述检测区域和校准区域的液体。
优选的，所述结合物释放垫包括可释放的校准结合物探针，该校准结合物探针具有由第四特异性结合部改性的时间分辨上转换发光探针。
优选的，所述支持垫对于可见光大体上是透明的，且透射率超过70％。
优选的，所述支持垫对于可见光大体上是不透明的，且透射率小于10％。
优选的，结合物探针是微米和纳米颗粒，且这些颗粒当被近红外和红外光子激发时，在可见光区域中产生发射寿命大于约10微秒的发光。
优选的，微米和纳米颗粒封装有镧系元素钐、镝、铕、铽的螯合物或其组合。
优选的，微米和纳米颗粒是掺杂有镧系元素钐、镝、铕、铽或其组合的纳米晶体。
优选的，检测区域内设置用于与多种分析物结合的多种捕获探针试剂。
优选的，结合物探针发出能量比激发光子高的发光。
优选的，结合物探针发光，且峰值位于比激发光的波长短50nm以上的波长处。
优选的，检测区域包括多个检测区域。
优选的，特异性结合部是抗原或抗体。
本发明的又一目的在于提供一种用于检测和量化分析物的侧向流层析测定装置，包括：
(1)叠置在固相支持垫上的多孔滤膜，其中所述支持垫对可见光大体上是透明的，且所述多孔滤膜设置有沿液体流动方向而被物理性分离的检测区域和校准区域；所述检测区域固定有第一特异性结合部；所述校准区域固定有第三特异性结合部；
(2)结合物释放垫，与所述多孔滤膜流体连通，且沉积有与液体样品可释放地接触的检测结合物和校准结合物，其中所述检测结合物具有由第二特异性结合部改性的上转换发光探针；所述校准结合物具有由第四特异性结合部改性的时间分辨上转换发光探针；
(3)吸收垫，用于收集流经所述检测和校准区域的所述液体。
优选的，特异性结合部是抗原或抗体。
本发明的另一目的在于提供一种用于检测测试样品中分析物是否存在及其含量的方法，包括下列步骤：
i)提供一种侧向流层析测定装置，所述装置包括与结合物介质流体连通的多孔滤膜，该结合物介质包括由与所述分析物结合的结合物探针，所述结合物探针具有第二特异性结合部改性的时间分辨上转换发光探针，且所述结合物探针当被脉冲的近红外或红外光源激发时在可见光区域中具有大于约1微秒的发光发射寿命，所述多孔滤膜上设置检测区域、检测区域下游的校准区域，所述检测区域固定有与所述分析物结合的第一特异性结合部，所述校准区域固定有与所述探针结合的第三特异性结合部；
ii)使所述结合物探针与所述测试样品接触，并带动所述探针流动到所述检测区域和所述校准区域；
iii)使所述检测区域受到近红外或红外照明的脉冲作用，在可见光区域中产生检测信号，且在脉冲激发后一定延迟之后测量所述检测信号的强度，其中使用发光读数装置来提供辐射和测量所述检测信号的强度，所述发光读数装置包括近红外或红外脉冲激发源以及用于在可见光区域中发光的时间选通检测器；
iv)使所述校准区域受到近红外或红外脉冲激发的作用而在可见光区域中产生校准发光信号，且在脉冲激发一定延迟之后测量所述校准信号的强度；以及
v)将所述检测信号的强度与所述校准信号的强度作比较，其中在所述测试样品内的所述分析物的数量与由所述校准信号校准过的所述检测信号的强度成正比。
优选的，所述检测区域和所述校准区域同时受到照明脉冲的作用。
优选的，同时测量所述检测信号的强度和所述校准信号的强度。
优选的，在每个脉冲激发后约20微秒至约200微秒之后测量所述检测信号的强度。
优选的，在每个脉冲激发后一定延迟之后测量所述检测信号的强度。
优选的，在每个脉冲激发后一定延迟之后测量所述校准信号的强度。
本发明的一种具体实施方式是一种用于检测和量化分析物的侧向流层析测定装置，包括：(1)叠置在固相支持垫上的多孔滤膜；支持垫对可见光大体上是透明的，且多孔滤膜具有沿液体流动方向分为检测区域和校准区域；(2)第一特异性结合部固定在检测区域上；(3)第二特异性结合部固定在校准区域上；(4)与多孔滤膜流体连通的结合物释放垫，其上沉积有与液体样品接触可释放的检测结合物和校准结合物；检测结合物和校准结合物具有分别由第三和第四特异性结合部改性的时间分辨上转换发光探针；(5)吸收垫，用于收集流经检测区域和校准区域的液体。
本发明的另一种具体实施方式是一种用于检测和量化分析物的方法，包括：(1)提供一种具有检测区域的侧向流层析测定装置，其利用荧光发射寿命大于约1微秒的上转换发光探针；(2)将样品置于该侧向层析装置上；(3)允许样品与上转换发光探针混合，并流向检测区域；(4)采用由脉冲近红外或红外光源激发并采用时间选通检测器的时间分辨荧光读数装置，测量在检测区域捕获的探针的时间分辨上转换荧光信号；(5)将测得的信号与标准曲线作比较，以获得样品中分析物的浓度。
