CN103293133B - 利用时间分辨上转换发光检测技术进行磁性结合测定的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于检测分析物在样品中是否存在及其含量的一般磁性结合测定方法。该方法采用磁性效应原理来分离和浓缩复杂样品中的分析物，且无需使用诸如带通滤光片的昂贵光学元件，就能通过时间分辨上转换荧光检测技术来进行高灵敏度的检测。该方法采用脉冲的长波长光来进行激发和时间延迟的发光检测，且几乎不受样品介质干扰。此外，使用长波长激发光大大简化样品制备和纯化清理过程诸如去除会显著干扰荧光探针的激发效率以及红细胞的清理操作。

Description

利用时间分辨上转换发光检测技术进行磁性结合测定的方法

技术领域

本发明属于检测技术领域，具体涉及一种利用时间分辨上转换发光检测技术进行磁性结合测定的方法，更具体的涉及一种用于检测分析物在样品中是否存在及其含量的测定方法。

背景技术

磁珠由于可轻易地通过磁场而分离且无需特殊而又昂贵的设备，因而已广泛用作分析物分离和富集的载体，通过在磁珠表面上标记以特异性粘合剂而捕获复杂样品中的欲研究物种（例如蛋白质、核酸（DNA或RNA）、细胞和微生物）。被捕获的物种通过磁铁可轻易地与样品的其余部分分离。随后，被捕获的物种可被裂解，并通过各种手段而从磁珠表面上释放出来。为检测欲研究的物种，标记有另一特异性待测物结合位点的检测探针可在磁性分离前与含待测物样品一同振荡混匀，以使一些探针可通过欲研究的物种而被捕获，形成夹心复合物。在磁珠上的捕获探针随后可与那些剩余的未结合检测探针分离。捕获探针数量取决于探针的性质而可通过各种方式来测量。捕获探针的数量与欲研究物种的数量成正比或反比，由此获得一种用于检测欲研究物种在样品中是否存在及其含量的方法。

一些众所周知的结合测定类型已与磁珠分离技术配合，实现了方便的分析物检测。这些结合测定之一是免疫测定法，它使用标记以可检测成分的免疫反应物，以可对分析物进行分析检测。对于“夹心型”免疫测定，测试样品通常首先与固定在磁珠表面上的抗体混合，以捕获分析物。抗体通常对分析物具有特异性。磁珠随后与样品的其余部分分离，之后与移动和连接到标记或探针的另一抗体混合，例如染色胶乳、胶质金属溶胶、放射性同位素、荧光染料或酶。抗体也对不同表位上的分析物具有特异性。磁珠随后通过磁铁而再次与未结合的标记或探针分离。之后测量与磁珠一同被捕获的标记的信号，且与标准曲线相联系，以获得分析物的数量。这样，由磁性免疫测定可获得一种用于确定物种存在与否的快速简便的技术。在这类测定中，已使用各种信号产生机制，包括颜色（吸收和反射率）、荧光、化学发光法、放射性和酶。

类似地，核酸（DNA和RNA）杂交测定也可与磁性分离配合，实现对样品中DNA和RNA的检测和定量。在磁性DNA/RNA杂交测定中可使用各种信号产生机制，包括颜色（吸收和反射率）、荧光、化学发光法、放射性和酶。

然而，所有这些现有的信号产生机制对于磁性结合测定都存在明显的局限。例如，基于颜色的吸光率检测灵敏度低。大多数商业磁珠呈深色和褐色，会干扰彩色探针的吸光率或反射率的测量。传统的荧光测量会受到大多数复杂生物样品的自发荧光的干扰，且需要很昂贵的仪器。此外，磁珠通常对可激发大多数荧光探针的紫外线或可见激发光具有显著的吸收作用。时间分辨荧光可消除背景荧光和自发荧光的干扰，且成本可以很低。然而，所有适用于时间分辨发光检测的有用探针均需在紫外线附近或短于450nm处被激发，而在此大多数生物样品具有显著的吸收作用。激发光在近紫外线区域中被分析物本身和样品介质吸收，由此显著降低了结果的准确性。短波长的激发光也可因光诱导氧化而损坏分析物。因此，仍需建立一种改进的荧光测量方法。目前在结合测定中需要使用一种便宜、准确而又灵敏的信号检测技术。本发明因此而来。

发明内容

本发明目的在于提供一种用于检测分析物在样品中是否存在及其含量的测定方法，解决了现有技术中激发光在近紫外线区域中被分析物本身和样品介质吸收而导致显著降低了结果的准确性等问题。

为了解决现有技术中的这些问题，本发明提供的技术方案是：

一种用于检测分析物在样品中是否存在及其含量的测定方法，其特征在于所述测定方法包括以下步骤：

（1）使含有所述分析物的样品与磁珠结合物、探针结合物接触，其中所述磁珠结合物为磁珠与第一特异性结合部连接形成，所述探针结合物为用来作为标记的检测探针与第二特异性结合部连接而成，所述检测探针在短于激发光波长的波长处发出发光寿命超过5μs的发光，所述第一特异性结合部和所述第二特异性结合部分别与所述分析物的不同表位特异性结合，形成夹心复合物；

（2）使用磁性装置将样品中磁性结合体与所述样品的其余部分分离，其中所述磁性结合体包括所述夹心复合物；

（3）使用在第一波长处的脉冲光源来激发所述分离的磁性结合体，从而在每次脉冲之后的一定延迟后，通过收集和测量在第二波长处的所述发光来获得检测信号，其中所述第二波长短于所述第一波长；

（4）将所述检测信号与校准曲线作比较，从而获得所述样品中所述分析物的数量，其中所述样品中所述分析物的数量与所述检测信号成正比。

优选的，所述分析物选自蛋白质、肽、诸如细菌的微生物、病毒、酵母、DNA和RNA、酶、抗体和抗原。

优选的，所述磁珠的大小从10nm至10μm，且与所述第一特异性结合部通过共价结合或物理吸附的方式连接。

优选的，所述含有第一特异性结合部或第二特异性结合部的待测物包括抗体、抗原、DNA和RNA。

优选的，所述检测探针包括镧系元素的螯合物、封装有所述镧系元素螯合物的颗粒、以及掺杂有所述镧系元素的磷光体纳米晶体颗粒，其中所述镧系元素选自钐、镝、铕、铽及其组合。

