ES2340303T3 - Composicion y metodo analitico. - Google Patents

Abstract

Un composición analítica ópticamente detectable que comprende partículas de vidrio de menos 20 μm, consistiendo dichas partículas en un transportador de vidrio que incorpora un dopante de tierras raras y, unido al transportador, al menos uno de un agente de unión biológico seleccionado entre biomoléculas y macromoléculas o un enlazador químico adecuado para unirse a un agente de unión biológico, proporcionando dicho enlazador un medio para modificar la superficie del transportador de vidrio para volverlo receptivo a la fijación de una biomolécula o macromolécula, caracterizada por que el vidrio es un vidrio de borosilicato.

Description

Composición y método analítico.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a una composición analítica que incluye un marcador detectable. La invención también se refiere a un método analítico para detectar el marcador.

Antecedentes de la invención

Los marcadores analíticos se usan en ensayos para unirse a o indicar de otra manera la presencia de moléculas diana en una muestra que se está ensayando. Los marcadores existentes se usan para marcar anticuerpos o hebras de ácido nucleico, etc. que se unen a las moléculas diana de interés. La presencia de marcadores químicos y bioquímicos (por ejemplo fluoróforos, isótopos radiactivos, etc.) unidos a las moléculas de unión a diana indican la presencia de la diana y la cantidad de marcador presente puede cuantificarse opcionalmente mediante técnicas conocidas. Los marcadores con frecuencia se denominan identificadores, sondas, marcas o etiquetas.

Las técnicas existentes para detectar marcadores fluorescentes se conocen bien. Los fluoróforos emiten luz cuando se excitan por una radiación de una longitud de onda particular. Sin embargo, los marcadores fluorescentes conocidos tienen la desventaja de que los mismos generalmente tienen un espectro muy amplio, lo que limita el número de marcadores que se pueden ensayar a la vez y cuando existen varios acontecimientos de unión diferentes que suceden en una muestra única, se hace muy difícil distinguir entre los mismos.

Una nanopartícula de Europio se describe en Clin Chem Härmä et al. 47 (3): 561, y se analiza su uso en fluorescencia de resolución temporal para detección ultrasensible de antígeno prostático específico. La partícula es de poliestireno a la cual se aplica quelato de europio y estreptavidina.

Se describen códigos de barras de vidrio de tamaño micrométrico que contienen un patrón de diferentes materiales fluorescentes en Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, Vol. 100, Nº 2 (21 de enero de 2003), págs. 389-393, Matthew J. Dejneka, et al. Se introducen iones de tierras raras en un vidrio de silicato de aluminio que se había fundido, vertido, templado y proporcionado en varas que se dispusieron de forma adecuada para formar el patrón de códigos de barras deseado y después se proporcionaron en cintas a partir de las cuales se formaron códigos de barras individuales. Las partículas de tales vidrios también se describen en el documento US 2004/0171076A1 (Matthew J. Dejneka, et al) y se propusieron para uso como, transportadores, soportes y etiquetas de perla en bioensayos.

Sumario de la invención

De acuerdo con un primer aspecto de la presente invención se proporciona una composición analítica detectable ópticamente que comprende partículas de vidrio de menos de 20 \mum, consistiendo dichas partículas en un transportador de vidrio que incorpora un dopante de tierras raras y, unido al transportador, al menos uno de un agente de unión biológico seleccionado entre biomoléculas y macromoléculas o un enlazador químico adecuado para unirse a un agente de unión biológico, proporcionando dicho enlazador un medio para modificar la superficie del transportador de vidrio para volverlo receptivo a la fijación de una biomolécula o macromolécula, donde el vidrio es vidrio de
borosilicato.

Las partículas de vidrio pueden ser menores de 5 \mum.

Las partículas de vidrio pueden ser perlas que tienen típicamente un intervalo de tamaño de pocos micrómetros.

El transportador de vidrio basado en borosilicato, puede tener una composición que comprende SiO_{2}; NaO; CaO; MgO; Al_{2}O_{3}; FeO y/o Fe_{2}O_{3}; K_{2}O y B_{2}O_{3} donde el dopante de tierras raras es preferiblemente un lantánido.

Opcionalmente, el vidrio tiene una composición de SiO_{2} 51,79% p; NaO 9,79% p; CaO 7,00% p; MgO 2,36% p; Al_{2}O_{3} 0,29% p; FeO, Fe_{2}O_{3} 0,14% p; K_{2}O 0,07% p y B_{2}O_{3} 28,56% p.

El dopante es típicamente un lantánido. Los dopantes de tierras raras se pueden seleccionar entre Europio, Disprosio y Terbio.

Opcionalmente, se usa una pluralidad de dopantes de tierras raras. Uno o más de estos dopantes de tierras raras diferentes pueden tener emisiones fluorescentes intrínsecas que son visibles a simple vista y uno o más pueden tener emisiones fluorescentes intrínsecas que son invisibles a simple vista, por ejemplo emisiones fluorescentes infrarrojas-ultravioletas.

Opcionalmente, el efecto combinado del transportador y el dopante de tierras raras es tal que provoca que la composición emita luz que es visible a simple vista, por ejemplo, en el intervalo de 390-700 nm.

Típicamente, la composición se puede excitar mediante luz visible de intensidad elevada altamente selectiva y la emisión resultante se puede detectar en la región visible.

El enlazador químico cuando se une al transportador puede mostrar propiedades polares. Por ejemplo, el enlazador químico puede ser un grupo polar, tal como silano o un grupo no polar per se, tal como poliestireno, que cuando se une al transportador muestra propiedades polares.

No es necesario que el enlazador se enlace químicamente al transportador, puede ser un recubrimiento, por ejemplo, un recubrimiento de poliestireno.

Preferiblemente, se utiliza silano cuando el agente de unión biológico comprende un ácido nucleico.

Preferiblemente, se utiliza poliestireno cuando el agente de unión biológico comprende proteínas tales como anticuerpos.

Opcionalmente, el enlazador químico unido al transportador puede mostrar una carga negativa. Por ejemplo, amino-silano, mercapto-silano.

Como alternativa, el enlazador químico unido al transportador puede mostrar una carga positiva. Por ejemplo, se puede conseguir una carga positiva tratando el transportador con estreptavidina.

Opcionalmente el enlazador químico comprende un átomo de oxígeno.

El enlazador químico puede ser una porción modificada del transportador. Por ejemplo, el enlazador químico puede comprender un grupo tiol, un grupo carboxílico (preferiblemente un grupo carboxílico activado), un grupo yodo-acetamida o un grupo maleimida.

Preferiblemente, la composición comprende el agente de unión biológico.

De acuerdo con un segundo aspecto de la invención se proporciona un método para analizar una diana en una muestra, comprendiendo el método:

(a)

proporcionar una composición de análisis como en el primer aspecto, en la que un agente de unión biológico conjugado con una partícula se adapta o elige para unirse a la diana;

(b)

exponer la muestra y el agente de unión biológico el uno al otro;

(c)

separar (i) el agente de unión biológico que se ha unido a cualquier diana del (ii) agente unión biológico que no se ha unido a ninguna diana;

(d)

y, producir emisiones a partir del elemento de tierras raras, iluminando al menos uno del (i) agente de unión biológico que se ha unido a cualquier diana y (ii) el agente de unión biológico que no se ha unido a ninguna diana;

(e)

detectar cualquier emisión a partir de la muestra iluminada en el paso (e); y,

(f)

relacionar la emisión detectada con cualquier característica de la diana incluyendo su presencia o ausencia en la muestra.

Cada muestra se puede iluminar típicamente con múltiples longitudes de onda usando una serie de filtros de detección y fotomultiplicadores diferentes de forma que la emisión a cada longitud de onda pre-seleccionada se pueda determinar.

En ciertas realizaciones la muestra se puede proporcionar de forma que cualquier diana se inmovilice. Por ejemplo, la muestra se puede proporcionar sobre una membrana de forma que una diana, tal como un antígeno, básicamente se fije o inmovilice.