上转换发光探针可包括掺杂有镧系元素钐、镝、铕、铽或其组合的上转换纳米晶体。上转换发光探针也可包括镧系元素钐、镝、铕、铽或其组合的某些螯合物。上转换发光探针还可包括封装有镧系元素钐、镝、铕、铽或其组合的某些螯合物以及掺杂有镧系元素的上转换纳米晶体的微米颗粒和纳米颗粒。此外，上转换发光探针的发射寿命可大于10微秒，在一些实施方式中大于50微秒，在一些实施方式中从100微秒至约1000微秒。同样地，上转换发光探针的反斯托克斯位移可大于50纳米，在一些实施方式中大于100纳米，在一些实施方式中从250纳米至约350纳米。可使用分析物的特异性结合部来对探针进行改性。
本发明的另一种具体实施方式是一种用于检测和量化分析物的方法，包括：(1)为侧向流层析测定装置提供检测区域和校准区域；侧向流层析测定装置包括与上转换发光探针流体连通的多孔滤膜，且该上转换发光探针的荧光发射寿命大于50微秒，反斯托克斯位移大于100纳米；(2)将样品置于该装置上；(3)允许样品与上转换发光探针混合，并流向检测区域和校准区域；(4)采用由脉冲近红外或红外激发源和时间选通检测器构成的时间分辨荧光读数装置，分别测量在检测区域和校准区域捕获的探针的时间分辨上转换荧光信号；(5)将检测信号的强度与校准信号作比较，其中分析物的数量与由校准信号的强度校准过的检测信号的强度成正比。可以同时或分别激发校准区域、检测区域处的上转换发光探针，也可同时或分别测量校准区域和检测区域的上转换发光信号。
本发明公开了一种用于检测和量化分析物的免疫层析测定装置。该装置利用上转换发光探针来检测时间分辨发光信号。由于上转换发光探针具有相对较长的发射寿命，因而可轻易地通过延迟发光检测来除去样品自发荧光产生的背景干扰和激发源产生的光散射。此外，上转换发光探针可被诸如LED激光的近红外(Infrared,IR)或红外光源激发，并在可见光区域中发出长寿命的强发光。与紫外线和可见光相比，近红外和红外光可深入到样品基质内的较深处，更有效地激发探针，而并非样品基质，因而具有较少的背景噪声和较高的检测灵敏度。这些特征使利用时间分辨上转换发光技术的侧向流层析测定方法比传统的荧光侧向流层析测定方法更具有吸引力。可设计一种简单而又低成本的读数装置，用于测量长寿命的上转换延迟发光，而无需使用昂贵的滤光器和反射镜。例如，读数装置可利用IRLED激光来产生脉冲IR光子，从一侧激发在侧向流层析装置上捕获的探针；利用硅光电二极管在一定时段的延迟之后在另一侧检测可见光区域中的长寿命发光信号。
根据本发明的一种具体实施方式，公开了一种用于检测分析物在样品中是否存在及其含量的测定方法。该测定方法中结合物探针是一种发光标记，具体的为上转换发光标记(up--convertingluminescentlabel，即反-斯托克斯发光标记，Anti-Stokes)，能够在短于激发光源波长的波长处发出寿命超过5s的强发光。
术语说明
术语“分析物”通常是指待检测的物质。例如，分析物可包括抗原、半抗原、抗体及其组合。分析物包括但不限于毒素、有机化合物、蛋白质、肽、微生物、氨基酸、核酸、激素、类固醇、维生素、药物、细菌、病毒颗粒以及上述任何物质的代谢物或抗体。
术语“样品”一般是指有可能含有分析物的材料。样品可从来源处获得后直接使用，或经过预处理，以对样品进行改性。测试样品可来源于任何生物来源，例如生理体液，包括血液、唾液、眼液、脑脊髓液、汗液、尿液、牛奶、腹水、粘膜液、滑液、腹水、羊水等。测试样品可在使用前经过预处理，例如由血液制备血浆、稀释粘性液体等。除生理体液外，还可应用于其它液体样品，例如水、食品等环境或食品生产领域的测定。
本发明公开了一种用于检测和量化样品中分析物的侧向流层析测定装置。该装置通过使用脉冲的近红外或红外光子来激发上转换发光探针，从而利用时间分辨上转换发光来检测信号。由于探针可在近红外区域中被激发且具有长的发射寿命，因而实际上可在检测期间除去来自许多源的诸如散射光和自发荧光的背景干扰。此外，用于本发明的发光读数装置可具有简单而又低成本的特点。例如，读数装置可利用近红外或红外发光二极管(light-emittingdiode,LED)来进行脉冲激发，且利用硅光电二极管来准确地检测在基于膜的测定装置上的延迟发光，而无需使用诸如单色器或带通滤光器的昂贵的光学元件。
