DE102006056949B4

DE102006056949B4 - Verfahren und Vorrichtung zur Detektion mindestens einer Eigenschaft von mindestens einem Objekt mit einem Mikrochip

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Publication number: DE102006056949B4
Application number: DE102006056949A
Authority: DE
Inventors: Dr. Breitling Frank; Prof. Dr. Hausmann Michael; Kai König; Prof. Dr. Lindenstruth Volker; Dr. Nesterov-Müller Alexander; Dr. Torralba Collados Gloria Maria; Dr. Stadler Volker; Yipin Zhang; Dr. Bischoff Ralf
Original assignee: Universitaet Heidelberg
Current assignee: Universitaet Heidelberg
Priority date: 2006-11-30
Filing date: 2006-11-30
Publication date: 2011-12-22
Anticipated expiration: 2026-12-01
Also published as: WO2008065201A3; DE102006056949A1; US20100068825A1; WO2008065201A2; EP2097737A2

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Detektion mindestens einer Eigenschaft von mindestens einem Objekt (16). Die Detektion erfolgt mit einem Mikrochip (1). Der Mikrochip (1) weist mindestens einen auslesbaren Detektionspixel (3) auf. Zum Veringern des gerätetechnischen Aufwands bei der Objektdetektion ist das erfindungsgemäße Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass das mindestens eine Objekt (16) an dem Mikrochip (1) in einer räumlich vorgebbaren Position angeordnet wird. Das mindestens eine Objekt (16) wird mit Beleuchtungslicht (17, 19) beaufschlagt, um das mit dem mindestens einen Objekt (16) wechselwirkende Beleuchtungslicht (17, 19) oder das von dem Beleuchtungslicht (17, 19) induzierte und von dem mindestens einen Objekt ausgehende Licht (20) mit dem mindestens einen auslesbaren Detektionspixel (3) des Mikrochips (1) zu detektieren.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Detektion mindestens einer Eigenschaft von mindestens einem Objekt. Die Detektion erfolgt mit einem Mikrochip. Der Mikrochip weist mindestens einen auslesbaren Detektionspixel auf. Das mindestens eine Objekt wird an dem Mikrochip in einer räumlich vorgebbaren Position angeordnet und mit Beleuchtungslicht beaufschlagt, um das mit dem mindestens einen Objekt wechselwirkende Beleuchtungslicht oder das von dem Beleuchtungslicht induzierte und von dem mindestens einen Objekt ausgehende Licht mit dem mindestens einen auslesbaren Detektionspixel des Mikrochips zu detektieren.
Eine Vorrichtung der eingangs genannten Art ist beispielsweise aus der DE 101 33 844 A1 bekannt.
Unter einem Mikrochip im Sinn der vorliegenden Erfindung wird insbesondere ein Mikrochip mit integrierten elektronischen Schaltungen zur Steuerung und Auslese verstanden. Ein solcher Mikrochip könnte beispielsweise auf der CMOS-Technologie basieren.
In der Biologie, Chemie, Pharmazie und Medizin wird unterdessen mit dem Begriff Mikrochip oder Chip üblicherweise ein Träger bezeichnet, auf den Arrays reaktiver Moleküle in hoher Dichte aufgebracht werden und die zum Screening molekularer Objekte bzw. Testsubstanzen genutzt werden. Im Folgenden wird daher der Begriff Chip verwendet, falls ein solcher aus dem Stand der Technik bekannter Träger gemeint ist.
Molekulares Screening mittels DNA, RNA, PNA, Peptiden oder Proteinen, insbesondere auch von Gemischen dieser Substanzen, stellen in der biologischen und biomedizinischen Forschung sowie in der medizinischen Diagnostik mittlerweile unverzichtbare Techniken dar. So können unterschiedliche DNA- und RNA-Sequenzen in hoher Dichte auf einen geeigneten Träger aufgebracht („gespottet”) werden und über automatisierte Auslesegeräte Kopplungsreaktionen an spezifischen Partnern nachgewiesen werden. Als Beispiel seien genannt: Genomarrays zur Charakterisierung unbekannter Genome, cDNA Arrays, Genexpressionsarrays oder Oligonukleotid-Arrays zur Suche nach Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs). Im Gegensatz zu Oligonukleotiden ist die Spot- oder Synthesedichte bei Peptid-Arrays aus technischen Gründen wesentlich geringer. Peptid-, oder genauer Oligopeptid-Arrays können eingesetzt werden zur Charakterisierung von Antikörpern oder Antikörpergemischen, wie z. B. Blutserum, zur Suche nach pharmazeutisch wirksamen Molekülen, die z. B. virale Infektionen blockieren, oder durch die spezifische Bindungen an ein Protein dessen Funktion modulieren.