Cuando el agente de unión biológico y la muestra se exponen el uno al otro en el paso (c) el agente de unión biológico se unirá a cualquiera de las dianas inmovilizadas y, por tanto, se inmovilizará él mismo.

La separación del agente biológico no unido de acuerdo con el paso (d) se puede realizar lavando la muestra, ya que el agente de unión biológico no unido se arrastrará mientras que el agente de unión biológico unido estará inmovilizado, ya que está unido a la diana.

Por tanto, en tales realizaciones, una emisión a partir de la muestra unida como por el paso (f) sólo se detectará en presencia de la diana. En tales realizaciones, la invención de acuerdo con un segundo aspecto de la invención es un método para detectar la presencia o ausencia de la diana en la muestra y opcionalmente la cantidad de la diana en la muestra.

En otras realizaciones, el paso de separación (d) se puede realizar mediante electroforesis en gel. El agente de unión biológico no unido se desplazará más lejos a través del gel que cualquier agente de unión biológico unido.

Las realizaciones de la invención se pueden usar para determinar el tamaño de la diana, por ejemplo en análisis de fragmentos de ADN. Por tanto, dicha característica en el paso (g) es el tamaño de la diana. En una realización de este tipo, el ADN está presente pero su tamaño se desconoce y las realizaciones de la presente invención se pueden usar para determinar su tamaño. El método de acuerdo con tales realizaciones no necesita proporcionar información acerca del tamaño molecular exacto de la diana.

El agente de unión biológico puede ser uno o más nucleótidos, por ejemplo una cadena de nucleótidos, es decir, un ácido nucleico y la diana puede ser un nucleótido/ácido nucleico complementario. Los ácidos nucleicos incluyen ADN, ARN, oligonucleótidos, alelos y genes.

El agente de unión típicamente se puede unir específicamente a una molécula diana que se tiene que identificar o cuantificar.

El agente de unión puede ser una proteína tal como un anticuerpo, opcionalmente un anticuerpo monoclonal, aunque los anticuerpos policlonales también pueden ser útiles en este aspecto. También pueden ser útiles ligandos no de anticuerpo y agentes quelantes y también se pueden usar agentes de unión basados en ácido nucleico tales como hebras de ADN o ARN adaptadas para hibridarse a las secuencias de ácido nucleico diana. Se puede unir más de una molécula diana y, en algunas realizaciones de la invención, el transportador porta una combinación de diferentes agentes de unión. Sin embargo, en la mayoría de las realizaciones, una especie única de transportador con una identificación fluorescente específica porta una especie única de agente de unión, por ejemplo, un anticuerpo específico adaptado para unirse sólo a una molécula diana específica, de forma que la identificación fluorescente del transportador se pueda unir con la presencia (y opcionalmente la cantidad) de la molécula diana específica. Una ventaja de unir una especie de transportador específica (con una identificación fluorescente) a un anticuerpo y un segundo transportador (con una segunda identificación fluorescente) a otro anticuerpo, es la posibilidad de inmunoensayos multi-analito simultáneos para cada diana en la misma muestra. Los elementos de tierras raras (RE) permiten la detección de fluorescencia altamente sensible en bandas específicas para indicar la unión de los dos anticuerpos a sus moléculas diana respectivas en la muestra que se está ensayando. Un número mayor de anticuerpos o ligandos se puede unir a estas perlas debido a su gran área superficial, aumentando de ese modo el límite de detección por encima de ensayos de unión convencionales.

Los anticuerpos u otros agentes se pueden unir a las perlas sobre la superficie de vidrio de la perla y las perlas se pueden dispersar en el analito. Un conjunto de protocolos convencionales, específicos para la superficie y ligandos se pueden usar para el proceso de unión. La silanización de las perlas de vidrio es una opción. Es posible conseguir cubrir totalmente la superficie sobre las perlas con anticuerpos. Un conjugado biológico (por ejemplo, un antígeno) se puede unir a estos anticuerpos con especificidad elevada. La unión inespecífica se puede evitar bloqueando adecuadamente los sitios vacíos en la perla. El antígeno no unido se puede retirar mediante un proceso de lavado. De manera similar, esto se puede ampliar para el análisis de ácido nucleico usando las mismas perlas transportadoras.

Se pueden usar diferentes sondas biológicas, cada una unida a unas perlas transportadoras dopadas multi-RE. Las ventajas con este método son las longitudes de difusión más pequeñas de las biomoléculas y la detención más rápida de gran cantidad de interacciones en un volumen pequeño. Se pueden preparar perlas codificadas de espectro múltiple incorporando iones de tierras raras, con espectros de absorción y fluorescencia espectralmente nítidos y en un material hospedador adecuado. Estas perlas junto con un sistema de detección adecuado se pueden usar para detección marcada de interacciones biológicas.

El método puede incluir el paso de realizar una hibridación, tal como una transferencia de northern o transferencia de southern.

El método se puede usar para realizar análisis de fragmentos de ácidos nucleicos, tales como ADN.

El agente de unión biológico puede ser una proteína tal como una enzima, anticuerpo, antígeno, etcétera.

Uno del agente de unión biológico y la diana puede ser un anticuerpo y el otro del agente de unión biológico y la diana puede ser un antígeno.

Uno del agente de unión biológico y la diana puede ser una especie celular y el otro puede ser una proteína tal como una enzima, antígeno, receptor, etcétera.

El propio agente de unión puede estar marcado, por ejemplo, con un fluoróforo convencional, tal como fluoresceína o rodamina, típicamente uno que emita radiación a una longitud de onda diferente del dopante de RE.

Se prefiere un sistema de detección microscópico con una opción para resolver espectralmente la identificación de las perlas para leer la identificación fluorescente de las perlas transportadoras. Una fase de exploración X-Y unida a este sistema puede proporcionar una recogida de datos de todas las perlas. Las perlas se pueden identificar a partir de la identificación espectral. Se prefiere un sistema de detección microscópico, que opcionalmente comprenda un fluorómetro de resolución temporal, perlas dopadas con lantánido intrínsicamente fluorescentes y micropartículas como la fase sólida.

En este punto se apreciará que un dopante de tierras raras tiene un conjunto intrínseco de niveles de energía electrónica y que la interacción entre un transportador y el dopante es tal que estos niveles de energía intrínseca típicamente cambian cuando el dopante se incorpora en el transportador. Por ejemplo, cuando el dopante se incorpora en un vidrio, se forman nuevos enlaces en el vidrio dopado, alterando de este modo la disposición electrónica y, por tanto, los niveles de energía de absorción y emisión fluorescente. La alteración del dopante de tierras raras y/o el quelato dopante y/o la composición del transportador cambia estos niveles de energía y, por tanto, la huella fluorescente observada de la composición.

El transportador en el que el dopante está incrustado se puede producir fácilmente en una diversidad de formatos, por ejemplo, microperlas o fibras. Como alternativa, éstas pueden ser una parte integral de la matriz de polímero formando un producto.

Debido a la longitud de onda fluorescente muy específica de un transportador dopado con un elemento de tierras raras, se pueden usar múltiples transportadores (o un transportador único dopado con múltiples elementos de tierras raras), cada uno preparado para tener una longitud de onda de emisión pre-seleccionada diferente, de forma que se pueda proporcionar un perfil que comprende múltiples longitudes de onda en un transportador único sin que las longitudes de onda diferentes se solapen entre sí.

El transportador dopado con el ión de tierras raras tiene un nuevo perfil de nivel de energía que permite transiciones diferentes a las permitidas por el elemento de tierras raras o el transportador no dopado.

El nuevo perfil de energía es particularmente ventajoso para propósitos de identificación, puesto que proporciona una emisión estrecha a longitudes de onda de emisión que no se encuentran de forma natural en el elemento de tierras raras o en el transportador no dopado. Estas emisiones estrechas se pueden usar como parte de un marcador de identificación.

En una realización preferida, los marcadores tienen diferentes concentraciones de dopante, de forma que las intensidades de las emisiones de longitud de onda pre-seleccionadas son diferentes. Gracias a esta característica, la intensidad de emisión relativa de diferentes longitudes de onda pre-seleccionadas se puede usar como una característica de identificación adicional. Por ejemplo, una intensidad de longitud de onda pre-seleccionada puede ser el 100%, otra intensidad de longitud de onda pre-seleccionada el 50%; una tercera intensidad pre-seleccionada el 25% y una cuarta intensidad pre-seleccionada el 5%. Se pueden usar más o menos de cuatro longitudes de
onda.