优选的，所述检测探针吸收长波长的双光子，且发射一个较短波长的光子，其发射寿命从约20μs至2000μs。

优选的，通过发光二极管、激光或钨灯来产生所述脉冲光源。

优选的，通过硅光电二极管和光电倍增管来测量所述发光。

优选的，所述脉冲光源和所述时间选通电路进行检测是通过定时电路来控制的。

优选的，所述信号是在每个脉冲照射后延迟20μs至200μs市测量的。。

本发明的另一目的在于提供一种用于检测分析物在样品中是否存在及其含量的测定方法，所述测定方法包括：

（1）使含有所述分析物的样品与磁珠结合物、探针结合物接触，其中所述磁珠结合物为磁珠与第一特异性结合部连接形成，所述探针结合物为用来作为标记的检测探针与分析物或分析物的类似物连接而成，所述检测探针在短于激发光波长的波长处发出发光寿命超过5μs的发光，所述第一特异性结合部和所述分析物或分析物的类似物特异性结合，形成夹心复合物；

（2）使用磁性装置将所述磁性结合体与所述样品的其余部分分离，其中所述磁性结合体包括所述夹心复合物；

（3）使用在第一波长处的脉冲照明来激发所述分离的磁性结合体，从而在每次脉冲之后的一定延迟后，通过收集和测量在第二波长处的所述发光来获得检测信号，其中所述第二波长短于所述第一波长；

（4）将所述检测信号与校准曲线作比较，从而获得所述样品中所述分析物的数量，其中所述样品中所述分析物的数量与所述检测信号成反比。

优选的，所述分析物选自小分子、蛋白质、肽、诸如细菌的微生物、病毒、酵母、半抗原、酶、抗体和抗原。

优选的，所述磁珠的大小从10nm至10μm，且与所述第一特异性结合部通过共价结合或物理吸附的方式连接。

优选的，所述第一特异性结合部是抗体、抗原、DNA或RNA。

优选的，所述检测探针选自所述镧系元素的螯合物、封装有所述镧系元素螯合物的颗粒、以及掺杂有所述镧系元素的磷光体纳米晶体颗粒，其中所述镧系元素是钐、镝、铕、铽或其组合。

优选的，所述检测探针吸收长波长的双光子，且发射一个较短波长的光子，其发射寿命从约20μs至2000μs。

优选的，通过发光二极管、激光或钨灯来产生所述脉冲照明。

优选的，通过硅光电二极管和光电倍增管来测量所述发光。

优选的，所述脉冲照明和所述时间选通检测是通过定时电路来控制的。

优选的，所述信号是在每个脉冲照射后延迟20μs至200μs市测量的。。

根据本发明的一种具体实施方式，公开了一种用于检测分析物在样品中是否存在及其含量的测定方法。该测定方法中检测探针是一种发光标记，具体的为上转换发光标记（up--convertingluminescentlabel，即反-斯托克斯发光标记，Anti-Stokes），能够在短于激发光源波长的波长处发出寿命超过5s的强发光。另一种具体实施方式中，作为标记的检测探针与分析物或分析物的类似物直接结合，因此与样品中的分析物竞争与磁珠结合的有限数量的第一特异性结合部。

术语说明

术语“分析物”通常是指待检测的物质。例如，分析物可包括抗原、半抗原、抗体及其组合。分析物包括但不限于毒素、有机化合物、蛋白质、肽、微生物、氨基酸、核酸、激素、类固醇、维生素、药物、细菌、病毒颗粒以及上述任何物质的代谢物或抗体。

术语“样品”一般是指有可能含有分析物的材料。样品可从来源处获得后直接使用，或经过预处理，以对样品进行改性。测试样品可来源于任何生物来源，例如生理体液，包括血液、唾液、眼液、脑脊髓液、汗液、尿液、牛奶、腹水、粘膜液、滑液、腹水、羊水等。测试样品可在使用前经过预处理，例如由血液制备血浆、稀释粘性液体等。除生理体液外，还可应用于其它液体样品，例如水、食品等环境或食品生产领域的测定。

原理说明

一般地，本发明部分基于以下发现，即上转换荧光可克服一些在荧光技术中遇到的自发荧光和背景光散射的问题，虽然并未完全消除它们。此外，上转换荧光测量仍需要昂贵的光学滤波器来分离激发光和荧光信号。由于需要使用光学元件来进行荧光分离，这对构建小型低成本的便携式装置用于上转换荧光测量构成了挑战。

一般地，本发明旨在提供一种用于检测分析物在样品中是否存在及其含量的磁性结合测定（例如夹心测定、竞争性测定等）方法。磁性结合测定使用上转换发光标记的探针，且当该发光探针被较长波长的脉冲光源激发时，能够在较短波长处产生长发光寿命的发光信号。在脉冲光源激发后，在一定时段内收集和测量上转换发光信号。分析物在样品中的含量与时间分辨上转换发光信号成比例（正比或反比）。

下文将更详细地描述本发明的一种具体实施方式。参见图1，本测定方法包括磁珠10，它与第一特异性结合部20连接，以形成磁珠结合物70。本发明还包括探针结合物80，它包括第二特异性结合部40，第二特异性结合部40与检测探针50连接作为探针标记。检测探针50是指一种上转换发光标记，且当探针50通过脉冲光源的激发而吸收具有较长波长的双光子时，它可在较短波长处产生长发光寿命的上转换发光信号。第一特异性结合部20和第二特异性结合部特异性结合40，且与分析物的不同表位特异性地结合，形成夹心复合物60。

为进行测定，含有分析物的样品首先与磁珠结合物70和探针结合物80接触。分析物Ag30分别与磁珠结合物70的第一特异性结合部20以及探针结合物80的第二特异性结合部接触，形成夹心复合物60。包括夹心复合物60的磁性结合体随后通过磁性装置将其与样品中非磁性响应的其余部分分离，这些非磁性响应的其余部分例如那些通过分析物Ag30而未与磁性结合物60复合的探针结合物80。磁性中间体为样品中具有磁性响应的部分，包括具有磁性响应的夹心复合物60、具有磁性响应的磁珠结合物和/或未与第一特异性结合部连接的磁珠。

