ES2216034T3 - Indicadores de conversion creciente destinados a ensayos biologicos y otros utilizando tecnicas de excitacion por laser. - Google Patents

Indicadores de conversion creciente destinados a ensayos biologicos y otros utilizando tecnicas de excitacion por laser.

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ES2216034T3
ES2216034T3 ES96200682T ES96200682T ES2216034T3 ES 2216034 T3 ES2216034 T3 ES 2216034T3 ES 96200682 T ES96200682 T ES 96200682T ES 96200682 T ES96200682 T ES 96200682T ES 2216034 T3 ES2216034 T3 ES 2216034T3
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Michel J. Rossi
Norman A. Peppers
James Kane
Gregory W. Faris
Mark J. Dyer
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Abstract

LA INVENCION SUMINISTRA METODOS, COMPOSICIONES Y UN APARATO PARA REALIZAR UNA DETECCION SENSIBLE DE SUJETOS DE ANALISIS, TALES COMO MOLECULAS BIOLOGICAS Y OTROS SUJETOS, ETIQUETANDO UNA MOLECULA DE SONDA CON UNA ETIQUETA DE CONVERSION ASCENDENTE. LA ETIQUETA DE CONVERSION ASCENDENTE ABSORBE LA RADIACION DE UNA FUENTE DE ILUMINACION Y EMITE LA RADIACION EN UNA O MAS FRECUENCIAS MAYORES, SUMINISTRANDO UNA RELACION MEJORADA DE SEÑAL-RUIDO Y LA ELIMINACION ESENCIAL DE LA AUTOFLUORESCENCIA DE FONDO DE LA MUESTRA. LOS METODOS, LAS COMPOSICIONES Y EL APARATO SON ADECUADOS PARA LA DETECCION SENSIBLE DE SUJETOS DE ANALISIS MULTIPLES Y PARA DIFERENTES TECNICAS DE ANALISIS EN EL MEDIO CLINICO.

Description

Indicadores de conversión creciente destinados a ensayos biológicos y otros utilizando técnicas de excitación por láser.
La invención se refiere generalmente a procedimientos de análisis y a aparatos para detectar sustancias o analitos solubles, en suspensión o en forma de partículas como por ejemplo proteínas, carbohidratos, ácidos nucleicos, bacterias, virus y células eucarióticas, que utilizan marcas detectables y más específicamente se refiere a aparatos y a procedimientos que incluyen marcas luminiscentes (fosforescentes o fluorescentes).
Los procedimientos para la identificación de especies macromoleculares específicas, como por ejemplo partículas, fármacos y polinucleótidos, han demostrado ser técnicas analíticas muy valiosas en biología y medicina, particularmente para la caracterización de la composición molecular de muestras de tejido normal y anormal y de material genético. Muchos tipos diferentes de dichos procedimientos de identificación se utilizan ampliamente en la investigación biomédica y en la medicina clínica de laboratorio. Ejemplos de dichos procedimientos de identificación incluyen: inmunoanálisis, coloración inmunoquímica para microscopía, clasificación celular activada por fluorescencia (FACS), hibridación de ácidos nucleicos, toma de muestras de agua, toma de muestras de aire y otros.
Típicamente, un método de detección emplea al menos un reactivo analítico que se une a una especie macromolecular diana específica y produce una señal detectable. Estos reactivos analíticos tienen normalmente 2 componentes: (1) una macromolécula sonda, por ejemplo, un anticuerpo o un oligonucleótico, que se puede unir a una macromolécula diana con un grado elevado de especificidad y afinidad y (2) una marca detectable, como por ejemplo un radioisótopo o una molécula de colorante fluorescente unida con fijación covalente. En general, las propiedades de fijación de la macromolécula sonda definen la especificidad del método de identificación y la detectabilidad de la marca asociada determina la sensibilidad del procedimiento de detección. La sensibilidad de la detección está a su vez relacionada tanto con el tipo de marca empleada como con la calidad y el tipo de equipo disponible para detectarla.
Por ejemplo, el radioinmunoanálisis (RIA) ha estado entre los procedimientos analíticos más sensibles y específicos utilizados para detectar y analizar cuantitativamente macromoléculas biológicas. Las técnicas de radioinmunoanálisis se han utilizado para identificar y medir cantidades diminutas de analitos específicos, tales como polipéptidos, fármacos, hormonas esteroides, polinucleótidos, metabolitos y marcadores tumorales, en muestras biológicas. Los procedimientos de radioinmunoanálisis emplean inmunoglobulinas marcadas con uno o más radioisótopos como reactivo analítico. La radiación (\alpha, \beta o \gamma) producida por la desintegración de la marca del radioisótopo unido, sirven como señal que se puede detectar y cuantificar por varios procedimientos radiométricos.
Las marcas radioisotópicas poseen varias ventajas, como por ejemplo: muy alta sensibilidad de detección, muy baja señal de fondo y una medición exacta con instrumentos radiométricos de precisión (contadores de centelleo y gamma) o mediante técnicas autorradiográficas económicasas y sensibles. Sin embargo, las marcas radioisotópicas también presentan varios inconvenientes como por ejemplo: riesgos potenciales para la salud, dificultad de eliminación, requisitos de permisos especiales e inestabilidad (desintegración radioactiva y radiolisis). Además, el hecho de que las marcas radioisotópicas no produzcan de forma típica una señal potente (es decir, no-Cerenkov) en las bandas ultravioleta, infrarroja o visible del espectro electromagnético hace inadecuados a los radioisótopos en general como marcas para aplicaciones, como por ejemplo en microscopía, espectroscopía por imagen y citometría de flujo, que emplean procedimientos ópticos para la identificación.
Por estas y otras razones, los campos de la química clínica, del control del agua y del aire y de la investigación biomédica han buscado marcas detectables alternativas que no requieran radioisótopos. Ejemplo de dichas marcas no radioactivas incluyen: (1) enzimas que catalizan la transformación de un sustrato cromógeno en un producto coloreado insoluble (p. ej., fosfatasa alcalina, \beta-galactosidasa, peroxidasa del rábano picante) o que catalizan una reacción que proporciona un producto fluorescente o luminiscente (p. ej. luciferasa) (Beck y Koster (1990) Anal. Chem. 62: 2258; Durrant, I. (1990) Nature 346: 297; Analytical Applications of Bioluminescence and Chemiluminescence (1984) Kricka et al. (Eds.) Academic Press, Londres), y (2) marcas fluorescente directas (p. ej. isotiacionato de fluoresceína, rodamina, Cascade blue), que absorben energía electromagnética en un espectro de longitud de onda de absorción determinado y por consiguiente emiten luz visible a una o más longitudes de onda mayores (es decir, menos energéticas).
La utilización de enzimas y marcadores fosforescentes/fluorescentes o colorimétricas detectables ofrece la ventaja significativa de la conversión creciente de señal, ya que una molécula de enzima individual tiene una capacidad persistente para catalizar la transformación de un sustrato cromógeno en un producto detectable. En condiciones de reacción y de tiempo de incubación apropiados, una sola molécula de enzima puede producir una gran cantidad de producto, y por consiguiente proporcionar una conversión creciente de señal considerable. Sin embargo, los procedimientos de detección que emplean enzimas como marcadores requieren de forma desventajosa procedimientos y reactivos adicionales para proporcionar una concentración apropiada de sustrato en las condiciones adecuadas para la producción y la detección del producto coloreado. Además, los procedimientos de detección que se basan en marcadores enzimáticos requieren normalmente intervalos de tiempo prolongados para generar cantidades de producto detectables y también generan un producto insoluble que no se une a la molécula sonda.
Un inconveniente adicional de los marcadores enzimáticos es la dificultad para detectar múltiples especies de diana con sondas marcadas por enzimas. Es problemático optimizar las condiciones de reacción y el/los tiempo(s) de desarrollo para dos o más especies de marcador de enzima discreto y, además, existe con frecuencia un solapamiento espectral considerable en los productos finales del cromóforo que dificulta la discriminación de los productos de reacción.
Los marcadores fluorescentes no ofrecen la ventaja de la conversión creciente de señal de los marcadores enzimáticos, no obstante, los marcadores fluorescentes poseen importantes ventajas que han dado lugar a su adopción extendida en inmunocitoquímica. Los marcadores fluorescentes típicamente son pequeñas moléculas orgánicas de colorante, como por ejemplo, fluoresceína, Texas Red, o rodamina, que se pueden conjugar fácilmente con moléculas de sonda, como por ejemplo inmunoglobulina o la proteína A de Staph. aureus. Las moléculas fluorescentes (fluoróforos) se pueden detectar por iluminación con luz de una frecuencia de excitación apropiada y las emisiones del espectro resultantes se pueden detectar mediante sensores electro-ópticos o por microscopía óptica.
Una amplia variedad de colorantes fluorescentes está disponible y se ofrece una selección de espectros de excitación y de emisión. Es posible seleccionar fluoróforos con espectros de emisión que son suficientemente diferentes como para permitir la detección multiobjetivo y la discriminación con sondas múltiples, en los que cada especie de sonda está unida a un fluoróforo diferente. Debido a que los espectros de los fluoróforos se pueden discriminar basándose tanto en la excitación de la banda estrecha como en la detección selectiva de los espectros de emisión, dos o más especies distintas de diana se pueden detectar y resolver (Titus et al. (1982) j. Immunol. Methods 50: 193; Nederlof et al. (1989) Cytometry 10: 20; Ploem, J.S. (1971) Ann. NY Acad. Sci. 177: 414).
Desgraciadamente, los procedimientos de detección que emplean marcadores fluorescentes son de sensibilidad limitada por varias razones. En primer lugar, con fluoróforos convencionales es difícil discriminar señales fluorescentes específicas a partir de señales de fondo no específicas. Los fluoróforos más corrientes son las moléculas orgánicas aromáticas que presentan absorción amplia y espectro de emisión, con desplazamiento al rojo entre 50 y 100 nm en el máximo de emisión hasta una longitud de onda mayor que la longitud de onda de excitación (es decir, absorción). Típicamente, tanto las bandas de absorción como las de emisión están situadas en la banda UV/visible del espectro. Además, el período de vida de la emisión fluorescente es normalmente corto, del orden de 1 a 100 ns. Desgraciadamente, estas características generales de la fluorescencia del colorante orgánico son también aplicables a las señales de fondo a las que contribuyen otros reactivos (p. ej. fijador o suero) o la autofluorescencia o la propia muestra (Jongkind et al. (1982) Exp. Cell Res. 138: 409; Aubin, J. E. (1979) J. Histochem. Cytochem. 27: 36). La autofluorescencia de las lentes ópticas y de la luz de excitación reflejada son fuentes adicionales de ruido de fondo en el espectro visible (Beverloo et al. (1991) Cytometry 11: 784; Beverloo et al. (1992) Cytometry 13: 561). Por lo tanto, el límite de detección de la señal fluorescente específica de los fluoróforos típicos está limitado por el importante ruido de fondo al que contribuyen la fluorescencia no específica y la luz de excitación reflejada.
Un segundo problema de los fluoróforos de colorante orgánico que limitan la sensibilidad es la descomposición fotolítica de la molécula de colorante (es decir, el fotoblanqueo). Por lo tanto, incluso en situaciones en las que el ruido de fondo sea relativamente bajo, a menudo no es posible integrar una señal fluorescente débil durante un tiempo de detección prolongado, ya que las moléculas de colorante se descomponen en función de la irradiación incidente en las bandas UV y UV próximo.
Sin embargo, debido a que los marcadores fluorescentes son atractivos para varias aplicaciones, se han propuesto diversos fluoróforos alternativos que tienen propiedades ventajosas para la detección sensible. Un planteamiento ha consistido en emplear colorantes orgánicos que comprenden un colorante con una molécula aceptora de ficobiliproteína que emite en la banda del rojo lejano o del infrarrojo próximo del espectro en el que el ruido fluorescente no específico se reduce. Se utilizan ficobiliproteínas juntamente con moléculas accesorias que efectúan un desplazamiento grande de Stokes mediante mecanismos de transferencia de energía (patente U.S. nº 4.666.862; Oi et al. (1982) J. Cell. Biol. 93: 891). Los marcadores de ficobiliproteína reducen el grado de solapamiento espectral entre las frecuencias de excitación y las frecuencias de emisión. Un planteamiento alternativo ha consistido en utilizar colorante de cianina que absorbe en la banda amarilla o roja y que emite en el rojo o en el rojo lejano cuando se reduce la autoflorescencia (Mujumbar et al. (1989) Cytometry 10: 11).
Sin embargo, tanto en los colorantes de ficobiliproteínas como en los de cianina las frecuencias de emisión se desplazan hacia el rojo (es decir, desplazamiento de la frecuencia hacia abajo) y se acorta la duración de la emisión, por consiguiente la autofluorescencia de fondo no está completamente eliminada como fuente de ruido. De forma más importante quizás, los colorantes de las ficobiliproteínas y de cianina poseen varios inconvenientes distintos: (1) la emisión en la banda del rojo, rojo lejano e infrarrojo próximo, no es muy adecuada para la detección por el ojo humano, impidiendo la utilización de marcadores de ficobiliproteína y de cianina en la microscopía de fluorescencia óptica, (2) las cianinas, ficobiliproteínas y las moléculas accesorias acopladas (p. ej. Azure A) son moléculas orgánicas susceptibles de fotoblanqueo y que experimentan interacciones químicas no deseadas con otros reactivos, y (3) la radiación emitida se convierte decreciente, es decir de longitud(es) de onda mayores que la radiación de excitación absorbida. Por ejemplo, Azure A absorbe a 632 nm y emite a 645 nm y la aloficocianina absorbe a 645 nm y emite a 655 nm y por lo tanto la autofluorescencia y el ruido de fondo procedente de la luz de excitación del barrido no se elimina.
Otra clase alternativa de fluoróforo que se ha propuesto son los quelatos de lantánido luminiscentes de conversión decreciente (Soini y Lovgren (1987) CRC Crit. Rev. Anal. Chem. 18: 105; Leif et al. (1997) Clin. Chem. 3: 1492; Soini y Hemmila (1979) Clin. Chem 25: 353; Seveus et al. (1992) Cytometry 13: 329). Los quelatos de lantánido de conversión decreciente son materiales fosforescentes inorgánicos que poseen un desplazamiento de Stokes grande hacia abajo (es decir, la emisión máxima típicamente es por lo menos de 100 nm mayor que la máxima absorción) lo que ayuda a la discriminación de la señal de la luz de barrido de excitación. Los materiales fosforescentes de lantánido poseen una duración de la emisión que es suficientemente prolongada (es decir, mayor de 1\mus) para permitir su utilización en los procedimientos de detección controlados por el tiempo que pueden reducir, pero no eliminar totalmente, el ruido causado por la autofluorescencia de vida más corta y la luz difusa de excitación. Además, los materiales fosforescentes de lantánidos poseen emisión de banda estrecha que facilita la discriminación de la longitud de onda contra el ruido de fondo y la luz difusa de excitación, particularmente cuando se utiliza una fuente de excitación (Reichstein et al. (1988) Anal. Chem. 60: 1069). Recientemente, se ha propuesto la luminiscencia de los lantánidos amplificada por la enzima que utiliza quelatos de lantánido de conversión decreciente como técnica de marcado fluorescente (Evangelist et al. (1991) Anal. Biochem. 197: 213; Gudgin-Templeton et al. (1991) Clin Chem. 37:1506).
Hasta hace poco, los materiales fosforescentes de lantánido de conversión decreciente han presentado el inconveniente significativo de que su eficacia cuántica en soluciones acuosas (oxigenadas) es tan baja como para proporcionarles una coloración inadecuada para la citoquímica. Beverloo et al. (op. cit.) ha descrito un material fosforescente lantánido particular con conversión decreciente (oxisulfuro de itrio activado con europio) que produce una señal en soluciones acuosas que se puede detectar mediante procedimientos de resolución temporal. Seveus et al. (op. cit) ha utilizado quelatos de europio de conversión decreciente juntamente con microscopía fluorescente de resolución temporal para rechazar la señal de la fluorescencia puntual y reducir de este modo la autofluorescencia. Tanke et al. (patente U.S. nº 5.043.265) describe partículas de material fosforescente con conversión decreciente como marcadores para inmunoglobulinas y polinucleótidos.
Sin embargo, el material fosforescente de lantánido con conversión decreciente de Beverloo et al. y el quelato de europio de Seveus et al. requiere la máxima longitud de onda de excitación que está en la banda ultravioleta y de este modo produce importante autofluorescencia y ruido de fondo en la muestra (p. ej., suero y/o fluorescencia fijadora, difusión de la luz de excitación y refracción, etc.) que se debe rechazar (p. ej., mediante filtros o rechazo de la señal controlada por el tiempo). Además, la excitación con irradiación ultravioleta daña los ácidos nucleicos y otras moléculas biológicas, planteando serios problemas para las aplicaciones inmunocitoquímicas en las que se desea preservar la viabilidad de las células vivas y mantener las estructuras celulares (p. ej., FACS, microscopía citoestructural).
Se ha utilizado microscopía de láser de fluorescencia por barrido para la excitación del fotón dos de un colorante orgánico fluorescente excitable por UV, Hoechst 33258, utilizando una corriente de impulsos de láser marcadamente enfocados (Denk et al. (1990) Science 248:73). El fluoróforo orgánico utilizado por Denk et al. se fotoblanqueó de forma importante mediante luz de láser intensa muy enfocada durante el transcurso de la detección por imagen.
Por lo tanto, existe una importante necesidad en esta técnica de procedimientos de detección y marcadores que permitan la sensibilidad óptica y/o la detección espectométrica de señal(es) específica(s) de marcador(es) con rechazo total esencialmente del ruido de fondo no específico y que sean compatibles con células sanas viables y medios acuosos o transportados por el aire.
El documento EP-A-0 476 556 da a conocer un sistema de detección analítico en el que la luz roja suministra energía a una sustancia fotosensible que reacciona de forma catalítica con oxígeno molecular para generar un oxidante.
Sumario de la invención
En general, la presente invención proporciona procedimientos de detección y aparatos de detección que permiten la detección ultrasensible de células, macromoléculas biológicas y otros analitos, que se pueden utilizar para la detección de dianas múltiples y la discriminación de dianas. Los marcadores de material fosforescente de conversión creciente utilizados en la invención permiten esencialmente el rechazo total de la autofluorescencia no específica de fondo y se caracterizan por la excitación y las longitudes de ondas emitidas que existen de forma típica en las bandas infrarroja o visible del espectro, respectivamente y evitan de este modo los efectos perjudiciales potenciales de la radiación ultravioleta. Los marcadores de material fosforescente de conversión creciente utilizados en la invención convierten la radiación de excitación de longitud de onda larga (p. ej. IR próximo) en radiación emitida aproximadamente a la mitad a un tercio de la longitud de onda de excitación. Como la fluorescencia de fondo en la banda visible es despreciable si se utilizan longitudes de onda de excitación en el IR próximo, la utilización de marcadores de material fosforescente de conversión creciente proporciona esencialmente la detección de la señal exenta de fondo.
De este modo, según un aspecto de la presente invención se proporciona un aparato para analizar una muestra que contiene un indicador luminiscente de material fosforescente de conversión creciente, caracterizado por una banda de excitación en el primer intervalo de longitudes de onda y una banda de emisión en el segundo intervalo de longitudes de onda que son más cortas que las longitudes de onda en el primer intervalo, comprendiendo el aparato:
un foco capaz de emitir luz en el intervalo de longitudes de onda que se solapan al menos con una parte de la banda de excitación del indicador luminiscente de material fosforescente de conversión creciente, en el que la banda de excitación tiene una longitud de onda de 950 a 1000 nm;
medios para suministrar energía a dicho foco;
un detector capaz de detectar luz en un intervalo de longitudes de onda que se solapa con al menos una parte de la banda de emisión del indicador luminiscente de material fosforescente de conversión creciente, en el que la banda de emisión está en la banda visible del espectro;
primer medio para dirigir al menos una parte de la luz emitida por dicho foco a una posición en la muestra, incluyendo la luz en el primer intervalo de longitudes de onda y excluyendo la luz en el segundo intervalo de longitudes de onda;
segundo medio para dirigir al menos una parte de la luz que emana de dicha posición en la muestra a dicho detector, incluyendo la luz en el segundo intervalo de longitudes de onda;
medios, acoplados a dicho detector, para generar una señal eléctrica representativa de la identidad de la luz incidente en dicho detector en un intervalo de longitudes de onda que incluyen las longitudes de onda en el segundo intervalo y excluye las longitudes de onda en el primer intervalo.
Según otro aspecto de la presente invención, se proporciona un aparato para analizar una posible muestra que contiene el primer y segundo indicadores luminiscentes de material fosforescente de conversión creciente, en la que el primer indicador se caracteriza por una banda de excitación en el primer intervalo de longitudes de onda y una banda de emisión en el segundo intervalo de longitudes de onda que son más cortas que las longitudes de onda en el primer intervalo, en la que el segundo indicador se caracteriza por una banda de excitación en un tercer intervalo de longitudes de onda y una banda de emisión en un cuarto intervalo de longitudes de onda y en la que el primer y tercer intervalos no se solapan y el segundo y cuarto intervalo se solapan, comprendiendo el aparato:
un primer foco capaz de emitir luz en un intervalo de longitudes de onda que se solapa al menos con una parte de la banda de excitación del primer indicador, en el que la banda de excitación tiene una longitud de onda de 950 a 1000 nm;
un segundo foco capaz de emitir luz en un intervalo de longitudes de onda que se solapa al menos con una parte de la banda de excitación del segundo indicador;
medios para suministrar energía a dichos primer y segundo focos, incluyendo los medios para imponer modelos de intensidad diferente en dichos primer y segundo focos mencionados;
un detector capaz de detectar luz en un intervalo de longitudes de onda que se solapa al menos con una parte de la banda de emisión del indicador, en el que la banda de emisión está en la zona visible del espectro;
medios para dirigir al menos una parte de la luz emitida por dichos primer y segundo focos hasta una posición en la muestra, incluyendo la luz en el primer y tercer intervalos de longitudes de onda y excluyendo la luz en el segundo y cuarto intervalos de longitudes de onda ; y
medios, acoplados a dicho detector, para generar la primera y segunda señales eléctricas representativas de las intensidades respectivas de la luz incidente en dicho detector a longitudes de onda en el segundo y cuarto intervalos y fuera del primer y tercer intervalos, incluyendo los medios para distinguir dichos modelos de intensidad diferentes.
Según todavía otro aspecto de la invención, se proporciona un procedimiento para analizar una muestra que contiene un indicador luminiscente de material fosforescente de conversión creciente caracterizado por una banda de excitación en un primer intervalo de longitudes de onda y una banda de emisión en un segundo intervalo de longitudes de onda que son más cortas que las longitudes de onda en el primer intervalo, procedimiento que comprende:
proporcionar una muestra que contiene un indicador luminiscente de material fosforescente de conversión creciente caracterizado por una banda de excitación en un primer intervalo de longitudes de onda y una banda de emisión en un segundo intervalo de longitudes de onda que son más cortas que las longitudes de onda en el primer intervalo,
proporcionar un foco capaz de emitir luz en un intervalo de longitudes de onda comprendido dentro de la banda de excitación del indicador, en el que la banda de excitación tiene una longitud de onda de 950 a 1000 nm;
proporcionar un detector capaz de detectar luz a longitudes de onda que esté dentro de la banda de excitación del indicador;
proporcionar un detector capaz de detectar luz a una longitud de onda que esté dentro de la banda de emisión del indicador, en el que la banda de emisión está en la zona visible del espectro;
dirigir la luz emitida por dicho foco a una posición en la muestra;
dirigir la luz que emana desde dicha posición en la muestra hasta el detector;
generar una señal eléctrica representativa de la intensidad de la luz en un intervalo de longitudes de onda que incluye las longitudes de onda en el segundo intervalo y excluye las longitudes de onda en el primer intervalo.