En una realización, la emisión a partir de cada marcador disminuye a lo largo de un periodo de tiempo diferente. Gracias a esta característica, el tiempo a lo largo del cual ocurre la emisión a partir de una longitud de onda particular se puede usar como parte de un perfil de identificación.

Opcionalmente, la composición se ilumina usando un láser pulsátil o LED y, opcionalmente, un filtro de iluminación para asegurar que sólo una banda estrecha de longitudes de onda ilumine el artículo.

Típicamente, las emisiones a partir de las perlas dopadas pasan a través de un filtro de detección para filtrar todas las longitudes de onda excepto la longitud de onda pre-seleccionada y se suministran a un fotomultiplicador para detectar la intensidad de luz que pasa a través del filtro de detección.

Se puede realizar una extensión del agente de unión hibridado.

Una realización de la invención se describirá a continuación sólo a modo de ejemplo y con referencia a los dibujos adjuntos, en los que:

La Figura 1 es una vista esquemática de un sistema detector para analizar una señal fluorescente producida a partir de una composición de la invención;

La Figura 2 muestra los espectros de absorción de perlas de vidrio dopado con Eu;

La Figura 3 muestra los espectros de absorción de perlas de vidrio bruto no dopado;

La Figura 4 muestra el espectro de fluorescencia de vidrio bruto no dopado;

La Figura 5 muestra el espectro de fluorescencia de vidrio bruto no dopado en el espectro visible;

La Figura 6 muestra el espectro de fluorescencia de vidrio dopado con Eu al 3%;

La Figura 7 muestra un perfil de pulso láser típico a 465 nm;

La Figura 8 muestra un pulso de señal de fluorescencia típico de perlas dopadas con Eu al 3% expuestas a un pulso láser a 465 nm;

La Figura 9 muestra un aparato de tamizado en húmedo;

La Figura 10 muestra una distribución del tamaño de partícula de una muestra de perlas de vidrio para uso en una realización de la invención;

Las Figuras 11a-11d muestran diagramas esquemáticos de los pasos principales de un ensayo de una realización de la invención;

La Figura 12 muestra un diagrama esquemático de una técnica analítica de transferencia de southern usada de acuerdo con una realización de la presente invención;

La Figura 13 muestra un esquema de reacción de un material modificado con Acrydite^{TM} con grupos tiol, que conduce a la formación de un enlace tioéter estable; y

La Figura 14 es un esquema de reacción que muestra la conexión entre un agente de unión biológico modificado con tiol con un transportador.

Las realizaciones de la presente invención proporcionan una composición analítica detectable ópticamente que comprende una perla de vidrio que incorpora un dopante de tierras raras y un agente de unión que se une a la perla de vidrio opcionalmente a través de un enlazador químico.

La perla de vidrio/dopante de tierras raras produce un espectro identificable cuando se ilumina. (Esto se puede identificar mediante longitud de onda o mediante intensidad). En particular, el espectro producido es de un intervalo muy estrecho en comparación con fluoróforos conocidos.

Como se explica con más detalle más adelante, se pueden usar varias de tales perlas con diferentes agentes de unión. Los diferentes agentes de unión se pueden elegir para unirse a varias dianas diferentes en una muestra. Después de que las perlas se hayan expuesto a una muestra, la composición se puede explorar e interpretar un espectro combinado de los diferentes espectros emitidos por las diferentes perlas para determinar la presencia de puntuaciones de dianas diferentes en un ensayo.

Los fluoróforos existentes sólo se pueden mezclar con, por ejemplo, tres o, como mucho, cuatro dopantes diferentes. Si se usan más, el espectro combinado producido no se puede interpretar debido a que se produce el solapamiento de las bandas anchas.

La siguiente descripción detallada proporciona información acerca de cómo preparar y modificar el vidrio para uso en la composición y métodos como se define en las reivindicaciones.

Transportador

Se pueden emplear varios métodos para dopar composiciones de vidrio con los iones de tierras raras fluorescentes seleccionados. En un método, se preparan muestras de ensayo de vidrio dopado mediante la incorporación de los iones de tierras raras en la composición del lote usando la sal metálica apropiada. El vidrio se preparó calentando el lote en un crisol de platino hasta por encima del punto de fusión de la mezcla. En otro método, muestras de vidrio convencionales existentes se pulverizan y se mezclan con soluciones de los iones fluorescentes. El vidrio se extrae del disolvente, se lava y después se seca al horno.

Un vidrio que comprende SiO_{2} 51,79% p; NaO 9,79% p; CaO 7,00% p; MgO 2,36% p; Al_{2}O_{3} 0,29% p; FeO, Fe_{2}O_{3} 0,14% p; K_{2}O 0,07% p y B_{2}O_{3} 28,56% p se puede preparar sometiendo a molienda de bolas perlas de cal sodada (100 \mum) durante 5 minutos para crear un polvo para ayudar a la fusión y la mezcla. Después, 5 g de las perlas de cal sodada trituradas, 2 g de B_{2}O_{3} y el 3% en mol del dopante de tierras raras, por ejemplo, Europio, Disprosio y Terbio pero también otros, se someten a molienda de bolas juntos durante, por ejemplo, 3 minutos. Después el polvo resultante se pone en un horno y se calienta hasta 550ºC. El mismo se deja en el horno a esta temperatura durante aproximadamente 30 minutos, para asegurar que el óxido bórico esté completamente fundido. La temperatura se aumenta a 900ºC, 1000ºC y después a 1100ºC durante 1 hora en cada fase para producir un fundido homogéneo. La temperatura se aumenta opcionalmente hasta 1250ºC como un paso final, y el vidrio fundido después se vierte en un molde de metal, que está a temperatura ambiente, lo cual interrumpe que el vidrio forme un vidrio de borosilicato transparente sin burbujas, dopado con ión de tierras raras. Opcionalmente, el molde de metal se puede calentar para reducir la posibilidad de agrietamiento durante el paso de vertido.

La longitud de onda de emisión pico para la emisión fluorescente en el marcador depende de los niveles de energía del vidrio dopado con tierras raras final. La alteración del porcentaje en peso de los óxidos modificadores de red dentro de la matriz de vidrio cambiará estos niveles y por lo tanto, cambia la huella de pico observada. Análogamente, cuando se usan dos o más dopantes de tierras raras, la variación de las proporciones en porcentaje en mol, de los mismos cambian la intensidad de fluorescencia en la señal detectada. Las intensidades pico se pueden usar como parte del esquema codificante y de este modo al variar los niveles de dopante, se proporciona una oportunidad para proporcionar incluso más opciones de identificación.

Para triturar el vidrio hasta un polvo fino se usó un molino de bolas Glen Creston con vial de ágata y bolas de circonio. El tamizado inicial hasta 45 \mum se consiguió usando un tamiz de 45 \mum convencional y agitador de tamiz. Por debajo de ese tamaño se necesitó trabajo adicional debido a problemas provocados por la aglomeración y los efectos de apelmazamiento que impiden el paso de polvo a través de los tamices convencionales.

La técnica de tamizado húmero se adaptó de Mullin [2] y un diagrama del esquema experimental se muestra en la Fig. 9. El proceso implicó la colocación de la muestra tamizada (1 g) en el tamiz antes de bajar el tamiz hasta un vaso de precipitado de acetona de forma que la acetona estaba 1 cm por encima de la superficie de tamizado sumergida. Después el vaso de precipitado se colocó en un baño ultrasónico y se sometió a su sonicación durante 2 minutos. Se usó un cable de cobre para el enganche a los lados del vaso de precipitado para mantener el tamiz en su lugar.

La muestra tamizada se dispersó en la acetona por debajo del tamiz. Por lo tanto, la mayor parte de la acetona se pudo decantar (después de dejar un tiempo para que la muestra se sedimentara) antes de permitir que el resto se evaporara hasta sequedad. Este proceso se puede usar para producir muestras por debajo de 5 \mum.