图1显示一种典型的由多孔滤膜10叠置在支持底物11上而构成的侧向流层析测定装置。该支持垫对于紫外线和/或可见光和/或近红外或红外光可以是或不是显著半透明的。多孔滤膜10可选自测试样品能够根据毛细管作用而穿过的多种材料。例如，多孔滤膜可包括但不限于天然和合成的材料，例如纤维素材料、纸和纤维素衍生物、醋酸纤维素和硝化纤维、聚醚砜和尼龙膜。一种优选的多孔滤膜是由硝化纤维和/或聚酯砜材料制成的。多孔滤膜上设置有固定一或多个特异性结合部30的检测区域20。多孔滤膜上还设置有固定有一或多种特异性结合部31的校准区域21。
侧向流层析测定装置也可包括吸收垫12。吸收垫用于吸收已通过毛细管作用迁移经过整个多孔滤膜的液体。通常，用于制造吸收垫的吸收材料可包括但不限于天然和合成材料，例如纤维素材料、纸和纤维素衍生物、醋酸纤维素和硝化纤维。
侧向流层析测定装置也可包括结合物释放垫13，在此沉积有与一或多个特异性结合部33通过共价结合或物理吸附的方式连接上转换发光探针(结合物探针40)，且这些上转换发光探针能够释放和悬浮地与液体样品接触。该结合物释放垫包括但不限于玻璃纤维垫。
侧向流层析测定装置还可包括用于放置样品的样品垫14。样品垫可由天然和合成材料制成，例如纤维素材料、纸和纤维素衍生物、醋酸纤维素和硝化纤维。样品垫14、结合物释放垫13、多孔滤膜10和吸收垫12通常叠置达一定的重叠程度，以使这些部件相互间流体连通。
为进行测定，样品可首先与结合物探针混合，并随后置于具有检测区域的侧向层析装置的多孔滤膜上。在这种情况下，侧向层析装置可无需样品垫和结合物释放垫。混合物随后流过检测区域而与特异性结合部相互作用，从而形成检测线，该检测线可通过时间分辨荧光读数装置来测量。
当侧向层析装置具有样品垫和结合物释放垫时，样品可直接置于样品垫14上，并随后流到结合物释放垫13处，在此结合物探针从该结合物释放垫释放和悬浮到流动液体内。样品液体随同结合物探针进一步流到检测区域20和校准区域21中，并最终流到吸收垫12上。虽然只显示出一个结合物释放垫13，但应理解，多个结合物释放垫也可用于本发明。为有助于准确检测特定分析物，可在结合物释放垫的不同区域应用连接的上转换发光探针。结合物探针可分别用于对分析物的检测和校准。一般地，这类上转换发光探针可以是掺杂有镧系元素的纳米晶体、镧系元素螯合物、封装有镧系元素掺杂或封装镧系元素螯合物的纳米晶体的颗粒。
上转换发光探针可被近红外和红外光上转换激发以及“时间分辨发光检测”。上转换激发包括两个或更多个光子同时被探针吸收而达到激发状态，然后发射一个比激发光子能量更高或波长更短的光子。这样，诸如近红外和红外光子的长波长激发光通常可用于激发探针，由此可最大程度减小自发荧光和背景干扰的负面影响。时间分辨发光测量包括使用短脉冲光来激发上转换，随后通常在激发之后等待一定时间(例如在约20微秒至200微秒之间)，即可测量剩余的长寿命发光信号。由此可除去任何短寿命的荧光背景信号以及散射的激发辐射。上转换激发与时间分辨发光检测结合，可除去许多背景信号，由此使灵敏度比传统荧光高出几个数量级。因此，通过利用某些上转换发光材料的发光特异性，上转换时间分辨发光检测可减少来自发射源或散射过程(源于激发辐射的散射)的背景噪声。此外，近红外和红外激发光子能够比可见光和紫外线光子更深入到多孔滤膜内，以激发大多数或所有的上转换发光探针。使用上转换发光探针来进行时间分辨发光侧向流层析测定要比其它现有检测技术的灵敏度高很多。由于可见光和紫外线激发光子只能穿透很浅的诸如硝化纤维膜的多孔滤膜层，因而实际上只有小部分探针标记被激发，由此使检测灵敏度并非最佳。