Bei all diesen Chiptechnologien für molekulares Screening, insbesondere in der Biologie, Biotechnologie, Chemie, Pharmazie und Medizin, ist es üblich, dass nach Aufbringen der (fluoreszenz)markierten Objekte bzw. Testsubstanzen und spezifischer Reaktion mit Trägermolekülen auf dem Chip unspezifisch angelagerte Reaktionspartner weggewaschen werden. Die auf den Chips befindlichen, spezifisch an Träger gebundenen Testsubstanzen werden dann mit einem Mikroskop oder mit einem speziellen Lesegerät auf Basis optischer Mikroskoptechniken ausgelesen bzw. detektiert. Als Beispiele für solche Technologien seien die Peptidarrays der Firma Jerini Biotools, Affymetrix GeneChip oder Abbott-Vysis Genosensor erwähnt.
Die mikroskopbasierten Lesegeräte zeichnen sich durch folgende Komponenten und Eigenschaften aus:

• eine separate Beleuchtungslichtquelle, beispielsweise ein Temperaturstrahler oder eine Gasentladungslampe mit optischem Filter, mit welchem lediglich Licht einer vorgebbaren Wellenlänge bzw. einem vorgebbaren Wellenlängenbereich selektiert wird, um damit angepasst auf das Anregungsspektrum der verwendeten Fluoreszenzmarkierungsstoffe diese zur Fluoreszenzemission anzuregen. Es kann auch ein Laser mit geeigneter Wellenlänge zur Anregung der Fluoreszenzmarkierungsstoffe eingesetzt werden;
• eine Beleuchtungsoptik zur Fokussierung des Anregungslichtes auf die Chipoberfläche, beispielsweise in Form eines Mikroskopobjektivs;
• einen Träger für den Chip nach entsprechender Reaktion mit fluoreszenzmarkierten Objekten bzw. Testsubstanzen;
• eine separate Detektionsoptik mit entsprechenden optischen Filtern zur Separation von Anregungslicht und Fluoreszenzlicht und einer Sammeloptik für das Fluoreszenzlicht;
• einen Photodetektor, vorzugsweise eine fluoreszenzlichtempfindliche CCD-Kamera, zur Umwandlung der elektromagnetischen bzw. optischen Signale in elektrische Signale (mittels des Photoelektrischen Effekts);
• insgesamt hohe Anschaffungs- und Betriebskosten sowie komplexe Handhabung.

Aus den Druckschriften US 6,882,420 B2 und US 2004/0157237 A1 sind jeweils Detektionsverfahren bekannt, mit welchen spezifisch markierte Objekte evaneszent beleuchtet werden. Eine Detektion des Lichts erfolgt hierbei mit Detektoren, wie z. B. mit einer CCD-Kamera.
Ein weiterer Vorteil der beschriebenen Array- bzw. Auslesetechnologie besteht darin, dass auch Signale zweier oder sogar mehrerer unterschiedlicher Fluoreszenzfarbstoffe gleichzeitig analysiert werden können. Damit können z. B. bei der vergleichenden Genomhybridisierung mit Hilfe aufgebrachter DNA-Spots (CGH-Matrixanalyse) zwei Testsubstanzen innerhalb eines Experimentes miteinander verglichen werden, wodurch verlässliche Aussagen über die Bindesignale auch dann möglich werden, wenn die Menge an aufgebrachter DNA pro individuellem Spot von Array zu Array schwankt. Aufgrund der komplizierten Herstellungsverfahren, insbesondere von hochkomplexen Arrays, ist ein solches Schwanken der aufgebrachten Molekülmenge pro Spot sicherlich eher die Regel als die Ausnahme, wodurch ein durch die Fertigungstoleranzen bedingtes Rauschen in der Stärke der Bindungssignale entsteht.