样品与磁珠结合物、探针结合物的接触方式

一般可通过两种不同的方式来进行接触。一种方式是将磁珠结合物70和探针结合物80均与样品混合。另一种方式是首先将磁珠结合物70与含有分析物Ag30的样品混合，然后通过磁性装置来分离样品中的磁珠。分离后的磁珠结合物70与剩下的磁性结合物70混合或者分离后的磁珠结合物70与多余的分析物Ag30混合后，再与探针结合物80混合，形成夹心复合物60。夹心复合物60随后通过磁性装置而分离。无论哪种混合方法，均可直接在磁性装置捕获的测量探针50结合的夹心复合物60时的时间分辨上转换发光信号，从而通过装置90而获得检测信号。或者捕获夹心复合物60后可首先再悬浮在溶液中，随后通过装置90来测量捕获探针50的时间分辨上转换发光。将测得的时间分辨上转换发光检测信号与校准曲线作比较，从而获得样品中分析物的含量。校准曲线一般是通过绘制在已知分析物浓度的范围内时间分辨上转换发光检测信号相对于分析物浓度的变化而得到的。根据校准曲线将检测信号转换为分析物的浓度，以确定未知测试样品中分析物的含量。

磁珠10通常是由“磁性作用”的磁性材料制成的颗粒。颗粒被吸引或排斥，或具有可检测的磁化率或磁感应强度。例如，一些可用于赋予探针以磁性的适当磁性响应材料的例子包括但不限于顺磁性材料、超顺磁性材料、抗磁性材料，铁磁性材料，亚磁性材料，反磁性材料。具体的例子包括金属，例如铁、镍、钴、铬、锰；镧系元素，例如钕、铒；合金，例如铝、镍、钴、铜等的磁性合金；氧化物，例如四氧化三铁(Fe₃O₄)、三氧化二铁(Fe₂O₃)、氧化铬(CrO₂)、氧化钴(CoO)、氧化镍(NiO₂)、氧化锰(Mn₂O₃)；复合材料，例如铁氧体；以及固溶体，例如含有氧化铁等的磁铁矿。磁珠的平均直径根据需要通常可随一些因素而改变，例如所选磁珠的类型、颗粒粒径、颗粒膜成分。例如，在一些具体实施方式中，磁珠的平均直径可在约0.01微米至约1,000微米的范围内；在一些具体实施方式中，在约0.01微米至约100微米的范围内；在一些具体实施方式中，在约0.01微米至约10微米的范围内。在一特别的实施方式中，磁珠的平均直径在约1微米至约2微米的范围内。通常，磁珠在外形上大致呈球形，虽然包括但不限于板状、棒状、条状、不规则形状的其它形状也适用于本发明。如本领域技术人员所理解的那样，可在大范围内改变磁珠的成分、形状、大小和/或密度。

除与待测分析物形成经典的夹心复合物外，第一特异性结合部20与第二特异性结合部40也可以特异性结合，通常是指两者为特异性结合对，即两者属于两个不同的分子，其中第一个分子以化学和/或物理的方式与第二个分子结合。例如，免疫反应的特异性结合部可包括抗原、半抗原、适体、抗体以及它们的复合物，所述复合物包括通过重组DNA方法或多肽合成而形成的复合物。抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体、重组蛋白质或其混合物或片段、以及抗体与其它类型的结合部的混合物。本领域技术人员熟知这类抗体的制备细节及其适用于特异性结合部的特性。其它常见的特异性结合对包括但不限于生物素和亲和素、碳水化合物和外源凝集素、互补的核苷酸序列（包括在DNA杂交测定中使用的用于检测目标核酸序列的探针和捕获核酸序列片段）、互补氨基酸序列（包括那些由重组方法而形成的互补氨基酸序列）、效应物和受体分子、激素和激素结合蛋白质、酶辅助因子和酶、酶抑制剂和酶，等等。此外，特异性结合对可包括作为原特异性结合部的类似物。例如，分析物的衍生物或片段（即分析物的类似物）只要具有至少一个与分析物相同的表位，即可使用。

特异性结合部20和40通常可通过多种众所周知的技术而被相应的连接到磁珠10和探针50上。例如，可通过使用羧基、氨基、醛基、溴乙酰基、碘乙酰基、巯基、环氧基和其它反应性或连接性官能团、以及残留自由基和阳离子自由基，使特异性结合部20共价结合到磁珠10或者使特异性结合部40共价结合到探针50上，由此可完成蛋白质偶联反应。由于微米颗粒表面可含有表面浓度相对高的极性基团，所以表面官能团也可并入为官能化的共聚单体。此外，虽然微米颗粒如探针通常在合成之后被表面官能化处理，但微米颗粒能够在无需另外改性的条件下直接与蛋白质共价连接。例如，可通过以下两个步骤使第一特异性结合部抗体共价结合到羧酸官能化的磁珠上。第一步骤是使用碳化二亚胺来活化在磁珠表面上的羧基。在第二步骤中，被活化的羧基与抗体的氨基反应，形成酰胺键。除共价键合外，也可在本发明中使用诸如物理吸附的其它连接技术。

检测探针50是指一种上转换发光标记，且当探针50被较长波长的光源激发而同时吸收双光子时，它可在较短波长处产生长发光寿命的发光。上转换发光探针的发光寿命通常比5μs长。更具体地，探针50的发光寿命在20μs至3000μs的范围内。因此检测探针50可以用于时间分辨上转换发光检测。时间分辨上转换发光包括使用在较长波长处（通常在远红光或近红外区域）的短脉冲光源来激发探针50，以实现双光子吸收，随后通常在激发之后等待一定时间（例如等待时间在约20微秒至200微秒之间），即可在较短波长处测量剩余的长寿命的发光信号。通过在远红光或近红外区域激发探针，可使包括分析物和介质在内的样品对激发光子的吸收以及样品介质的自发荧光显著减到最少。因此，包含分析物的混合物样品在一些情况下无需经过处理或预清理即可直接测量。此外，时间分辨上转换发光检测检测可消除任何短寿命的荧光背景信号和被散射的激发辐射，使其灵敏度比传统发光检测技术高出2至4个数量级。除较高的检测灵敏度和无需预清理复合物样品之外，时间分辨上转换发光检测装置还无需昂贵的光学元件来使探针发光信号与背景分离。因此，有可能降低检测装置的成本。