用于时间分辨上转换发光侧向流层析测定的特别有利的探针的一个选择标准包括相对高的上转换效率。高的上转换效率将会提供强信号和高的检测灵敏度。使用上转换发光探针允许使用低成本和强大的近红外和红外LED和激光。使用上转换发光探针的另一优点是对样品的干扰最小，特别是通常对于紫外线和可见光比对于近红外和红外光更透明的生物基质。例如，生物样品，其遭受到的由近红外或红外光而造成的破坏通常小于由紫外线和可见光而造成的破坏。此外，上转换发光探针通常具有相对大的反“斯托克斯位移”。术语“反斯托克斯位移”是指发光辐射的谱线或带位移到比激发线或带更短的发射波长处。由于在激发和发射波长之间的较大差异使得易于除去来自发射信号的反射激发辐射，因而相对大的反斯托克斯位移允许上转换发光探针的激发波长保持在远离其发射波长处，而且是有利的。此外，上转换发光探针的近红外和红外激发产生最少的来自诸如蛋白质和组织的样品基质的自发荧光。再者，大的反斯托克斯位移也将最大程度地减少对用于除去背景干扰的昂贵、精密度高的滤波器的需求。例如，上转换发光探针的反斯托克斯位移大于50纳米，在一些实施方式中大于100纳米，在一些实施方式中从250纳米至约350纳米。
用于时间分辨上转换发光侧向流层析测定的特别有利的探针的另一个选择标准包括相对长的发射寿命。长发光寿命是有利的，以使在任何短寿命的背景信号消失之后，探针仍能良好地发射其信号。此外，长发光寿命使得有可能使用低成本的时间选通电路来进行发光测量。例如，用于本发明的发光探针可具有大于1微秒的发光寿命，在一些实施方式中大于10微秒，在一些实施方式中大于50微秒，在一些实施方式中在100微秒至约1000微秒的范围内。
用于时间分辨上转换发光侧向流层析测定的特别有利的探针的又一个选择标准是探针易于改性，由此可连接到特定的特异性结合部上。连接可以是与特异性结合部的物理吸收或共价键合。这对于提供良好的检测特异性和试剂稳定性是重要的。
一类适用于时间分辨上转换发光侧向流层析测定的发光探针为掺杂镧系元素钐(Sm(III))、镝(Dy(III))、铕(Eu(III))和铽(Tb(III))的纳米晶体、这些镧系元素的螯合物。另一类适宜的探针是封装有这些镧系元素螯合物和/或掺杂镧系元素纳米晶体的微米和纳米颗粒。又一类适宜的发光探针是银-金-配体的纳米晶体和簇(silver-gold-ligandclusters)，或封装有这些簇和纳米晶体的颗粒。这些探针具有相对高的上转换发光效率和长的发光寿命，可通过近红外和红外光子而被高效激发。此外，这些探针也具有大的反斯托克斯位移，通常大于100nm。一种适宜的铕螯合物是N-(对异硫氰基苄基)-二亚乙基三胺四乙酸-Eu+3(N-(p-isothiocyanatobenzyl)-diethylenetriaminetetraaceticacid-Eu+3)。
本发明可使用多种形式的发光探针。发光探针的可使用的形式包括但不限于，如聚合物、脂质体、树枝状聚合物以及其它微米或纳米级结构。探针也可以是微米颗粒和纳米颗粒的形式。例如，在一种具体实施方式中，探针是封装有镧系元素螯合物或掺杂纳米晶体的胶乳微米颗粒。探针优选具有允许特异性结合部共价连接的官能团。这些官能团包括醛基、羧基、氨基、羟基或其酰肼衍生物。上转换发光分子是指诸如镧系元素螯合物的分子，它们能够产生强大的具有相对长寿命的上转换发光，且相对于激发时的激发光源而发生蓝移。例如，在一种具体实施方式中，使用封装有上转换发光分子的微米胶乳颗粒。胶乳颗粒通常由以下材料制成：聚苯乙烯、丁二烯苯乙烯、苯丙-乙烯基三元共聚物、聚甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸乙酯、苯乙烯-马来酸酐共聚物、聚乙酸乙烯酯、聚乙烯基吡啶、聚二乙烯基苯、聚对苯二甲酸丁二醇酯、丙烯腈、氯乙烯-丙烯酸酯等，或其醛基、羧基、氨基、羟基或酰肼衍生物。
当使用探针颗粒时，探针颗粒的大小可随某些因素而改变，例如所选探针颗粒的类型、滤膜孔径以及滤膜成分。探针颗粒的粒径可在0.01微米至1,000微米的范围内，在一些实施方式中在0.01微米至100微米的范围内，在一些实施方式中从0.01微米至10微米。在一种具体实施方式中，颗粒的平均直径在0.1微米至2微米的范围内。通常，颗粒在外形上大致呈球形，虽然包括但不限于板状、棒状、条状、不规则形状的其它形状也适用于本发明。如本领域技术人员所理解的那样，可在大范围内改变颗粒的成分、形状、大小和/或密度。