En resumen, la invención utiliza materiales luminiscentes que son capaces de excitar el multifotón y tienen espectros de emisión desplazados hacia arriba. Los materiales fosforescentes de conversión creciente (es decir, que absorben múltiples fotones en una banda de frecuencia baja y emiten en una banda de frecuencia mayor) se utilizan como marcadores que se pueden unir a una o más sondas, como por ejemplo a una molécula de inmunoglobulina, polinucleótido, estreptavidina, Proteína A, ligando de receptor u otras moléculas sonda. En otra forma de realización, los colorantes orgánicos de conversión creciente, sirven como marcadores. Los marcadores de colorante orgánico y los marcadores de material fosforescente de la invención son muy compatibles con las aplicaciones en análisis de diagnóstico automatizado, diagnóstico por imagen microscópico y en la detección de partículas codificadas, entre otras muchas aplicaciones.
La naturaleza de la invención proporciona considerable flexibilidad en el aparato para llevar a cabo los procedimientos. Como asunto general, la fuente de excitación puede ser cualquier foco de luz apropiada, incluyendo los diodos de láser de infrarrojo próximo económicos o los diodos emisores de luz (LED) y el detector puede ser cualquier detector apropiado, como por ejemplo un fotodiodo. En el caso de un indicador único, el aparato incluye un diodo de láser capaz de emitir luz en una o más longitudes de onda en la banda de excitación del indicador y un detector que es sensible al menos en algunas longitudes de onda en la banda de emisión del indicador. La luz de láser está enfocada preferentemente a una zona pequeña de la muestra, y la luz que emana de esta región se recoge y se dirige al detector. Una señal eléctrica que representa la intensidad de la luz en la banda de emisión proporciona una medición de la cantidad de indicador presente. Dependiendo de la respuesta espectral del indicador, puede ser necesario proporcionar un filtro para bloquear la luz de excitación.
La detección simultanea de indicadores múltiples es posible, al menos cuando los indicadores tienen diferentes bandas de excitación o diferentes bandas de emisión. Cuando las bandas de excitación difieren, los diodos de láser múltiples que emiten a las respectivas longitudes de onda apropiadas se combinan utilizando un multiplexor de división de longitud de onda u otras técnicas adecuadas, como por ejemplo el marcado de frecuencia, la modulación de frecuencia y un dispositivo detector de cierre. Si las bandas de emisión son diferentes (si las bandas de excitación son o no diferentes) se separa la luz en las bandas de emisión diferentes y se envía a detectores múltiples. Si las bandas de emisión se solapan, se puede utilizar un único detector, pero se utilizan otras técnicas de detección. Un ejemplo es utilizar técnicas de multiplexado temporal de forma que solamente un indicador está emitiendo en un momento dado. Por otra parte, se pueden modular diferentes diodos de láser a diferentes frecuencias características y realizar la detección de cierre.
Los procedimientos de detección y los aparatos de detección de la presente invención permiten la detección ultrasensible de materiales fosforescentes de conversión creciente explotando lo que es en esencia la ausencia total de ruido de fondo (p. ej. autofluorescencia, suero/fluorescencia fijadora, difusión de luz de excitación) que son características ventajosas de los marcadores de conversión creciente. Algunas formas de realización de la invención utilizan la detección controlada en el tiempo y/o la detección controlada por la longitud de onda para optimizar la sensibilidad de la detección, discriminando muestras múltiples y/o detectando sondas múltiples en una única muestra. La detección sensible a la fase se puede también utilizar para proporcionar discriminación entre la(s) señal(es) atribuible a un material fosforescente de conversión creciente y al ruido de fondo (p. ej. autofluorescencia) que presenta un desplazamiento de fase diferente.
En algunas formas de realización, la presente invención utiliza una o más ópticas de láser para generar iluminación de excitación de una o más frecuencia(s) discreta(s). En determinadas variaciones de la invención, la irradiación del láser de un marcador de conversión creciente puede modificar el medio molecular inmediato mediante procesos fotoquímicos producidos por el láser, bien por absorción directa o por transferencia de energía; tal deposición de energía controlada espacialmente se puede utilizar para producir daño localizado y/o para sondar el medio químico de una posición definida. En dichas formas de realización, el marcador de conversión creciente puede actuar preferentemente como catalizador fotofísico.
La invención proporciona procedimientos para producir daño dirigido (p. ej. catálisis) en materiales químicos o biológicos, en los que se emplea una sonda para localizar un marcador de conversión creciente unido en una posición cerca de una estructura biológica dirigida que está unida mediante la sonda. El marcador de conversión creciente localizado es excitado por una o más longitudes de onda de excitación y emite a una longitud de onda más corta que puede ser directamente citotóxica o genotóxica (p. ej. produciendo radicales libres tales como superóxido, y/o generando dímeros de timina-timina), o que puede provocar una reacción química fotolítica local para producir especies químicas reactivas en el entorno inmediato del marcador y por consiguiente en el entorno del material biológico dirigido. Por lo tanto las sondas de direccionamiento marcadas con uno o más marcadores de conversión creciente (es decir, un material fosforescente inorgánico de conversión creciente) se pueden utilizar para producir daño dirigido a estructuras biológicas tales como células, tejidos, neoplasmas, sistema vascular u otras estructuras anatómicas o histológicas.
La presente invención utiliza materiales fosforescentes de conversión creciente que pueden también ser excitados por un rayo de electrones u otro rayo de radiación energética de suficiente energía y son catodoluminiscentes. Dichos marcadores estimulados por electrones proporcionan nuevas ventajas para eliminar el fondo en procedimientos de detección de biomoléculas ultrasensibles. La estimulación del material fosforescente de conversión creciente de por lo menos dos electrones se emplea de forma típica para generar una emisión de banda de luz visible o UV.
La invención proporciona así mismo la detección simultanea de múltiples especies diana explotando la excitación por multifotones y la posterior detección fluorescente exenta de fondo de diversos materiales fosforescentes de conversión creciente.
En una forma de realización, se seleccionan varios materiales fosforescentes que presentan bandas de absorción con solapamiento que permiten la excitación simultanea a una longitud de onda (o en una banda estrecha), pero que varían en las características de emisión, de modo que cada especie sonda-marcador está dotada de una "identificación" fluorescente distinguible. Utilizando varios procedimientos y dispositivos, se puede determinar la presencia y la concentración de cada uno de los materiales fosforescentes.
La invención puede proporcionar así mismo métodos de análisis bioquímicos para determinar la presencia y la concentración de uno o más analitos, normalmente en solución. Los procedimientos de análisis emplean composiciones de sondas marcadas con materiales fosforescentes de conversión creciente y un aparato para atrapar óptica y/o magnéticamente partículas que se componen del analito y la sonda marcada. En una forma de realización, se efectúa un análisis de tipo sandwich, en el que una sonda inmovilizada, inmovilizada sobre una partícula, se une a un analito determinado previamente, produciendo una inmovilización del analito unido a la partícula; una segunda sonda, marcada con un marcador de conversión creciente, puede a continuación unirse al analito unido para producir un complejo en sandwich unido que contiene un marcador de conversión creciente unido a una partícula. Combinando diferentes combinaciones sonda-marcador, partículas de varios tamaños, colores y/o formas con sonda(s) inmovilizada(s) distinta(s) y/o varias longitudes de onda de excitación, es posible realizar esencialmente múltiples análisis simultáneamente o a la vez. Estas ventajas múltiples proporcionan detección y cuantificación de especies de analito múltiples en una sola muestra. Los procedimientos de análisis son también útiles para controlar el avance de la reacción, como por ejemplo una reacción física, química, bioquímica o inmunológica, incluyendo reacciones de formación de fijaciones. Por ejemplo, la invención se puede utilizar para controlar el avance de reacciones de fijación al ligando, reacciones de hibridación de polinucleótidos, incluyendo la cinética de hibridación y la estabilidad termodinámica de los polinucleóticos hibridados.
La invención proporciona también procedimientos y marcadores de conversión creciente y composiciones de reactivos de fijación marcados, útiles para realizar la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) por citrometía de flujo utilizando radiación de excitación que está en la banda infrarroja del espectro y no daña de forma significativa las células. Esto proporciona una ventaja significativa sobre los procedimientos de FACS presentes que se basan en la iluminación por excitación en la banda ultravioleta del espectro, incluyendo las longitudes de onda que son conocidas por producir lesiones en el ADN y daño en las células.
La invención puede también emplear composiciones que comprenden por lo menos una molécula de colorante orgánico fluorescente unida a un material fosforescente de conversión creciente inorgánico. La molécula de colorante orgánico fluorescente se selecciona de entre: rodaminas, cianinas, xantenos, acridinas, oxazinas, porfirinas y ftalocianinas y puede opcionalmente acomplejarse con un metal pesado. El colorante orgánico fluorescente se puede adsorber al cristal de material fosforescente de conversión creciente inorgánico y/o se puede unir por enlace covalente a un material fosforescente de conversión creciente inorgánico recubierto o a un material fosforescente de conversión creciente vitrocerámico derivado o a un material fosforescente de conversión creciente inorgánico microencapsulado.
Breve descripción de los dibujos
La Fig. 1 es un diagrama de bloques óptico y electrónico que ilustra el aparato representativo para realizar diagnósticos en una muestra según la presente invención;
la Fig. 2A presenta un aparato para realizar la fase de detección sensible en el contexto de un solo canal;
la Fig. 2B presenta el aparato en el que se modulan el primer y segundo diodos de láser mediante señales de generadores en forma de onda;
la Fig. 3 presenta el aparato para realizar la detección controlada;
la Fig. 4 presenta un aparato para realizar diagnósticos en una muestra utilizando las bandas de excitación del primer y segundo indicadores centradas en \lambda_{1} y \lambda_{2}, respectivamente y que tiene bandas de emisión solapantes cerca de \lambda_{3};
las Figs. 5A, 5B y 5C presentan en forma esquemática las transiciones del estado de energía en esquemas de excitación multi-fotón.
La Fig. 6 presenta un instrumento en miniatura utilizando una sonda portátil;
la Fig. 7A presenta la utilización de una disposición de un dispositivo acoplado por carga (CCD) para detectar emisiones de una gran variedad de zonas de fijación;
la Fig. 7B presenta el conjunto de CCD utilizado juntamente con una disposición de lentes;
la Fig. 8 presenta una forma de realización que utiliza la trampa óptica;
la Fig. 9 presenta en forma esquemática el recubrimiento del colorante y la encapsulación de una partícula de material fosforescente de conversión creciente;
la Fig. 10 presenta en forma esquemática un aparato para determinar la velocidad de las partículas y las propiedades hidrodinámicas o aerodinámicas de una diana;
la Fig. 11 es un espectro de emisión de material fosforescente convertidor creciente de fluoruro de sodio e itrio-iterbio/erbio con una fuente de excitación de láser con un máximo de longitud de onda de 977,2 nm; la emisión máxima está aproximadamente a 541,0 nm;
la Fig. 12 es una exploración de la excitación del espectro de excitación del fluoruro de sodio e itrio-iterbio/material fosforescente de erbio, con una ventana de recogida de la emisión establecida en 541,0 nm;
la Fig. 13 es una medición de la desintegración en el tiempo de la luminiscencia del material fosforescente a 541 nm después de la terminación de la iluminación de excitación para el fluoruro de itrio y sodio-iterbio/erbio;
la Fig. 14 presenta la intensidad de emisión del material fosforescente en función de la intensidad de iluminación por excitación para un material fosforescente de fluoruro de sodio e itrio-iterbio/erbio;
la Fig. 15 presenta la sección transversal de la fosforescencia eficaz de un solo fotón para 0,3 \mum partículas de Na(Y_{0,8}Yb_{0,12}Er_{0,08})F_{4} después de la excitación con 200W/cm^{2} a 970 nm.
La Fig. 16 presenta la dependencia del tamaño de las sección transversal de la fosforescencia para partículas de Na(Y_{0,8}Yb_{0,12}Er_{0,08})F_{4}.
La Fig. 17A presenta una exploración de la fluorescencia de un indicador de material fosforescente de conversión creciente en solución salina tamponada con Hepes producida por excitación con una fuente de láser a 970 nm;
la Fig. 17B presenta una exploración del espectro de fluorescencia de un indicador de material fosforescente de conversión creciente recubierto con estreptavirina en solución salina tamponada con Hepes producida por la excitación con una fuente de láser a 970 nm;
la Fig. 18A presenta una exploración del espectro de excitación de un indicador de material fosforescente de conversión creciente en la solución salina tamponada con Hepes con detección monocromática de la emisión a 541 nm;
la Fig 18B presenta una exploración del espectro de excitación de un indicador de material fosforescente de conversión creciente recubierto con estreptavirina en solución salina tamponada con Hepes con detección monocromática de la emisión a 541 nm;
la Fig. 19 presenta la señal integrada obtenida de las muestras de (Y_{0,86}Yb_{0,08}Er_{0,06})_{2}O_{2}S, presentando la relación entre la concentración de material fosforescente y la señal amplificada;
la Fig. 20 muestra de forma esquemática una forma de realización de un inmunoanálisis en sandwich para detectar un analito en una solución mediante fijación del analito (p. ej. un antígeno diana) a un anticuerpo biotinilado y a un anticuerpo inmovilizado, en el que el analito forma un complejo en sandwich inmovilizado en un micrograno superparamagnético del sustrato sólido; y
La Fig. 21 presenta en forma esquemática la detección y discriminación de dos antígenos de la superficie celular con anticuerpos específicos marcados con dos materiales fosforescentes con distintas características de fosforescencia.
La Fig. 22 presenta un esquema de un aparato para la detección sensible a la fase.
La Fig. 23 presenta un esquema de un análisis homogéneo competitivo que utiliza materiales fosforescentes como marcadores e iluminación por fibra óptica en una superficie de captura.
La Fig. 24 presenta un esquema de un análisis competitivo de captura de antígeno homogéneo utilizando materiales fosforecentes como marcadores y un rayo de iluminación convergente enfocado sobre la superficie de captura.
La Fig. 25 presenta un esquema de un análisis de inmunoprecipitación homogénea utilizando materiales fosforescentes como marcadores y un rayo de iluminación convergente enfocado sobre la superficie de captura, en el que la superficie de captura recoge inmunoprecipitados.
Descripción de las formas de realización específicas Definiciones
A menos que se defina de otra manera, todas las técnicas y términos científicos utilizados en la presente memoria tienen el mismo significado que el entendido normalmente por cualquier técnico en la materia a quien pertenece esta invención. Aunque se puede utilizar cualquier procedimiento y material similar o equivalente a los descritos en la presente invención en la puesta en práctica o en la experimentación de la presente invención, se describen los procedimientos y materiales preferidos. Para los fines de la presente invención, se definen a continuación los siguientes términos.
Tal como se utiliza en la presente memoria, "marcador" se refiere a un sustituyente químico que produce, en condiciones de excitación apropiadas, una señal óptica detectable. La señal óptica producida por un marcador excitado es normalmente una radiación electromagnética entre las bandas del infrarrojo próximo, visible o ultravioleta del espectro. Los marcadores de la invención son marcadores de conversión creciente, lo que significa que el sustituyente químico absorbe por lo menos dos fotones a una frecuencia de excitación y emite posteriormente energía electromagnética a una frecuencia de emisión mayor que la frecuencia de excitación. Por lo tanto, existe generalmente un desplazamiento de Stokes significativo entre la frecuencia de excitación original y la frecuencia de emisión final. Un marcador se une generalmente a una sonda para servir como indicador que indica la presencia y/o situación de la sonda. La invención comprende marcadores inorgánicos de material fosforescente de conversión creciente, pero preferentemente emplea materiales fosforecentes de lantánidos inorgánicos de conversión creciente como marcadores. Por lo tanto un marcador típico de la invención es una partícula de material fosforescente de lantánido de conversión creciente de tamaño submicrónico.
Tal como se utiliza en la presente memoria, una "sonda" se refiere a un componente de fijación que se une preferentemente a una o más dianas (p. ej. epítopos antigénicos, secuencias de polinucleótido, receptores macromoleculares) con una afinidad suficiente para permitir la discriminación de la sonda marcada unida a la diana de la sonda marcada unida de forma no específica (es decir, fondo). En general, el enlace sonda-diana es una interacción no covalente con una afinidad de enlace (K_{D}) de por lo menos aproximadamente 1 \times 10^{6} M^{-1}, preferentemente de por lo menos aproximadamente 1 \times 10^{7} M^{-1} y más preferentemente con una afinidad de por lo menos aproximadamente 1 \times 10^{8} M^{-1} o mayor. Los anticuerpos tienen típicamente una afinidad de enlace para el antígeno afín de aproximadamente 1 \times 10^{10} M^{-1} o más. Por ejemplo, pero sin limitación, las sondas de la invención comprenden: anticuerpos, hormonas de polipéptidos, polinucleótidos, estreptavidina, proteína A de Staphlyococcus aureus, ligandos del receptor (p. ej. esteroides u hormonas de polipéptidos), polipéptidos con cierre de leucina, lecitinas, antígenos (polipéptidos, carbohidratos, ácidos nucleicos y epítopos de hapteno) y otros.
Tal como se utiliza en la presente memoria, un "conjugado sonda-marcador" y una "sonda marcada" se refieren a una combinación que se compone de un marcador unido a una sonda. En determinadas formas de realización, a una sonda se puede unir más de un sustituyente del marcador. Por otra parte, en algunas formas de realización se puede unir más de una sonda a un marcador (p. ej. se pueden unir moléculas múltiples de anticuerpos a un grano de material fosforescente inorgánico de conversión creciente de tamaño submicrónico). Se pueden emplear varias químicas de enlace para acoplar un marcador a una sonda, que incluyen, pero no se limitan a, la formación de: enlaces covalentes, enlaces de hidrógeno, enlaces iónicos, interacciones electrostáticas e interacciones por tensión superficial (límite de fases). La fijación del marcador puede implicar también la incorporación del marcador en o sobre microesferas, micropartículas, inmunogranos y granos magnéticos superparamagnéticos (Polysciences, Inc., Warrington, Pennsylvania; Bangs Laboratories, Inc. 979 Keystone Way, Carmel, IN 46032). Por ejemplo, las partículas inorgánicas de material fosforescente de conversión creciente se pueden encapsular en microesferas que se componen de material polímero que es esencialmente transparente o translúcido en el/los intervalo(s) de longitud de onda de excitación y emiten radiación electromagnética (Patente U. S. nº 5.132..242). Dichas microesferas se pueden dotar de grupos funcionales por derivación superficial con uno o más grupos reactivos (p. ej. carboxilato, amino, hidroxilato o poliacroleína) para el enlace covalente a una sonda, como por ejemplo una proteína. Los conjugados sonda-marcador pueden comprender además un quelato fosforescente.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "diana" y "analito diana" se refiere al o a los objeto(s) que se analiza(n) por los procedimientos de la invención. Por ejemplo, pero sin limitación, los dianas pueden comprender polipéptidos (p. ej., hGH, insulina, albúmina), glucoproteínas (p. ej., inmunoglobulinas, trombomodulina, \gamma-glutamiltranspeptidasa; Goodspeed et al. (1989) Gene 76: 1), lipoproteínas, virus, micoorganismos (p. ej. bacterias patógenas, levaduras), polinucleótidos (p. ej. ADN genómico celular, ARN en una muestra histológica fijada para hibridación in situ, ADN o ARN inmovilizado en una membrana de nilón o de nitrocelulosa, ADN o ARN vírico en un tejido o en un fluido biológico) y productos farmacéuticos (es decir, prescritos o fármacos comerciales relacionados en la Physicians Drug Reference y/o en el Manual Merck, o sustancias ilegales tales como intoxicantes o esteroides anabólicos).
Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "anticuerpo" se refiere a una proteína que consiste en uno o más polipéptidos codificados principalmente por genes de inmunoglobulina. Los genes de inmunoglobulina reconocidos incluyen los genes de zona constante kappa, lambda, alpha, gamma (IgG_{1}, IgG_{2}, IgG_{3}, IgG_{4}), delta, epsilon y mu, así como la multitud de genes de zona variable de inmunoglobulina. Las "cadenas ligeras" de inmunoglobulina completas (aproximadamente 25 kd ó 214 aminoácidos) están codificadas por un gen con zona variable en el terminal NH_{2} (aproximadamente 110 aminoácidos) y un gen con región constante kappa o lambda en el terminal COOH. Las "cadenas pesadas" completas de inmunoglobulina (aproximadamente de 50 kd ó 446 aminoácidos), están codificadas igualmente por un gen con región variable (aproximadamente 116 aminoácidos) y uno de los demás genes con región constante antes citados, p. ej., gamma (que codifica aproximadamente 330 aminoácidos). Una forma de inmunoglobulina constituye la unidad estructural básica de un anticuerpo. Esta forma es un tetrámero y consta de dos pares idénticos de inmunoglobulina, teniendo cada par una cadena ligera y otra pesada. En cada par, las zonas variables de las cadenas ligera y pesada son responsables conjuntamente de unirse a un antígeno, y las zonas constantes son responsables de las funciones del efector del anticuerpo. Además de los anticuerpos, pueden existir inmunoglobulinas en varias otras formas incluyendo, por ejemplo, Fv, Fab y F(ab')_{2}, así como anticuerpos híbridos bifuncionales (p. ej. Lanzavecchia et al., Eur. J. Immunol. 17, 105 (1987)) y en cadenas individuales (p. ej., Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 85, 5879-5883 (1988) y Bird et al., Science, 242, 423-426 (1988)). (Véase, en general, Hood et al., "Immunology", Benjamin, N. Y., 2ª ed. (1984), y Hunkapiller y Hood, Nature, 323, 15-16 (1986)). Por lo tanto, no todas las onmunoglobulinas son anticuerpos. (Véase, U. S. S. N. 07/634.278, y Co et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. (U. S. A.) 88: 2869).
Tal como se utiliza en la presente memoria, "polinucleótido sonda" se refiere a un polinucleótido que se híbrida de forma específica con un polinucleótido diana determinado previamente. Por ejemplo, pero sin limitación, un polinucleótido sonda puede ser una parte de un ADNc correspondiente a una secuencia determinada ARNm, una parte de un clon genómico, un oligonucleótido sintético con una homología de secuencia suficiente para una secuencia diana conocida (p. ej. una repetición de telómero TTAGGG o una secuencia repetitiva de Alu) para hibridación específica, un ARN transcrito (p. ej. de una inserción del vector de clonación SP6 o un ácido nucleico de poliamida (Nielsen et al. (1991) Science 254:1497). Se pueden detectar varios polinucleótidos diana por hibridación de un polinucleótido con sonda marcada en la(s) secuencia(s) diana. Por ejemplo, pero sin limitación, los polinucleótidos diana pueden ser: secuencias genómicas (p. ej. genes estructurales, secuencias cromosómicas repetidas, secuencias reguladoras, etc.), ARN (p. ej. ARNm, ARNhn, ARNr, etc.), secuencias patógenas (p. ej. secuencias de ADN o de ARN víricas o microplasmáticas) o secuencias transgénicas.
"Hibridación específica" se define en la presente memoria como la formación de híbridos entre un polinucleótido sonda y un polinucleótido diana, en el que polinucleótido sonda se hibrida preferentemente con el ADN diana de modo que, por ejemplo, se puede identificar al menos una banda discreta en una transferencia Southern de un ADN preparado a partir de células eucarióticas que contienen una secuencia de polinucleótido diana y/o un polinucleótido sonda en un núcleo intacto localiza una posición cromosómica discreta característica de una secuencia única o repetitiva. En algunos casos, la secuencia diana puede estar presente en más de una especie de polinucleótido diana (p. ej. una secuencia diana determinada puede tener lugar en elementos múltiples de una familia de genes o en una secuencia repetitiva conocida). Es evidente que las condiciones óptimas de hibridación variarán en función de la composición de la secuencia y de la(s) longitud(es) del o de los polinucleótido(s) y diana(s) de direccionamiento y del procedimiento experimental seleccionado por el especialista. Se pueden utilizar varias instrucciones para seleccionar las condiciones de hibridación apropiadas (véase, Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1989), 2º Ed., Cold Spring Harbor, N. Y. y Berger y Kimmel, Methods in Enzymology, Volumen 152, Guide to Molecular Cloning Techniques (1989), Academic Press, Inc., San Diego, CA., Dunn et al. (1989) J. Biol. Chem. 264: 13057 y Goodspeed et al. (1989) Gene 76:1.