Um trotz dieses Rauschens verlässliche Daten zu erhalten, wird bei der CGH-Matrixanalyse ein komplexes DNA-Gemisch (z. B. als Testsubstanz einer Tumorprobe) mit einem grünen Fluoreszenzfarbstoff markiert und mit einem nah verwandten anderen komplexen DNA-Gemisch (z. B. als Testsubstanz aus Normalgewebe desselben Patienten) verglichen, das mit einem roten Fluoreszenzfarbstoff markiert wurde. Eine Mischung beider markierter DNA-Gemische (Testsubstanzen) ergibt immer dann ein gelbes Signal, wenn gleiche DNA-Mengen in der Tumorprobe und in der Normalgewebsprobe vorhanden sind, die miteinander um die Bindung an eine auf dem Träger aufgebrachte komplementäre genomische DNA-Sequenz kompetitieren. Wenn aber bestimmte Genombereiche der Tumorprobe fehlen oder vervielfältigt wurden, so entsteht ein leicht detektierbares rotes bzw. grünes Signal. Neben der Farbe des Fluoreszenzsignals (rot, gelb oder grün) ist dabei nur wichtig, dass die entsprechenden Genombereiche durch die auf dem Array aufgebrachten komplementären DNA-Sequenzen abgedeckt werden, nicht aber die Intensitäten der einzelnen Signale selbst, die fertigungsbedingt stark schwanken können.
Das hier für die vergleichende Genomhybridisierung beschriebene Prinzip kann natürlich auch für analoge Fragestellungen verwendet werden, indem z. B. das jeweilige Antikörperserum eines Menschen vor und nach einer Immunisierung mit roten bzw. grünen Fluoreszenzfarbstoffen markiert wird (z. B. durch den von der Firma Molecular Probes erhältlichen Xenon Labelling Kit). Wird ein Peptidarray mit einem Gemisch dieser beiden Antikörperseren gefärbt, so würden rot und grün gefärbte Peptidspots für den Impferfolg sehr interessante Unterschiede in den vorliegenden Antikörpern vor und nach der Immunisierung verraten, wobei die erhaltenen Signale – wie für die CGH beschrieben – weitgehend unabhängig von fertigungsbedingten Schwankungen in der aufgebrachten Menge der individuellen Peptide wären. Dieses Prinzip der vergleichenden Bindung von Testsubstanzen an eine Molekülbibliothek kann für alle der oben beschriebenen Testsubstanzen bzw. Objekte angewendet werden (z. B. Virus-, Bakterien- und Zellvarianten, defekte/funktionsfähige extrazelluläre Matrix, Proteingemische nah verwandter Zellen, Allergene, aus arthritischen/gesunden Kniekapseln gewonnene Moleküle etc.), insbesondere aber für nah verwandte Gemische dieser Testsubstanzen. Dabei bietet insbesondere die Firma Molecular Probes eine Vielzahl von Fluoreszenzfarbstoffen an, die sehr einfach an Aminogruppen, OH-Gruppen und Zuckermoleküle koppelbar sind, so dass nahezu alle biologischen Objekte bzw. Testsubstanzen mit Fluoreszenzfarbstoffen umgesetzt werden können.
Ein Nachteil dieser Chiptechnologien und Auslesemethoden besteht in dem relativ hohen gerätetechnischen Aufwand zur externen Detektion der Fluoreszenzsignale auf dem Chip. Durch geometrische und optische Optimierung dieser Auslesegeräte sind die gängigen Chips in Form, Größe und Belegungsdichte festgelegt. Variationen im Chipdesign bedürfen einer kompletten Anpassung der Detektionseinrichtung.
Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren und eine Vorrichtung der eingangs genannten Art anzugeben und weiterzubilden, mit welchem der gerätetechnische Aufwand verringert werden kann und insbesondere eine Miniaturisierung der Arraytechnologie möglich wird.
Das erfindungsgemäße Verfahren der eingangs genannten Art löst die voranstehende Aufgabe durch die Merkmale des Patentanspruchs 1. Danach ist ein solches Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass das mindestens eine Objekt an dem Mikrochip in einer räumlich vorgebbaren Position spezifisch gebunden oder angeordnet wird bzw. ist. Das mindestens eine Objekt wird mit Beleuchtungslicht beaufschlagt, um das mit dem mindestens einen Objekt wechselwirkende Beleuchtungslicht oder das von dem Beleuchtungslicht induzierte und von dem mindestens einen Objekt ausgehende Licht mit dem mindestens einen auslesbaren Detektionspixel des Mikrochips zu detektieren. Das mindestens eine Objekt wird mit Hilfe eines Prismas evaneszent beleuchtet. Das Prisma ist in einem vorgebbaren Abstand relativ zum Mikrochip angeordnet. Beleuchtungslicht wird derart in das Prisma eingekoppelt, dass sich aufgrund der im Prisma erfolgenden Totalreflexion auf der den Objekten zugewandten Seite des Prismas ein evaneszentes Feld ausbildet.