用于时间分辨上转换发光的理想探针应具有良好的上转换发光量子效率，且具有相对长的发射寿命。即探针可优选在远红光或近红外光区域（较长波长）具有较强的双光子吸收作用，且在可见光区域（较短波长）发光。因此，发光具有反斯托克斯位移（anti-Stokesshift））。探针的长发光寿命至关重要，以使在任何短寿命的背景信号消失之后，探针仍能良好地发射其信号。此外，长荧光寿命使得有可能在荧光测量中使用低成本的时间选通电路。例如，用于本发明的探针的发光寿命可大于约5微秒，在一些具体实施方式中大于约10微秒，在一些具体实施方式中大于约50微秒，在一些具体实施方式中在约100微秒至约1000微秒的范围内。术语“反斯托克斯位移”通常被定义为发光辐射的谱线或带位移到比激发线或带更短的发射波长处。

检测探针说明

一类适用于上转换发光磁性结合测定的探针为镧系元素钐(Sm(III))、镝(Dy(III))、铕(Eu(III))和铽(Tb(III))的螯合物。这类螯合物可同时吸收远红光或近红外的双光子，且其在大致较短的波长处被激发后显示出强烈的蓝移（blueshift)、窄带信号和长寿命的发射信号。例如，与约1纳秒至约100纳秒的典型荧光标记信号寿命相比，铕螯合物的上转换长寿命发光在约100微秒至约1000微秒范围内进行。一种适宜的铕螯合物是N-（对异硫氰基苄基）-二亚乙基三胺四乙酸-Eu⁺³(N-(p-isothiocyanatobenzyl)-diethylenetriaminetetraaceticacid-Eu⁺³)。

除使用上转换发光分子作为探针外，也可使用其他多种形式的探针。例如，探针可以是聚合物、脂质体、树枝状聚合物的标记探针，以及其它微米或纳米尺度的标记探针，这些标记探针封装有上转换发光分子的结构。此外，探针可以是微米颗粒或微球。上转换发光分子是指诸如镧系元素螯合物的分子，它们能够产生强大的具有相对长寿命的上转换发光，且相对于激发时的激发光源而发生蓝移。例如，在一种具体实施方式中，使用封装有上转换发光分子的微米胶乳颗粒。胶乳颗粒通常由以下材料制成：聚苯乙烯、丁二烯苯乙烯、苯丙-乙烯基三元共聚物、聚甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸乙酯、苯乙烯-马来酸酐共聚物、聚乙酸乙烯酯、聚乙烯基吡啶、聚二乙烯基苯、聚对苯二甲酸丁二醇酯、丙烯腈、氯乙烯-丙烯酸酯等，或其醛基、羧基、氨基、羟基或酰肼衍生物。

当使用颗粒作为探针时，通常可根据需要来改变颗粒的平均直径。例如，在一些具体实施方式中，颗粒探针的平均直径可在约0.01微米至约1,000微米的范围内；在另一些具体实施方式中，在约0.01微米至约100微米的范围内；在另一些具体实施方式中，在约0.01微米至约10微米的范围内。在一些特别的实施方式中，颗粒的平均直径在约0.1微米至约2微米的范围内。通常，颗粒在外形上大致呈球形，虽然包括但不限于板状、棒状、条状、不规则形状的其它形状也适用于本发明。如本领域技术人员所理解的那样，可以在大范围内改变颗粒的成分、形状、大小和/或密度。

另一类适用于本发明的探针是掺杂有镧系元素离子的晶状基质的磷光体颗粒或磷光微球。掺杂有镧系元素离子的磷光体颗粒的例子包括Yb/Er或Yb/Tm共掺杂的NaYF4纳米颗粒，它具有高效的红外至可见光的上转换发光。这些上转换发光的颗粒具有相对长的发光寿命，适用于时间分辨上转换发光的测量。除这些掺杂有镧系元素离子的磷光体颗粒之外，封装有掺杂有镧系元素的磷光体纳米晶体的胶乳颗粒对于本发明也是有用的探针。胶乳颗粒通常由以下材料制成：聚苯乙烯、丁二烯苯乙烯、苯丙-乙烯基三元共聚物、聚甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸乙酯、苯乙烯-马来酸酐共聚物、聚乙酸乙烯酯、聚乙烯基吡啶、聚二乙烯基苯、聚对苯二甲酸丁二醇酯、丙烯腈、氯乙烯-丙烯酸酯等，或其醛基、羧基、氨基、羟基或酰肼衍生物。

时间分辨上转换发光检测的原理通过利用上转换发光探针的长寿命发光特性，可减少来自发射源或散射过程（源于激发辐射散射）的背景信号；其中发光探针包括镧系元素铕(Eu(III))和铽(Tb(III))的螯合物、封装有这些螯合物的颗粒、以及由掺杂有镧系元素离子的磷光体晶体。通常使用长波长光或光子进行双光子激发的时间分辨上转换发光检测，还避免使用通常对细胞和其它生物物种有害的传统时间分辨荧光检测技术的短波长激发。用于传统的时间分辨荧光检测技术的短波长激发已在辐射到大多数生物基质和其它类型材料内的深度方面受到限制，使激发效率并非最佳。上转换发光探针在探针激发后在大致较长的波长处可显示出强烈的蓝移、窄带信号和长寿命发射信号。使用在远红光和近红外区域的脉冲光源激发，并通过时间选通电路检测可以对只来自探针本身的发光进行特异性检测，同时抑制来自存在于样品中的其它物种的通常寿命比较短的发射信号。使用长波长的脉冲激发光(>650nm)可避免损坏诸如细胞的生物样品，且避免由样品吸收激发光子而导致的探针激发的干扰。使用长波长的脉冲激发光(>650nm)可增大激发光的穿透深度且提高激发效力。因此，本发明的时间分辨上转换发光检测技术比传统的时间分辨荧光检测技术和传统的上转换荧光检测技术更具有技术优势。

检测装置的说明

用于测量时间分辨发光的检测装置90的一种具体实施方式包括激发源和光电检测器。激发源在远红光或近红外区域提供脉冲照射来激发检测探针，以使探针可同时有效地吸收双光子。本发明可使用各种激发源，包括发光二极管(LED)、闪光灯以及其它合适的光源。激发光源可以多路复用和/或进行光线准直；例如，来自多个相干源的各种离散频率的光线（例如激光）可通过使用分色镜阵列而进行准直和复用。此外，辐射是脉冲的，或可通过复用多个辐射光线而与连续波(continuouswave,CW)和脉冲光源结合使用（例如脉冲光线与CW光线复用），且允许在由CW源引起的发光与由脉冲源引起的发光之间进行信号鉴别。