在一些情况下需要改性的探针，使其更易于与分析物特异性地结合。可使用某些特异性结合部来改性探针，以形成结合物探针。特异性结合部通常是指为特异性结合对的两个不同的分子，其中一个分子以化学和/或物理的方式与第二个分子结合。例如，免疫反应的特异性结合部包括抗原、半抗原、适体、抗体及这些的复合物，这些的复合物包括那些由重组DNA方法或肽合成而形成的复合物。抗体可以是单克隆或多克隆抗体、重组蛋白质或这些物质的混合物或片段、以及抗体与其它特异性结合部的混合物。其它常见的特异性结合对包括但不限于生物素和亲和素、生物素和链酶亲和素、抗体结合蛋白质(例如蛋白质A或G)和抗体、碳水化合物和外源凝集素、互补核苷酸序列(包括在DNA杂交测定中使用的用于检测目标核苷酸序列的标记和捕获核苷酸序列)、互补氨基酸序列(包括那些由重组方法而形成的互补氨基酸序列)、效应物和受体分子、激素和激素结合蛋白质、酶辅助因子和酶、酶抑制剂和酶，等等。此外，特异性结合对还包括原特异性结合部的类似物。例如，分析物的衍生物或片段(即分析物的类似物)只要具有至少一个与分析物相同的表位也可使用。
可使用多种众所周知的技术来将特异性结合部连接到探针上。例如，可通过使用羧基、氨基、醛基、溴乙酰基、碘乙酰基、巯基、环氧基和其它反应性或连接性官能团、以及残留的自由基和阳离子自由基，使特异性结合部共价结合到探针(例如微米颗粒)上，由此可完成蛋白质偶联反应。由于微米颗粒表面可含有表面浓度相对高的极性基团，所以表面官能团也可作为官能化的共聚单体(co-monomer)结合到探针上。此外，虽然微米颗粒探针通常在合成后已经官能化，但在例如聚(苯硫酚)的某些情况下，微米颗粒能够在无需另外改性的条件下直接与蛋白质共价结合。例如，共价结合的一种具体实施方式为：第一步骤是使用碳化二亚胺来活化在颗粒表面上的羧基。在第二步骤中，被活化的羧基与抗体的氨基反应，形成酰胺键。除共价结合外，也可在本发明中使用诸如物理吸附的其它连接技术。
多种侧向流层析测定装置可与时间分辨上转换发光检测读数装置构建在一起。如图1所示，首先，含有分析物的待测样品置于样品垫上。待测样品随后移到结合物释放垫13上，在此分析物与结合物探针40混合，形成分析物复合物。在一种具体实施方式中，结合物探针40是由封装有镧系元素螯合物的微米颗粒形成的，结合物探针40与分析物的特异性结合部结合。此外，由于结合物释放垫13与多孔滤膜10流体连通，复合物可从结合物释放垫13迁移到多孔滤膜10上的检测区域20处。
检测区域20包括通常能够与探针形成化学键合或物理吸附连接的且固定在检测区域的特异性结合部特异性结合部30。例如，特异性结合部特异性结合部30可包括生物结合部。这类结合部可包括但不限于抗原、半抗原、抗体、蛋白质A或G、亲和素、链酶亲和素、第二抗体及其复合物。理想的是，这些生物结合部能够与存在于微米颗粒上的另一特异性结合部(例如抗体)结合。
这些特异性结合部通过结合特异性地捕获结合物探针与分析物结合的复合物上的结合位。例如，诸如抗体、抗原的分析物具有两个结合位。一旦到达检测区域20，这些结合位中的一个就被复合物探针的特异性结合部占据。然而，分析物的自由结合位可结合到这些固定的特异性结合部上。结合物探针一旦结合到固定特异性结合部上，就形成新的三元夹心复合物。
虽然检测区域20可指示分析物的存在，但只使用检测区域20通常难以量化分析物。因此，测定装置也可包括校准区域21。校准区域21设置在多孔滤膜10上，且位于检测区域20的下游。校准区域21具有特异性结合部31，且该特异性结合部31能够与通过检测区域的任何余下的未捕获的结合物探针40结合。在校准区域21，这些未捕获的结合物探针随后与校准区域中的特异性结合部结合。校准区域21中的特异性结合部可与检测区域21中的特异性结合部相同或不同。此外，与检测区域20类似，校准区域21也可在任何方向上提供多个校准区域，以便可更准确地确定在测试样品内特定分析物的浓度。每个校准区域可包括相同的特异性结合部，或可包括用于捕获不同结合物探针的不同特异性结合部。
一旦被捕获，可使用时间分辨上转换发光读数装置来测量结合物探针在检测区域20和校准区域21中的时间分辨上转换发光信号。可通过许多不同方式来构建时间分辨上转换发光读数装置。图2显示时间分辨上转换发光读数装置的一种具体实施方式，它用于以透射模式来测量来自检测区域和校准区域的时间分辨上转换发光信号。用于该透射模式测量的侧向层析装置的支持垫11的透射率对于上转换可见荧光达70％以上。光源100和200向检测和校准区域20和21同时提供脉冲的近红外光或红外激发光，分别从多孔滤膜10侧来激发捕获的上转换发光探针。检测器300和400位于侧向层析装置的对侧，分别与检测和校准区域20和21对准，通过时间选通方式来测量来自捕获探针的上转换可见发光信号。通常，发光读数装置包括一或多个优选为近红外和红外LED和激光的脉冲激发源和与其它可选择部件如滤光器相互连通的光电检测器。使用脉冲激发源和时间选通电路检测允许对只来自上转换发光探针的上转换发光进行特异性检测，同时抑制来自存在于样品中的其它物种的通常寿命比较短的发射信号。脉冲激发源和时间选通电路检测可选择地与滤光片结合。