El término "longitud de onda de excitación del marcador", tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a una longitud de onda de la radiación electromagnética que, cuando es absorbida por un marcador de conversión creciente, produce una emisión fluorescente detectable en el marcador de conversión creciente, en el que la emisión fluorescente es de una longitud de onda más corta (es decir, radiación de frecuencia mayor) que la longitud de onda de excitación del marcador. El término "longitud de onda de emisión del marcador", tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a una longitud de onda que es es emitida desde un marcador de conversión creciente después de, o a la vez que, la iluminación del marcador de conversión creciente con uno o más longitudes de onda de excitación; las longitudes de onda de emisión del marcador de los marcadores de conversión creciente son más cortas (es decir, radiación de frecuencia mayor) que las correspondientes longitudes de onda de excitación. Las longitudes de onda de excitación del marcador y las longitudes de onda de emisión del marcador son ambas características de las especies individuales de marcador de conversión creciente y se determinan fácilmente realizando barridos de excitación y emisión simple.
Compendio de la invención
El objeto de la invención comprende marcadores fluorescentes que son excitados por una longitud de onda de excitación y posteriormente emiten radiación electromagnética a frecuencias mayores desplazadas (es decir, a frecuencias mayores que las de la radiación de excitación).
Según la presente invención, se proporcionan marcadores que comprenden materiales fosforescentes inorgánicos de conversión creciente para varias aplicaciones. Los marcadores de conversión creciente de la invención pueden estar unidos a una o más sonda(s) que sirven como indicador (es decir, como marcador detectable) de la posición de la(s) sonda(s). Los marcadores de conversión creciente pueden estar unidos a varias sondas, como por ejemplo anticuerpos, estreptavidina, proteína A, ligandos de polipéptido de receptores celulares, sondas de polinucleótido, fármacos, antígenos, toxinas y otros. La fijación del marcador de conversión creciente a la sonda se puede realizar utilizando varias químicas de enlace, dependiendo de la naturaleza de la sonda específica. Por ejemplo, pero sin limitación, partículas microcristalinas fosforescentes de lantánido de conversión creciente se pueden recubrir con un ácido policarboxílico (p. ej. Additon XW 330, Hoechst, Frankfurt, Alemania) durante la molienda y varias proteínas (p. ej., inmunoglobulina, estreptavidina o proteína A) se pueden adsorber físicamente a la superficie de la partícula fosforescente (Beverloo et al. (1991) op. cit.).
Como alternativa, se pueden emplear varias técnicas de recubrimiento con material fosforescente inorgánico incluyendo, pero sin limitarse a: secado por pulverización, deposición de plasma y derivación con grupos funcionales (p. ej. -COOH, -NH_{2}, -CONH_{2}) unidos por un agente de acoplamiento de silano a grupos -SiOH recubiertos sobre la partícula de material fosforescente o incorporados a partículas de material fosforescente vitrocerámicas que comprenden óxido(s) de silicio y composiciones de material fosforescente de conversión creciente. Las partículas de material fosforescente vitrocerámicas se pueden aminar, por ejemplo con aminopropiltrietoxisilano con el fin de unir grupos amino a la superficie vitrocerámica en moléculas formadoras de enlace, sin embargo se pueden sustituir otros silanos con grupos funcionales omega para unir grupos funcionales alternativos. Las sondas, como por ejemplo proteínas o polinucleótidos, se pueden unir directamente al material fosforescente vitrocerámico mediante enlace covalente, por ejemplo mediante enlaces siloxano o mediante enlaces carbono-carbono a moléculas formadoras de enlaces (p. ej. agentes silantes organofuncionales) que se unen por enlace covalente o se adsorben a la superficie de una partícula fosforescente.
Las partículas microcristalinas de material fosforescente de conversión creciente son normalmente más pequeñas de aproximadamente 3 micras de diámetro, preferentemente de aproximadamente menos de 1 micra de diámetro (es decir, submicrónicas) y más preferentemente son de 0,1 a 0,3 micras o menos de diámetro. Generalmente se prefiere más que las partículas de material fosforescente sean tan pequeñas como sea posible mientras conserven suficiente eficacia de conversión cuántica para producir una señal detectable; sin embargo, para cualquier aplicación particular, el tamaño de la(s) partícula(s) de material fosforescente que se ha de utilizar se debería seleccionar a voluntad del especialista. Por ejemplo, algunas aplicaciones (p. ej. la detección de un antígeno de superficie celular no abundante) puede requerir un marcador de material fosforescente sumamente sensible que no necesita ser pequeño pero que debe tener una eficacia de conversión y/o sección transversal de absorción altas, mientras que otras aplicaciones (p. ej. la detección de un antígeno nuclear abundante en una célula permeabilizada) puede requerir una partícula de material fosforescente muy pequeña que se puede difundir fácilmente y penetrar en las estructuras subcelulares, pero que no necesita tener una eficacia de conversión elevada). Por consiguiente, el tamaño óptico de la partícula de material fosforescente inorgánico depende de la aplicación y es seleccionado por el especialista basándose en los datos de eficacia cuántica para los diversos materiales fosforescentes de la invención. Dichos datos de eficacia de conversión pueden obtenerse de las fuentes disponibles (p. ej. manuales y referencias publicadas) o se pueden obtener generando una curva de calibración que mide la eficacia de conversión cuántica en función del tamaño de partícula. En algunas aplicaciones, tales como las que requieren la detección muy sensible de pequeñas partículas fosforescentes, se seleccionan preferentemente diodos de láser infrarrojo como fuente de excitación.
Aunque las propiedades de los materiales fosforescentes de conversión creciente se describirán con detalle en el apartado siguiente, es útil bosquejar los mecanismos básicos implicados. Se ha observado que la conversión creciente tiene lugar en determinados materiales que contiene iones de tierras raras en determinados materiales cristalinos. Por ejemplo, el iterbio y el erbio actúan como una pareja activadora en un material huésped de material fosforescente como por ejemplo fluoruro de bario e itrio. Los iones de iterbio actúan como absorbedores, y transfieren energía no de forma radioactiva para excitar los iones de erbio. La emisión se caracteriza de este modo por los niveles de energía de los iones de erbio.
Materiales fosforecentes microcristalinos de conversión creciente
Aunque la invención se puede poner en práctica con una variedad de materiales fosforescentes inorgánicos de conversión creciente, se cree que la(s) forma(s) de realización preferida(s) emplean uno o más materiales fosforescentes derivados de uno de los diversos materiales huésped fosforescentes diferentes dopado cada uno por lo menos con una pareja activadora. Los materiales huésped fosforescentes adecuados comprenden: fluoruro de sodio e itrio (NaYF_{4}), fluoruro de lantano (LaF_{3}), oxisulfuro de lantano, oxisulfuro de itrio, fluoruro de itrio (YF_{3}), galato de itrio, granate de aluminio e itrio, fluoruro de gadolinio (GdF_{3}), fluoruro de bario e itrio (BaYF_{5}, BaY_{2}F_{8}) y oxisulfuro de gadolinio. Las parejas de activador adecuadas se seleccionan de entre: iterbio/erbio, iterbio/tulio e iterbio/holmio. Pueden también utilizarse otras parejas de activador adecuadas para la conversión creciente. Mediante combinación de estos materiales huésped con las parejas de activador, se proporcionan al menos tres materiales fosforescentes con al menos tres diferentes espectros de emisión (luz roja, verde y azul visible). En general, el absorbedor es el iterbio y el centro de emisión se puede seleccionar de entre: erbio, holmio, terbio y tulio; sin embargo otros materiales fosforescentes de conversión creciente de la invención pueden contener otros absorbentes y/o emisores. La relación molar de absorbente:centro emisor es normalmente por lo menos aproximadamente 1:1, más frecuentemente al menos aproximadamente 3:1 a 5:1, preferentemente al menos aproximadamente 8:1a 10:1, más preferentemente al menos aproximadamente a 11:1 a 20:1 y típicamente menos de aproximadamente 200:1, frecuentemente menos de aproximadamente 100:1 y más frecuentemente menos de aproximadamente 50:1 a 25:1, aunque el especialista puede seleccionar varias relaciones basándose en las características deseadas (p. ej., propiedades químicas, eficacia de elaboración, sección transversal de absorción, excitación y longitudes de emisión, eficacia cuántica u otras consideraciones). La(s) relación(es) seleccionada(s) dependerá(n) en general así mismo de la(s) pareja(s) absorbente-emisor determinada y se puede calcular a partir de los valores de referencia según las características deseadas.
La relación óptima del absorbedor (p. ej., iterbio) con respecto al centro emisor (p. ej., erbio, tulio u olmio) varía, dependiendo de la pareja específica absorbedor/emisor. Por ejemplo, la relación absorbedor:emisor para las parejas Yb:Er está comprendida normalmente en el intervalo de 20:1 a aproximadamente 100:1, mientras que la relación absorbedor:emisor para las parejas Yb:Tm e Yb:Ho está comprendida normalmente en el intervalo de aproximadamente 500:1 a aproximadamente 2000:1. Estas relaciones diferentes son atribuibles a los diferentes niveles de energía de compatibilidad de nivel de Er, Tm u Ho con respecto al nivel de Yb en el cristal. Para la mayoría de las aplicaciones, los materiales fosforescentes de conversión creciente pueden comprender en la práctica aproximadamente del 10 al 30% de Yb y ya sea: aproximadamente del 1 al 2% de erbio, aproximadamente del 0,1 al 0,5% de Ho, o aproximadamente del 0,1 al 0,5% de Tm, aunque se pueden emplear otras formulaciones.
Algunas formas de realización de la invención emplean materiales fosforescentes inorgánicos que se excitan óptimamente por radiación infrarroja de aproximadamente 950 a 1000 nm, preferentemente aproximadamente de 960 a 980 nm. Por ejemplo, pero sin limitación, un material fosforescente inorgánico microcristalino de fórmula YF_{3}:Yb_{0,10}Er_{0,01} presenta una intensidad de luminiscencia máxima a una longitud de onda de excitación de aproximadamente 980 nm. Los materiales fosforescentes inorgánicos de la invención tienen típicamente una emisión máxima que está en la banda visible. Por ejemplo, las parejas de activador específicas presentan espectros de emisión característicos: las parejas iterbio-erbio tienen una emisión máxima en las fracciones roja o verde del espectro visible, dependiendo del huésped fosforescente; las parejas de iterbio-holmio generalmente emiten al máximo en la banda verde, iterbio-tulio tienen normalmente un máximo de emisión en la banda azul e iterbio-terbio normalmente emiten al máximo en la banda verde. Por ejemplo, Y_{0,80}Yb_{0,19}Er_{0,01}F_{2} emite al máximo en la banda verde del espectro.
Aunque los cristales de material fosforescente inorgánico de conversión creciente de varias fórmulas son adecuados para su utilización en la invención, en general son adecuadas las siguientes fórmulas, proporcionadas a título de ejemplo y no para limitar la invención:
Na(Y_{x}Yb_{y}Er_{z})F_{4}: x es 0,7 a 0,9, y es 0,09 a 0,29, y z es 0,05 a 0,01;
Na(Y_{x}Yb_{y}Ho_{z})F_{4}: x es 0,7 a 0,9, y es 0,0995 a 0,2995, y z es 0,0005 y 0,001; y
Na(Y_{x}Yb_{y}Tm_{z})F_{4}: x es 0,7 a 0,9, y es 0,0995 a 0,2995, y z es 0,0005 y 0,001.
(Y_{x}Yb_{y}Er_{z})O_{4}S: x es 0,7 a 0,9, y es 0,05 a 0,12, y z es 0,05 y 0,12.
(Y_{0,86}Tb_{0,08}Er_{0,06})_{2}O_{3} es un material fosforescente de conversión creciente relativamente eficaz.
A título de ejemplo, pero no para limitar la invención, la luminiscencia de los oxisulfuros de itrio se dopó con iterbio(Yb)-erbio(Er) en el verde después de la excitación a 950 nm. Estos son materiales fosforescentes no lineales, en los que el iterbio actúa como una "antena" (absorbente) para dos fotones de 950 nm y transfiere su energía al erbio que actúa como un emisor (activador). El tamaño de grano crítico del material fosforescente está dado por el rendimiento cuántico para la emisión verde y el nivel de dopaje tanto del Yb como del Er, que está generalmente comprendido en el intervalo entre aproximadamente 1 y el 10 por ciento y más generalmente en el intervalo entre el 2 y el 5 por ciento. Un cristal de material fosforescente Yb:Er típico comprende aproximadamente del 10 al 30% de Yb y aproximadamente del 1 al % de Er. Por lo tanto, un grano de material fosforescente que contiene varios millares de unidades de la fórmula asegura la emisión de al menos uno o más fotones durante un tiempo de irradiación de láser típico. Sin embargo, la relación no lineal entre la absorción y la emisión indica que puede ser necesaria la iluminación intensa a la(s) longitud(es) de onda de excitación para obtener la señal satisfactoria en las formas de realización que emplean partículas de material fosforescente muy pequeñas (es decir, menores de aproximadamente 0,3 \mum). Además, generalmente es deseable aumentar los niveles de dopaje de las parejas activador/emisor para producir partículas de material fosforescente muy pequeñas con el fin de maximizar la eficacia de conversión cuántica.
Los materiales fosforescentes microcristalinos inorgánicos con activadores de tierras raras generalmente presentan espectros de absorción estrecha y de emisión lineal. Los espectros de emisión lineal son debidos a transiciones f-f dentro del ión de tierra rara. Éstas son transiciones internas protegidas que producen emisión de línea estrecha. En determinadas aplicaciones, tales como cuando se requiere detección muy sensible, se puede proporcionar iluminación intensa mediante focos disponibles en el comercio, tales como los focos de láser infrarrojo (p. ej., diodos de láser de onda continua (CW) o de semiconductor pulsado). Por ejemplo, en las aplicaciones en las que la partícula de material fosforescente microcristalina debe ser muy pequeña y la eficacia de conversión cuántica sea baja, la iluminación de láser intensa puede aumentar la señal y disminuir los tiempos de detección. Por otra parte, algunas aplicaciones de la invención pueden requerir composiciones de material fosforescente que tengan eficacias de conversión cuántica intrínsecamente bajas (p. ej., niveles bajos de dopaje de la pareja activadora), pero que tengan otras características deseables (p. ej. eficacia de fabricación, facilidad de derivación, etc.); tales materiales fosforescentes de conversión creciente de baja eficacia se excitan preferentemente con iluminación de láser a una frecuencia de o próxima a (es decir, comprendida entre 25 y 75 nm) la absorción máxima del material. El hecho de que ninguna otra luz se genere en el sistema a parte de la del material fosforescente de conversión creciente permite la detección con señal sumamente sensible, particularmente cuando se utiliza iluminación intensa con láser como foco de radiación de excitación. Por lo tanto, la única propiedad de conversión creciente de la energía del fotón por los materiales fosforescentes de conversión creciente hace posible la detección de partículas muy pequeñas de materiales fosforescentes inorgánicos microcristalinos. Para la realización práctica de los materiales fosforescentes como indicadores ultrasensibles, en particular como indicadores intracelulares, es esencial que el tamaño de grano del material fosforescente sea tan pequeño como sea practicable (típicamente menor de aproximadamente 0,3 a 0,1 \mum), para los cuales los materiales fosforescentes de conversión creciente excitados por láser son muy aconsejables.
Por ejemplo, varias composiciones de material fosforescente capaces de conversión creciente son adecuadas para su utilización para la invención como se muestra en la Tabla I.
TABLA 1 Composiciones de material fosforescente
Material huésped Ión absorbedor Ión emisor Color
Oxisulfuros (O_{2}S)
Y_{2}O_{2}S Iterbio Erbio Verde
Gd_{2}O_{2}S Iterbio Erbio Rojo
La_{2}O_{2}S Iterbio Holmio Verde
Oxialuros (OX_{y})
YOF Iterbio Tulio Azul
Y_{3}OCl_{7} Iterbio Terbio Verde
Fluoruros (F_{x})
YF_{3} Iterbio Erbio Rojo
GdF_{3} Iterbio Erbio Verde
LaF_{3} Iterbio Holmio Verde
NaYF_{3} Iterbio Tulio Azul
BaYF_{5} Iterbio Tulio Azul
BaY_{2}F_{8} Iterbio Terbio Verde
Galatos (Ga_{x}O_{y})
YGaO_{3} Iterbio Erbio Rojo
Y_{3}Ga_{5}O_{12} Iterbio Erbio Verde
Silicatos (Si_{x}O_{y})
YSi_{2}O_{5} Iterbio Holmio Verde
YSi_{3}O_{7} Iterbio Tulio Azul
Además de los materiales presentados en la Tabla I y de sus variaciones, los aluminatos, fosfatos y vanadatos pueden ser materiales huésped fosforescentes adecuados. En general, cuando se utilizan silicatos como material huésped, la eficacia de conversión es relativamente baja. En determinadas utilizaciones, se pueden preparar cristales de material fosforescente de conversión creciente híbridos (p. ej. combinando uno o más materiales huéspedes y/o uno o más iones absorbedores y/o uno o más iones emisores).
Preparación de marcadores fosforescentes inorgánicos
Las técnicas y procedimientos para la fabricación de materiales fosforescentes inorgánicos han sido descritas en la técnica. Expertos en la técnica pueden fabricar cristales de material fosforescente de conversión creciente por varios procedimientos publicados, que incluyen pero no se limitan a los siguientes: Yocom et al. (1971) Metallurgical Transactions 2: 763; Kano et al. (1972) J. Electrochem. Soc., p. 1595; Wittke et al. (1972) J. Appl. Physics 43: 595; Van Uitert et al. (1969) Mat. Res. Bull. 4: 381. Otras referencias a las que se puede referir son: Jouart JP y Mary G (1990) J. Luminescence 46: 39; McPherson GL y Meyerson SL (1991) Chem. Phys. Lett. (Abril) p. 325; Oomen et al. (1990) J. Luminescence 46: 353; NI H y Rand SC (1991) Optics Lett. 16 (Sept.); McFarlane RA (1991) Optics Lett. 16 (Sept); Koch et al. (1990) Appl. Phys. Lett. 56: 1083; Silversmith et al. (1987) Appl. Phys. Lett. 56: 1977; Lenth W y McFarlane RM (1990) J. Luminescence 45: 346; Hirao et al. (1991) J. Non-crystalline Solids 135: 90; McFarlane et al. (1988) Appl. Phys. Lett. 52: 1300.
En general, las partículas de material fosforescente inorgánico se muelen hasta un tamaño de partícula medio deseado y una distribución por métodos de molienda convencional conocidos en la técnica, incluyendo la molienda en un molino en un bidón convencional con granos de circonita y/o de alúmina durante períodos de hasta aproximadamente 48 horas o mayores. Las partículas de material fosforescente utilizadas en los análisis de enlace son normalmente alrededor de 3,0 a 0,01 \mum de diámetro (o a lo largo de la longitud del eje si no es esférico), con más frecuencia entre aproximadamente 2,0 y 0,1 \mum de tamaño y de modo más conveniente desde aproximadamente 1 a 0,3 \mum de tamaño, aunque para determinadas formas de realización pueden ser preferidas partículas de material fosforescente mayores o más pequeñas de estas dimensiones. El tamaño de partícula del material fosforescente se selecciona por el especialista basándose en las características deseadas y según las pautas proporcionadas en la presente memoria. Se pueden preparar por sedimentación fracciones con un intervalo de tamaño de partícula determinado, generalmente durante un período prolongado (es decir, un día o más) con eliminación de la fracción del intervalo de tamaño deseado después del tiempo de sedimentación apropiado. El proceso de sedimentación puede ser controlado, como por ejemplo con un analizador de partículas Horiba.
Las partículas fosforescentes se pueden recubrir o tratar con agentes tensioactivos (p. ej. tensioactivos aniónicos como por ejemplo Aerosol OT) durante el proceso de molienda o después de que haya terminado la molienda. Por ejemplo, se puede recubrir las partículas con un ácido policarboxílico (p. ej. Additon XW 330, Hoechst, Frankfurt, Alemania o Tamol, véase Beverloo et al. (1992) op. cit.) durante la molienda para producir una suspensión acuosa estable de partículas fosforescentes, normalmente a un pH alrededor de 6 a 8. El pH de una solución acuosa de partículas de material fosforescente se puede ajustar por adición de un tampón adecuado y valoración con ácido o base en el intervalo de pH deseado. Dependiendo de la naturaleza química del recubrimiento, pueden tener lugar algunas pérdidas menores en la eficacia de conversión del material fosforescente como resultado del recubrimiento, sin embargo la potencia disponible en un foco de excitación de láser puede compensar de dicha reducción en la eficacia de conversión y asegurar la emisión fosforescente adecuada.
En general, la preparación de las partículas fosforescentes inorgánicas y el acoplamiento a los reactivos de fijación se realiza esencialmente como se describe en Beverloo et al. (1992) op. cit., y la patente U. S. 5.043.265 de Tanke.
Con frecuencia, tal como con los materiales fosforescentes que tienen un material huésped de oxisulfuro, las partículas fosforescentes están dispersadas preferentemente en un disolvente polar, como por ejemplo acetona o DMSO y similares para generar una emulsión sustancialmente monodispersa (p. ej., para una solución madre). Se pueden diluir posteriormente alícuotas de la solución madre monodispersa en una solución acuosa (por ejemplo, una solución de avidina en agua tamponada o solución salina tamponada).
Análisis de enlace
Los materiales fosforescentes de conversión creciente se utilizan como indicadores (es decir, marcadores detectables) para marcar reactivos de fijación, bien directa o indirectamente, para su utilización en análisis de enlace para detectar y analizar cuantitativamente la presencia de analito(s) en una muestra. Los reactivos de enlace se marcan directamente mediante fijación a indicadores de conversión creciente (p. ej. adsorción superficial, enlace covalente). Los reactivos de enlace que se pueden marcar directamente incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos primarios (es decir, que se unen a un analito diana), anticuerpos secundarios (es decir, que se unen a un anticuerpo primario o a un grupo prostético, tal como biotina o digoxigenina), la proteína A de Staphlococcus aureus, polinucleótidos, estreptavidina y ligandos de receptor. Los reactivos de enlace se pueden marcar así mismo indirectamente; de este modo, un anticuerpo primario (p. ej., un anticuerpo anti-erb-B de conejo) puede estar marcado indirectamente mediante enlace no covalente con el segundo anticuerpo marcado directamente (p. ej. un anticuerpo anti-conejo de cabra unido a un material fosforescente inorgánico de conversión creciente). La detección cuantitativa del complejo analito-sonda se puede realizar junto con la calibración apropiada del análisis para cada sonda empleada. Una sonda se detecta de forma conveniente en condiciones de excitación de saturación utilizando, por ejemplo, un foco de láser o un foco de fotodiodo enfocado para iluminación con excitación.
Los análisis de enlace específica se dividen generalmente en análisis homogéneos y heterogéneos. En un análisis homogéneo, la señal emitida por la sonda marcada en el enlace es diferente de la señal emitida por la sonda marcada sin enlace, por consiguiente, las dos se pueden distinguir sin necesidad de una etapa de separación física. En el análisis heterogéneo, la señal emitida desde las sondas marcadas con enlace y sin enlace es idéntica, por consiguiente, las dos deben ser separadas físicamente para distinguirlas entre ellas. El análisis clásico de enlace específico heterogéneo es el radioinmunoanálisis (RIA) (Yalow et al. (1978) Science 200: 1245, que se incorpora en la presente memoria como referencia). Otros análisis de enlace heterogéneos incluyen el análisis del radioreceptor (Cuatrecasas et al. (1974) Ann. Rev. Biochem. 43: 109), el radioinmunoanálisis en sandwich (patente U. S. 4.376.110), y el análisis en sandwich de anticuerpo/lectina (documento EP 0 166 623).