可用于本发明的适当检测器的例子包括但不限于：光电倍增管设备；光电二极管，例如雪崩光电二极管（APD，AvalanchePhotoDiode）、硅光电二极管；高速线性电荷耦合器件(charge-coupleddevices,CCD)、CID器件或基于CMOS的成像仪；等等。在一种具体实施方式中，装置90利用硅光电二极管来进行发光检测。硅光电二极管的优点是便宜、灵敏，能够用于高速操作（上升时间短/带宽大），且易于整合到大多数其它半导体技术和单片电路内。此外，硅光电二极管尺寸小，因而能够轻易地嵌入到便携式系统内。如果使用硅光电二极管，则发光发射的波长范围应在其灵敏度的范围内，即400纳米至1100纳米。另一中可选的检测器是CdS（硫化镉）光导电池，它的优点是具有与人类视觉（适光曲线）类似的光谱灵敏度，可更容易地抑制反射的激发辐射。

检测装置90包括各种定时电路，用于控制激发源的脉冲激发和发射发光的测量。例如，可使用时钟源（例如晶体振荡器）来为装置90中的其它电子元件提供受控的频率源。在一种具体实施方式中，采用例如振荡器可产生20MHz的信号，提供给LED驱动器/脉冲发生器和A/D转换器。通过从振荡器至A/D转换器的时钟信号来控制A/D转换器的操作速度。应当理解，如果A/D转换器的操作频率或由时钟输入给LED驱动器/脉冲发生器的所需频率不同于20MHz，则可在各个信道中使用分频器。因此，应当理解，可适当调整来自振荡器的信号，以提供所需频率的信号。在一些具体实施方式中，来自振荡器的信号也可提供给微处理器，以控制其操作速度。根据本发明，在其它信道中可使用另外的分频器。

检测装置90也包括微处理器，用于向脉冲发生器提供控制输入，以调整来自振荡器的20MHz信号，从而提供所需的脉冲持续时间和频率（例如，具有50%工作周期的1kHz源）。来自脉冲发生器的信号随后可提供给激发源，控制其脉冲频率和辐射工作周期。在一些具体实施方式中，可在通向激发源的信道中使用晶体管，由此获得用于在激发源处产生脉冲光信号的开关器件。

如上所述，使用脉冲光来激发上转换发光探针。在所需响应时间（例如约20微秒至约200微秒）之后，检测器检测到由激发探针发出的发光信号，且产生其代表性电流。随后该电流可通过高速跨阻前置放大器（high-speedtransimpedancepreamplifier）而被转换到电压电平，高速跨阻前置放大器具有相对短的置位时间和从饱和状态快速恢复的特点。前置放大器的输出随后可提供给A/D转换器的数据输入端。可在前置放大器之后和A/D转换器之前的信道中使用另一放大器元件（例如可编程增益放大器），以在激发脉冲信号的后缘处在适当电压范围内产生信号，并提供给A/D转换器。A/D转换器可以是高速转换器，它在荧光标记的荧光寿命内的采样率使其足以获得许多采样点。可设定前置放大器的增益参数，以使数据的值在激发脉冲的后缘处下降到最大A/D计数之下（例如，对于12位的转换器为2047）。在A/D转换器的动态范围内的数据则将主要代表所需的荧光信号。如果采样间隔比激发脉冲的上升时间和下降时间短，则可设定前置放大器的增益，以确保在A/D转换器的动态范围的上部1/2或3/4内的信号值对应于发射脉冲信号的后缘处（trailingedge下降沿）。

A/D转换器对前置放大器的信号进行采样，并将其提供给微处理器，通过对微处理器进行编程进行数字信号的各种处理。当对检测荧光信号进行采样时，来自微处理器的输出提供给A/D转换器，用于进一步控制。可连续调整前置放大器和A/D转换器的输入控制信号，以获得最适宜的增益、采样间隔和触发偏移。应当理解，虽然A/D转换器和微处理器被描述为不同的模块，但也可在本发明中使用在单一单元中封装有这两种模块的市售芯片。在数字信号处理之后，微处理器可提供至少一个输出，用于指示由检测器检测到的荧光水平。例如向显示器提供一个这样的示例性输出，由此向用户提供一种对于由标记产生的荧光信号的视觉指示。显示器可具有更多的互动特征，例如控制接口，用户可由此向微处理器提供可编程的输入。

如图2所示，复合物60的检测模式有很多种。在检测模式I中，脉冲激发光源直接照射在样品上，且光电检测器置于与辐射源相对的一侧。在模式II中，脉冲激发光源以一定角度照射在样品上，且光电检测器以一定角度置于与照明源相同的一侧，从而以时间延迟的方式来收集和测量探针的上转换发光。在模式III中，脉冲激发光源以90°的角度直接照射在样品上，且光电检测器垂直于照明方向。

本领域技术人员众所周知的是，无论哪种检测模式，都需要至少一个滤光片，以将激发光源与上转换发光分离，用于所有三个模式的传统非转换发光检测。由于激发光源的量值通常比上转换发光高，且滤光器难以完全消除直接照射在光电检测器上的所有激发光源，所以传统非转换发光检测被认为不适用于模式I。结果，检测背景噪声明显，且检测灵敏度受到限制。然而，由于通过时间延迟而使上转换发光信号与照明分离，所以模式I对于时间分辨上转换发光检测技术是有实用价值的。因此，如果激发光源在发光检测检测期间已延迟到背景水平，则激发光源将会对发光检测具有最小的干扰。