图3显示时间分辨上转换发光读数装置的另一种具体实施方式，它用于以反射模式来测量来自检测区域和校准区域的时间分辨上转换发光信号。用于该反射模式测量的侧向层析装置的支持垫11的透射率对于上转换可见荧光可小于10％。光源100和200向检测和校准区域20和21同时提供脉冲的近红外光或红外激发光，分别从多孔滤膜10侧来激发捕获的上转换发光探针。检测器300和400位于侧向层析装置的同侧，分别与检测和校准区域20和21对准，用于以时间选通方式来测量来自捕获探针的上转换可见发光信号。
无论读数装置的构造如何，通过将在检测区域20捕获的探针的发光信号Is与校准曲线关联起来，可测量分析物的含量。强度信号Is也可与在校准区域21上捕获的探针的发光强度信号Ic作比较。发光强度信号Is直接与发光强度信号Ic作比较时，可预先确定和得知探针在校准区域21的总量，因此可用于校准目的。例如，在一些实施方式中(例如夹心法测定)，分析物的数量和Is与Ic的比值成正比。在其它实施方式中(例如竞争法测定)，分析物的数量和Is与Ic的比值成反比。以检测区域20的信号强度范围为基础，可确定分析物的一般浓度范围。这样可在大致相同的情况下同时进行校准和采样测试，由此提供可靠的定量或半定量结果，且灵敏度较高。
如果需要，可在已知分析物的浓度范围内绘制Is与Ic的比值相对于分析物浓度变化的曲线，从而得到校准曲线。为确定未知测试样品中分析物的数量，随后可根据校准曲线将信号比转换为分析物的浓度。应注意的是，可绘制Is与Ic之间的其它数学关系相对于分析物浓度的变化，以获得校准曲线。例如，在一种具体实施方式中，可绘制Is/(Is+Ic)的数值相对于分析物浓度的变化，以获得校准曲线。
如上所述，可在侧向层析装置中使用夹心测定法、竞争性测定法等。夹心测定法通常包括将测试样品与分析物的抗体混合步骤。这些分析物的抗体可以移动连接到诸如染色胶乳、胶质金属溶胶或放射性同位素的探针标记上形成结合物探针。所得混合物随后与包括在检测线或检测区域固定有分析物抗体的层析测定介质接触。层析测定介质通常采用类似于试纸条形式。当分析物和结合物探针的复合物到达在层析测定介质上的检测区域时，与固定有分析物抗体发生结合，且结合后的结合物探针-分析物-抗体复合物抗体固定在该检测区域中。由此指示分析物的存在。该技术可用来获得定量或半定量结果。
在竞争性测定中，结合物探针通常是标记的分析物或分析物的类似物，它能与存在于样品中未标记的分析物的与分析物抗体竞争结合。竞争性测定通常用于检测诸如半抗原的分析物，且每个半抗原是单价的，能够只与一个抗体分子结合。
虽然已在上文中描述了装置配置的各种实施方式，但应理解，本发明的装置通常可具有任何需要的配置，且无需包括上文所述的所有部件。
附图说明
下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：
图1是本发明的基于膜的侧向流层析检测装置的一种具体实施方式的透视图；
图2是透射测量模式的示意图；
图3是反射测量模式的示意图；
图4是在例1中获得的上转换发光探针颗粒的扫描电子显微图片；
图5是在例2中获得的结合物探针的时间分辨上转换激发与发射光谱图；
图6是在例2中获得的结合物探针的上转换发射衰减图。
具体实施方式
以下结合具体实施例对上述方案做进一步说明。应理解，这些实施例是用于说明本发明而不限于限制本发明的范围。实施例中采用的实施条件可以根据具体厂家的条件做进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。
实施例1：上转换发光探针的制备