Normalmente se prefieren los análisis heterogéneos y en general son más sensibles y más fiables que los análisis homogéneos.
Si se prepara un extracto de tejido o se utiliza una muestra de fluido biológico es deseable con frecuencia diluir la muestra en uno o más diluyentes que no interfieran sustancialmente con los procedimientos de análisis posteriores. En general, los diluyentes adecuados son soluciones acuosas que contienen un sistema de tampón (p. ej. NaH_{2}PO_{4} 50 mM o Tris 5 a 100 nM, pH 4 a pH 10), especies iónicas que no interfieren (KCl o NaCl 5 a 500 nM, o sacarosa), y opcionalmente un detergente no iónico, como por ejemplo Tween. Cuando la muestra que se ha de analizar se fija a un soporte sólido, es deseable en general lavar la muestra y el soporte sólido con diluyente antes de ponerla en contacto con la sonda. En la muestra, ya sea directa o diluida, se analiza a continuación el analito para diagnóstico.
En el procedimiento general de la invención, se detecta y se analiza cuantitativamente un analito en una muestra poniendo en contacto la muestra con un conjugado sonda-marcador que se une de forma específica o preferentemente a un analito para formar un complejo unido y detectar a continuación la formación del complejo unido, midiendo típicamente la presencia del marcador presente en los complejos unidos. Un conjugado sonda-marcador puede incluir un reactivo de enlace con el analito marcado directamente (p. ej., un anticuerpo primario unido a un material fosforescente de conversión creciente y/o un reactivo de enlace con el analito marcado indirectamente (p. ej. un anticuerpo primario que se detecta mediante un segundo anticuerpo marcado o un polinucleótido biotinilado que se detecta mediante estreptavidina marcada). El/los complejo(s) unido(s) se aisla(n) de manera típica del o de los conjugado(s) sonda-marcador no unido(s) antes de la detección del marcador, incorporando normalmente por lo menos una etapa de lavado, con el fin de eliminar la señal de fondo atribuible al marcador presente en el/los conjugado(s) sonda-marcador no unido(s). Por consiguiente, es deseable normalmente incubar el/los conjugado(s) sonda-marcador con la muestra de analito en las condiciones de fijación durante un período de fijación adecuado.
Las condiciones de fijación varían, dependiendo de la naturaleza del conjugado sonda-marcador, del analito diana y del procedimiento de análisis específico. Por lo tanto, las condiciones de fijación diferirán normalmente si la sonda es un polinucleótido utilizado en una hibridación in situ, en una transferencia de Northern o Southern, o en un análisis de hibridación en solución. Las condiciones de la fijación serán así mismo diferentes si la sonda es un anticuerpo utilizado en un procedimiento de coloración histoquímica in situ de una transferencia de Western (Towbin et al. (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. (U. S. A.) 76: 4350).
En general, las condiciones de la fijación se seleccionan de acuerdo con los procedimientos generales de fijación conocidos en la técnica. Por ejemplo, pero no como limitación, se proporcionan las siguientes condiciones de fijación para orientación general:
Para sondas de anticuerpos
Tris 10-200 mM, pH 6 a 8; normalmente Tris 100 mM pH 7,5
NaCl 15 a 250 Nm; normalmente NaCl 150 mM
Tween 20 de 0,01 a 0,5 por ciento, en volumen
Albúmina de suero bovino al 1 por ciento
4 a 37ºC; normalmente de 4 a 15ºC
Para sondas de polinucleótido
SSC 3 a 10\times, pH 6 a 8; normalmente SSC 5\times, pH 7,5
Formamida desionizada 0 a 50 por ciento
Solución de Denhardt 1 a 10\times
Dodecilsulfato de sodio 0 a 1 por ciento
ADN de esperma de salmón desnaturalizado fragmentado 10 a 200 \mug/ml
20 a 65ºC, normalmente 37 a 45ºC para sondas de polinucleótido mayores de 50 bp, normalmente 55 a 65ºC para sondas de oligonucleótidos más cortas
Otros ejemplos de condiciones de fijación para anticuerpos y polinucleótidos se proporcionan en varias fuentes, incluyendo: Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1989), 2ª Ed., Cold Spring Harbor, N. Y. y Berger y Kimmel, Methods in Enzymology, Volumen 152, Guide to Molecular Cloning Techniques (1987), Academic Press, Inc., San Diego, CA.; Young y Davis (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. (U. S. A) 80: 1194.
Cuando la sonda es un ligando de receptor, como por ejemplo IL-2, \beta-interferón u otras hormonas de polipéptido, citocinas o linfocinas, las condiciones de fijación adecuadas son generalmente las descritas en la técnica para realizar el análisis de enlace al receptor-ligando respectivo.
Varios ejemplos de condiciones de fijación adecuadas útiles en inmunoanálisis e inmunohistoquímica se discuten, por ejemplo en Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Nueva York (1988).
En general, las condiciones de fijación adecuadas para las reacciones inmunológicas incluyen un tampón de fijación acuso que contiene una sal (p. ej., NaCl o KCl 5 a 500 mM), un tampón (p. ej., Tris o tampón fosfato a pH 4 a 10) y opcionalmente un detergente no iónico (p. ej. Tween). En algunas formas de realización, se pueden incluir inhibidores o estabilizadores de proteinasa. Las reacciones de fijación se realizan durante un período de fijación adecuado, que, para reacciones del anticuerpo, es de forma típica por lo menos de alrededor de 1 a 5 minutos, preferentemente por lo menos aproximadamente 30 minutos a varias horas, aunque típicamente menos de aproximadamente 24 horas, más preferentemente menos de aproximadamente unas pocas horas o menos. Las reacciones de fijación (incluyendo los lavados) se realizan típicamente en un intervalo de temperatura de aproximadamente 0ºC a 45ºC, preferentemente alrededor de 4ºC a aproximadamente 20 a 25ºC.
Los análisis de enlace, que incluyen hibridación in situ, los análisis de enlace in situ, y la coloración inmunihistoquímica, se realizan normalmente por primera vez incubando la muestra con una solución de bloqueo o de prehibridación, seguida de incubación de la muestra, con una sonda en las condiciones de la fijación durante un período de fijación adecuado, seguido de lavado o de otra forma eliminando la sonda no unida y finalmente detectando la presencia, cantidad y/o situación de la sonda unida. La etapa de detección de la sonda unida se puede realizar detectando el marcador, si la sonda está unida directamente, o incubando el/los complejo(s) unido(s) con un segundo reactivo de enlace (p. ej. estreptavidina) que está marcado y que se une a la sonda, realizando de este modo el marcaje indirecto de la sonda.
Los marcadores de conversión creciente se unen a sonda(s) o a los reactivos con una segunda fijación que se unen específica o preferentemente a sonda(s) por cualquiera de las diversas metodologías descritas en la presente memoria. Además, las partículas del material fosforescente con conversión creciente pueden estar encapsuladas en microesferas y recubiertas con una sonda (p. ej. un antígeno o anticuerpo específico) para su utilización como sonda marcada en un análisis de inmunodiagnóstico o en un ensayo de hibridación de ácido nucleico para detectar un analito en una muestra, como por ejemplo la presencia de un anticuerpo, virus o antígeno en una muestra de suero sanguíneo, según el procedimiento de Hari et al. (1990) Biotechniques 9: 342.
La microencapsulación del material fosforescente se puede realizar de varias maneras conocidas en la técnica, incluyendo el recubrimiento del material fosforescente con una solución y la polimerización del monómero para generar una carcasa de polímero que recubra la partícula fosforescente. Las partículas fosforescentes embebidas en un recubrimiento de polímero, como por ejemplo un recubrimiento de gel, se pueden dotar de grupos funcionales (p. ej. con grupos amino) para enlace covalente a un componente del enlace.
Igualmente, las partículas de material fosforescente de conversión creciente se pueden recubrir con sonda directamente, bien mediante adsorción superficial, mediante enlace de hidrógeno múltiple, por interacción electroestática, por enlace de van der Waals, o por enlace covalente a un grupo funcional en una partícula de material fosforescente inorgánico con grupos funcionales (p. ej. un material fosforescente vitrocerámico), uniendo, por ejemplo, un grupo amino o carboxilato de la cadena lateral de un aminoácido de una proteína de sonda a un grupo carboxilato o amino, respectivamente, en una partícula fosforescente con grupos funcionales.
En determinadas formas de realización, como por ejemplo cuando el impedimento estérico y/o de carga de una partícula voluminosa fosforescente de conversión creciente inhibe el enlace del reactivo de enlace ligado a una diana, es deseable incorporar un espaciador molecular entre la partícula fosforescente y el reactivo de enlace. Por ejemplo, un material fosforescente microencapsulado derivado o un material fosforescente vitrocerámico se puede conjugar con un reactivo heterobifuncional que tiene un espaciador-(CH_{2})_{n}, en el que n es normalmente un entero comprendido entre aproximadamente 2 y aproximadamente 50, entre los grupos funcionales terminales. Igualmente, los materiales fosforescentes se pueden derivar directamente con agentes de derivación (p. ej. silanos con grupos funcionales omega) con cadenas de espaciador intramolecular largas, en las que un grupo funcional reactivo con un reactivo de enlace deseado se separa desde la superficie del material fosforescente mediante un espaciador de normalmente por lo menos aproximadamente 15 \ring{A} (es decir, el equivalente de aproximadamente 10 grupos con cadena lineal -CH_{2}-). En algunas formas de realización los marcadores están unidos por brazos espaciadores de varias longitudes para reducir el impedimento estérico potencial. Se pueden también utilizar capas múltiples de brazos espaciadores (p. ej. capas múltiples de uniones estreptavidina-biotina).
Detección de analitos múltiples
Como los materiales fosforescentes de conversión creciente se pueden diferenciar basándose en los espectros de longitud de onda de excitación y/o emisión, se pueden utilizar fosforescentes de conversión creciente para detectar y discriminar dianas de analito múltiples, tal como por ejemplo, antígenos de la superficie celular o macromoléculas solubles.
Por ejemplo, estreptavidina, abidina u otra molécula de fijación (p. ej. antidigoxigenina) se unen, respectivamente, a cada uno de los dos materiales fosforescentes diferentes (para ilustración, se denomina aquí material fosforescente nº 1 y material fosforescente nº 2) que difieren en su espectro de absorción y/o de emisión de modo que facilitan la discriminación de los dos materiales fosforescentes basándose en las longitudes de onda de absorción y/o emisión; p. ej. un material fosforescente puede emitir en el azul y el otro puede emitir en el verde. Por ejemplo, y no a modo de limitación, Na(Y_{0,80}Yb_{0,18}Er_{0,02})F_{4} emite principalmente en el verde y Na(Y_{0,73}Yb_{0,27}Tm_{0,001})F_{4} emite principalmente en el azul y por lo tanto estos dos materiales fosforescentes se pueden discriminar basándose en sus emisiones fosforescentes. Por otra parte, dos materiales fosforescentes pueden producir espectros de emisión esencialmente similares pero pueden tener distintas longitudes de onda de excitación que proporcionen una base para su discriminación en la detección múltiple de analiltos. Se puede utilizar un primer componente de fijación (p. ej. un anticuerpo) que se une específicamente a una primera especie de analito (p. ej. un antígeno CD4 de linfocitos) e incorpora grupos biotinilo que pueden estar unidos mediante conjugados estreptavidina-material fosforescente nº 1, para detectar cuantitativamente la presencia de un primer analito en una muestra (p. ej., una muestra de suero) midiendo la fosforescencia del material fosforescente nº 1 en complejos analito-componente de fijación. Un segundo componente de fijación (p. ej., un polinucleótido sonda) que se une específicamente a una segunda especie de analito (p. ej., una secuencia de HIV-1) e incorpora grupos de digoxigenina (p. ej., 11-UTP-digoxigenina) que puede estar unido mediante conjugados antidigoxigenina-material fosforescente nº 2 se puede utilizar para detectar cuantitativamente la presencia de un segundo analito en la muestra midiendo la fosforescencia del material fosforescente nº 2 en los complejos analito-componente de fijación. Por lo tanto, mediante detección simultanea o al mismo tiempo la presencia de indicadores de material fosforescente múltiples con características de señal diferenciables, se pueden detectar cuantitativamente analitos múltiples en una sola muestra.
Análisis de enlace en sandwich
Se pueden utilizar marcadores de material fosforescente con conversión creciente como indicadores para análisis de enlace en sandwich (patente U. S. nº 4.376.110). Por ejemplo, un grano magnético tal como un inmunograno superparamagnético o una partícula de polímero magnetizable con grupos funcionales (Polysciences, Inc., Warrington, Pensilvania), puede servir como sustrato sólido que tiene un primer componente de fijación inmovilizado (p. ej. un anticuerpo, un polinucleótido o una lectina) que se une a un primer epítopo (es decir, un locus de fijación: un determinante antigénico, un grupo azúcar, un sustituyente químico, o una secuencia de nucleótidos) de un analito. El analito se une a un primer componente de fijación y también a un segundo componente de fijación (p. ej. un anticuerpo, una lectina o un polinucleótido) que se une a un segundo epítopo del analito. De este modo, el analito abarca los dos componentes de fijación para formar un complejo en sandwich que está inmovilizado en el sustrato sólido. El segundo componente de fijación tiene normalmente un marcador unido o incorporado, como por ejemplo un grupo biotinilo que se puede unir a un material fosforescente de conversión creciente recubierto con estreptavidina. Por otra parte, el segundo componente de la fijación se puede unir directamente a un material fosforescente de conversión creciente, tal como mediante un enlace covalente con un material fosforescente de conversión creciente vitrocerámico con grupos funcionales.
El complejo en sandwich comprende el primer componente del enlace, un analito y el segundo componente del enlace, que está marcado, ya sea directa o indirectamente, con un indicador de conversión creciente. El complejo en sandwich está de este modo inmovilizado sobre el sustrato sólido, aunque el propio sustrato sólido puede ser móvil (p. ej. un grano superparamagnético que circula en una lechada de la muestra). La presencia y cantidad de analito(s) se puede medir cuantitativamente detectando la presencia de indicador de conversión creciente en los complejos en sandwich.
Por ejemplo, un sustrato sólido puede constar de un conjunto de especies distintas del primer componente del enlace (p. ej. una disposición de oligopeptidos diferentes fijados a un soporte sólido). Una o más especies del primer componente del enlace se pueden unir a un analito determinado (p. ej. un receptor muscarínico) en una solución de analito que está en contacto con el soporte sólido. El enlace del analito a una o más de las especies del primer componente del enlace se puede detectar a continuación con un segundo componente del enlace (p. ej. un anticuerpo receptor antimuscarínico) marcado con un material fosforescente de conversión creciente (ya sea directamente o mediante un anticuerpo secundario biotinilado).
Los sustratos sólidos se pueden unir a un primer componente del enlace que se puede unir a más de un analito distinto (p. ej., puede ser inmunoreactivo cruzado o poliespecífico) y/o puede estar unido a múltiples especies del primer componente del emlace que se pueden unir a analitos múltiples diferentes. Igualmente, se pueden emplear múltiples especies del segundo componente del enlace con especificidades de enlace para analitos determinados. Cuando se emplean múltiples especies del segundo componente del enlace, es deseable normalmente marcar cada especie del segundo componente del enlace con un único marcador de conversión creciente que se puede distinguir en sus propiedades de absorción y/o emisión.
Es posible utilizar diferentes absorbentes en combinación con varios emisores para producir una colección de materiales fosforescentes con diversas combinaciones de espectros de excitación y emisión diferenciables. Por ejemplo, pero sin limitación, se pueden generar seis materiales fosforescentes diferenciables a partir de dos absorbentes y tres emisores. Un primer absorbente, A_{1} tiene una longitud de onda de excitación de \lambda_{A1}, un segundo absorbente, A_{2} tiene una longitud de onda de \lambda_{A2}, un primer emisor, E_{1} tiene una línea de emisión a \lambda_{E1}, un segundo emisor E_{2} tiene una línea de emisión a \lambda_{E2} y un tercer emisor, E_{3} tiene una línea de emisión a \lambda_{E3}. Los seis materiales fosforescentes se pueden diferenciar y analizar cuantitativamente la señal de cada uno de forma individual iluminando la muestra con una longitud de onda de excitación \lambda_{A1} y detectar por separado la radiación de emisión a \lambda_{E1}, \lambda_{E2} y \lambda_{E3} e iluminar por separado la muestra con una \lambda_{A2} y detectar por separado la radiación emitida a \lambda_{E1}, \lambda_{E2} y \lambda_{E3}. La Tabla II presenta las diversas combinaciones absorbente:emisor y sus longitudes de onda de excitación y emisión.
TABLA II
Combinación absorbente:emisor \lambda de excitación \lambda de emisión
A1:E1 \lambda_{A1} \lambda_{E1}
A1:E2 \lambda_{A1} \lambda_{E2}
A1:E3 \lambda_{A1} \lambda_{E3}
A2:E1 \lambda_{A2} \lambda_{E1}
A2:E2 \lambda_{A2} \lambda_{E2}
A2:E3 \lambda_{A2} \lambda_{E3}
Desde luego, otras combinaciones absorbente:emisor son posibles para proporcionar más de seis marcadores fosforescentes diferenciables.
Es también posible utilizar sustratos sólidos de diferentes tipos que se puedan distinguir (p. ej., por tamaño, color, densidad, propiedades magnéticas, forma, carga) de modo que un tipo de partícula de sustrato sólido esté relacionado con una especie particular del primer componente del fijación.
Por ejemplo, y sin limitación, se proporcionan los siguientes tres breves ejemplos para explicar otras posibles aplicaciones de múltiples procedimientos de análisis en sandwich del analito.
Diferenciación del sustrato
Los ejemplos siguientes describen la utilización de tipos de sustrato distinguibles para detectar la presencia de idiotipos específicos de inmunoglobulina en una muestra (p. ej., una muestra de suero sanguíneo extraída de un paciente) que puede proporcionar información del diagnóstico acerca del estado inmunitario del paciente (p. ej., es un paciente serorreactivo con un antígeno determinado). Los granos superparamagnéticos grandes se conjugan con una glucoproteína inmunógena de la envoltura del Herpesvirus tipo II, los granos superparamagnéticos de tamaño medio se conjugan con la glucoproteína gp120 de VIH y los granos superparamagnéticos pequeños se conjugan con una glucoproteína inmunógena de la envoltura del citomegalovirus. Se extrae una muestra de suero de un paciente y se incuba con una mezcla de granos superparamagnéticos en las condiciones de fijación que permitan el fijación específico de las inmunoglobulinas en la muestra con las tres especies de glucoproteínas víricas inmovilizadas. Se separan los granos superparamagnéticos de la muestra para eliminar la inmunoglobulina unida de forma no específica y se incuban con partículas de material fosforescente de conversión creciente recubiertas con proteína A de Staphylococcus aureus, que se unen a IgG, en las condiciones de la fijación. Los granos superparamagnéticos con IgG unida específicamente se marcan de este modo con el conjugado material fosforescente-proteína A. Se separan a continuación los granos superparamagnéticos grandes, medios y pequeños, iluminando con radiación electromagnética de excitación fosforescente y se detecta la fosforescencia emitida controlada en el tiempo. Se determina, si existe, el fondo atribuible al enlace no específico, y se sustrae utilizando granos estándar internos (albúmina de suero bovina recubierta con granos superparamagnéticos) y muestras de suero de referencia positivas y negativas. La intensidad de la fosforescencia asociada a los granos grandes, medios y pequeños proporciona una medida de la cantidad de anticuerpos en la muestra que son reactivos con la glucoproteína de la envoltura de Herpesvirus de tipo II, glucoproteína gp120 de VIH y glucoproteína de la envoltura del citomegalovirus, respectivamente. Esta información se puede utilizar para determinar si un determinado paciente ha sido infectado con el VIH-1, CMV humano y/o virus de tipo 2 de Herpes simple.
Diferenciación del material fosforescente
Los ejemplos siguientes describen la utilización de materiales fosforescentes de conversión creciente diferenciables para detectar la presencia y la abundancia relativa de determinadas isoformas de APP (proteína precursora del amiloide) humana en una muestra de suero o de biopsia de cerebro. Varias isoformas de APP surgen en el cerebro como consecuencia de la utilización alternativa del exón y/o de trayectorias de proceso proteolítico alternativas. Por lo tanto, aunque todas las isoformas de APP pueden compartir un epítopo hipotético común (X), una determinada isoforma de APP puede tener un único epítopo (Y), mientras que otra isoforma de APP tiene un único epítopo (Z). Es posible que la abundancia relativa de una determinada isoforma de APP en una muestra pueda ser un valor predecible o puede ser patognómica para la enfermedad de Alzheimer.
Los granos superparamagnéticos se conjugan con un anticuerpo que se une específicamente a un epítopo de APP común (X) compartido por todas las isoformas. Un anticuerpo específico reactivo con el único epítopo Y se marca con material fosforescente nº 1, que está excitado por una longitud de onda \lambda_{1} y emite en un espectro de longitud de onda centrado en el azul. Un anticuerpo específico reactivo con el único epítopo Z está marcado con un material fosforescente nº 2, que se excita mediante una longitud de onda \lambda_{2} y emite en un espectro de longitud de onda centrado en el verde. Una muestra que contiene isoformas de APP se incuba con los granos superparamagnéticos y anticuerpos específicos marcados en las condiciones de fijación. Los granos superparamagnéticos se recuperan de la muestra, ya se a de forma individual o en la totalidad. Los granos se iluminan con longitud de onda \lambda_{1} y se detecta y se mide la emisión de luz azul y se iluminan con \lambda_{2} y se detecta y se mide la emisión de luz verde. La intensidad de la emisión azul producida por \lambda_{1} es una medida de la(s) isoforma(s) de APP que tiene el epítopo Y, mientras que la intensidad de la emisión verde producida por \lambda_{2} es una medida de la(s) isoforma(s) de APP que tiene el epítopo Z. Aunque las emisiones de los dos materiales fosforescentes se distingan fácilmente, \lambda_{1} y \lambda_{2} pueden ser idénticas. Las intensidades relativas estandarizadas de los dos materiales fosforescentes proporcionan una medida de la abundancia relativa de la(s)
isoforma(s) de APP que contienen los epítopos Y o Z.
Diferenciación del material fosforescente y del sustrato
El ejemplo siguiente describe la utilización de materiales fosforescentes de conversión creciente diferenciables juntamente con sustratos distinguibles para detectar la presencia y abundancia relativa de determinadas subpoblaciones de linfocitos T en una muestra de sangre extraída de un paciente. Aunque en la presente memoria se describe en relación con las subpoblaciones que detectan linfocitos T, el multiplexado del analito (es decir, la detección y/o caracterización de analitos múltiples en una muestra utilizando varios tipos de sustratos sólidos y/o marcadores de material fosforescente con conversión creciente) se cree que es un procedimiento generalmente aplicable.
Se conjugan granos superparamagnéticos grandes con un anticuerpo anti-CD4, se conjugan granos superparamagnéticos de tamaño medio con un anticuerpo anti-CD8 y se conjugan granos superparamagnéticos pequeños con un anticuerpo anti-CD28. Un anticuerpo que se une de forma específica al antígeno CD2 se marca con un material fosforescente de conversión creciente que tiene una longitud de onda de excitación \lambda_{1} y emite en el rojo. Un anticuerpo que se une específicamente a un antígeno CD45R se marca con un material fosforescente de conversión creciente que tiene una longitud de onda de excitación \lambda_{2} y emite en el verde. Un anticuerpo que se une de forma específica al antígeno CDW60 se marca con un material fosforescente de conversión creciente que tiene una longitud de onda de excitación \lambda_{3} y emite en el azul.