本发明人的研究已发现，使用时间分辨上转换发光检测技术的磁性结合测定比传统的时间分辨发光检测技术具有优势，尽管两种技术均使用脉冲激发光源和延迟测量来将背景与发光信号分离。本领域已知，适用于传统的时间分辨发光检测技术的现有检测探针局限于镧系元素的螯合物、铂与钯的螯合物、以及封装有这些螯合物的颗粒。虽然这些探针具有对任何时间分辨发光检测技术而言都很重要的强发光和长发光寿命，但所有这些探针只可被小于450nm的光源辐射来有效激发。然而用于传统的时间分辨发光检测技术的小于450nm的短波长光源激发存在明显的局限。例如，小于450nm的强光源通常更昂贵，且与其较长波长的对应光源相比，对诸如蛋白质和核酸的分析物更有害。许多样品和样品介质在这一波长区域具有明显的吸收作用，由此干扰检测探针的高效吸收和激发。在大多数情形下，诸如蛋白质和核酸的分析物也可在这一区域具有明显的吸收作用。这些样品和分析物暴露于强烈的激发光源下，因而可使这些分析物和样品退化，使测量不准确。由于大多数市售的磁珠在小于450nm处具有强烈的吸收作用，因此也干扰检测探针的稳定性和有效激发，所以这对于使用传统的时间分辨发光检测技术的磁性结合测定而言是很重要的问题。本发明的发明人已发现，由于本发明检测探针被远可见光或近红外照明有效激发，因而对于用于磁性结合测定的时间分辨上转换发光检测技术而言，不存在上述的关于传统的时间分辨发光检测技术的问题。这些远红光或近红外照明对于大多数分析物是安全的，且通常比其短波长光源更便宜。由于大多数样品和介质无强烈吸收作用，因此对探针的有效激发干扰最小。磁珠在远红光和近红外区域吸收很弱，因此也最大限度地减少了在传统检测探针激发中存在的问题。

常见的上转换激发（双光子激发）探针的效率一般很低，甚至对于那些在这类中被认为是最好的探针也是如此。因此，与传统的上转换发光检测技术相比，由于时间分辨上转换发光使用的是脉冲激发光源而非连续照明，因而时间分辨上转换发光检测技术一般被认为是不可行的检测技术，由此使整体信号太弱而无法使用。然而，本发明人最近已开发出高亮度的上转换发光探针，使该检测技术可行。

磁性竞争性结合测定原理

本发明的另一种具体实施方式是使用时间分辨上转换发光检测技术的磁性竞争性结合测定方法。参见图3，本测定方法中磁珠100结合到第一特异性结合部200上，以形成磁珠结合物700。第一特异性结合部是分析物或分析物的类似物。本发明还包括探针结合物800。探针结合物800包括检测探针50，其中检测探针50通过共价结合或物理吸附的方式而连接第二特异性结合部400。第二特异性结合部400与分析物和分析物的类似物可特异性结合。检测探针50是指一种上转换发光标记，且当探针50被较长波长的光源激发而吸收双光子时，它可在较短波长处产生长发光寿命的发光。探针的上转换发光寿命通常比5微秒长。更具体地，探针50的发光寿命在20微秒至3000微秒的范围内。上转换发光探针的例子包括但不限于镧系元素螯合物的分子、封装有镧系元素螯合物的胶乳颗粒、掺杂有镧系元素离子的纳米晶体磷光体颗粒、以及封装有磷光体颗粒纳米晶体的胶乳颗粒。

进一步参见图3来进行测定，要么样品依次与探针结合物、磁珠结合物接触进行混合分离逐步混合在一起，要么样品、探针结合物和磁珠结合物同时混合在一起。无论哪种混合方式，如果存在分析物Ag300，则分析物与磁珠结合物竞争有限数量的探针结合物。这与样品中无分析物的情形相比，与磁珠结合物结合的探针结合物的数量减少。随后通过磁性装置而使与磁珠结合物结合的探针结合物与未结合的探针结合物分离。之后通过装置90而采用时间分辨上转换发光检测技术来测量分离的探针结合物。一般可通过两种不同的方式来进行混合。一种方式是首先将磁珠结合物与样品混合，之后与探针结合物混合，再之后通过磁性装置而进行分离。另一种方式是将磁珠结合物与探针和样品混合，并随后进行磁性分离。

无论哪种混合和分离方法，均可在磁性装置捕获得到的复合物600上直接测量复合物600的时间分辨上转换发光信号，从而通过装置90而得到捕获探针的信号。或者可首先将被捕获的复合物600再悬浮在溶液中，随后测量捕获探针的时间分辨上转换发光信号。

使用时间分辨上转换发光检测技术的磁性竞争性结合测定方法的另一种具体实施方式参见图4。该测定方法包括磁珠100，磁珠100连接到第一特异性结合部210上，以形成磁珠结合物710。第一特异性结合部210与分析物是特异性结合对。本发明还包括探针结合物810。探针结合物810包括检测探针50，所述检测探针50通过共价结合或物理吸附的方式与第二特异性结合部410连接。第二特异性结合部410是分析物或分析物的类似物。检测探针50是指一种上转换发光标记，且当探针50被较长波长的光源激发而吸收双光子时，它可在较短波长处产生长发光寿命的发光。上转换发光探针的发光寿命通常比5微秒长。更具体地，探针50的发光寿命在20微秒至3000微秒的范围内。上转换发光探针的例子包括但不限于镧系元素螯合物的分子、封装有镧系元素螯合物的胶乳颗粒、掺杂有镧系元素的磷光体纳米晶体、以及封装有磷光体纳米晶体的胶乳颗粒。

进一步参见图4以进行测定，要么样品依次与探针结合物、磁珠结合物进行混合分离逐步混合在一起，要么样品、探针结合物和磁珠结合物同时混合在一起。无论哪种混合方式，如果存在分析物Ag300，则分析物与探针结合物竞争有限数量的磁珠结合物。它与样品中无分析物的情形相比，与磁珠结合物结合的探针结合物的数量减少。随后通过磁性装置而使与磁珠结合物结合的探针结合物与未结合的探针结合物分离。之后通过装置90而采用时间分辨上转换发光检测技术来测量分离的探针结合物。一般可通过两种不同的方式来进行混合。一种方式是首先将磁珠结合物与样品混合，之后与探针结合物混合，再之后通过磁性装置而进行分离。另一种方式是将磁珠结合物与探针和样品混合，并随后进行磁性分离。

无论哪种混合和分离方法，均可在磁性装置捕获得到的复合物610上直接测量复合物610的时间分辨上转换发光信号，从而通过一装置而得到捕获探针的信号。或者可首先将被捕获的复合物610再悬浮在溶液中，随后测量捕获探针的时间分辨上转换发光信号。将测得的时间分辨上转换发光检测信号与校准曲线作比较，从而获得样品中分析物的数量。校准曲线一般是通过绘制发光检测信号在已知分析物浓度的范围内相对于分析物浓度的变化而得到的。随后根据校准曲线将信号转换为分析物的浓度，以确定未知测试样品中分析物的数量。