在搅拌下向适量的(200μl)羧酸官能化聚甲基丙烯酸胶乳颗粒PP02N(直径0.33μm)的水溶液中加入一定量的乙醇，达到溶剂总量的65％。在搅拌下向该颗粒悬浮液中缓慢加入适量的(例如占胶乳颗粒重量的1％)含有专有铕螯合物的氯化乙烯(例如占总溶剂重量的1％)。搅拌混合物达半小时。随后在一定时段内(例如2小时)向搅拌混合物中缓慢加入适量的水(例如为初始溶剂体积总量的三倍)。在加完水后，通过旋转蒸发器而除去混合物中大部分的乙醇。随后使用90％的乙醇通过离心分离而将颗粒清洗两次。之后使用水清洗颗粒两次。清洗后的颗粒随后通过超声处理而悬浮在含有0.5％Tween20的Tris缓冲液中。图4显示颗粒的扫描电子显微图片。
实施例2：抗体与上转换发光探针的连接形成结合物探针
首先采用碳化二亚胺通过标准方法来活化在实施例1中制得的探针的羧酸表面基团。将反生物素抗体与活化的探针混合达四小时。探针采用Hepes缓冲液清洗四次，并悬浮在含有10mg/mlBSA和0.5％Tween20的Hepes缓冲液中进行储存。
实施例3：在实施例2中制得的结合物的时间分辨上转换激发与发射光谱
使实施例2中制得的适量的结合物悬浮在水中，制得在细胞中的颗粒悬浮液(例如浓度为10ng/细胞)。使用下列测量参数获得时间分辨上转换激发与荧光光谱，并显示在图5中。对于时间分辨上转换荧光光谱：在870nm处激发，采样窗口为50μs，每次闪光时间为100μs，初始延迟为0.01μs，闪光次数为10次，扫描次数为10次，荧光收集从500nm至800nm。对于时间分辨上转换激发光谱：在615nm处发射，采样窗口为50μs，每次闪光时间为100μs，初始延迟为0.01μs，闪光次数为10次，扫描次数为10次，激发收集如图5所示从700nm至900nm。
实施例4：在实施例2中制得的结合物的上转换荧光的荧光衰减
使实施例2中制得的适量的结合物悬浮在水中，制得在细胞中的颗粒悬浮液(例如浓度为10ng/细胞)。衰减情况显示在图6中。使用下列参数来测量荧光衰减：在870nm处激发，在615nm处发射，采样窗口为50μs，每次闪光时间为100μs，初始延迟为0.01μs，闪光次数为10次，扫描次数为10次。
实施例5：生物素化b-酪蛋白的制备
向含有适量的b-酪蛋白(例如500mg)的硼酸盐缓冲液中加入适量的(例如300mg)NHS-LC-生物素的硼酸盐缓冲液。使该混合物反应几个小时。在反应后，从在PBS缓冲液中的非结合生物素中通过透析而分离出生物素轭合的b-酪蛋白。
实施例6：侧向层析装置的制备
在塑料支持卡片上的硝化纤维膜被制成长条形，且含有10mg/ml生物素结合的b-酪蛋白，并置于水中，形成检测区域。膜卡片在室温下干燥。纤维素吸收垫叠置在硝化纤维膜的端部，且与硝化纤维膜重叠4mm。将卡片剪成6mm宽的长条。
实施例7：量化由检测区域捕获的结合物
向微量滴定板中的六个井1、2、3、4、5和6中分别加入不同数量的在实施例2中制得的结合物探针0、5、20、50、100和200ng，这些都溶解在含有0.1％Tween20和5mg/mlBS的60μl50mMPBS缓冲液(pH:7.2)中。向每个井中插入在实施例6中制得的侧向层析装置。在20分钟之后，允许侧向层析装置风干达30分钟。通过使用870nm的脉冲光来激发检测区域，在20μs的延迟时在每个侧向层析装置的检测区域上测量在615nm处的时间分辨上转换发光。延迟的上转换发光的强度在615nm时分别为7、11、19、39、80和170。
上述实例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人是能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所做的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (18)
1.一种用于检测分析物的侧向流层析测定装置，包括：
(1)叠置在固相支持垫上的多孔滤膜，所述多孔滤膜设置有检测区域；所述检测区域固定有第一特异性结合部；
(2)结合物释放垫，与所述多孔滤膜流体连通，且沉积有结合物探针；其中所述结合物探针具有由第二特异性结合部改性的时间分辨上转换发光探针；
所述探针是封装有镧系元素螯合物的胶乳颗粒；所述的镧系元素螯合物，为N-(对异硫氰基苄基)-二亚乙基三胺四乙酸-Eu+3。
2.根据权利要求1所述的侧向流层析测定装置，沿液体流动方向还设置有而与所述检测区域物理性分离的校准区域，所述校准区域固定有第三特异性结合部。
3.根据权利要求2所述的侧向流层析测定装置，还包括吸收垫，用于收集流经所述检测区域和校准区域的液体。