Como una alternativa al método de tamizado húmedo descrito anteriormente, también pueden ser útiles cernedores sónicos (por ejemplo, de Endecotts) ya que los mismos pueden permitir un proceso de tamizado seco hasta un tamaño de partícula de micrómetro único. El método de tamizado es mediante una columna vertical variable de aire que oscila a través de un tamiz o un conjunto de tamices. El movimiento del aire levanta de forma alterna la muestra y después la ayuda a través de las aberturas del tamiz. También se puede aplicar un impulso mecánico vertical a los tamices en intervalos regulares para descomponer cualquier partícula agrupada y ayudar a eliminar cualquier bloqueo de las aberturas.

Se colocaron muestras de aproximadamente 1 g en el tamiz (tamiz de 10 \mum) y se desarrollaron en el cernedor sónico durante periodos de 9 minutos. Este proceso se repitió hasta que se produjo una cantidad suficiente. El polvo resultante era blanco en comparación con el polvo de tamizado húmedo, que era de apariencia marrón claro. Esto produjo cantidades mucho mayores de muestra en un periodo mucho más corto de tiempo. La pureza de la muestra también fue evidente sin signos de contaminación provocados por el método de tamizado.

Para determinar el tamaño de partícula de las muestras trituradas, se usó un Malvern Mastersizer/E. Se usó una solución al 0,1% de hexametafosfato sódico (calgon) como un líquido de dispersión para dispersar la muestra en la celda de la muestra para permitir que se calculara un valor promediado de tamaño de partícula. Se usó la lente de enfoque de 100 mm para medir el intervalo de tamaño de 0,5-180 \mum. La cantidad de muestra añadida se determinó mediante el programa de software en el ordenador unido al instrumento, que proporcionó un indicio de la cantidad óptima a medida que la muestra se añadió a la celda.

Los resultados de distribución del analizador de tamaño de partícula se muestran en la Fig. 10 y en la Tabla 1 se muestra una tabla de resultados importantes:

TABLA 1

1

El programa informático para el análisis del tamaño de partícula proporciona los datos en diversas formas dependiendo de cómo calculó el tamaño. Los términos en el lado izquierdo se refieren a lo siguiente [3]:

D [v,0,5] -

Diámetro medio de volumen. Esta figura tiene el 50% de la distribución por encima y el 50% por debajo de este valor. La misma divide la distribución exactamente por la mitad.

D [v,4,3] -

Diámetro medio de volumen. Éste es el diámetro de la esfera que tiene el mismo volumen que una esfera ideal.

2

D[v,0,9], D [v,0,1] -

Éstos son puntos de corte del 90% y el 10% respectivamente de la distribución. Donde D [v,0,9] tiene el 90% de la distribución por debajo de este valor y D [v,0,01] tiene el 10% de la distribución por debajo de este valor.

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El análisis de tamaño de partícula concluyó que la mayoría de las muestras recogidas después del procedimiento de cernedor sónico estaban por debajo de 10 um.

Las identificaciones fluorescentes de perlas brutas se verificaron usando un Espectrofotómetro Perkin Elmer Lambda 2 UV/Vis. Los ajustes seleccionados para determinar los espectros de absorción se muestran en la tabla 2.

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TABLA 2

3

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Cada muestra se insertó en una cubeta de cuarzo para minimizar la señal de fondo. Después los datos se guardaron en un formato que se podía usar en Microsoft Excel donde se podía alterar el eje para conseguir el espectro óptimo.

Para determinar los espectros de fluorescencia de cada muestra las mismas se analizaron usando el Espectrómetro de Luminiscencia Perkin Elmer LS50B. Los ajustes típicos usados para producir un espectro 3D de las muestras se muestran en la tabla 3.

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TABLA 3

4

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Enlazador Químico

Antes de conjugarse al agente de unión para unirse a la diana, el transportador de perlas de vidrio se puede tratar con un enlazador químico adecuado tal como un recubrimiento para mejorar la conjugación del agente de unión con el transportador. En determinadas realizaciones, el agente de unión en primer lugar se puede unir químicamente con el enlazador químico y después la molécula combinada fijarse químicamente, o de otra manera, a la perla de vidrio.

Para otras realizaciones el enlazador químico puede ser una superficie modificada de la perla de vidrio.

Algunos ejemplos del tratamiento de la superficie de vidrio y/o de conjugación del agente de unión en la perla de vidrio se detallan más adelante.

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Ejemplo 1

Silanización

Preferiblemente se usa silanización para unir ácidos nucleicos a las perlas de vidrio. Un método de sinalización de las perlas de vidrio se proporciona más adelante.

\bullet

Limpiar las bandejas de vidrio enjuagándolas con agua destilada doble antes del uso. Las bandejas de silano después se deben enjuagar con EtOH al 95% y la bandeja de acetona se debe enjuagar con acetona.

\bullet

Sonicar las perlas de vidrio en acetona durante 10 minutos.

\bullet

Después de la sonicación en acetona, lavar las perlas de vidrio en la bandeja de agua destilada doble al menos dos veces.

\bullet

Sonicar las perlas de vidrio en NaOH 0,1 M durante 10 minutos.

\bullet

Preparar la siguiente solución de silano en una campana:

\bullet

Añadir REACTIVOS:

\bullet

350 ml de EtOH al 95%

\bullet

42 ul de Ácido Acético Glacial

\bullet

11 ml de glicidoxipropiltrimetoxi silano

\bullet

Después de la sonicación en NaOH, lavar las perlas en la bandeja de agua destilada doble al menos dos veces.

\bullet

Sonicar las perlas en solución de silano durante al menos 3 minutos

\bullet

Lavar las perlas en la bandeja de EtOH al 100%

\bullet

Secar con gas nitrógeno pre-purificado. Almacenar en horno a 100ºC. Esperar al menos 2 horas antes de usar las perlas.

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Ejemplo 2

Silanizar oligonucleótidos a perlas de vidrio

En este ejemplo el agente de unión en primer lugar se fija al grupo que contiene silano. La molécula combinada después se fija a la perla de vidrio.

Perlas de vidrio no modificadas en primer lugar se limpian mediante ultrasonicación durante 30 minutos, seguido por inmersión en NaOH al 10% durante 30 minutos, después tres lavados en agua desionizada y uno de agua destilada. Se deja que las perlas se sequen al aire durante una noche.

El protocolo de silanización generalmente sigue el descrito por Kumar et al (2000)^{4}, con algunas modificaciones. En general, 5 nmol del agente de unión, es decir oligonucleótidos 5' modificados con tiol, se someten a reacción con el enlazador es decir, 5 nmol de mercaptosilano (3-Mercaptopropil-trimetoxisilano) en tampón de acetato de sodio 30 mM (pH 4,3) durante dos horas a temperatura ambiente, véase el esquema de reacción 1.

Esquema de reacción 1

Conjugación de ácidos nucleicos marcados con tiol a mercapto- o disulfuro silano

5

Durante este proceso, los oligonucleótidos se modifican químicamente (silanizan). Las perlas de vidrio después se suspenden en el volumen mínimo de oligonucleótidos silanizados. Las perlas se incuban en una cámara humidificada (37ºC durante 30 minutos). Después las perlas de vidrio se incuban (50ºC durante 10 minutos).

El agente de unión con oligonucleótidos fijados se forma de esta manera. Cualquier oligonucleótido no unido se retira mediante inmersión durante 30 segundos en H2O destilada hirviendo.

Más adelante se muestran los esquemas de reacción alternativos 2 y 3.

Esquema de Reacción 2

Conjugación de ácidos nucleicos marcados con acrílico a silano acrílico mediante polimerización

6

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Esquema de Reacción 3

Conjugación de ácidos nucleicos marcados con tiol a amino silano usando un reticulante heterobifuncional

7

Ejemplo 3

Enlace de tioéter

Como se muestra en la Figura 13, la superficie de la perla de vidrio se puede modificar para proporcionar un tiol. El agente de unión (en este caso ADN) modificado con Acrydite se fija a la superficie de vidrio.