Se extrae una muestra de sangre (o de suero, esputo, orina, heces, tejido de biopsia, etc.) de un paciente y se incuba con una mezcla de granos superparamagnéticos y de anticuerpos marcados con material fosforescente en las condiciones de fijación que permitan la fijación específica de las células en la muestra de sangre con las tres especies de anticuerpo inmovilizadas por el grano y con tres especies de anticuerpo marcadas por el material fosforescente. Después que ha tenido lugar la fijación antígeno-anticuerpo, se segregan los granos superparamagnéticos y se examinan, ya sea sucesiva o simultáneamente, por iluminación con \lambda_{1}, \lambda_{2} y \lambda_{3} y detección cuantitativa de las emisiones roja, verde y azul, respectivamente. Por ejemplo, la intensidad de la emisión de luz roja producida por \lambda_{1} asociada con los granos grandes es una medida aproximada de la cantidad de células que tienen antígenos de superficie CD4 y CD2 y/o de la abundancia relativa de estos antígenos de superficie (p. ej., existen muy pocas células CD4^{+} que tengan CD2, pero aquellas pocas células pueden tener una gran cantidad de antígeno CD2 y por consiguiente una gran señal fosforescente CD2). Igualmente la intensidad de la luz verde producida por \lambda_{2} relacionada con los granos grandes es una medida aproximada de la cantidad de células que tienen antígenos superficiales tanto CD4 como CD45R y/o de la abundancia relativa de estos antígenos superficiales en una muestra.
De este modo, una muestra de analito, como por ejemplo una muestra de sangre, puede estar "identificada" por la presencia y la(s) distribución(es) relativa(s) (p. ej., la segregación conjunta y/o correlación) de varias especies de analito. Dicha identificación de analito se puede utilizar para proporcionar una información del diagnóstico o terapéutica, por ejemplo, para medir el estado inmunitario de un paciente o para medir la respuesta a la quimioterapia dirigida contra un subconjunto de células sanguíneas determinado. Se pueden utilizar identificaciones de analitos similares para tipificar organismos y virus patógenos, así como para clasificar la cartografía génica y/o el secuenciado de secuencias de polinucleótido.
Los granos superparamagnéticos que se pueden diferenciar basándose en el tamaño, aspecto, color o la densidad se pueden atrapar magnéticamente de forma individual y ser barridos con una(s) iluminación(es) de excitación apropiada y una(s) emisión(es) de material fosforescente característica de analitos particulares detectados. Por ejemplo, un detector unitario puede simultáneamente o al mismo tiempo atrapar el grano superparamagnético en una suspensión, determinar el tipo de grano (tamaño, forma y/o color) y hacer una exploración en presencia y abundancia de materiales fosforescentes determinados (iluminando con longitud(es) de onda de excitación y detectando las longitudes de onda emitidas).
Realizando análisis de enlace en condiciones diluidas en las que un promedio de un analito o menos (p. ej. linfocitos) se une por micrograno, es posible tipificar individualmente células (p. ej. determinar la abundancia de CD45R en cada célula CD4^{+} individual) y generar de este modo más definiciones precisas de subpoblación de linfocitos.
Se pueden también utilizar granos magnéticos biotinilados para controlar la cinética de la fijación de estreptavidina a partículas fosforescente y/o segregar o purificar las partículas de fosforescente de conversión creciente recubiertas con estreptavidina procedentes de una reacción. Por lo tanto, la estreptavidina y las partículas de material fosforescente de conversión creciente se mezclan en un recipiente de reacción en las condiciones de la fijación para formar partículas fosforescentes recubiertas de estreptavidina. Después de un período de fijación adecuado, se puede eliminar la estreptavidina no unida (p. ej. por centrifugación, en la que las partículas de material fosforescente se recogen como sedimento, la estreptavidina no unida se decanta en el sobrenadante, y el sedimento se vuelve a poner en suspensión), los granos magnéticos biotinilados se añaden a la suspensión de material fosforescente restante en condiciones de fijación y las partículas de material fosforescente recubiertas con estreptavidina se recuperan unidas a los granos magnéticos biotinilados.
Catálisis fotofísica por materiales fosforescente de conversión creciente
Otras aplicaciones de la invención emplean materiales fosforescentes como catalizador fotofísico acoplado a una sonda, en las que la radiación emitida por el material fosforescente se utiliza, de forma típica juntamente con una molécula de colorante, para producir radiación electromagnética intensa localizada en una zona adyacente a la sonda con otros fines diversos aparte de la detección (p. ej. citotoxicidad, ionización de especies químicas, mutagénesis, etc.). Por ejemplo, un anticuerpo que se une específicamente a un antígeno de la superficie celular, como por ejemplo un antígeno CD8 en un linfocito CD8^{+}, se puede utilizar como sonda ligada a un material fosforescente de conversión creciente para localizar el material fosforescente en linfocitos CD8^{+}. Una muestra que contiene linfocitos CD8^{+} se puede incubar con el conjugado sonda-material fosforescente anti-CD8^{+} e irradiarse con una longitud de onda de excitación (p. ej. de un diodo de láser infarrojo), produciendo emision de fotones desplazados hacia arriba (es decir, radiacción electromagnética de frecuencia mayor) en la proximidad de los linfocitos CD8^{+} a los que se ha unido el conjugado sonda-material fosforescente anti-CD8^{+}. La radiación emitida puede ser de una longitud de onda que sea directamente mutágena y/o citotóxica (p. ej. radiación ultravioleta que puede conducir a la formación de dímeros de timina, luz de 760 a 765 nm y que se cree que produce también daño a los cromosomas) o puede ser de una longitud de onda que puede producir una descomposición fotolítica de un producto químico presente en el medio, conduciendo a la formación local de especies reactivas que pueden dañar las células adyacentes (p. ej., fotodescomposición de buckminsterfullereno, C_{60}, a C_{58} y C_{2}, puede producir radicales libres que pueden dar lugar a la peroxidación del lípido de las membranas celulares).
Como la radiación emitida por el material fosforescente es isótropa, generalmente se desea que las dianas se separen físicamente (p. ej., linfocitos CD8^{+}) procedentes de no-dianas (p. ej., linfocitos CD8^{-} antes de la irradiación de excitación, de modo que se evite el daño no deseable a las no-dianas por la(s) emisión(es) isótropa(s) (es decir, "daño secundario"). La separación física se puede realizar por varios medios, incluyendo pero sin limitarse a: (1 realizar la irradiación de excitación en una suspensión diluida de células diana y no-diana en la que la distancia de separación media de las células aisladas es suficiente para reducir el daño secundario a las no-dianas y (2) emplear el enfoque hidrodinámico para pasar las células (tanto dianas como no dianas) de una sola fila a través de una zona de iluminación (p. ej. como en un clasificador de células activadas por fluorescencia o similar). Por lo tanto, se puede utilizar un material fosforescente de conversión creciente acoplado a un anticuerpo anti-CD8^{+} para dañar de forma selectiva linfocitos CD8^{+} en una muestra de linfocitos, en la que (1) el material fosforescente emite a una longitud de onda que es directamente citotóxica y/o (2) el material fosforescente emite a una longitud de onda que produce especies químicas reactivas por fotocatálisis de un compuesto presente en la muestra (p. ej. se puede dopar una muestra con buckminsterfullereno).
En lugar de utilizar la radiación emitida directamente para la acción fotocatalítica en tejidos o tumores, se puede generar una forma excitada de oxígeno, denominado oxígeno excitado en singlete (O_{2}'\Deltag) mediante transferencia de energía desde un sensibilizador colorante hasta el oxígeno molecular disuelto. Este esquema hace uso del poder penetrante en el tejido de la radiación infrarroja próxima (luz de la zona roja y ultrarroja, incluyendo 970 nm) que alcanza al material fosforescente inorgánico de conversión creciente. Dos de los fotones infrarrojos se convierten bien en fotones rojos, verdes o azules dependiendo del espectro de absorción del colorante sensibilizador. El colorante es excitado por la radiación de conversión creciente en un estado de triplete que transfiere su energía a una molécula de oxígeno molecular disuelta para dar una molécula de oxígeno excitada (singlete). La actividad citotóxica del oxígeno en singlete está bien documentada en la terapia fotodinámica y en otras aplicaciones biomédicas (véase, Wagnieres et al. (19-21 de enero de 1990) Future Directions and Applications of Photodynamic Therapy, págs. 249, SPIE Institutes for Advanced Optical Technologies, Society of Photo-Optical Instrumentation Engineers, Box 10, Bellingham, Washington 98277; Pelegrin et al. (1991) Cancer 67: 2529; Wagnieres et al. (24 y 25 de mayo de 1991) Future Directions and Applications of Photodynamic Therapy, págs. 219; Folli et al. (17 de diciembre de 1991) Fluoresceine Clinique 4; Braichotte et al. (Mayo de 1991) ENT-Clinic, Lausana, Suiza).
En esta memoria el material fosforescente de conversión creciente se mezcla o se enlaza con un colorante sensibilizador, como por ejemplo azul de metileno, rosa de bengala o derivados de ftalocianina, como por ejemplo Zn-ftalocianina. En el primer y tercer casos se utilizan un material fosforescente con emisión roja, mientras que para el rosa de bengala es más adecuado un material fosforescente que emita en el verde. Los derivados de ftalocianina son adecuados teóricamente para este fin debido a su insolubilidad total en soluciones acuosas o biológicas. Estos colorantes por lo tanto permanecen en íntima proximidad con los emisores de modo que la especificidad del complejo superficie celular/indicador/sonda/colorante se convierte en el factor limitante. En este caso, se deben sintetizar las combinaciones especializadas de las formulaciones de indicador/sonda/colorante preferentemente en el intervalo de tamaño de 0,1 a 0,3 micras para transferir la energía eficiente permisible: en primer lugar, el colorante absorbe la radiación de conversión creciente tan completamente como sea posible; y en segundo lugar la energía excitada por el colorante (estado de triplete) se transfiere al oxígeno molecular disuelto. Ambos procesos son muy eficaces si el espectro de absorción del colorante sensibilizador se equilibra con la radiación de conversión creciente.
Este esquema presenta una etapa más allá de los procedimientos de terapia fotodinámica en los que se puede utilizar luz roja tanto para seguimiento como diagnóstico, así como con fines terapéuticos después de la conversión creciente necesitando únicamente de este modo un foco de luz (infrarroja) a aproximadamente 1000 nm. Otra ventaja es el intervalo mayor de radiación infrarroja en las muestras biológicas en comparación con otros esquemas de excitación de conocidas terapias fotodinámicas (750-850 nm).
Para formas de realización que emplean materiales fosforescentes como catalizadores fotofísicos, es deseable en general que: (1) la(s) longitud(es) de onda de la radiación de excitación no produzca(n) fotocatálisis significativa del compuesto del sustrato, (2) la(s) longitud(es) de onda de la radiación de excitación no sean directamente citotóxicas o mutágenas, y (3) la radiación emitida sea directamente citotóxica y/o sea de una longitud de onda apropiada para producir una cantidad biológicamente eficaz de fotodescomposición de un compuesto del sustrato (p. ej.: buckminsterfullereno, psoraleno, compuestos que contienen sustituyentes de azida u otros grupos fotoactivados). Por otra parte, las cadenas laterales con histidina de polipéptidos se pueden oxidar por la luz en presencia de sensibilizadores de colorantes, como por ejemplo azul de metileno o rosa de bengala (Proteins, Structures and Molecular Principles (1984). Creigthon (ed.), W.H. Freeman and Company, Nueva York; Introduction to Protein Structure, (1991), C. Branden y J. Tooze, Garland Publishing, Nueva York, NY, que se incorporan en la presente memoria como referencia). Por lo tanto, por ejemplo, los materiales fosforescentes de conversión creciente ligados a anticuerpos anti-CD8 se pueden utilizar como catalizadores fotofísicos para producir daño selectivo, localizado a linfocitos CD8^{+}. Según la invención, esencialmente cualquier anticuerpo se puede unir a un material fosforescente de conversión creciente, bien directamente o en conjugación con la proteína A que se puede unir a continuación a la inmunoglobulina. Por lo tanto, los catalizadores fotofísicos de conversión creciente de la invención se pueden utilizar para dirigir cualquier antígeno o tipo de célula deseados que se pueda distinguir por la presencia de un antígeno identificado.
Aparato de detección
La detección y cuantificación de el/los materiales fosforescentes de conversión creciente se realiza generalmente: (1) iluminando una muestra susceptible de contener materiales fosforescentes de conversión creciente con radiación electromagnética a una longitud de onda de excitación y (2) detectar la radiación fosforescente a una o más banda(s) de longitud de onda de emisión.
La iluminación de la muestra se produce exponiendo la muestra a la radiación electromagnética producida al menos por una fuente de excitación. Se pueden utilizar varias fuentes de excitación, incluyendo los diodos de láser infrarrojo y filamentos incandescentes, así como otras fuentes adecuadas. Se pueden emplear filtros ópticos que tienen alta transmisiblidad en el/los intervalo(s) de longitud de onda de excitación y baja transmisibilidad en una o más banda(s) de longitud de onda indeseable, para filtrar longitudes de onda indeseables de la iluminación del foco. Los intervalos de longitud de onda indeseables incluyen en general aquellas longitudes de onda que producen autoflorescencia detectable en la muestra y/o están comprendidas dentro de aproximadamente 25 a 100 nm de longitudes de onda de excitación máxima y por lo tanto son fuentes potenciales de ruido de fondo de la iluminación de excitación difusa. La iluminación de excitación se puede también multiplexar y/o concentrar; por ejemplo, rayos de varias frecuencias discretas de fuentes coherentes múltiples (p. ej.: láceres) se pueden concentrar y multiplexar utilizando un conjunto de espejos dicroícos. De este modo, las muestras que contienen especies fosforescentes múltiples que presentan diferentes bandas de longitud de onda de excitación se pueden iluminar a sus frecuencias de excitación simultáneamente. La iluminación puede ser continua o pulsada, o puede combinar ondas continuas (CW) e iluminación pulsada cuando se multiplexan los rayos de iluminación múltiple (p. ej.: un rayo pulsado se multiplexa con un rayo CW), permitiendo la discriminación de la señal entre la fosforescencia producida por el foco de CW y la fosforescencia producida por la fuente pulsada, permitiendo de este modo la discriminación de especies de material fosforescente múltiples con espectros similares de emisión pero diferentes espectros de excitación. Por ejemplo, pero sin limitación, se pueden utilizar diodos de láser de arseniurio de galio disponibles en el comercio como foco de iluminación para proporcionar luz de infrarrojo próximo.
La capacidad para utilizar excitación infrarroja para estimular materiales fosforescentes de conversión creciente proporciona diversas ventajas. En primer lugar, se pueden utilizar láseres de diodo IR e IR próximo económicos para iluminación de excitación de alta luminosidad mantenida, particularmente en bandas de longitud de onda IR que no son absorbidas por el agua. Este nivel de iluminación de alta intensidad no sería adecuado para su utilización con marcadores convencionales, como por ejemplo, colorantes fluorescentes corrientes (p. ej.: FITC), ya que la radiación UV de alta intensidad o visible produce fotoblanqueo extensivo del marcador y, potencialmente, daño a la muestra. La capacidad para utilizar intensidades de mayor iluminación sin fotoblanqueo o daño de la muestra se traduce en señales potenciales mayores y por consiguiente análisis más sensibles.
La compatibilidad de los marcadores de conversión creciente con la utilización de láseres de diodo como focos de iluminación proporciona otras ventajas distintas en todas las lámparas yen la mayoría de demás focos de láser. En primer lugar, se puede modular la intensidad del láser de diodo directamente mediante modulación de la corriente del conductor. Esto permite la modulación de la luz para técnicas de detección controladas por el tiempo o sensibles a las fases, que proporcionan aumento de sensibilidad sin la utilización de un modulador adicional. Los moduladores requieren circuitos de alto voltaje y cristales costosos que añaden tanto coste como tamaño adicional al aparato. El diodo de láser o el diodo emisor de luz se puede pulsar mediante modulación directa de la corriente. En segundo lugar, los focos de iluminación de láser proporcionan iluminación que es excepcionalmente monocromática y se pueden enfocar con exactitud en tamaños de espacios muy pequeños, que proporcionan ventajas en la relación señal a ruido y sensibilidad debida a la luz de fondo reducida fuera de la zona espectral de excitación deseada y del volumen iluminado. Un láser de diodo proporciona éstas ventajas significativas sin gasto ni tamaño adicionales de otros focos convencionales o de láser.
La detección o cuantificación de la radiación fosforescente de materiales fosforescentes de conversión creciente excitados se puede realizar por varios medios. Se pueden emplear varios medios de emisión(es) fosforecente(s) de detección, incluyendo pero sin limitarse a: dispositivos fotomultiplicadores, fotodiodos de avalancha, dispositivos acoplados con carga (CCD), dispositivos CID, emulsión de película fotográfica, reacciones fotoquímicas que producen rendimientos detectables y observación visual (p. ej.: microscopía de luz fluorescente). Si los indicadores son colorantes orgánicos, se puede sensibilizar la ionización por multifotón resonante utilizando detectores electrotásticos sensibles a la posición. La detección puede emplear captación de luz controlada por el tiempo y/o controlada por la frecuencia para el rechazo del ruido de fondo residual. La detección controlada por el tiempo es deseable generalmente, ya que proporciona un procedimiento para registrar la(s) emisión(es) de larga duración al final de la iluminación; por lo tanto, se registra(n) la(s) señal(es) atribuible(s) a la fosforescencia o a la fluorescencia retardada del material fosforescente de conversión creciente, mientras que la luz de iluminación de autofluorescencia de corta duración y difusa, si hubiera, se rechaza. La detección controlada por el tiempo se puede producir bien por bloqueo mecánico periódico especificado mediante una cuchilla rotatoria (es decir, una tajadera mecánica) o por medios electrónicos en los que señales rápidas (es decir que tienen lugar dentro de aproximadamente 0,1 a 0,3 \mus del final de la iluminación) se rechazan (p. ej.: un interruptor óptico en estado sólido controlado electrónicamente, como por ejemplo células de Pockell o de Kerr). Los materiales fosforescentes de conversión creciente y los colorantes fluorescentes de conversión creciente retardada presentan de forma típica duraciones de emisión de aproximadamente unos pocos milisegundos (quizás como mucho de 10 ms, pero normalmente del orden de 1 ms, mientras que el ruido de fondo disminuye normalmente a los 100 ns aproximadamente. Por lo tanto, cuando se utiliza una fuente de excitación pulsada, generalmente es deseable utilizar la detección controlada por el tiempo para rechazar las señales puntuales.
Como los materiales fosforescentes de conversión creciente no están sometidos a fotoblanqueo, las señales muy débiles de material fosforescente emitidas se pueden captar e integrar durante periodos de detección prolongados (iluminación continua o iluminación pulsada múltiple) para aumentar la sensibilidad de la detección. Dicha integración del tiempo puede ser electrónica o química (p. ej.: película fotográfica). Cuando se utiliza película fotográfica no infrarroja como medio para detectar señales débiles emitidas, los indicadores de conversión creciente proporcionan una ventaja en comparación con los materiales fosforescentes de conversión decreciente que la(s) fuente(s) de excitación proporcionan normalmente la iluminación en un intervalo de longitud de onda (p. ej.: infrarrojo o infrarrojo próximo) que no produce exposición significativa de la película (es decir, es similar a la luz de seguridad del cuarto oscuro). Por lo tanto, los materiales fosforescentes de conversión creciente se pueden utilizar como marcadores ultrasensibles adecuados para la coloración inmunohistoquímica y/o la hibridación in situ juntamente con la microscopía de fluorescencia utilizando un foco infrarrojo (p. ej.: un diodo de láser infrarrojo) y película fotográfica (p. ej.: Kodak Ektachrome) para la detección por señal o por imagen de la luminiscencia en la banda visible (con o sin un filtro de bloqueo del infrarrojo).
Compendio de instrumentación
La Fig. 1 es un diagrama óptico y electrónico de bloques que ilustra el aparato 10 representativo para realizar diagnósticos en la muestra 15 según la presente invención. La invención se puede realizar con uno o un conjunto de indicadores. A título de ilustración el aparato presenta un sistema en el que se realizan dos diagnósticos en una sola muestra en la que se utilizan dos indicadores de material fosforescente. El primer indicador tiene una banda de excitación centrada en \lambda_{1} y una banda de emisión centrada en \lambda_{1}' mientras que el segundo indicador presenta bandas respectivas de excitación y de emisión centradas en \lambda_{2} y \lambda_{2{'}}. Como los indicadores de la presente invención se basan en la excitación por multifotones, las longitudes de onda \lambda_{1} y \lambda_{2} son mayores que la longitudes de onda \lambda_{1{'}} y \lambda_{2}'. Las primeras están normalmente en el infrarrojo próximo y las últimas en el visible.
Un par de focos de luz 20(1) y 20(2), que pueden ser diodos de láser o diodos emisores de luz (LED), proporcionan luz a las longitudes de onda de excitación deseadas, mientras que los detectores 22(1) y 22(2) respectivos, que pueden ser fotodiodos detectan la luz a las longitudes de onda de emisión deseadas. La radiación emitida está relacionada con el flujo incidente por una ley de potencia, de este modo la eficacia se puede maximizar teniendo el rayo incidente enfocado con precisión sobre la muestra. Con este fin, la luz de los dos focos se combina en un solo paso mediante un elemento 25 de combinación adecuado, se enfoca en una zona pequeña mediante un una lente u otro mecanismo de enfoque 27 y encuentra la muestra. La luz emitida por los indicadores fosforescentes se capta por medio de una lente 30 y se separan los componentes en las dos bandas de emisión mediante un elemento de separación 32 adecuado y se dirige hacia los detectores respectivos.
Existen numerosos regímenes posibles para conducir los diodos de láser y detectar la luz emitida en diferentes bandas de longitud de onda. Esto se muestra genéricamente como un bloque electrónico 35 de control que comunica con los diodos y los detectores de láser. La duración particular y otras características de la electrónica de control se describirán más adelante en relación con las formas de realización específicas.
Puede ser un conjunto de indicadores con bandas de emisión distintas pero con una banda de excitación común. En tal caso, el sistema incluiría detectores múltiples para un único diodo de láser. Igualmente, puede ser un conjunto de indicadores con bandas de excitación distintas pero con una banda de emisión común. En tal caso, el sistema incluiría múltiples diodos de láser para un solo detector y utilizaría técnicas de múltiplexado temporal o similares para separar las longitudes de onda.
La luz procedente de los dos focos se presenta combinada de modo que se enfoque en una sola posición mediante un mecanismo de enfoque común. Esto no es necesario, incluso si se desea iluminar la misma zona de la muestra. Igualmente, la captación no necesita ser a través de un mecanismo de captación único. Si es necesario mantener toda la luz, la combinación y los elementos de separación pueden comprender un multiplexor de división de longitud de onda y un desmultiplexor que utiliza filtros dicroícos. Si se pueden tolerar pérdidas, se pueden utilizar un 50% de separadores de rayos y de filtros.
El esquema presenta la luz que pasa a través de la muestra y que se detecta en línea. Como asunto general, la emisión de los indicadores de material fosforescente es generalmente isótropa y se puede preferir a la luz captada en un ángulo de la dirección de la luz incidente para evitar el fondo de la fuente de excitación. Sin embargo, como las bandas de excitación y de emisión están muy separadas, dicho fondo es improbable que sea una solución en la mayoría de los casos. En su lugar, otras consideraciones pueden establecer otras geometrías. Por ejemplo, puede ser deseable detectar el paso de la luz a lo largo de la trayectoria de la radiación incidente con el fin de que determinados elementos en la sucesión óptica se intercambien entre las trayectorias de la excitación y de la detección.
Un tipo típico de instrumento con elementos compartidos es un microscopio en el que el objetivo se utiliza para enfocar la radiación de excitación en la muestra y para captar la radiación emitida. Una variación potencialmente ventajosa en dicha configuración utiliza el fenómeno de la captación óptica. En una situación en la que el indicador se une a un grano pequeño, puede ser posible atrapar el grano en la zona próxima al foco del rayo. La misma fuente o una fuente diferente, se puede utilizar para excitar el indicador. La utilización de un láser de diodo infrarrojo para atrapar pequeñas partículas se describe en Sato et al., "Optical trapping as small particles using a 1.3 \mum compact InGaAsp laser", Optics Letters, Vol. 16, no. 5 (1 de marzo de 1991).