4.根据权利要求1所述的侧向流层析测定装置，其中所述结合物释放垫包括可释放的校准结合物探针，该校准结合物探针具有由第四特异性结合部改性的上转换发光探针。
5.根据权利要求1所述的侧向流层析测定装置，其中所述支持垫对于可见光大体上是透明的，且透射率超过70％。
6.根据权利要求1所述的侧向流层析测定装置，其中所述支持垫对于可见光大体上是不透明的，且透射率小于10％。
7.根据权利要求1所述的侧向流层析测定装置，其中结合物探针是微米和纳米颗粒，且这些颗粒当被近红外和红外光子激发时，在可见光区域中产生发射寿命大于约10微秒的发光。
8.根据权利要求7所述的侧向流层析测定装置，其中检测区域内设置用于与多种分析物结合的多种捕获探针试剂。
9.根据权利要求1所述的侧向流层析测定装置，其中结合物探针发出能量比激发光子高的发光。
10.根据权利要求1所述的侧向流层析测定装置，其中结合物探针发光，且峰值位于比激发光的波长短50nm以上的波长处。
11.根据权利要求1所述的侧向流层析测定装置，其中检测区域包括多个检测区域。
12.根据权利要求1所述的侧向流层析测定装置，其中特异性结合部是抗原或抗体。
13.一种用于检测和量化分析物的侧向流层析测定装置，包括：
(1)叠置在固相支持垫上的多孔滤膜，其中所述支持垫对可见光大体上是透明的，且所述多孔滤膜设置有沿液体流动方向而被物理性分离的检测区域和校准区域；所述检测区域固定有第一特异性结合部；所述校准区域固定有第三特异性结合部；
(2)结合物释放垫，与所述多孔滤膜流体连通，且沉积有与液体样品可释放地接触的检测结合物和校准结合物，其中所述检测结合物具有由第二特异性结合部改性的时间分辨上转换发光探针；所述校准结合物具有由第四特异性结合部改性的时间分辨上转换发光探针；
(3)吸收垫，用于收集流经所述检测和校准区域的所述液体；
所述探针是封装有镧系元素螯合物的胶乳颗粒；所述镧系元素螯合物的分子，为N-(对异硫氰基苄基)-二亚乙基三胺四乙酸-Eu+3。
14.根据权利要求13所述的侧向流层析测定装置，其中特异性结合部是抗原或抗体。
15.一种使用如权利要求1-6、9-14任一项所述的侧向流层析测定装置检测测试样品中分析物是否存在及其含量的方法，包括下列步骤：
i)提供一种侧向流层析测定装置，所述装置包括与结合物介质流体连通的多孔滤膜，该结合物介质包括由与所述分析物结合的结合物探针，所述结合物探针具有第二特异性结合部改性的上转换发光探针，且所述结合物探针当被脉冲的近红外或红外光源激发时在可见光区域中具有大于约1微秒的发光发射寿命，所述多孔滤膜上设置检测区域、检测区域下游的校准区域，所述检测区域固定有与所述分析物结合的第一特异性结合部，所述校准区域固定有与所述探针结合的第三特异性结合部；
ii)使所述结合物探针与所述测试样品接触，并带动所述探针流动到所述检测区域和所述校准区域；
iii)使所述检测区域受到近红外或红外照明的脉冲作用，在可见光区域中产生检测信号，且在脉冲激发一定延迟之后测量所述检测信号的强度，其中使用发光读数装置来提供辐射和测量所述检测信号的强度，所述发光读数装置包括近红外或红外脉冲激发源以及用于在可见光区域中发光的时间选通检测器；
iv)使所述校准区域受到近红外或红外脉冲激发的作用而在可见光区域中产生校准发光信号，且在脉冲激发一定延迟之后测量所述校准信号的强度；以及
v)将所述检测信号的强度与所述校准信号的强度作比较，其中在所述测试样品内的所述分析物的数量与由所述校准信号校准过的所述检测信号的强度成正比。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述检测区域和所述校准区域同时受到照明脉冲的作用。
17.根据权利要求15所述的方法，其中同时测量所述检测信号的强度和所述校准信号的强度。
18.根据权利要求15所述的方法，其中检测信号的强度是在每个脉冲照射后延迟20μs至200μs时测量的检测信号的强度。
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| US20140170674A1 (en) | 2014-06-19 |
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