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Ejemplo 4

Como se muestra en la Figura 14, la superficie de la perla de vidrio se trata para proporcionar un transportador sólido derivatizado de amino-silano (A) que se somete a reacción con succinimidil-4[maleimidofenil]butirato (SMPB) para formar una conexión con el agente de unión (C), que en este caso es un oligonucleótido modificado con tiol.

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Ejemplo 5

Ejemplo de método para hibridación con oligonucleótidos con perla de vidrio unida

En este ejemplo usando la técnica de hibridación, se usan oligonucleótidos marcados complementarios para unirse con los olignucleótidos diana que se han separado mediante electroforesis en gel.

Las técnicas de transferencia de southern o transferencia puntual o transferencia por ranuras se usan para separar fragmentos diferentes de ADN. La Figura 12 muestra un esquema adecuado que comprende un aparato de electroforesis en gel 10 con suministro eléctrico unido 12, una membrana 14, placa 15 y escáner 18.

Los oligonucleótidos se pueden pre-hibridar en un horno a 60 ó 65ºC en solución de hibridación durante al menos 3 horas, a la que no se ha añadido ninguna sonda (ADN marcado con identificador).

Los oligonucleótidos o fragmentos de ADN no marcados se separan mediante electroforesis en gel 10. Los fragmentos de ADN separados se desnaturalizan usando álcali y se inmovilizan en una membrana cargada 14 que se coloca en una placa 15.

Los oligonucleótidos complementarios marcados con identificador, es decir con perla de vidrio unida se producen como se han descrito en los ejemplos anteriores o mediante cualquier otro proceso adecuado.

Los oligonucleótidos complementarios se aplican a la placa 15 mediante una pipeta 22.

La membrana 14 se deja en la placa 15 y se incuba adicionalmente con un volumen mínimo de solución de hibridación a la que se han añadido dos oligonucleótidos complementarios marcados con identificador de cadena única. La membrana 14 y los oligonucleótidos se incuban al menos seis horas a la misma temperatura a la que tuvo lugar la pre-hibridación.

A continuación de la hibridación la membrana 14 se lava secuencialmente de acuerdo con el siguiente programa:

3 x 10 minutos en 50ml de 2 x SSC, SDS al 0,1% a 65ºC

3 x 20 minutos en 50ml de 0,2 x SSC, SDS al 0,1% a 65ºC

2 x 10 minutos en 50ml de 0,1 x SSC a 37ºC.

Después la membrana se seca al aire y se explora para determinar fluorescencia.

Ejemplo de Solución de Hibridación para ADN Genómico (30 ml)

7,5 ml de 20x SSC

1,5 ml de Solución de Denhardt 100x

3 ml de sulfato de dextrano al 50%

1,5 ml de tampón fosfato 1 M, pH 6,7

0,3 ml de SDS al 10%

16,05 ml de H_{2}O

Añadir 150 \mul de 10 mg/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado para pre-hibridización.

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Ejemplo 6

Recubrimiento con Poliestireno/Anticuerpo

Cuando las proteínas, tales como anticuerpos, se unen a las perlas de vidrio es preferible usar un enlazador de poliestireno como se ha descrito en el método que se detalla más adelante.

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Tomar especies de perlas de vidrio con dopantes de tierras raras.

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Recubrir perlas de vidrio con poliestireno.

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Mezclar una solución tamponada (pH 9,3) que comprende un anticuerpo con las perlas recubiertas con poliestireno.

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Mezclar las perlas en esta solución y dejarlas durante varias horas o durante una noche a 37ºC con agitación suave.

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Lavar dos o tres veces con PBS (solución salina tamponada con fosfato) Tween 20 (0,1%) a temperatura ambiente.

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Bloquear las perlas durante 1 h a 37ºC con BSA (Albúmina sérica bovina) al 2% en PBS para evitar la unión inespecífica al anticuerpo en pasos posteriores, después lavar como anteriormente.

-

Lavar las perlas como anteriormente y enjuagar con agua destilada. Las perlas están listas para ensayo con el sistema de detección.

Por tanto, para determinadas realizaciones, las perlas de vidrio recubiertas con poliestireno y anticuerpos (como agente de unión) se introducen en una muestra que comprende el antígeno (diana) también en una superficie de poliestireno. Después la muestra se lava y la cantidad de fluorescencia detectada a partir de la muestra lavada es proporcional a la cantidad de perlas de vidrio/anticuerpos unidos al antígeno diana y, por lo tanto, indicativas de la presencia y/o cantidad de antígeno en la muestra.

Como alternativa, una superficie de poliestireno se puede recubrir con un anticuerpo de captura. Se puede introducir una mezcla de antígenos (tal como una muestra de sangre), uno de los cuales "un primer antígeno" se unirá al anticuerpo en la superficie de poliestireno. Después se introducen las perlas de vidrio con un agente de unión a antígeno. Dicho primer antígeno, que funciona como un anticuerpo, después se unirá al antígeno unido a las perlas de vidrio.

Esto permite la selección de un antígeno específico cuando la muestra comprende una mezcla de antígenos, por ejemplo, las muestras de sangre comprenden muchos antígenos diferentes y, con frecuencia, es sólo uno de los mismos el que está en análisis en cualquier momento dado.

Las perlas de vidrio no unidas después se pueden retirar por lavado y las perlas de vidrio unidas a la diana se pueden analizar como se ha descrito anteriormente para otros ejemplos.

Una opción adicional se muestra en las Figuras 11a-11d que muestran antígeno 32 inmovilizado sobre una membrana de poliestireno 34. El antígeno no unido 32 después se retira por lavado.

El antígeno se puede conjugar con BSA (Albúmina sérica bovina) que es una proteína que aumenta el tamaño del antígeno 32 para ayudar a la unión del anticuerpo al antígeno 32.

Como se muestra en la Fig. 11b, los sitios restantes en la membrana de poliestireno 34 después se bloquean mediante la adición de BSA, tween u otro agente adecuado 38.

Como se muestra en la Fig. 11c, después se introduce antígeno libre 33 junto con anticuerpos 36 para producir una unión competitiva entre los antígenos libres 33 e inmovilizados 32 con los anticuerpos 36. Los anticuerpos 36 que no se unen al antígeno libre 33, se unen al antígeno inmovilizado 32.

Después la muestra se lava para retirar por lavado cualquier antígeno libre no unido 33. Como se muestra en la Fig. 11d, se añaden perlas de vidrio 30 con anticuerpos marcados secundarios. Los anticuerpos marcados secundarios se unen a los anticuerpos 36 (que ahora actúan como un antígeno). La muestra se lava nuevamente para separar cualquier perla de vidrio no unida antes de explorar y detectar la fluorescencia como se ha descrito para otras realizaciones.

Análisis de fragmento

Determinadas realizaciones de la presente invención se pueden usar para análisis de fragmento de ADN, por ejemplo, con propósitos de identificación. En este ejemplo, se usan perlas de vidrio marcadas con tierras raras con ADN u oligonucleótidos como cebadores en una reacción en cadena polimerizada para producir secuencias de ADN amplificadas de longitud variable que son características de cada animal. El procedimiento se describe más adelante.

Perlas de vidrio que incorporan el elemento/dopante de tierras raras se proporcionan con un agente de unión adecuado, tal como una cadena de ADN corta (cebador) que está enlazada a las perlas de vidrio. Se usan dos cebadores diferentes simultáneamente; cada uno se sintetiza para unirse a diferentes elementos de las dos cadenas de ADN que se están investigando. Un cebador marcado con perlas se une a cada extremo de la región de ADN de interés. Después el ADN bicatenario se calienta para separar las hebras y los cebadores se unen a secuencias complementarias en cada una de las hebras. Después se introducen enzimas y nucleótidos de base única para sintetizar una cadena de ADN que es una extensión del cebador unido. La extensión es complementaria a la región de interés. Esto da como resultado un par de cadenas de ADN bicatenario, siendo una hebra de cada par un original y la otra "cadena artificial" preparándose a partir de la extensión enzimática, el cebador y la perla de vidrio. La hebra artificial de cada par es una copia de la hebra original del otro par.