Técnicas específicas de detección
Tal como se bosquejó anteriormente, la detección por multicanal utiliza dispositivos ópticos, como por ejemplo, filtros o separadores de rayos dicroicos en los que las bandas de emisión de los indicadores de material fosforescente se separan suficientemente. Igualmente se indicó que los indicadores múltiples con una banda de emisión común se podrían detectar utilizando técnicas electrónicas. Estas técnicas electrónicas se describen más adelante en la relación con fuentes múltiples. Sin embargo, las técnicas se describen en primer lugar en el contexto de un solo canal. Las técnicas son útiles en este contexto ya que son fuentes de fondo que están comprendidas en el mismo intervalo de longitud de onda que la señal buscada que se debe medir.
La Fig. 2A presenta una aparato para realizar la detección sensible de la fase en el contexto de un canal único. Se utilizan números de referencia correspondientes para los elementos que corresponden a las figuras descritas al principio. En este contexto, la electrónica de control 35 comprende un generador en forma de onda 37 y un mezclador de frecuencias 40. El generador en forma de ondas 37 conduce el diodo de láser 20 (1) a una frecuencia f_{1} y proporciona una señal a f_{1} en el mezclador de frecuencias. El mezclador de frecuencias recibe también la señal del detector 22 (1) y una señal de entrada del control de fase. Este circuito proporciona discriminación de fondo adicional debido a que el fondo tiene una duración mucho más corta que la búsqueda de la señal que se debe medir (nanosegundos o microsegundos en comparación con los milisegundos). Esto da lugar a que la señal y el fondo presenten diferentes fases (aunque ambas se modulen a la frecuencia característica de un generador en forma de onda). Para una descripción del desplazamiento de fase en función de la duración, véase: Demtröder, Laser Spectroscopy, Springer-Verlag, Nueva York, 1988, págs. 557-559).
Se controla la señal de salida de la fase para maximizar la señal y discriminarla frente al fondo. Esta discriminación del fondo difiere de la típica para la detección sensible de la fase cuando se modula la señal y no el fondo. La discriminación contra el fondo no modulado es también beneficiosa aquí, conduciendo a los dos tipos de discriminación.
Debido a que la señal se basa en la excitación por dos fotones, es posible utilizar dos diodos de láser modulados y detectar la señal en la suma o diferencia de las frecuencias de modulación. La Fig. 2B presenta dicha disposición en la que el primer y segundo diodo de láser 20(1) y 20(1)' (que emiten en la misma longitud de onda \lambda_{1} o posiblemente a diferentes longitudes de onda) se modulan mediante señales de generadores en forma de onda 37a y 37b que operan a las respectivas frecuencias f_{a} y f_{b}. Las señales de salida del generador en forma de onda se comunican con un primer mezclador 42 de frecuencia y una señal a f_{a} \pm f_{b} se comunica con un segundo mezclador 45 de frecuencias. La señal del detector 22(1) y una señal de entrada de fase está también comunicada con el mezclador 45 de frecuencias.
La Fig. 3 presenta un aparato para realizar la detección controlada. Como el fondo es de duración más corta que la señal, la disminución de la detección permite una mejor discriminación. Con esta finalidad, el diodo de láser es dirigido mediante un generador de pulsos 50, del cual se utiliza una salida retardada para permitir un integrador controlado u otro analizador 55 controlado.
La Fig. 4 presenta un aparato para realizar diagnósticos en una muestra utilizando el primer y segundo indicadores con bandas de excitación centradas en \lambda_{1} y \lambda_{2} y con bandas de emisión solapantes próximas a \lambda_{3}. Se irradia la muestra con luz de diodos de láser 20(1) y 20(2) como se describió anteriormente en relación con la Fig. 1. El primer y segundo generadores en forma de onda 37(1) y 37(2) conducen los diodos de láser a las respectivas frecuencias f_{1} y f_{2} y además proporcionan señales a f_{1} y f_{2} para los respectivos mezcladores de frecuencias 60(1) y 60(2). La señal procedente del detector 22(3) se comunica a ambos mezcladores de frecuencias, que también reciben las respectivas señales de entrada de fase. Por lo tanto, el mezclador de frecuencia 60(1) proporciona una señal de salida correspondiente a la cantidad de luz emitida modulada a la frecuencia f_{1} que proporciona una medición de la presencia en la muestra. Igualmente, el mezclador de frecuencias 60(2) proporciona una señal de salida correspondiente a la cantidad de luz emitida modulada a la frecuencia f_{2}, que proporciona una medición de la presencia del segundo indicador en la muestra.
La utilización de dos diferentes longitudes de onda se describió anteriormente en el contexto de dos indicadores con banda de excitación diferentes. Sin embargo, la descripción está relacionada también con una situación del único indicador. Como la excitación es un proceso de dos fotones, no existe requisito para que los dos fotones tengan la misma energía. En su lugar, sólo es necesario que la energía total de los dos fotones esté comprendida dentro de la banda de excitación. Por lo tanto, ya que es relativamente directo y económico proporcionar diferentes longitudes de onda con diodos de láser, existen combinaciones más posibles, es decir, elecciones más posibles de la energía de excitación total. Esto permite una latitud mayor en la selección de los iones de tierras raras para convertidores crecientes ya que las etapas de excitación no necesitan basarse en las coincidencias de transferencia de energía que implican una única energía de fotón. Además, puede ser posible conseguir la excitación directa paso a paso del ión emisor (el ión de erbio del ejemplo bosquejado anteriormente) sin utilizar transferencia de energía de otro ión absorbente ( el ión iterbio del ejemplo) mientras que tiene la ventaja de un aumento de resonancia de los niveles intermedios. Además, la utilización de longitudes de onda diferentes para un solo indicador pueden proporcionar otras opciones para las técnicas para la discriminación del multiplexado dependiente de la excitación y la discriminación del fondo.
La excitación múltiple de la longitud de onda de un solo material fosforescente puede tener lugar de numerosas formas, como se muestra en las Figs. 5A a la 5C. Dos láseres pueden producir excitación paso a paso de un solo ión, como se muestra en la Fig. 5A. Un primer láser estimula la excitación desde el nivel 1 hasta el nivel 2 y un segundo láser estimula la excitación desde el nivel 2 hasta el nivel 3, en el que tiene lugar la emisión de nivel. La excitación de un solo ión también puede tener lugar utilizando transferencia de energía como se demuestra en la Fig. 5B. En este caso, un primer láser estimula la excitación desde el nivel 1 al nivel 2, la transferencia de energía tiene lugar desde el nivel 2 al nivel 3 y un segundo láser estimula la excitación desde el nivel 3 al nivel 4. En una variación de este último proceso, los niveles 1 y 2 pueden estar en un primer ión (es decir, un ión sensibilizador) y los niveles 3 y 4 en un segundo ión (es decir ión activador) como se muestra en la Fig. 5.C.
En un esquema de excitación paso a paso mostrado en la Fig.5A, no se necesita transferencia de energía y por lo tanto la información en la polarización de los láseres de excitación se puede conservar y producir la polarización de la radiación emitida. En este caso, la despolarización de la luz puede permitir el aumento de discriminación entre la señal y el ruido de fondo.
Para el esquema de excitación de multi-láser de multi-ión mostrado en la Fig 5C, pueden existir diversos materiales fosforescentes que comparten una longitud de onda de excitación común. En este caso, se puede realizar la discriminación entre diferentes materiales fosforescentes basándose en diferentes longitudes de onda de emisión y/o mediante la detección modulada por la frecuencia, controlada por el tiempo y/o sensible a la fase utilizando la modulación de la(s) longitud(es) de onda de excitación.
Formas de realización de instrumentos específicos
La Fig. 6 es una vista esquemática que presenta la sucesión óptica de una determinada forma de realización del aparato para realizar la presente invención en una muestra utilizando una sonda portátil. Esta forma de realización toma la forma de un instrumento en miniatura que comprende un alojamiento 75 (mostrado en línea de puntos), una sonda portátil 80, con un cable de conexión de fibra óptica 82. Los componentes ópticos y electrónicos están situados dentro del alojamiento. A título de ilustración, se muestran los componentes ópticos de un sistema de 3 canales. La muestra puede contener hasta tres indicadores con distintas bandas de emisión, por ejemplo, en las zonas azul, verde y roja del espectro visible. Se supone también que los indicadores tienen bandas de excitación distintas en el infrarrojo próximo. Los rayos de salida de los tres diodos de láser se comunican mediante lentes 85a-c de índice graduado (GRIN), enfocadas a los extremos de los segmentos 88a-c de fibra respectivos y acopladas en una sola fibra 90 mediante un acoplador 92 direccional u otro dispositivo adecuado. La luz que sale del extremo de la fibra 90 se concentra mediante una lente GRIN 95, que pasa a través de un separador de rayos dicroícos 97 y se reenfoca mediante una lente GRIN 100 en el extremo del cable de fibra óptica 82. El separador de rayos se supone que pasa la radiación infrarroja desde los diodos de láser pero refleja la luz visible.
La sonda 80 portátil incluye una pieza manual 102, una lente 105 GRIN interna u un cabezal 110 de alineación frustocónica. La luz que sale de la fibra 82 es enfocada por la lente 105 GRIN en un punto focal 115 que está ligeramente más allá de la alineación del cabezal 110. El cabezal de alineación se lleva junto al tubo de ensayo que contiene la muestra de modo que el punto del foco 115 esté en la muestra. Se supone que el tubo de ensayo puede transmitir la radiación de láser.
Una parte de la luz que sale de la zona del punto focal 115 en la muestra es captada por la lente GRIN 105 enfocada en la fibra 82, concentrada por las lentes GRIN 100 y reflejada en el separador de rayo dicroico 97. Esta luz puede contener longitudes de onda hasta en las tres bandas de emisión. Los filtros ópticos 120a-c dirigen determinados componentes a los respectivos fotodetectores 125a-c. Se muestra una determinada disposición de filtro en la que cada filtro refleja la luz en una banda de emisión respectiva, pero se utilizarían otras disposiciones si, por ejemplo, uno o más filtros fuesen filtros de paso de banda para las bandas de emisión.
No se muestra la electrónica de control, pero incorporaría las técnicas multiplexadas en el tiempo o heterodinas descritas anteriormente. Dichas técnicas serían necesarias, por ejemplo, si las bandas de emisión no fueran distintas.
La Fig. 7A es un esquema de una forma de realización de la invención en la que se utiliza una disposición de la detección por imagen del dispositivo acoplado con carga (CCD) como detector en combinación con una disposición 152 bidimensional de péptidos o de otra especie biológicamente activa depositada sobre un sustrato de vidrio o de plástico. El conjunto CCD tiene numerosos elementos 155 detectores fotosensibles dirigibles individualmente con una capa de pasivación 157 de recubrimiento mientras el conjunto del péptido tiene numerosas zonas de fijación 160 individuales. La sonda que contiene el material fosforescente sería específica para la reacción para uno o más de los elementos en esta disposición del péptido y llegaría a estar físicamente unida a esos elementos y únicamente a esos elementos. El conjunto del péptido se presenta con una relación geométrica uno a uno en el conjunto de la detección por imagen en la que un píxel corresponde a cada elemento en el conjunto del péptido. Sin embargo, es también posible tener elementos del péptido mayores que abarquen un grupo de tales elementos del detector debería ser necesario.
Varias de las técnicas descritas anteriormente se pueden utilizar para permitir al conjunto del detector distinguir las emisiones del material fosforescente de la estimulación de láser infrarrojo.
En primer lugar, es posible utilizar un material fosforescente que responda a la estimulación IR más allá del intervalo de sensibilidad del conjunto del detector. Un ejemplo de dicho material fosforescente sería el oxisulfuro de gadolinio: 10% de erbio. Este material fosforescente está estimulado por una radiación de 1,5 micras y emite a 960 nm y a 520 nm. El conjunto del detector es insensible a la radiación de 1,5 micras pero es sensible a la radiación de conversión creciente.
Además, como la emisión de material fosforescente es relativamente lenta en la subida y disminuye con el tiempo, debería resolverse en el tiempo desde una fuente de estimulación de láser pulsada por el conjunto del detector CCD. El periodo de desintegración para el proceso de conversión creciente es una variable que depende de una transición de emisión determinada y del huésped del material fosforescente; está comprendido normalmente en el intervalo entre 500 \mus segundos y 10 \mus. Esto es muy lento en comparación con la pulsación de la excitación del láser y con la capacidad del conjunto del detector.
Las técnicas de fabricación del conjunto de CCD son bien conocidas ya que los conjuntos de detección por imagen han estado disponibles en el comercio durante muchos años. Una variedad de dichos dispositivos se puede adquirir en David Sanoff Research Center, Princeton, NJ.
Las técnicas de fabricación del conjunto del péptido están descritas en un artículo por Fodor et al., "Light-Directed, Spatially Adressable Parallel Chemical Synthesis", Science, Vol. 251, págs. 767-773 (15 de febrero de 1991).
El conjunto particular descrito contiene 1024 elementos discretos en un área de 1,28 cm \times 1,28 cm.
La forma de realización de la Fig. 7A presenta la disposición del péptido en contacto íntimo con el conjunto de CCD. Realmente puede ser posible depositar los péptidos directamente sobre la capa de pasivación sin un sustrato independiente. Sin embargo, pueden existir situaciones en las que se prefieren conjuntos espacialmente separados. La Fig. 7B presenta una forma de realización en la que el conjunto del péptido y el conjunto de CCD están separados. Un conjunto de lentes 165 capta la luz de los puntos de fijación respectivos y la enfoca en los respectivos elementos detectores. Esta disposición facilita la utilización de filtros hasta el punto en que no se utilizan otras técnicas para el rechazo de la radiación de excitación.
Se puede utilizar la trampa óptica para inmovilizar transitoriamente una partícula de muestra para la determinación de la presencia o ausencia del material fosforescente sobre la partícula. De forma adecuada, el intervalo de longitud de onda utilizado para atrapar partículas de muestra puede ser esencialmente idéntico al de un intervalo de longitud de onda de excitación para el/los material(es) fosforescente(s) seccionado(s), de modo que la trampa óptica y la iluminación de excitación se realizan con la misma fuente. La Fig. 8 presenta un diagrama de bloques de un aparato utilizado para atrapar la fuerza del gradiente de un solo rayo de partículas pequeñas.
Clasificación celular activada por fluorescencia
Los materiales fosforecentes de conversión creciente descritos en la presente memoria se pueden utilizar como marcadores fosforescentes para la clasificación de células fluorescentes por fluocitometría. A diferencia de los colorantes fluorescentes convencionales, los materiales fosforecentes de conversión creciente poseen la ventaja distinta de no necesitar iluminación de excitación en bandas de longitudes de onda (p. ej.: UV) que dañan el material genético y las células. Normalmente, los marcadores fosforecentes de conversión creciente se unen a un reactivo de enlace, como por ejemplo un anticuerpo, que se une con gran afinidad y especificidad a una proteína de la superficie de la célula presente en un subconjunto de células en una población de células en suspensión. El componente de fijación marcado por el material fosforecente se pone en contacto con la suspensión celular en condiciones de fijación, de modo que estas células que tienen la proteína de la superficie de la célula se unen al reactivo de fijación marcado, mientras que las células que carecen de proteína en la superficie de la célula no se unen prácticamente al reactivo de fijación marcado. Las células en suspensión se pasan a través de un detector de muestras en condiciones en las que sólo una célula aislada está presente en una zona de detección de la muestra en un momento. Un foco, de forma típica un láser IR, ilumina cada célula y un detector, normalmente un fotomultiplicador o fotodiodo, detecta la radiación emitida. El detector controla la regulación de la célula en la zona de detección en uno de un conjunto de zonas de recogida de muestras basándose en la(s) señal(es) detectada(s). En las patentes U.S. nº 4.172.227; nº 4.347.935; nº 4.661.913; nº 4.667.830; nº 5.093.234; nº 5.094.940 y nº 5.144.224 se proporciona una descripción general del aparato FACS y de los procedimientos.
Es preferible que los materiales fosforecentes de conversión creciente utilizados como marcadores por los procedimientos FACS tengan intervalo(s) de excitación (y preferentemente también de intervalo(s) de emisión) que no dañen las células o el material genético; generalmente, se prefieren para la excitación las bandas de radiación en el rojo lejano y en el infrarrojo. Se cree que debería evitarse la radiación en la banda de 200 nm a 400 nm, cuando sea posible, y el intervalo de longitudes de onda de 760 nm a 765 nm se puede evitar en las aplicaciones en que se desee el mantenimiento de células viables.
Otras variaciones
En los medios en los que la absorción de la radiación del material fosforescente de conversión creciente sea elevada, las micropartículas de material fosforescente se recubren con un colorante fluorescente o una combinación de colorantes, en proporciones seleccionadas, que absorben a la frecuencia de conversión creciente y vuelven a irradiar posteriormente a otras longitudes de onda. Debido a que las secciones transversales de la absorción de un solo fotón para estos materiales fluorescentes son normalmente muy elevadas, solamente se necesita una capa fina para la absorción completa de una emisión fosforescente. Esta partícula de la capa se puede encapsular y recubrir a continuación en un receptor de antígeno o anticuerpo adecuado (p. ej.: micropartícula). En la Fig. 9 se representa esquemáticamente un ejemplo de esta estratificación. Existe una amplia variedad de colorantes fluorescentes con fuertes transiciones de absorción en la banda visible y su emisión cubre la banda visible y se extiende a la infrarroja. La mayoría tiene eficacias fluorescentes del 10% o más. De este modo, las longitudes de onda de emisión se pueden adaptar al cliente para atravesar el medio de la partícula y se pueden utilizar otra vez los filtros de interferencia para distinguir entre longitudes de onda de excitación y de emisión. Si existe una "ventana" de longitud de onda relativamente grande en el medio del ensayo, entonces la variedad de longitudes de onda de emisión que puede recubrirse en un solo tipo de material fosforescente está limitado únicamente por el número de colorantes disponibles y combinaciones de colorantes. La discriminación entre varios indicadores se realiza fácilmente a continuación utilizando las técnicas espectroscópicas y de multiplexado descritas en la presente memoria. Por lo tanto, el número de "identificaciones" sonda/indicador que se pueden idear y utilizar en una mezcla heterogénea de dianas múltiples es prácticamente ilimitado.
Los principios descritos anteriormente se pueden adaptar asimismo para impulsar las reacciones fotocatalíticas y fotoquímicas específicas de la especie. Además de la selección espectroscópica, los periodos prolongados de desintegración con emisión de los materiales fosforescentes permite reacciones o series de reacciones relativamente lentas que tienen lugar en la emisión después de la fotoexposición. Esto es especialmente útil cuando el conjugado material fosforescente-[catalizador o reactivo] se introduce en un medio a través del cual no puede penetrar la longitud de onda de excitación. Esta liberación lenta aumenta asimismo la probabilidad de que interactúen más dianas con la
partícula.
Las velocidades de desintegración exclusivas de las partículas fosforescentes permiten también estudios dinámicos. En un sistema en el que no es posible, o es invasiva y por lo tanto indeseable, la exposición continua a la fuente de excitación, es necesaria la excitación pulsada seguida de la detección fluorescente retardada. Después de que el indicador fosforecente se ha fotoexcitado, la emisión posterior de la partícula fosforescente o del conjugado fosforescente/colorante termina normalmente en aproximadamente un milisegundo. En un medio dinámico, como por ejemplo un sistema estático o dinámico que desplaza dianas, la partícula emitirá una intensidad de luz de desintegración de forma característica a medida que se desplaza en relación con el aparato de excitación/detección. Se utiliza un conjunto de sensor fotoeléctrico CCD, combinado con ópticas de detección por imagen apropiadas a la escala del sistema y a las velocidades en el sistema, para detectar el movimiento de la partícula o de las partículas a través del campo de visión del conjunto. La emisión retardada de materiales fosforescentes, que es una función del tiempo bien caracterizada, posibilita el seguimiento dinámico de las posiciones, direcciones y velocidades de cada partícula y de manera opcional del tamaño de partícula, densidad y conformación hidrodinámica. A medida que se desplaza la partícula, se expone a más elementos del conjunto, pero con intensidad cada vez menor. Cuantos más son los elementos que se exponen durante una determinada fracción de su periodo de desintegración, más rápido es el desplazamiento. Por consiguiente, el modelo de intensidad integrado de un "rastro" de emisión de la partícula captado por el conjunto está relacionado directamente con la velocidad de la partícula. Las partículas se pueden renovar de nuevo en cualquier momento mediante la fuente de excitación CW pulsada o discontinua. La Fig. 10 ilustra este esquema. Aunque sólo se muestra una representación de la excitación y de la detección "lateral", son posibles tanto las disposiciones como las combinaciones de detección y excitación laterales y finales. La reducción de la información de la intensidad del conjunto CCD mediante análisis informático permitirá el seguimiento en tiempo casi real de las partículas en sistemas dinámicamente en desarrollo o vivos. El análisis de los datos y la reducción llevada a cabo por el ordenador incluiría una convolución de la desintegración intrínseca de la emisión fosforescente, del número de píxeles iluminados en su nivel de señal, de la orientación de la señal de desintegración de la señal en el conjunto y de las contribuciones de la intensidad de un círculo borroso procedente de las partículas que se desplazan dentro y fuera del plano focal del conjunto. En una disposición para la detección del flujo terminal, el tamaño del círculo borroso se relacionaría directamente con cuán rápidamente se desplaza la partícula fuera del foco, permitiendo de este modo determinar la velocidad de la partícula. Una posible aplicación consistiría en controlar la química y la cinética en una columna de reacción, por otra parte, la aplicación de este procedimiento a la fluocitometría puede permitir la resolución de células basándose en propiedades hidrodinámicas (tamaño, forma, densidad). El procedimiento puede ser también útil para las aplicaciones de diagnóstico in vivo (p. ej.: índice de perfusión de la sangre).
Se pueden utilizar también marcadores fosforescentes de conversión creciente para sensibilizar la temperatura en la zona en la que está unido el material fosforescente de conversión creciente. Los procedimientos de medición de la temperatura del material fosforescente de conversión creciente se describen en Berthou H. y Jorgensen CK (Octubre de 1990) Optics Lett. 15(19): 1100.
Aunque la presente invención se ha descrito con algún detalle a título de ilustración en aras de la claridad de comprensión, se pone de manifiesto que se pueden poner en práctica determinados cambios y modificaciones dentro del alcance de las reivindicaciones.
El amplio alcance de la presente invención se entiende mejor en relación con los ejemplos siguientes, que no están destinados de ninguna manera a limitar la invención.
Ejemplos experimentales Validación de materiales fosforescentes inorgánicos de conversión creciente como indicadores
Se molieron hasta tamaño submicrónico, partículas fosforescentes de conversión creciente compuestas por fluoruro de sodio e itrio dopadas con iterbio-erbio, se clasificaron por tamaño de partícula y se recubrieron con ácido policarboxílico. Se seleccionó Na(Y_{0,80}Yb_{0,18}Er_{0,02})F_{4} por su gran eficacia para la excitación en la banda de 960 a 960 nm. Se utilizó una combinación de colorante láser/IR de colorante Nd:Yag bombeado para generar pulsaciones de duración comprendida entre 8 ns y 10 ns en la banda de frecuencia anterior.
Se utilizaron pulsaciones de láser para iluminar una suspensión de partículas fosforescentes molidas en un líquido y se pusieron en el portaobjetos de vidrio in situ. Se controló la luminiscencia de la suspensión observada en los ángulos derechos utilizando unos lentes de captación, un filtro espacial para filtrar la luz de excitación difusa hasta el máximo punto posible y un fotomultiplicador, fotodiodo de vacío o un simple fotodiodo en estado sólido (dependiendo del nivel de luz observado).