Da das bzw. die Objekte in einer räumlich vorgebbaren Position bzw. in einer räumlich definierten Position an dem Mikrochip spezifisch gebunden bzw. angeordnet sind, ist durch das erfindungsgemäße Verfahren eine pixelkorrelierte Detektion der Objekte möglich. Dies insbesondere deshalb, weil ein Detektionspixel in der Regel das Licht des Objekts detektiert, welches räumlich am geringsten von dem Detektionspixel beabstandet ist. Unter einem Detektionspixel im Sinn der vorliegenden Erfindung ist insbesondere ein Detektionsbereich des Mikrochips zu verstehen, welcher in einem vorgebbaren Abstand von der Mikrochipoberfläche bzw. in einer vorgebbaren Tiefe des Mikrochips angeordnet ist und mit welchem Licht detektierbar ist.
Somit sind Detektionspixel optische Sensoren, wie zum Beispiel Photogates oder Photodioden, welche ein elektrisches Signal erzeugen. Deren Signale können auf demselben Mikrochip während des Auslesevorgangs verstärkt und/oder zeitaufgelöst gemessen werden. Die Messung bzw. der Nachweis der Signale kann durch Digital-Analogwandler oder durch programmierbare Analogschwellen und Diskriminatoren erfolgen. Somit weisen die Detektionspixel elektrische Ladungen bzw. Potentiale auf, die einzeln ausgelesen werden könnten. Es ist also nicht wie bei einer CCD Kamera erforderlich, alle Pixel (z. B. durch Pixelshift) gleichzeitig möglichst genau zu erfassen. Die Auslese und möglicherweise auch die Verstärkung der optischen Signale kann also auch zum Beispiel durch eine Serie von Beleuchtungsereignissen zeilenweise erfolgen. Im Allgemeinen wird eine gruppenweise Auslesung der Detektionspixel bevorzugt.
Grundsätzlich ist es auch denkbar, das Objekt mit einer elektromagnetischen Welle zu beaufschlagen, anstatt es mit Beleuchtungslicht zu beaufschlagen. Dementsprechend wird mit einem Detektionspixel dann die elektromagnetische Welle detektiert, welche mit dem Objekt wechselgewirkt hat. Es ist w eiterhin denkbar,dass eine von der elektromagnetischen Welle induzierte und von dem mindestens einen Objekt ausgehende weitere elektromagnetische Welle mit dem mindestens einen auslesbaren Detektionspixel detektiert wird. Hierauf wird im Folgenden noch weiter eingegangen.
Als Objekte bzw. Testsubstanzen kommen alle Arten von Moleküle in Frage, die in der Biologie, Chemie, Pharmazie und Medizin relevant sind und die insbesondere mit auf dem Mikrochip ortsfest angeordneten Verbindungs- bzw. Anbindungsobjekten eine spezifische Bindung eingehen können. Diese spezifischen Bindungen spielen eine wichtige Rolle bei der Bestimmung der molekularen Eigenschaften der Objekte bzw. Testsubstanzen, aber auch der auf dem Mikrochip gebundenen Verbindungsobjekte, welche beispielsweise in Form von Oligomeren ausgebildet sind. Typische Beispiele solcher Testsubstanzen sind Antikörper, Proteine, Peptide, Enzyme, DNA-, RNA-Moleküle, synthetische Pharmaka und Gemische dieser Stoffe.
Erfindungsgemäß ist erkannt worden, dass der Mikrochip nicht nur als Träger für das bzw. die zu detektierenden Objekte und/oder für die in Frage kommenden Verbindungsobjekte bzw. Anbindungsobjekte dient. Der Mikrochip dient vielmehr auch zur Detektion des Lichts, welches mit dem bzw. den Objekten wechselgewirkt hat oder welches von dem Beleuchtungslicht am Objekt induziert wurde. Wenn man – wie dies eingangs beschrieben – von einer sehr kompakten Packungsdichte der zu detektierenden Objekte auf dem Mikrochip ausgeht, kann mit dem als Träger wirkenden Mikrochip gleichzeitig die Objektdetektion der dicht angeordneten Objekte erfolgen, und zwar ohne hierzu weitere optische Komponenten wie Detektionsoptiken sowie CCD-Kameras vorzusehen. Hierzu muss der Mikrochip bzw. Objektträger nicht relativ zu einer Detektionsoptik (beispielsweise mit einem Mikroskoptisch) bewegt werden, um vollständig ausgelesen zu werden. Die Detektion des vom Objekt kommenden Lichts erfolgt dort, wo sie entsteht und nicht in einer bei der Mikroskopie üblichen Entfernung, wo das zu detektierende Licht eine Vielzahl optischer Bauteile durchlaufen muss, um schließlich z. B. von einem CCD-Chip einer CCD-Kamera mit einer vergleichsweise geringen Quantenausbeute detektiert zu werden. Insoweit ist es auch nicht unbedingt erforderlich, dass – verglichen zur Detektion mit einer CCD-Kamera – mehrere Bilder bzw. Detektionszyklen aufgenommen und gemittelt werden, da Verluste des Detektionslichts durch teilweise Reflexionen an optischen Komponenten wie Linsen usw. bei dem erfindungsgemäßen Verfahren nicht auftreten.