El proceso después se repite: los pares de hebra de ADN se separan mediante calentamiento y adicionalmente los cebadores enlazados a perlas y enzimas replican las hebras nuevamente. Se puede seguir el procedimiento para conducir una reacción en cadena de la polimerasa conocida (PCR). Esto se puede repetir, por ejemplo treinta veces, lo cual permite que las hebras de ADN originales se repliquen aproximadamente un billón de veces (2^{30}). Todas las hebras (aparte de las hebras de ADN originales) tendrán las perlas de vidrio unidas.

Este proceso se puede repetir muchas veces. Diferentes secciones de ADN con perlas de vidrio con una identificación espectroscópica diferente se pueden incluir en la mezcla de reacción.

Hebras únicas para cada una de las hebras de ADN preparadas como se ha detallado anteriormente se pueden separar después mediante electroforesis, que es una técnica conocida que separa especies principalmente de acuerdo con el tamaño mediante la determinación de la distancia a la que cada especie se ha movido a través del gel después de determinado tiempo.

Cualquiera de las perlas de vidrio no unidas se moverá rápidamente a través del gel y no se analizarán adicionalmente. El tamaño de las hebras de ADN se puede estimar de esta manera y las hebras después se pueden explorar para proporcionar, por ejemplo, un perfil de ADN.

Se pueden analizar tanto como cien (o más) hebras de tamaño similar a la misma vez. Por tanto, el procedimiento es mucho más eficaz que realizar múltiples ensayos con sólo tres o cuatro hebras a la vez.

También se pueden usar realizaciones de la presente invención en la reacción en cadena de la polimerasa para aplicaciones diferentes a análisis de fragmento. Con tales realizaciones, perlas marcadas con ADN u oligonucleótidos unidos se usan como cebadores en la reacción de PCR para producir secuencias de ADN amplificadas que se usan para propósitos variables. Por ejemplo, las mismas se pueden usar para producir sondas marcadas de doscientos a quinientos pares de bases de longitud que se pueden usar como sondas.

Las perlas de vidrio marcadas también se pueden usar en reacciones de secuenciación de ADN. De acuerdo con esta solicitud, nucleótidos únicos se marcan con identificador y se usan, por ejemplo, en un protocolo de secuenciación de prolongación de base única o el método de secuenciación de Sanger.

La composición se puede usar con otros tipos de ensayos de unión. Por ejemplo, una muestra de células enteras se puede desarrollar en un gel electroforético convencional y transferirse a una membrana de nitrocelulosa como para transferencia de western convencional. Después la membrana se puede sondear con perlas dopadas con RE que portan los anticuerpos necesarios frente a una diversidad de proteínas que se cree que están presentes en la muestra. Después la membrana se puede desarrollar y las bandas específicas de proteínas diana en la muestra identificarse mediante los espectros de fluorescencia específicos de los iones de RE elegidos. Por ejemplo, el anticuerpo 1 se puede acoplar al ión 1 de RE y se unirá sólo al antígeno 1 en la transferencia.

Análogamente, el antígeno 2 se revelará sólo mediante los espectros de emisión del ión 2 de RE y así sucesivamente. De este modo varias dianas diferentes se pueden identificar fácilmente en la misma muestra al mismo tiempo. En una manera similar perlas transportadoras que portan sondas de ácido nucleico se pueden usar en un método adaptado de transferencia de Southern o Northern. El peso molecular de la diana se puede comprobar en la transferencia para verificar la identificación de la diana.

Tradicionalmente se han realizado inmunoensayos como ensayos específicos, es decir, un analito por tubo de ensayo. Sin embargo, realizaciones de la presente invención permiten el ensayo multi-analito en el que dos o más analitos se miden simultáneamente de una manera única, con las ventajas de simplificación del trabajo, un aumento en el rendimiento del ensayo y la posible reducción de los costes globales.

Los marcadores de lantánido intrínsicamente fluorescentes con fluorescencia de fondo baja, actividad específica elevada y unión inespecífica baja son ideales para incorporación en microperlas transportadoras y la identificación fluorescente resultante de la perla dopada es altamente sensible, específica y tiene un espectro estrecho, haciendo que la detección de varias identificaciones sea viable dentro de una exploración fotométrica única.

Para determinadas realizaciones, el sistema de detección puede comprender un microscopio de fluorescencia de barrido o de fluorescencia confocal de barrido provisto de una fuente láser para excitación y fluoresceína o ficoeritrina como el marcador. También se pueden usar transferencias diferentes (Western, Southern y Northern) para identificar y caracterizar adicionalmente las dianas encontradas.

Detección

Para distinguir la fluorescencia de las perlas de vidrio dopadas unidas al agente de unión de otras especies fluorescentes en la muestra, se utilizaron los tiempos de vida de fluorescencia largos de los iones de tierras raras (RE). Ya que la mayoría de los fluoróforos tienen tiempos de vida de fluorescencia cortos en comparación con las RE, una señal de excitación pulsátil produciría a partir de las RE una señal de fluorescencia pulsátil de la misma frecuencia que produce una corriente alterna (CA). Sin embargo, si la frecuencia pulsátil fuera de una velocidad donde la fluorescencia de RE no tuviera tiempo de degradarse antes del próximo pulso, entonces se produciría una señal de corriente directa (CD) a partir de las RE. Esta señal de CD se puede detectar sin ninguna interferencia de señal CA. Además, como la longitud de onda de la fluorescencia producida por RE es muy específica en comparación con otros fluoróforos, las mismas se pueden detectar espectralmente incluso con muestras dopadas con RE múltiple en comparación con colorantes fluorescentes moleculares que tienen espectros solapantes muy amplios.

Se usó un tiempo encendido/apagado (ciclo de funcionamiento) del 20% para un pulso de excitación corto y un tiempo de degradación largo. Esto se alteró dependiendo del tiempo de vida de los dopantes usados. Ya que las perlas transportadoras típicamente tienen un diámetro inferior a 5 \mum, fue necesaria una fuente de alimentación elevada para producir fluorescencia suficiente. Por lo tanto, se usaron láseres de estado sólido pequeños (tales como los de Edmund Optics Ltd) y se seleccionaron basándose en la caracterización espectral del vidrio en masa. Para aumentar la eficacia de excitación y recolección, se usan guías de luz que pueden acercar la fuente a la muestra y reducir la dispersión de luz.

Para la detección, se pueden usar fotomultiplicadores pequeños (PMT) tales como los PMT de tipo de cabeza de diámetro de 13 mm de Hammamatsu para sensibilidad elevada en el intervalo UV a cerca de IR. Como este sistema se basa en la excitación visible y la emisión visible, esto sería adecuado para la mayoría de las realizaciones sencillas, pero se pueden usar otros PMT para otras longitudes de onda de fluorescencia producida. Se pueden añadir filtros de banda estrecha (ancho de banda de 10 nm) a la fuente de excitación y el detector para aumentar la especificidad en el sistema detector y para reducir cualquier señal de fondo. Los PMT también son lo suficientemente pequeños para encajar en unos tubos de cabeza de detector para estar tan cerca de la muestra como sea posible colocando cualquier lente o guías de luz y filtros necesarios en los tubos.

Se incorporaron amplificadores de instrumentación en el circuito para amplificar las señales de salida. También se añadió un filtro de paso bajo activo electrónico antes de que la señal alcanzara el amplificador para reducir la señal de CA de fondo. Se seleccionó una frecuencia de punto de corte de 2,84 Hz para retirar cualquier señal con una frecuencia de más de 2,84 Hz. Este efecto se hace mayor a medida que la frecuencia aumenta, por lo tanto, elimina la frecuencia de puslo de excitación que es mayor a 400 Hz.

Para aumentar la velocidad de detección para análisis de alto rendimiento se usó un sistema de detección de punto único (como se muestra en la Fig. 1). Este diseño se puede cambiar dependiendo de los requerimientos de aplicación específicos. El cabezal detector 51 descrito aquí puede alojar tres canales diferentes (para tres dopantes de RE diferentes) que incluyen tres fuentes de excitación diferentes y tres detectores. Para cada canal la excitación y el detector se colocan en ángulos rectos entre sí para aumentar la eficacia de recolección de fluorescencia y para minimizar el ruido disperso indeseado. También proporciona una opción para el canal de detección de referencia en el centro.