La cantidad de la señal luminiscente se determinó en función del pH de la solución (intervalo: 6 a 8), del tamaño de grano, de la concentración de partículas (\etag/cm^{3}) y de la naturaleza del tensioactivo aniónico estabilizante. Se registraron las señales tanto como integral del tiempo en un integrador boxcar como a partir de un tiempo RC prolongado constante o como una señal transitoria utilizando un digitalizador transitorio para delinear la duración de la luminiscencia en las particulares condiciones experimentales. Se midieron in situ asimismo las señales por microscopía de barrido con láser. La Fig. 11 es una exploración de la fluorescencia del espectro de emisión fosforescente, incidente a la excitación con un foco de láser a una longitud de onda máxima de 977,2 nm; la emisión máxima es aproximadamente 541,0 nm. La Fig. 12 es una exploración de la excitación del espectro de excitación fosforescente, con una ventana de captación de la emisión establecida a 541,0 nm; excitación máxima para el material fosforescente a 541,0 nm, la longitud de onda de emisión es aproximadamente 977 nm. La fig. 13 es una medición de la desintegración en el tiempo de la luminiscencia del material fosforescente a 541,0 nm tras la terminación de la iluminación de excitación; la fosforescencia máxima aparece a aproximadamente 400 \mus con una desintegración gradual a un nivel más bajo, estable de fosforescencia de aproximadamente 1000 \mus. La Fig. 14 presenta la intensidad de la emisión fosforescente en función de la intensidad de la iluminación de excitación; la intensidad fosforescente aumenta con la intensidad de excitación hasta casi aproximadamente 1000 W/cm^{3}.
Se midieron las eficacias de fosforescencia de las partículas de Na(Y_{0,8}Yb_{0,12}Er_{0,08})F_{4}. Se utilizó un láser de Ti:zafiro como fuente de excitación y se utilizó un fotoespectrómetro y un multiplicador como sistema de detección. Se realizaron dos tipos de mediciones. La primera fue una medición directa en la que se midió la emisión absoluta por partícula para suspensiones fosforecentes en las bandas de emisión a 540 nm y 660 nm. En la Fig. 15 se presentan las secciones transversales calibradas y en la Fig. 16 se presenta gráficamente la dependencia del tamaño. Ésta correspondió a una sección transversal fosforescente de aproximadamente 1\times10^{-16} cm^{2} para partículas de 0,3 \mum con luz de excitación a 975 nm y una intensidad de aproximadamente 20 W/cm^{2}. Se midió asimismo la eficacia de la emisión del polvo fosforescente seco de aproximadamente 25 \mum. Basándose en los valores conocidos para la sección transversal de Yb^{+3} en huéspedes cristalinos (Lacovara et al. (1991) Op. Lett. 16: 1089), y en la dependencia medida de la emisión de fosforescencia del tamaño de partícula, se halló una sección transversal fosforescente de aproximadamente 1\times10^{-15} cm^{2}. La diferencia entre estas dos mediciones puede ser debida a la diferencia en la eficacia de fosforescencia entre el material fosforecente seco y las suspensiones acuosas o debido a la absorción de multiplicar fotones difusos en el material fosforecente seco. Basándose en ambas secciones transversales, la sección transversal es suficientemente grande para permitir la detección de partículas fosforecentes submicrónico a intensidades de láser moderadas. A intensidades de láser de aproximadamente 10 W/m^{2}, la fosforescencia se eleva a la 1,5 potencia como intensidad de láser.
Rendimiento de las partículas fosforescentes: Sensibilidad y detección
Se ensayó la fluorescencia de conversión creciente bajo iluminación de láser de diodo IR en un instrumento prototipo en una serie de placas Terasaki que contenían diluciones en serie de partículas fosforescentes de conversión creciente de 0,3 \mum monodispersas compuestas por (Y_{0,86}Yb_{0,08}Er_{0,06})_{2}O_{2}S.
Las partículas fosforescentes se prepararon por sedimentación en DMSO y se diluyeron en serie en solución de goma arábiga acuosa al 0,1%. Esto pareció eliminar completamente cualquier problema de dispersión del agua. Las diluciones en serie utilizadas se relacionan en la Tabla III.
TABLA III
Cantidad de material fosforecente Cantidad de material fosforecente Sensiblidad de detección
Marcador (ng/pocillo) (partículas/pocillo) equivalente (M)
10^{0} 1700 \pm 90 23.600.000 \pm 1.200.000 4\times10^{-12}
10^{-1} 170 \pm 9 2.360.000 \pm 120.000 4\times10^{-13}
10^{-2} 17 \pm 0,9 236.000 \pm 12.000 4\times10^{-14}
10^{-3} 1,7 \pm 0,09 23.600 \pm 1.200 4\times10^{-15}
10^{-4} 0,170 \pm 0,009 2.360 \pm 120 4\times10^{-16}
TABLA III (continuación)
Cantidad de material fosforecente Cantidad de material fosforecente Sensiblidad de detección
Marcador (ng/pocillo) (partículas/pocillo) equivalente (M)
10^{-5} 0, 017 \pm 0,0009 236 \pm12 4\times10^{-17}
10^{-6} 0, 0017 \pm 0,00009 23,6 \pm1,2 4\times10^{-18}
La dispersión madre de DMSO tiene una densidad de material fosforecente de 1,70 \pm 0,09 mg/ml (a límites de confianza del 95%), determinada por gravimetría evaporando muestras de 4 a 1 ml. Esto se traduce en 23,6\times10^{9} partículas/ml (suponiendo un tamaño de partícula medio de 0,3 \mum y una densidad de partícula de 5,3 g/ml). El residuo después de evaporar las muestra durante la semana entre 110 y 120ºC fue sensiblemente amarillo, pero produjo fosforescencia al analizarlo con un láser de diodo IR.
La luz verde visible que procede de todas las diluciones en serie inferiores a 10^{-3} (es decir, 1,7 \mug/ml ó 23,6\times10^{6} partículas/ml) en un tubo de microcentrifugadora de polipropileno de 1 ml utilizando un láser de diodo portátil en un cuarto oscuro. Las diluciones 10^{-1} y 10^{-2} eran turbias a simple vista. Se pipeteó 1 \mul de cada dilución en serie ó 0,1 \mul de la siguiente dilución mayor en un pocillo de una placa Teresaki. Se observó que 1 \mul llena el fondo del pocillo y 0,1 \mul se distribuye a lo largo del borde del pocillo, pero no abarca toda la superficie. Debido a los problemas estadísticos y de pipeteado relacionados con los volúmenes pequeños con concentraciones bajas de partículas, se prepararon de 2 a 4 réplicas.
El pocillo de una placa Teresaki contiene un volumen de muestra de 10 \mul. Suponiendo que todas las partículas de material fosforecente contenidas en este volumen se adhieran al fondo del pocillo de la muestra, se puede estimar una sensibilidad de detección equivalente (Tabla III). Obsérvese que 10^{-15} a 10^{-18} M es el intervalo normal de los análisis de la superficie unida a la enzima.
Resultados de la muestra de referencia
Se exploraron las muestras de referencia utilizando un dispositivo prototipo de fluorímetro de conversión creciente (David Sarnoff Research Center). Las muestras se exploraron moviendo la placa a incrementos de 50 \mum, utilizando una fase de colocación X-Y motorizada, en relación con el punto focal de un láser de diodo infrarrojo.
El láser de diodo infrarrojo se operó a 63 mW (100 mA). Se enfocó el rayo a 2,4\times10^{-3} cm^{2} en el punto focal. Como el fondo del pocillo de la muestra es de aproximadamente 1,4\times10^{-2} cm^{2} (1365 \mum de diámetro), el rayo abarca menos del 17% de la superficie del fondo del pocillo en cualquier posición individual. El pocillo tiene también paredes laterales inclinadas que se ensanchan desde el fondo hasta la parte superior del pocillo de la muestra y se investigan mediante un rayo láser divergente de forma progresiva. Despreciando las pérdidas en las ópticas, la intensidad de la luz IR en el punto focal (fondo del pocillo de la muestra) fue aproximadamente de 26 a 27 W/cm^{2} a 980 nm de longitud de onda. Se utilizó un tubo fotomultiplicador (PMT) para la detección de la luz visible (convertida con aumento) emitida desde la muestra. Como la anchura del rayo de láser era más pequeña que el área de la superficie del fondo del pocillo de la muestra, la placa se alineó por inspección visual frente al punto focal del láser de diodo de modo que el láser se centró en el pocillo intermedio (C6 cuando se leen los pocillos C5, C6 y C7, y D6 cuando se leen los pozillos D5, D6 y D7).
Se registró la señal del PMT (amps) en cada posición de la placa y se integró numéricamente en toda la anchura del pocillo de la muestra (aproximadamente 4000 \mum). Se realizaron varias exploraciones en diferentes posiciones en los pocillos de muestra de dilución 10^{-2} a 10^{0} para determinar la uniformidad de la distribución de la partícula. La señal de fondo se determinó integrando la corriente media del campo oscuro del PMT a una distancia de 4000 \mum, que da una señal de fondo integrada de 1\times10^{-9} \mua-m. Los productos de integración de los pocillos de muestra se aumentaron hasta esta señal de fondo y se presentan en la Fig. 19.
Detección de muestras por inmunodiagnóstico
Se preparó una serie de muestras de IgG/anti-IgG para demostrar las capacidades de los indicadores fosforescentes de conversión creciente en un formato de análisis inmunosorbente. Estas muestras constaban de seis pocillos individuales (muestras positivas) recubiertas con antígeno (IgG de ratón) y albúmina de suero bovino (BSA) y seis pocillos recubiertos con BSA solo (referencias negativas). Se utilizaron a continuación partículas fosforescentes de (Y_{0,86}Yb_{0,08}Er_{0,06})_{2}O_{2}S de 0,3 \mum nominal recubiertas con anticuerpo IgG (anti-IgG) anti-ratón de cabra como conjugado indicador-anticuerpo.
Se recubrieron seis pocillos (C5, C6, C7, D5, D6 y D7) de una placa Terasaki de polietileno transparente con IgG de ratón por incubación a 37ºC frenta a 5 \mul de una solución de 100 \mug/ml de IgG de ratón en solución salina tamponada con fosfato (PBS). Después de 1 h, se aspiró esta solución y se lavó cada pocillo de muestra con 10 \mul de BSA al 3% en PBS. Se aspiró esto inmediatamente y se reemplazó con 20 \mul de BSA al 3% en PBS. Cada pocillo de muestra se recubrió después con BSA por incubación frente a los 20 \mul de solución BSA/PBS durante 1 h a 37ºC. Se aspiró la solución de cabra posterior y se almacenaron las placas a 4ºC toda la noche. Estos pocillos se consideraron muestras positivas. Se prepararon los mismos seis pocillos en una segunda placa Terasaki de modo idéntico, excepto que no se recubrieron con IgG de ratón. Esta segunda serie de pocillos de muestra se consideró de referencias negativas.
Conjugado material fosforecente/anticuerpo
Se preparó una solución de partículas fosforescentes de (Y_{0,86}Yb_{0,08}Er_{0,06})_{2}O_{2}S poniendo en suspensión los materiales fosforecentes anhidros en DMSO. La densidad inicial de la partícula fue aproximadamente 10^{7} partículas/ml determinada por recuento del número de partículas contenidas en el campo de un microscopio óptico. Obsérvese que el tamaño de partícula fundamental de 0,3 \mum era menor que los límites de resolución del microscopio. Esta solución se dejó sedimentar en reposo durante 3 días. El sobrenadante, que era turbio y supuestamente contenía la mayoría de las partículas monodispersas más pequeñas, se utilizó para conjugación posterior.
Se conjugó anticuerpo de IgG anti-ratón de cabra (Ab) (por adsorción) con partículas fosforescentes fraccionadas en DMSO. Se hizo esto mezclando 200 \mul de la solución de Ab (en Tris-HCl 0,1 M, pH 7,2) con 100 \mul de la suspensión fosforescente en DMSO. Varias concentraciones de Ab diferentes se probaron en el intervalo de 0,025 a 1 \mug/\mul. Una concentración de 0,25 \mug/\mul pareció dar como resultado el recubrimiento más eficaz (es decir, la utilización máxima de Ab con un mínimo de aumento de las partículas fosforescentes). Se equilibraron los materiales fosforecentes toda la noche a temperatura ambiente con el Ab en esta solución de DMSO/Tris en agitación suave. Los conjugados material fosforecente-Ab se centrifugaron en esta suspensión y se volvieron a poner en suspensión en una solución de 3 \mug/ml de BSA en PBS para su recubrimiento posterior. La resuspensión de BSA/PSA resultante se utilizó directamente para análisis.
Se determinó el grado de adsorción de Ab en los materiales fosforecentes y la actividad de Ab residual, tratando el Ab unido al material fosforecente con IgG de ratón conjugada con isotiocianato de fluoresceína (FITC). Los materiales fosforecentes marcados con FITC resultantes se pasaron a través de un fluocitómetro Cyteron Absolute, que asimismo fue capaz de medir el tamaño relativo de las partículas. Se observaron dos subpoblaciones distintas de tamaño, apareciendo el 65% aproximadamente de partículas contadas como partículas pequeñas supuestamente monodispersas y siendo el 35% significativamente mayores, supuestamente agregados. Únicamente el 60% de la subpoblación más pequeña parecía tener cantidades significativas de Ab activo (determinado por fluorescencia con FITC). De los agregados propuestos, aproximadamente el 90% parecía que contenía Ab activo (por fluorescencia con FITC). Esto sugiere que menos del 40% de los conjugados material fosforecente-Ab eran de tamaño apropiado (0,3 \mum nominal) y presentaban actividad IgG anti-ratón. Una fracción similar de conjugado material fosforecente-Ab (31%) era activa pero llevaba un indicador fosforescente significativamente mayor.
Se registró la señal del PMT (amps) en cada una de las posiciones de las placas y se integró numéricamente en toda la anchura del pocillo de muestra (aproximadamente 4000 \mum). Las señales medias (con límtes de confianza del 95%) son:
Promedio de muestras positivas = 1,30\times10^{-4} \pm 1,25\times10^{-4} \mua-m.
Promedio de referencias negativas = 4,20\times10^{-6} \pm 6,82\times10^{-6} \mua-m.
Las muestras positivas y las referencias negativas son estadísticamente diferentes en el nivel de confianza del 99,9%. Las muestra positivas emiten por término medio 30,0\pm29,7 veces más luz que las referencias negativas.
Acoplamiento de materiales fosforecentes a macromoléculas biológicas
Para definir además los parámetros para los materiales fosforecentes de conversión creciente como indicadores biológicos, se unieron acopladores biológicos a partículas fosforescentes. Se recubrieron partículas fosforescentes de fluoruro de sodio e itrio-iterbio/erbio con estreptavidina. Se midieron las propiedades espectrales de excitación y emisión del material fosforecente solo y del material fosforecente recubierto con estreptavidina (Figs. 17A, 17B, 18A y 18B) y tanto los materiales fosforecentes no recubiertos como los recubiertos con estreptavidina fueron casi idénticos en sus propiedades de emisión y absorción, indicando que la fijación de los acopladores moleculares (p. ej.: proteínas) ejercen poco, si es que algún efecto, sobre las propiedades fosforescentes de los materiales fosforecentes de conversión creciente. Los materiales fosforecentes recubiertos con estreptavidina se unen a continuación de forma específica a los granos magnéticos biotinilados, demostrando la aplicabilidad de los materiales fosforecentes conjugados con el acoplador como indicadores en análisis bioquímico, como por ejemplo en inmunoanálisis, inmunohistoquímica, hibridaciones de ácidos nucleicos y otros análisis. La tecnología del grano magnético permite la separación fácil del material fosforecente recubierto con estreptavidina unido a biotina de una solución y es particularmente muy adecuado para análisis en sandwich en los que el grano magnético es el sustrato sólido.
La química de estreptavidina-biotina se utiliza extensamente de forma ventajosa en varios análisis biológicos, para los que son adecuados los indicadores fosforescentes de conversión creciente. La Fig. 20 presenta en forma esquemática, por ejemplo y sin limitación, una forma de realización de un inmunoanálisis para detectar un analito en una solución uniendo el analito (p. ej.: un antígeno diana) a un anticuerpo biotinilado, en el que el analito forma un complejo en sandwich inmovilizado sobre un sustrato sólido (p. ej.: un grano magnético) acoplando un primer componente de fijación unido directamente al sustrato sólido a un segundo componente de fijación (p. ej.: el anticuerpo biotinilado); Un material fosforecente de conversión creciente recubierto con estreptavidina se une a continuación específicamente al anticuerpo biotinilado en el sandwich y sirve para indicar la formación del complejo en sandwich sobre el sustrato sólido (que es una medición de la concentración del analito). Cuando el sustrato sólido es un grano magnético, se elimina fácilmente de la solución de la muestra por separación magnética y se determina la cantidad de material fosforecente unido al o a los grano(s) en el/los complejo(s) en sandwich midiendo la fosforescencia específica de conversión creciente. Por lo tanto, la fosforescencia del complejo en sandwich proporciona una medición cuantitativa de la concentración del analito.
Los polinucleótidos biotinilados se utilizan también en la práctica como sondas de hibridación, que se pueden acoplar a materiales fosforecentes de conversión creciente recubiertos con estreptavidina para indicar la formación del híbrido.
Fosforescencia de fondo en muestras biológicas
Se determinaron señales de fondo en dos muestras biológicas para la determinación del fondo potencial en inmunoanálisis. Se utilizaron como muestras esputo y orina en el mismo aparato utilizado para las mediciones de sensibilidad de fosforescencia (supra). No se observaron niveles de fondo superiores a los niveles de ruido del sistema establecidos por la corriente oscura del fotomultiplicador. Este nivel de ruido permite la detección de señales desde el orden de unos pocos centenares de partículas/cm^{3}. Esto está próximo a una sola partícula en el volumen de detección del sistema.
Un fotomultiplicador es una elección preferida para un detector para mediciones de alta sensibilidad de materiales fosforecentes de conversión creciente ya que los fotomultiplicadores se pueden seleccionar para producir eficacia cuántica elevada en las longitudes de onda de conversión creciente (es decir, emitidas) y prácticamente no responden en la banda de longitudes de onda de excitación mayores.
Detección de antígenos celulares con anticuerpos marcados con material fosforecente
La estreptavidina se une a partículas fosforescentes de conversión creciente tal como se describió, supra. Se sonda la línea celular del linfoma de ratón con un anticuerpo anti-CD3 de hámster que se une específicamente al antígeno EL-4 CD3 de diferenciación del linfocito T en la superficie celular de 30 kD. El anticuerpo primario del hámster se une a continuación de manera específica a un anticuerpo secundario cabra-antihámster biotinilado. El anticuerpo secundario biotinilado se detecta a continuación con el conjugado estreptavidina-material fosforecente. Este tipo de fijación y de marcado múltiple del anticuerpo se denomina estratificación del anticuerpo.
La adición de capas múltiples (p. ej.: uniendo el Ab primario del hámster con un Ab de cabra-antihámster, seguido de fijación con un Ab de conejo-anticabra biotinilado) se utiliza para aumentar la distancia que separa el material fosforecente de la diana. El efecto de la estratificación sobre la intensidad de la señal y la especificidad para la detección de la diana se calibra y se optimiza para la aplicación individual efectuando la estratificación capa anticuerpo desde una capa (el anticuerpo primario está biotinilado) hasta al menos cinco capas y determinando el número óptimo de capas para detectar células CD3 en EL-4.
La Fig. 21 retrata esquemáticamente la detección simultánea de dos antígenos de la superficie de la célula EL-4 utilizando materiales fosforecentes que se pueden distinguir basándose en los espectros de excitación y/o de emisión. La detección de ambos antígenos en el esquema presentado en la Fig. 21 utiliza un anticuerpo con terminal biotinilado que está conjugado con el material fosforecente (nº 1 o nº 2) recubierto con estreptavidina antes de la incubación con la muestra estratificada estratificada por Ab. De este modo, se conserva la especificidad material fosforecente-anticuerpo mediante el enlace no covalente inusualmente fuerte (K_{D} aprox. 1 \times 10^{15} M^{-1}) entre la estreptavidina y la biotina que se forma previamente antes de la incubación con la muestra unida al anticuerpo primario. La cuantificación de cada antígeno se realiza detectando la(s) distinta(s) señal(es) atribuible(s) a cada especie individual de material fosforecente. Las señales fosforescentes se pueden distinguir basándose en el espectro de excitación, en el espectro de emisión, en el periodo de desaparición de la fluorescencia o una combinación de estas u otras propiedades.
La Fig. 22 presenta un esquema de un aparato para la detección sensible a la fase, que proporciona discriminación adicional del fondo. El mezclador a pulsaciones o por frecuencia se sitúa para pasar la señal y discriminarla frente al fondo siguiendo la calibración por frecuencia para el rechazo máximo del fondo.
Conjugación covalente del marcador fosforescente de conversión creciente con avidina
Un material fosforecente de oxisulfuro (O_{2}S) de itrio-iterbio-erbio (Y_{0,86}Yb_{0,08}Er_{0,06}) de conversión creciente se acopló con avidina mediante el procedimiento siguiente:
Partículas fosforescentes monodispersas de conversión creciente se silanizaron con tiopropiltrietoxisilano (Huls) siguiendo el procedimiento detallado por Arkles (en: Silicone Compounds: Register and Review, Hills America, págs. 59-75, 1991). Esto consistió en añadir tiopropiltrietoxisilano (2 g) y etanol acuoso al 95% (10 ml) a un matraz Erlenmeyer de 500 ml y se agitó durante 2 minutos. Se añadió a continuación a la mezcla aproximadamente 8 ml de una suspensión fosforescente de 65 mg/ml en DMSO. Se agitó esta suspensión durante 2 minutos más, a continuación se transfirió a tubos de centrífuga y se centrifugó para separar las partículas fosforescentes. Se lavaron los sedimentos dos veces con etanol acuoso al 95% centrifugando cada vez. Se recogieron las partículas resultantes y se secaron toda la noche al vacío aproximadamente a 30ºC. Se volvió a poner en suspensión una cantidad (127 mg) de materiales fosforecentes silanizados anhidros en 1,5 ml de DMSO (solución madre fosforescente).
Se preparó una solución que contenía 1,19 mg de avidina (Pierce) en 1,0 ml de tampón de borato (954 mg de decahidrato de borato de sodio y 17,7 ml de NaCl 0,1 N en 50 ml de agua desionizada, pH 8,3) (solución madre de avidina). Se preparó otra solución conteniendo 1,7 mg de aminobenzoato de N-succinimidil(4-yodoacetil) (Pierce Chemical) en 1,2 ml de DMSO (solución madre de SIAB). Se añadió una cantidad (10 ml) de solución madre SIAB a 1,0 ml de solución madre de avidina y se agitó 30 min a temperatura ambiente para dejar reaccionar el éster de N-hidroxisuccinimida del SIAB con aminas primarias en la avidina (solución madre avidina-SIAB).
Se preparó un vial de 20 ml para centelleo conteniendo 10 ml de tampón de borato (pH 8,3). A este vial se hicieron las adiciones siguientes: 21,6 \mul de la solución madre avidina-SIAB seguido de 1,5 ml de solución madre fosforescente. Se agitó esta mezcla de reacción a temperatura ambiente en la oscuridad toda la noche para dejar reaccionar la avidina activada por SIAB con los grupos presentes en la superficie fosforescente silanizada y produciendo el enlace covalente de avidina con las partículas fosforescentes.
Después de la incubación toda la noche se centrifugó 1,0 ml de la mezcla de reacción (1 min a 10.000 g) y se eliminó el sobrenadante. Se volvió a poner en suspensión el sedimento en 1 ml de solución salina tamponada con fosfato (pH 7,2, Pierce) y se centrifugó otra vez para lavar cualquier proteína no conjugada de los materiales fosforecentes. Se repitió este proceso de lavado. Se volvió a poner en suspensión el sedimento lavado en 1,0 ml de solución salina tamponada con fosfato y se utilizó directamente en análisis de diagnóstico tal como se describe más adelante.