附图说明

下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：

图1是本发明夹心复合物结合测定的具体实施方式的示意图；

图2是信号检测模式的示意图；

图3是本发明竞争性结合测定的具体实施方式的示意图；

图4是本发明竞争性结合测定的另一具体实施方式的示意图；

图5是在实施例1中获得的上转换发光颗粒的扫描电子显微图片；

图6是在实施例4中获得的结合发光探针的时间分辨上转换激发与发射光谱图；

图7是在实施例5中获得的结合探针的上转换发射衰减图。

具体实施方式

以下结合具体实施例对上述方案做进一步说明。应理解，这些实施例是用于说明本发明而不限于限制本发明的范围。实施例中采用的实施条件可以根据具体厂家的条件做进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。

实施例1：上转换发光探针的制备

在搅拌的同时向含有50mg羧酸官能化聚甲基丙烯酸胶乳颗粒PP02N（直径为0.33μm，由Bangs实验室提供）的500μl水溶液中加入2ml乙醇。在搅拌的同时向该颗粒悬浮液中缓慢加入适量的（例如占胶乳颗粒重量的1%）含有铕螯合物的氯化乙烯（例如占总溶剂重量的3%）。搅拌混合物达半小时。随后在一定时段内（例如2小时）向搅拌混合物中缓慢加入适量的水（例如为初始溶剂总体积量的四倍）。在加完水后，通过旋转蒸发器而除去混合物中大部分的乙醇。随后使用90%的乙醇通过离心分离而将颗粒清洗两次。之后使用水清洗颗粒两次。清洗后的颗粒随后通过超声处理而悬浮在含有0.5%Tween20的tris缓冲液中，制得5%的悬浮液。图5显示探针颗粒的扫描电子显微图片。

实施例2：将抗体结合到上转换发光探针上，制得探针结合物

使用1.5ml碳酸盐缓冲液将在实施例1中制得的200μl探针颗粒清洗一次，并使用Mes缓冲液(PH=4.3)通过离心分离而清洗两次。清洗后的探针颗粒再次悬浮在0.1mlMes缓冲液中，且向该悬浮颗粒液中加入溶解有6.2mg碳化二亚胺（由Polysciences公司提供）的0.1mlMes缓冲液进行活化处理。使混合物在室温下在摇荡器上反应30分钟。随后使用硼酸盐缓冲液将活化处理后的探针颗粒清洗两次。使活化处理后的探针颗粒再次悬浮在0.185ml硼酸盐缓冲液中，并向其中加入15μl的LHα单克隆抗体（LHαMab，9.8mg/ml，由FitzgeraldIndustrialInternational公司提供）。使反应混合物在摇荡器上反应过夜。随后收集颗粒，并在轻轻摇动下在0.2ml0.1M乙醇胺中培养15分钟。之后使用PBS将颗粒清洗两次，且储存在4℃储存缓冲液中。该储存缓冲液含有0.1MPBS、0.15MNaCl、1%BSA和0.1%NaN₃。经测定，探针结合物为α-Mab-P。

实施例3：将抗体结合到磁珠上，制得磁珠结合物

使用1.5ml碳酸盐缓冲液将100μl10%羧化磁珠（1.5μm，由Bangs实验室提供）清洗一次，并采用Mes缓冲液(PH=4.3)通过磁力分离器而清洗两次。清洗后的颗粒再次悬浮在0.1mlMes缓冲液中，且向该悬浮颗粒液中加入溶解有6.2mg碳化二亚胺（由Polysciences公司提供）的0.1mlMes缓冲液进行活化处理。使混合物在室温下在摇荡器上反应30分钟。随后使用硼酸盐缓冲液将活化处理后的磁珠颗粒清洗两次。使活化处理后的磁珠颗粒再次悬浮在0.185ml硼酸盐缓冲液中，并向其中加入15μl的LHβ单克隆抗体（LHβMab，由FitzgeraldIndustrialInternational公司提供）。使反应混合物在摇荡器上反应过夜。随后收集磁珠结合物（颗粒），并在轻轻摇动下在0.2ml0.1M乙醇胺中培养15分钟。之后使用PBS将磁珠结合物清洗两次，且储存在4℃储存缓冲液中。该储存缓冲液含有0.1MPBS、0.15MNaCl和1%BSA。经测定，磁珠结合物MP-β-Mab(10mg/ml)。

实施例4：探针结合物的时间分辨上转换激发与发射光谱

将在实施例2中制备的10ng探针结合物悬浮在600μl水中，放入到具有时间分辨能力的荧光计的腔室内，然后通过荧光计上测量时间分辨上转换激发与荧光光谱。通过使用下列测量参数而测得光谱，并示于图6中。对于时间分辨上转换荧光光谱：在870nm处激发，采样窗口为50μs，每次闪光时间为100μs，初始延迟为0.01μs，闪光次数为10次，扫描次数为10次，荧光收集从500nm至800nm。对于时间分辨上转换激发光谱：在615nm处发射，采样窗口为50μs，每次闪光时间为100μs，初始延迟为0.01μs，闪光次数为10次，扫描次数为10次，激发收集从700nm至900nm。

实施例5：探针结合物的上转换荧光的荧光衰减

将在实施例2中制备的10ng探针结合物悬浮在600μl水中，放入到具有时间分辨能力的荧光计的腔室内。衰减情况显示在图7中。使用下列参数来测量荧光衰减：在870nm处激发，在615nm处发射，采样窗口为50μs，每次闪光时间为100μs，初始延迟为0.01μs，闪光次数为10次，扫描次数为10次。