La salida de señal final se puede suministrar a un PC a través de un registrador de datos tal como un PicoLog ADC11 o un sistema de detección dedicado. Esto se podría usar junto con software para verificar las perlas y su identificación presente y, por lo tanto, qué anticuerpo y antígeno están presentes en la muestra. La señal se puede cuantificar mediante comparación con gráficos convencionales de cantidades conocidas de perlas dopadas con RE.

Durante el funcionamiento de esta disposición, se emite luz a partir del emisor, opcionalmente se pasa a través de un filtro y a una muestra que incluye la composición. Esta luz se absorbe mediante el dopante de tierras raras, la cual si coincide con los niveles de energía del dopante y el transportador usado provoca la fluorescencia. La luz emitida a partir del artículo se transmite al detector. También la emisión de cada RE en cada transportador se degrada a lo largo de un período de tiempo diferente. Debido a esta característica, el tiempo a lo largo del cual ocurre una emisión para una longitud de onda particular se puede usar como parte de un perfil de identificación. Para un ensayo positivo, la luz recibida en el detector debe tener un o más elementos característicos que se puedan identificar.

Las emisiones espectrales de diversas muestras de marcador se han investigado. Como un ejemplo, la tabla 4 más adelante muestra las longitudes de onda de emisión y las intensidades de diversas longitudes de onda de excitación de un transportador que comprende el 3% en mol de EuCl_{3} en el vidrio del borosilicato descrito anteriormente. A modo de comparación, la tabla 5 muestra los resultados correspondientes para el dopante EuCl_{3}:6H_{2}O, pero cuando está en solución. A partir de estas tablas se puede observar que en vidrio la excitación más fuerte es a 395 nm, que emite a 615 nm y 590,5 nm. Los resultados correspondientes para el EuCl_{3}:6H_{2}O en solución muestran que las longitudes de onda de emisión aquí son 592,5 nm, 618,5 nm, 556,5 nm, 536 nm y 526 nm. Por lo tanto, la respuesta espectral del marcador a 395 nm es significativamente diferente de la de EuCl_{3}:6H_{2}O en solución. También en vidrio, para excitación a una longitud de onda de 415 nm existe una salida de 615 nm y 590,5 nm. Por el contrario, para el EuCl_{3}:6H_{2}O en solución efectivamente no hay fluorescencia en esta longitud de onda. De nuevo, esto demuestra que existe una diferencia significativa y medible provocada por la incorporación de EuCl_{3}:6H_{2}O en el transportador de borosilicato.

TABLA 4

8

TABLA 5

9

Debido a que los iones de tierras raras tienen bandas espectrales bien definidas y relativamente estrechas no solapantes, es posible detectar la presencia de la molécula diana usando una longitud de onda de excitación pre-determinada específica única y análogamente una longitud de onda de detección pre-determinada específica única. Por ejemplo, para el vidrio del borosilicato dopado con EuCl_{3} descrito anteriormente, el filtro del emisor se podría seleccionar para que fuera de 465 nm y el filtro detector podría ser de 615 nm. Como alternativa, se podría usar una pluralidad de longitudes de onda estimulantes. Para realizar esto, se seleccionarían varios filtros de emisor adecuados diferentes y una pluralidad de filtros correspondientes. Éstos estarían incluidos en la disposición de la Figura 1 para permitir la medición simultánea de respuesta óptica a diversas longitudes de onda. La Figura 1 muestra un sistema de exploración 50 que comprende un fotomultiplicador 40, un cabezal láser 42, un cabezal de microscopio 44, una muestra de vidrio 46, un obturador 48, un interruptor periódico de haz 52, un portaobjetos de vidrio 54 y un fotodiodo 56.

Una ventaja adicional de la naturaleza específica de la respuesta espectral de los iones de tierras raras es que se pueden combinar varias especies en un transportador para una firma de identificación más específica, por ejemplo, 3% en mol de Eu + 3% en mol de Tb, sin excluir otras tierras raras en porcentajes diferentes y más de dos. Debido a que la respuesta de los diversos dopantes diferentes es relativamente específica, la detención de los mismos se simplifica. Las bandas de emisiones estrechas también facilitan la selección espectral de las moléculas, haciendo que el sistema de detección sea más sencillo que aquellos necesarios para sistemas que contienen múltiples colorantes. Una ventaja adicional es que muchos iones de tierras raras requieren excitación a longitudes de onda conducentes a tecnologías de diodo láser existentes. Esto hace que la excitación en línea sea no sólo posible sino compacta, robusta y de vida prolongada. Además, la incorporación de dopantes de tierras raras en un transportador adecuado, y en particular las perlas de vidrio descritas en este documento, significa que la composición en la que la invención está incluida es extremadamente estable en condiciones químicas, ambientales y físicas de abrasión adversas.

Resultados

Los espectros de absorción para el vidrio del borosilicato dopado con europio se muestran en la Fig. 2 para el intervalo completo y sólo la región visible. Debido a que la muestra era un vidrio, hubo una absorción marcada en el intervalo de UV inferior a 300 nm que se puede ignorar para todas las muestras ya que esta absorción estuvo presente para la absorción del vidrio bruto mostrada en la Fig. 3. Ya que la absorción de fondo del vidrio era constante este efecto se pudo retirar tomando el segundo espectro derivado de cada muestra.

Todas las asignaciones de nivel de energía se proporcionan en la tabla 6. El pico a 532 nm se refiere a la transición de ^{7}F1-^{5}D1 mientras que todas las transiciones en la tabla son desde el estado fundamental ^{7}F_{0}.

TABLA 6 Asignaciones de nivel de energía [1] para Eu^{3+} dopado en vidrio de borosilicato

11

A partir del espectro de absorción del vidrio de borosilicato bruto no hubo absorción en el intervalo visible y, por lo tanto no hubo interferencia. El espectro de fluorescencia del vidrio bruto se analizó para determinar si había cualquier fluorescencia debida al vidrio y se muestra en la Fig. 4. Este espectro muestra un pico de fluorescencia amplio marcado que varía de aproximadamente 300-500 nm de excitación y emisión entre 350-440 nm, lo cual se relaciona con el espectro de absorción de la Fig. 3. En la Fig. 5 también se muestra con más detalle la región visible.

Las Figs. 4 y 5 no muestran ninguna señal de fluorescencia marcada en la región visible comparación con la de UV. Por lo tanto, el vidrio bruto no muestra ninguna fluorescencia significativa que pudiera interferir con los dopantes de tierras raras que posibilitan que el vidrio dopado con europio se analice.

Los espectros de fluorescencia para el vidrio de borosilicato dopado con europio al 3% en mol se muestran en la Fig. 6. Estos espectros ilustran los picos característicos nítidos de las tierras raras relacionándose la mayoría de los picos de excitación con el espectro de absorción de la Fig. 2. Tampoco hubo señal presente del vidrio y por lo tanto esto apoya el razonamiento de que el vidrio no influiría en la fluorescencia del dopante. Todas las transiciones de emisión para el vidrio dopado con europio se muestran en la tabla 7.

TABLA 7 Picos de fluorescencia, su intensidade y transiciones relativas

12

13

Las longitudes de onda de interés para uso con el detector in-situ fueron excitación de 465 nm y emisión de 615,5 nm. Este pico fue útil debido a su naturaleza específica sin picos de interferencia alrededor del mismo.

A continuación de la caracterización espectral del vidrio de borosilicato dopado con RE, basándose en las longitudes de onda de excitación y emisión específicas, se identificó europio (Eu) como un dopante adecuado. Antes de usar el tiempo de degradación fluorescente como una característica de identificación, fue importante comprobar los tiempos de vida fluorescentes de los iones de RE dopados dentro del vidrio.