Aparato de medición
Se utilizó un fluorímetro SLM Aminco 48000 para medir el espectro de fluorescencia de las muestras de material fosforecente. Las modificaciones a este dispositivo consistieron en añadir un diodo de láser (David Sarnoff CD-299R-FA nº13) que se introdujo en el fluorímetro por la boca 3. El diodo de láser emite a \lambda = 985,1 nm. Los datos espectrales proporcionados por el David Sarnoff Research Center muestran también un pico pequeño a 980,2 nm. Este pico tiene el 15% de la intensidad del pico a 985 nm.
Se utilizó una lente de 5,08 cm de distancia focal para concentrar los rayos de láser del diodo. Se midió la potencia de la luz del láser IR en 6,1 mW y la posición de la cubeta con una corriente conductora de 75 mA. El rayo no se enfocó al centro de la cubeta. Esto es válido también para la luz visible normal procedente del monocromador de excitación del fluorímetro. El rayo láser diverge a medida que entra en el soporte de la cubeta y el tiempo para alcanzar el centro de la célula es aproximadamente 4 mm (H) \times 2 mm (V), despreciando los cambios del índice de refracción de la pared de la célula y del líquido.
La luz emitida se explora con un monocromador y se detecta mediante un tubo fotomultiplicador (PMT) 90º a partir de la dirección de la luz de excitación. Se determinaron los límites de detección para SLM Aminco 48000 modificado por dilución en serie que resultaron ser de 4 \times 10^{-16} M (240.000 partículas fosforescentes por ml) en PBS. Se observaron picos de emisión fosforescente en el espectro a longitudes de onda de 406\pm2 nm, 434\pm2 nm, 522\pm2 nm y 548\pm2 nm. El pico mayor fue a 548 nm. La intensidad del pico de 548 nm se utilizó para discriminar las muestras.
Acoplamiento del conjugado avidina-material fosforecente con el marcador de la superficie de la célula
Se cultivó una línea celular linfoblastoide (Depósito nº GM07092 de células mutantes genéticas humanas) en medio RPMI 1640 conteniendo 15% de suero de ternero fetal inactivado térmicamente. Se centrifugó una suspensión de células (10^{7} células) y se volvió a poner en suspensión en un volumen igual de solución salina tamponada con fosfato (PBS) pH 7,4. Se lavaron las células dos veces en PBS y se volvieron a poner en suspensión hasta una concentración final de 5 \times 10^{6} células/ml. Se incubaron a continuación estas células con un anticuerpo monoclonal de IgG1 de ratón en \beta_{2}-microglobulina humana y un antígeno con histocompatibilidad de clase I en tubos de centrifugadora de poliestireno. Se inmunoprecipitaron las células durante 30 minutos a 4ºC con una concentración de anticuerpo de 10 \mug/ml. Se recogieron las células por centrifugación, se lavaron dos veces en PBS, se volvieron a poner en suspensión en PBS y a continuación se tomaron alícuotas (250 \mul) en seis tubos nuevos de centrifugadora. Cuatro de estas muestras recibieron IgG anti-ratón de cabra biotinilada, mientras que las dos restantes recibieron IgG anti-ratón de cabra marcada con FITC. Estas inmunoprecipitaciones se realizaron a 4ºC durante 30 minutos en un volumen de 400 \mul con una concentración de segundo anticuerpo final de 20 \mug/ml. Se recogieron las células y se lavaron en PBS, como anteriormente, pero se volvieron a poner en suspensión en 50 \mul de tampón de bloqueo (caseína purificada al 2% en PBS, Tropix, Bedford, MA). Se bloquearon los complejos célula-anticuerpo en esta solución durante 30 minutos a temperatura ambiente y a continuación se transfirieron a tubos nuevos.
Se añadió una suspensión (40 \mul) bloqueada previamente de conjugado avidina-material fosforecente, avidina-FITC, avidina o material fosforecente sin conjugar a cuatro de las muestras de células conjugadas con la IgG anti-ratón biotinilado (H&L). Además, se añadió una cantidad igual de avidina-material fosforecente bloqueado previamente o de material fosforecente sin conjugar a las restantes dos muestras de células inmunoprecipitadas con IgG anti-ratón marcada con FITC no biotinilada (H&L). Los conjugados o las referencias negativas del indicador avidina se bloquearon previamente de la forma siguiente. Avidina-material fosforecente y el material fosforecente solo se diluyeron en el tampón de bloqueo añadiendo 10 \mul de una suspensión de 6,7 mg/ml hasta un volumen final de 100 \mul. Se diluyeron también las referencias avidina-FITC y la avidina sola en un tampón de bloqueo añadiendo 27 \mul de 2,5 mg/ml de solución hasta un volumen final de 100 \mul. Estos reactivos se bloquearon a temperatura ambiente durante 3 horas con resuspensión intermitente y a continuación se añadieron a 50 \mul de células marcadas con un segundo anticuerpo biotinilado o no biotinilado. Las reacciones de avidina-biotina se llevaron a cabo a temperatura ambiente durante 30 minutos con resuspensión ocasional. Se interrumpieron las reacciones recogiendo las células por centrifugación y lavando dos veces en tampón de bloqueo. Se volvieron a poner en suspensión las muestras en 100 \mul de tampón de bloqueo y se dejaron sedimentar durante 4 a 5 minutos. Se prepararon portaobjetos para la identificación por imagen pipeteando 5 \mul de células sedimentadas desde el fondo del tubo. Se identificaron las células por imagen, por microscopía confocal de láser en condiciones apropiadas para observar FITC de la superficie de la célula y señales fosforecentes de conversión creciente. En la Tabla IV se resumen las observaciones.
El resto de las muestras se utilizó para volver a poner en suspensión los granos de poliestireno paramagnéticos acoplados con IgG anti-ratón de oveja. En cada una de las seis muestras, se lavaron 3 \times 10^{7} granos con tampón de bloqueo durante 1 hora a temperatura ambiente en tubos Eppendorf. Se eliminó el tampón por aspiración mientras estaban los tubos en una rejilla magnética. Se dejó que los granos magnéticos con IgG anti-ratón se uniesen a las células marcadas con anticuerpo durante 1 hora a temperatura ambiente con resuspensión intermitente. Se recogieron a continuación los granos magnéticos en una rejilla magnética, se lavaron cuatro veces en tampón de bloqueo, se volvieron a poner en suspensión en 100 \mul de tampón de bloqueo, se transfirieron a un tubo nuevo y se midió la fosforescencia de conversión creciente en el fluorímetro.
Para explorar la emisión fosforescente, el ancho de banda del monocromador de emisión se situó en 8 nm y se exploraron los espectros desde 500 a 700 nm con un tamaño de paso de 2 nm. Se midió asimismo la señal FITC en las muestras con 37 \mum a \lambda = 490 nm con un ancho de banda de 2 nm. Como la longitud de onda de excitación (490 nm) y la longitud de onda de emisión (514 nm) están muy próximas para FITC, se necesitó mayor resolución para obtener señales separables que con marcado fosforecente. La intensidad de la señal de 490 nm fue de 240 \muW/cm^{2} en el centro del pocillo. Se exploraron los espectros de emisión en incrementos de 0,5 nm desde 450 a 750 nm con un ancho de banda de 2 nm en el monocromador de emisión. La muestra 1 es la referencia positiva y proporcionó de forma clara la mayor señal de emisión. La muestra 2 indica que cualquier adsorción no específica de los materiales fosforecentes en la muestra está limitada y se discrimina fácilmente a partir de la señal atribuible al material fosforecente conjugado con avidina y demostrando que los materiales fosforecentes acoplados a la avidina se pueden unir de forma específica solamente cuando estén conjugados con la sonda, en este ejemplo mediante el enlace biotina-avidina. La muestra 3 es la referencia negativa que no contiene materiales fosforecentes, excepto avidina. La muestra 4 presenta avidina conjugada con FITC. Aunque se observaron señales de FITC en la superficie celular por microscopía de láser, las señales fueron inferiores al nivel de detección en el fluorímetro para la medición de FITC y como no había material fosforecente en la muestra no hubo señal fosforescente significativa. Las muestras 5 y 6 demuestran que se pueden detectar anticuerpos primarios conjugados con FITC y que la presencia de material fosforecente o de avidina-material fosforecente no destruye de forma significativa la unón del anticuerpo primario a su antígeno diana.
TABLA IV
Tubo Tipo de IgG anti- Conjugado de avidina Señal fosforecente en la Señal de FITC en la
ratón de cabra superficie de la célula superficie de la célula
1 biotinilada Avidina-material fosforecente + -
2 biotinilada Material fosforecente - -
3 biotinilada Avidina - -
4 biotinilada Avidina-FITC - +
5 marcada con FITC Avidina-material fosforecente - +
6 marcada con FITC Material fosforecente - +
Acoplamiento del conjugado avidina-material fosforecente al ADN
ADN de plásmido (25 \mug) fue traducido en el corte en presencia de GTPd 20 mM, CPTd 20 mM, biotina-14 ATPd 20 mM, TTPd 13 mM y digoxigenina-11 UTPd 7 mM y se purificó por precipitación con etanol. Se estimó que el tamaño medio de los fragmentos biotinilados, marcados con digoxigenina estaba comprendido entre 200 y 300 nucleótidos, según se estimó por electroforesis en gel. Se inmunoprecipitaron aproximadamente 20 \mug de ADN durante 1 hora a 22ºC con 10 \mug/ml de solución (PBS) de IgG1 con anti-digoxigenina monoclonal de ratón en un volumen de 200 \mul. Se preparó también una reacción equivalente que no contenía ADN. A continuación se tomaron alícuotas (50 \mul) de cada una de las dos muestras en tres tubos nuevos Eppendorf.
Se bloquearon los conjugados de avidina durante 1 hora a temperatura ambiente diluyendo 500 \mug de suspensión avidina-material fosforecente, de suspensión fosforecente no conjugada o de una solución de avidina en 300 \mul de tampón de bloqueo. A cada una de las muestras (resumida a continuación en la Tabla V) se añadieron 50 \mul de conjugados de anti-digoxigenina a 150 \mul de conjugado de avidina bloqueados previamente o de avidina y se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente.
Se separaron conjugados de avidina no unidos volviendo a poner en suspensión 3 \times 10^{7} granos paramagnéticos acoplados con IgG anti-ratón de oveja (bloqueados previamente en tampón de bloqueo). Después de incubación durante 30 minutos a temperatura ambiente con resuspensión intermitente, se separaron los granos en una rejilla magnética y se lavaron 4 a 6 veces en PBS. Se midieron a continuación en el fluorímetro los granos unidos a anticuerpo-ADN.
Se exploraron las muestras desde 500 hasta 700 nm con un ancho de banda de 8 nm y un tamaño de paso de 2 nm. Cada valor de PMT indicado (Tabla V) representa un promedio de 5 exploraciones. Es de esperar que la muestra 1 proporcione la señal PMT más alta ya que está presente el ADN biotinilado y puede unirse a los materiales fosforecentes acoplados a la avidina. La muestra 2 indica el nivel de adsorción no específica de los materiales fosforecentes en la muestra que se observa que es insignificante, ya que se observa que la señal del PMT es la misma que la de la referencia negativa (muestra 4) que no contiene materiales fosforecentes. La muestra 3 es otra referencia y demuestra que los materiales fosforecentes acoplados a la avidina no se unen a los granos paramagnéticos en ausencia de ADN. Las muestras 5 y 6 presentan resultados de avidina marcada con FITC utilizada para validar el análisis.
TABLA V Resultados del análisis de diagnóstico del ácido nucleico fosforescente de conversión creciente
Muestra ADN Indicador Señal del PMT Señal del PMT
(V @ 546 nm) (V @ 514 nm)
1 ADN marcado con Material fosforecente 6,1297 2,4788
digoxigenina y biotina acoplado a avidina
2 ADN marcado con Material fosforecente 1,0528 4,4022
digoxigenina y biotina silanizado
3 sin ADN Material fosforecente 1,6302 3,5779
acoplado a avidina
4 ADN marcado con 0,8505 2,8067
digoxigenina y biotina Avidina
5 ADN marcado con FITC-avidina 1,0484 8,4394
digoxigenina y biotina
6 sin ADN FITC-avidina 1,0899 3,5779
Evaluación de la conversión decreciente del material fosforecente
Se exploró la presencia de una señal de conversión decreciente en los materiales fosforecentes (Y_{0,86}Yb_{0,08}Er_{0,06})_{2}
O_{2}S. Esto se realizó excitando la muestra de materiales fosforecentes monodispersos descrita anteriormente (4 \times 10^{-12} M en DMSO) con 1,3 mW de luz monocromática a 350 nm con un ancho de banda de 16 nm para la fuente de excitación. Se realizó la detección explorando esta muestra desde 350 a 800 nm con un ancho de banda de monocromador de 8 nm. La exploración se realizó a incrementos de 2 nm. No se observó conversión decreciente. Además, no se observó conversión decreciente a las longitudes de onda de excitación citadas por Tanke et al. (patente U.S. nº 5.034.265). Por lo tanto, los materiales fosforecentes de conversión creciente ensayados son distintos de los descritos por Tanke et al.
Análisis heterogéneos
Se puede explotar el proceso de activación con multifotones característico de los materiales fosforecentes de conversión creciente para producir análisis que no requieran etapas de lavado de la muestra. Dichos análisis de diagnóstico que no requieren la eliminación de los marcadores fosforescentes no unidos de la muestra se denominan en la presente memoria análisis homogéneos y también se pueden denominar análisis pseudohomogéneos.
Ejemplo 1
De análisis homogéneo
Una forma de realización de análisis homogéneo consiste en la utilización de un marcador fosforescente de conversión creciente acoplado a una sonda apropiada (p. ej.: un anticuerpo o ADN). La sonda marcada con material fosforecente se une a una diana de forma específica (p. ej.: antígeno o ácido nucleico) que se acopla a una superficie de captura. Una superficie de captura adecuada puede ser la punta de una fibra óptica luminosa (Fig. 23) o la superficie del fondo de un recipiente de muestra (Fig. 24). En la incubación de la superficie de captura marcada por la diana con la sonda marcada por material fosforecente, las partículas fosforecentes se acumularán en la superficie de captura en función de la cantidad de diana presente en la superficie de captura. La diana puede estar acoplada directamente a la superficie de captura o puede estar inmovilizada por interacción con un agente de fijación (p. ej.: reactivo específico de anticuerpo con diana, polinucleótido que se une a la diana) que se acopla a la superficie de captura (tal como por ejemplo, en un inmunoanálisis en sandwich).
La detección del material fosforecente unido a la superficie de captura se efectúa utilizando una luz de excitación que está enfocada desde un rayo de baja intensidad de la sección transversal grande hasta un rayo de alta intensidad de la sección transversal pequeña estando el punto focal del rayo en o muy próximo a la superficie de captura. El enfoque de la luz de excitación se realiza por transmisión a través de elementos ópticos que tienen una distancia focal muy pequeña, de modo que el rayo diverge, volviendo a ser menos intenso, dentro de una distancia corta de la superficie de captura.
Aunque la intensidad de la luz emitida desde los marcadores fosforescentes de conversión creciente es proporcional a la intensidad de la luz de excitación elevada a una potencia de dos o mayor, los materiales fosforescentes cerca del punto focal de la fuente de excitación emitirán de forma significativa mucha más luz que los que quedan en suspensión en la muestra lejos de la superficie de captura. Por consiguiente, la fijación de las sondas acopladas al material fosforecente de conversión creciente a la superficie de captura proporcionará un aumento de la intensidad de la luz emitida medida procedente de la muestra en conjunto o medida procedente de una muestra de referencia, en la que los materiales fosforecentes no se unen a la superficie de captura. La intensidad de la luz emitida se puede representar en función de la concentración de diana utilizando para la estandarización (calibración) una serie de muestras que contienen concentraciones predeterminadas de diana. La intensidad de la luz emitida desde una muestra de ensayo (concentración desconocida de la diana) se puede comparar con la curva patrón generada de este modo para determinar la concentración de la diana.
Los formatos de ejemplos de análisis homogéneos adecuados comprenden, pero no se limitan a, análisis de inmunodiagnóstico en sandwich y análisis de competencia en la superficie del antígeno o del anticuerpo.
Ejemplo 2
De análisis homogéneo
Otra forma de realización permite la acumulación de sondas acopladas al material fosforecente de conversión creciente en la superficie de detección mediante la aplicación de sedimentación centrífuga o por gravedad. En esta forma de realización un material fosforecente de conversión creciente se acopla a sondas múltiples. Todas las sondas deben unirse a la misma diana, aunque dicha fijación se puede realizar en diferentes posiciones (p. ej.: como sonda de anticuerpo puede dirigir diferentes epítopos sobre un solo antígeno). El material fosforecente multisonda se puede utilizar para efectuar la agregación de dianas en solución o suspensión en la muestra. Esta agregación producirá la formación de un gran complejo insoluble material fosforecente-sonda-diana que precipita en la solución o suspensión (Fig. 25). Este complejo agregado que contiene materiales fosforecentes se acumula en una superficie de detección en tanto que los materiales no agregados permanecen en solución o suspensión. La detección se realiza tal como se describe en el ejemplo anterior utilizando un rayo de excitación marcadamente convergente.
Aunque la presente invención se ha descrito con algún detalle a modo de ilustración en aras de la claridad de comprensión, resulta evidente que se pueden poner en práctica determinados cambios y modificaciones dentro del alcance de las reivindicaciones.

Claims (5)

1. Aparato para analizar una muestra que puede contener un indicador luminiscente de material fosforescente de conversión creciente caracterizado por una banda de excitación en el primer intervalo de longitudes de onda y una banda de emisión en el segundo intervalo de longitudes de onda que son más cortas que las longitudes de onda en el primer intervalo, comprendiendo el aparato:
un foco capaz de emitir luz en el intervalo de longitudes de onda que se solapan con al menos una parte de la banda de excitación del indicador luminiscente de material fosforescente de conversión creciente, en el que la banda de excitación tiene una longitud de onda comprendida entre 950 y 1000 nm;
medios para suministrar energía a dicho foco;
un detector capaz de detectar luz en un intervalo de longitudes de onda que se solapa al menos con una parte de la banda de emisión del indicador luminiscente de material fosforescente de conversión creciente, en el que la banda de emisión está en la zona visible del espectro;
un primer medio para dirigir al menos una parte de la luz emitida por dicho foco a una posición en la muestra, incluyendo la luz en el primer intervalo de longitudes de onda y excluyendo la luz en el segundo intervalo de longitudes de onda;
un segundo medio para dirigir al menos una parte de la luz que emana desde dicha posición en la muestra hasta dicho detector, incluyendo la luz en el segundo intervalo de longitudes de onda; y
medios, acoplados a dicho detector, para generar una señal eléctrica representativa de la identidad de la luz incidente en dicho detector en un intervalo de longitudes de onda que incluyen las longitudes de onda en el segundo intervalo y excluye las longitudes de onda en el primer intervalo.
2. Aparato según la reivindicación 1, en el que:
dicho detector es sensible a la luz en el primer y segundo intervalos;
dicho segundo medio para direccionamiento incluye un elemento selectivo para la longitud de onda; y
solamente la luz que tiene longitudes de onda en el segundo intervalo alcanza dicho detector.
3. Aparato según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la muestra posiblemente contiene además un segundo indicador caracterizado por una banda de excitación en el tercer intervalo de longitudes de onda y una banda de emisión en un cuarto intervalo de longitudes de onda y en el que el primer y tercer intervalos no se solapan y el segundo y cuarto intervalo no se solapan, y comprendiendo el aparato:
una primer foco capaz de emitir luz en un intervalo de longitudes de onda que se solapa al menos con una parte de la banda de excitación del segundo indicador,
medios para suministrar energía a dicha segundo foco;
un segundo detector capaz de detectar luz en un intervalo de longitudes de onda que se solapa al menos con una parte de la banda de emisión del segundo indicador;
un tercer medio para dirigir al menos una parte de la luz emitida por dicho segundo foco hasta una posición en la muestra, incluyendo la luz en el tercer intervalo de longitudes de onda y excluyendo la luz en el cuarto intervalo de longitudes de onda;
un cuarto medio para dirigir al menos una parte de la luz que emana desde dicha posición en la muestra hasta dicho detector, incluyendo la luz en el cuarto intervalo de longitudes de onda; y
medios adicionales, acoplados a dicho segundo detector, para generar una señal eléctrica representativa de la intensidad de la luz incidente en dicho segundo detector en un intervalo de longitudes de onda que incluye las longitudes de onda en el cuarto intervalo y excluye las longitudes de onda en el primer, segundo y tercer intervalos.
4. Aparato para analizar una posible muestra que contiene el primer y segundo indicadores luminiscentes de material fosforescente de conversión creciente, en la que el primer indicador se caracteriza por una banda de excitación en el primer intervalo de longitudes de onda y una banda de emisión en el segundo intervalo de longitudes de onda que son más cortas que las longitudes de onda en el primer intervalo, en el que el segundo indicador se caracteriza por una banda de excitación en un tercer intervalo de longitudes de onda y una banda de emisión en un cuarto intervalo de longitudes de onda y en el que el primer y tercer intervalos no se solapan y el segundo y cuarto intervalo se solapan, comprendiendo el aparato:
un primer foco capaz de emitir luz en un intervalo de longitudes de onda que se solapa al menos con una parte de la banda de excitación del primer indicador, en el que la banda de excitación tiene una longitud de onda de 950 a 1000 nm;
un segundo foco capaz de emitir luz en un intervalo de longitudes de onda que se solapa al menos con una parte de la banda de excitación del segundo indicador;
medios para suministrar energía a dichos primer y segundo focos, incluyendo los medios para imponer modelos de intensidad diferente en dichos primer y segundo focos mencionados;
un detector capaz de detectar luz en un intervalo de longitudes de onda que se solapa al menos con una parte de la banda de emisión del indicador, en el que la banda de emisión está en la zona visible del espectro;
medios para dirigir al menos una parte de la luz emitida por dichos primer y segundo focos hasta una posición en la muestra, incluyendo la luz en el primer y tercer intervalos de longitudes de onda y excluyendo la luz en el segundo y cuarto intervalos de longitudes de onda ; y
medios, acoplados a dicho detector, para generar la primera y segunda señales eléctricas representativas de las intensidades respectivas de la luz incidente en dicho detector a las longitudes de onda en el segundo y cuarto intervalos y fuera del primer y tercer intervalos, incluyendo los medios para distinguir dichos modelos de intensidad diferentes.
5. Procedimiento para analizar una muestra que contiene un indicador luminiscente de material fosforescente de conversión creciente caracterizado por una banda de excitación en un primer intervalo de longitudes de onda y una banda de emisión en un segundo intervalo de longitudes de onda que son más cortas que las longitudes de onda en el primer intervalo, procedimiento que comprende:
proporcionar una muestra que contiene un indicador luminiscente de material fosforescente de conversión creciente caracterizado por una banda de excitación en un primer intervalo de longitudes de onda y una banda de emisión en un segundo intervalo de longitudes de onda que son más cortas que las longitudes de onda en el primer intervalo,
proporcionar un foco capaz de emitir luz en un intervalo de longitudes de onda comprendido dentro de la banda de excitación del indicador, en el que la banda de excitación tiene una longitud de onda de 950 a 1000 nm;
proporcionar un detector capaz de detectar luz a longitudes de onda comprendidas dentro de la banda de excitación del indicador;
proporcionar un detector capaz de detectar luz a una longitud de onda comprendida dentro de la banda de emisión del indicador, en el que la banda de emisión está en la zona visible del espectro;
dirigir la luz emitida por dicho foco a una posición en la muestra;
dirigir la luz que emana desde dicha posición en la muestra hasta el detector; y
generar una señal eléctrica representativa de la intensidad de la luz en un intervalo de longitudes de onda que incluye las longitudes de onda en el segundo intervalo y excluye las longitudes de onda en el primer intervalo.
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