实施例6：量化黄体生成素(luteinizinghormone,LH)的数量

取六个小瓶，分别标记为小瓶1、2、3、4、5和6，每个小瓶分别装有由FitzgeraldIndustrialInternational公司提供的不同含量的LH和实施例2制备的相同含量的MP-β-Mab，小瓶1、2、3、4、5和6中加入的LH质量依次为0、5、20、50、100和200ng，LH、MP-β-Mab都溶解在含有2mg/mlBSA和0.1%Tween20的500μl50mMPBS缓冲液(pH:7.2)中。样品在轻轻摇动下培养20分钟。小瓶随后置于磁性装置内进行第一次分离，几乎所有的磁珠都被吸引到小瓶壁上靠近磁铁的地方。除去上清液，并在小瓶从磁性装置中移走之后，使第一次分离后的磁珠再次悬浮在含有2mg/mlBSA和0.1%Tween20的500μl50mMPBS缓冲液(pH:7.2)中。向每个小瓶中添加有相同质量的α-Mab-P，轻轻摇动培养混合物达20分钟。通过磁性装置而再次使磁珠与其余混合物分离。使用含有2mg/mlBSA和0.1%Tween20的500μl50mMPBS缓冲液(pH:7.2)来清洗第二次分离后的磁珠（磁性结合体）达三次。使每个小瓶中的清洗后的磁珠（磁性结合体）再次悬浮在含有2mg/mlBSA和0.1%Tween20的500μl50mMPBS缓冲液(pH:7.2)中，用于时间分辨上转换发光检测。使用870nm的脉冲光源来激发样品，在20μs的延迟时测量每个样品在615nm处的时间分辨上转换发光。样品1、2、3、4、5和6在615nm处的延迟上转换发光的相对强度分别为150、230、407、859、1717和3553。

上述实例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人是能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所做的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (18)

1.一种用于检测分析物在样品中是否存在及其含量的测定方法，其特征在于所述测定方法包括以下步骤：

(1)使含有分析物的样品与磁珠结合物、探针结合物接触，其中所述磁珠结合物为磁珠与第一特异性结合部连接形成，所述探针结合物为用来作为标记的检测探针与第二特异性结合部连接而成，所述检测探针在短于激发光波长的波长处发出发光寿命超过5μs的发光，所述第一特异性结合部和所述第二特异性结合部分别与所述分析物的不同表位特异性结合，形成夹心复合物；

所述检测探针为封装有上转换发光分子的胶乳颗粒，胶乳颗粒通常由以下材料制成：苯乙烯-马来酸酐共聚物、聚乙酸乙烯酯、聚乙烯基吡啶、聚二乙烯基苯、聚对苯二甲酸丁二醇酯、丙烯腈、氯乙烯-丙烯酸酯，或其醛基、羧基、氨基、羟基或酰肼衍生物；

所述上转换发光分子为镧系元素螯合物的分子；

(2)使用磁性装置将样品中磁性结合体与所述样品的其余部分分离，其中所述磁性结合体包括所述夹心复合物；

(3)使用在第一波长处的脉冲光源来激发分离的磁性结合体，从而在每次脉冲之后的一定延迟后，通过收集和测量在第二波长处的发光来获得检测信号，其中所述第二波长短于所述第一波长；

(4)将所述检测信号与校准曲线作比较，从而获得所述样品中所述分析物的数量，其中所述样品中所述分析物的数量与所述检测信号成正比。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述分析物选自蛋白质、肽、细菌、病毒、酵母、DNA和RNA、酶、抗体和抗原。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述磁珠的大小从10nm至10μm，且与所述第一特异性结合部通过共价结合或物理吸附的方式连接。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述含有第一特异性结合部或第二特异性结合部的待测分析物包括抗体、抗原、DNA和RNA。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述检测探针吸收长波长的双光子，且发射一个短波长的光子，其发射寿命从20μs至2000μs。

6.根据权利要求1所述的方法，其中通过发光二极管、激光或钨灯来产生所述脉冲光源。

7.根据权利要求1所述的方法，其中通过硅光电二极管和光电倍增管来测量所述发光。

8.根据权利要求1所述的方法，其中所述脉冲光源和时间选通电路进行检测是通过定时电路来控制的。

9.根据权利要求1所述的方法，其中所述信号是在每个脉冲照射后延迟20μs至200μs时测量的。

10.一种用于检测分析物在样品中是否存在及其含量的测定方法，所述测定方法包括：

(1)使含有分析物的样品与磁珠结合物、探针结合物接触，其中所述磁珠结合物为磁珠与第一特异性结合部连接形成，所述探针结合物为用来作为标记的检测探针与分析物或分析物的类似物连接而成，所述检测探针在短于激发光波长的波长处发出发光寿命超过5μs的发光，所述第一特异性结合部和所述分析物或分析物的类似物特异性结合，形成夹心复合物；

所述检测探针为封装有上转换发光分子的胶乳颗粒，胶乳颗粒通常由以下材料制成：苯乙烯-马来酸酐共聚物、聚乙酸乙烯酯、聚乙烯基吡啶、聚二乙烯基苯、聚对苯二甲酸丁二醇酯、丙烯腈、氯乙烯-丙烯酸酯，或其醛基、羧基、氨基、羟基或酰肼衍生物；

所述上转换发光分子为镧系元素螯合物的分子；

(2)使用磁性装置将所述磁性结合体与所述样品的其余部分分离，其中所述磁性结合体包括所述夹心复合物；

(3)使用在第一波长处的脉冲照明来激发分离的磁性结合体，从而在每次脉冲之后的一定延迟后，通过收集和测量在第二波长处的发光来获得检测信号，其中所述第二波长短于所述第一波长；

(4)将所述检测信号与校准曲线作比较，从而获得所述样品中所述分析物的数量，其中所述样品中所述分析物的数量与所述检测信号成反比。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述分析物选自蛋白质、肽、细菌、病毒、酵母、半抗原、酶、抗体和抗原。

12.根据权利要求10所述的方法，其中所述磁珠的大小从10nm至10μm，且与所述第一特异性结合部通过共价结合或物理吸附的方式连接。

13.根据权利要求10所述的方法，其中所述第一特异性结合部是抗体、抗原、DNA或RNA。

14.根据权利要求10所述的方法，其中所述检测探针吸收长波长的双光子，且发射一个短波长的光子，其发射寿命从20μs至2000μs。

15.根据权利要求10所述的方法，其中通过发光二极管、激光或钨灯来产生所述脉冲照明。

16.根据权利要求10所述的方法，其中通过硅光电二极管和光电倍增管来测量所述发光。

17.根据权利要求10所述的方法，其中所述脉冲照明和时间选通检测是通过定时电路来控制的。

18.根据权利要求10所述的方法，其中所述信号是在每个脉冲照射后延迟20μs至200μs时测量的。