Para ensayar los tiempos de vida, se realizaron estudios de fluorescencia de resolución temporal de los iones en el vidrio de borosilicato. El esquema experimental que incluye el Microscopio de Fluorescencia de Exploración Inducida por Láser (LISFM) se muestra en la Fig. 1. El microscopio enfocó la luz láser en la muestra de vidrio dopado con RE y recogió la fluorescencia. Se usaron pulsos láser cortos de longitud de onda apropiada, generados a partir de un láser de ión Ar de onda continua (CW) mediante un interruptor periódico mecánico, para excitar la fluorescencia y las variaciones de intensidad de fluorescencia temporales correspondientes se detectaron usando un fotodetector altamente sensible (tubo Fotomultiplicador o fotodiodo). Opcionalmente se colocó un conjunto de filtros frente al detector para filtrar longitudes de onda indeseadas. Como una referencia, los pulsos láser se supervisaron usando un fotodiodo con la ayuda de una placa de vidrio parcialmente reflectante (portaobjetos de vidrio microscópico). Se usó un osciloscopio en tiempo real digital Tektronix TDS 380 para presentar y registrar las señales.

Las características espectrales de muestras dopadas con Eu han mostrado un pico de absorción marcado aproximadamente a 465 nm y un pico de emisión correspondiente a aproximadamente 614 nm. Por lo tanto se seleccionó una longitud de onda láser de ión Ar a 465 nm para la excitación y se eligió un filtro de interferencia con pico de transmisión a 620 nm (Anchura de Banda a Media Altura, FWHM = 10 nm) como el filtro de fluorescencia. La intensidad transmitida se detectó usando un PMT y se presentó/registró usando el osciloscopio. Un puslo láser típico se muestra en la Fig. 8 y tiene una anchura de puslo de casi 500 microsegundos (FWHM). El puslo fluorescente correspondiente del Eu al 3% en mol dopado en vidrio de borosilicato se muestra en la Fig. 9. Como se puede observar a partir de la figura, el puslo de fluorescencia es mucho más largo que el puslo de bomba (casi 7 milisegundos de anchura de base) y tiene una FWHM de 2 milisegundos.

El marcador secundario del FITC conjugado al anticuerpo se puede usar para cuantificar la cantidad de antígeno presente, mediante comparación con una cantidad conocida en gráficos convencionales.

Aunque sólo algunos iones de tierras raras se han descrito específicamente, se apreciará que existe un amplio intervalo de iones de tierras raras fluorescentes que se podrían usar. Por lo tanto, las permutaciones disponibles están enormemente potenciadas. Los picos de excitación y emisión para algunos iones de RE se muestran en la tabla 8 a continuación:

TABLA 8

14

Además, aunque algunos iones de tierras raras emiten intervalos de UV e IR, es preferible que tanto la radiación de excitación como la radiación de emisión estén dentro del intervalo visible, es decir, dentro un intervalo de longitud de onda que sea visible a simple vista. Por consiguiente, la descripción anterior de una realización específica se realiza solamente a modo de ejemplo y no con propósitos de limitación.

Referencias

1. Carnall, W.T., Fields, P.R. y Rajnak, K., Electronic energy levels of the trivalent lanthanide aquo ions. IV. Eu3+, The Journal of Chemical Physics, 1968, 49(10), 4450-4455

2. Mullin, J. W., Particle size analysis with micro sieves using ultrasonic vibrations, Chemistry and Industry, 1971, 1435-1436

3. Rawle, A., Basic principles of particle size analysis, Accessed 26/05/03, http://www.malvern.co.uk/malvern/
kbase.nsf/0/5E3F5A148D336B0480256 BF2006E2195/\textdollarfile/Basic principles of particle size analysis MRK034-low res.pdf.

4. Kumar, A, Larsson, O, Parodi, D y Liang Z (2000). Silanised nucleic acids: a general platform for DNA immobilization. Nucleic Acids Research Methods Online, 28, 14, e71

Claims (20)

1. Un composición analítica ópticamente detectable que comprende partículas de vidrio de menos 20 \mum, consistiendo dichas partículas en un transportador de vidrio que incorpora un dopante de tierras raras y, unido al transportador, al menos uno de un agente de unión biológico seleccionado entre biomoléculas y macromoléculas o un enlazador químico adecuado para unirse a un agente de unión biológico, proporcionando dicho enlazador un medio para modificar la superficie del transportador de vidrio para volverlo receptivo a la fijación de una biomolécula o macromolécula, caracterizada por que el vidrio es un vidrio de borosilicato.

2. Una composición como se indica en la reivindicación 1, en la que el agente de unión biológico se selecciona entre oligonucleótidos, ácidos nucleicos, alelos, genes, enzimas, anticuerpos, antígenos y especies celulares.

3. Una composición como se ha indicado en la reivindicación 1, en la que las partículas de vidrio son de menos de 5 \mum.

4. Una composición como se ha indicado en la reivindicación 1, en la que el enlazador químico comprende uno de un silano o poliestireno.

5. Una composición como se ha indicado en la reivindicación 1, en la que el enlazador químico comprende uno cualquiera entre el grupo que consiste en un grupo tiol, un grupo carboxílico activado, un grupo yodo-acetamida y un grupo maleimida.

6. Una composición como se ha indicado en cualquier reivindicación precedente, donde la composición comprende una pluralidad de dopantes de tierras raras diferentes.

7. Una composición como se ha indicado en la reivindicación 6, en la que los dopantes de tierras raras se seleccionan entre Europio, Disprosio y Terbio.

8. Una composición como se ha indicado en la reivindicación 6, en la que los dopantes de tierras raras diferentes cada uno tiene niveles de concentraciones diferentes, de forma que las intensidades de las emisiones de longitud de onda pre-seleccionadas son diferentes.

9. Un método para analizar una diana en una muestra, comprendiendo el método:

(a)

proporcionar una composición de análisis como en la reivindicación 1, donde un agente de unión biológico conjugado a una partícula se adapta o elige para unirse a la diana;

(b)

exponer la muestra y el agente de unión biológico el uno al otro;

(c)

separar (i) el agente de unión biológico que se ha unido a cualquier diana de (ii) el agente de unión biológico que no se ha unido a ninguna diana;

(d)

y, producir emisiones a partir del elemento de tierras raras, iluminando al menos uno de (i) el agente de unión biológico que se ha unido a cualquier diana y (ii) el agente de unión biológico que no se ha unido a ninguna diana;

(e)

detectar cualquier emisión a partir de la muestra iluminada en el paso (e); y,

(f)

relacionar la emisión detectada con cualquier característica de la diana incluyendo su presencia o ausencia en la muestra.

10. Un método como se ha indicado en la reivindicación 9, en el que dicha característica es la presencia o ausencia de la diana en la muestra.

11. Un método como se ha indicado en cualquiera de las reivindicaciones 9 ó 10, en el que la cantidad de cualquier diana se determina mediante la emisión detectada.

12. Un método como se ha indicado en la reivindicación 9, en el que dicha característica es el tamaño de las moléculas diana.

13. Un método como se ha indicado en una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 10, en el que el agente de unión biológico conjugado es tal que provoca que la composición emita luz que es de una longitud de onda que está en la región visible del espectro electromagnético entre 390 nm y 700 nm.

14. Un método como se ha indicado en una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13, en el que el agente de unión biológico comprende un nucleótido.

15. Un método como se ha indicado en la reivindicación 14, que incluye el paso de realizar una hibridación.

16. Un método como se ha indicado en la reivindicación 13 o reivindicación 14, usado para conducir análisis de fragmento de ácidos nucleicos, tales como ADN.

17. Un método como se ha indicado en una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13, en el que uno del agente de unión biológico y la diana es un anticuerpo y el otro del agente de unión biológico y la diana es un antígeno.

18. Un método como se ha indicado en una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13, en el que el agente de unión biológico es uno de una proteína y una especie celular y la diana es otro de la proteína y la especie celular.

19. Un método como se ha indicado en una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 18, en el que el transportador comprende perlas de vidrio y la silanización de las perlas de vidrio se realiza antes de que la molécula biológica se conjugue a la misma.

20. Un método como se ha indicado en una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 19, en el que está unida más de un tipo de molécula diana.