Somit dient der Mikrochip im Sinn der vorliegenden Erfindung nicht wie bei den meisten Arraytechnologien nur als „passiver” Träger, welcher nur die Aufgabe hat, die aufgebrachten Ver-/Anbindungsobjekte, Moleküle bzw. Objekte auf einer im Wesentlichen zweidimensionalen Oberfläche zu verankern.
Insbesondere in den Ausführungsbeispielen, auf welche noch eingegangen wird, wird verdeutlicht, dass durch eine geeignete Kombination von Beleuchtungsoptik, Wahl der Absorptions- bzw. Fluoreszenzmarkierungsstoffe für die Objekte und Aufbau bzw. Anordnung der Photodetektoren hinsichtlich absorbierenden Siliziumschichtdicken, Oberflächenschichten und/oder Dotierungen das erfindungsgemäße Verfahren durchgeführt und optimiert werden kann, wobei dann die oben erwähnten Auslesekomponenten wie Detektionsoptiken und separater Photodetektor entfallen können. Hierdurch kann in vorteilhafter Weise eine große Anzahl unterschiedlicher Objekte, eine entsprechende Markierung und (vorgegebene oder bekannte) Objektpositionierung auf dem Mikrochip vorausgesetzt, in relativ kurzer Zeit detektiert und somit deren Informationsgehalt aufgenommen werden.
Ver-/Anbindungsobjekte und/oder das bzw. die Objekte können auf dem Mikrochip in einer vorgebbaren oder definierten Position auf unterschiedliche Weisen angeordnet bzw. aufgebracht werden. Im Folgenden wird auf bevorzugte Verfahrensschritte eingegangen, mit welchen die Ver-/Anbindungsobjekte bzw. die Objekte auf dem Mikrochip aufgebracht werden können.
So könnten die Ver-/Anbindungsobjekte bzw. die Objekte mittels elektrostatischer Anziehungskräfte auf dem Mikrochip positioniert und dort gebunden werden. Hierzu weist der Mikrochip mindestens einen Elektrodenpixel auf. Ein Elektrodenpixel könnte in Form eines Hochspannungspixels bzw. einer Hochspannungselektrode ausgebildet sein. An einem Elektrodenpixel kann eine Spannung angelegt werden, welche in einem Bereich von 30 bis 100 V liegt. Die Spannung kann positiv oder negativ sein. Ein solcher Mikropixel weist üblicherweise eine Kantenlänge ca. 30–100 μm auf. Der Mikrochip kann somit ca. 10.000 bis 100.000 Pixel/cm² aufweisen. Somit kann in dieser Ausführungsvariante ein Mikrochip zu Grunde liegen, der ein Feld aus Elektrodenpixeln implementiert, deren elektrische Potentiale individuell oder in Gruppen frei programmierbar, d. h. aktivierbar oder deaktivierbar sind. Die Programmierung eines solchen Mikrochips wird über übliche Computerschnittstellen wie I²C, USB oder ähnliche durchgeführt, wobei der Mikrochip die notwendigen Control- und Statusregister implementiert, die durch geeignete Software eines Host- oder Steuer-Rechners (z. B. eines PC) orchestriert bzw. angesteuert werden.
Nun können die Ver-/Anbindungsobjekte oder das mindestens eine Objekt an dem Mikrochip derart angelagert werden, dass selektiv mit dem mindestens einen Elektrodenpixel ein elektrisches Feld erzeugt wird. Dieses elektrische Feld ist in der Regel für die Objekte räumlich begrenzt wirksam. Durch das elektrische Feld wird mindestens ein Objekt oder mindestens ein Ver-/Anbindungsobjekt an einem dem Elektrodenpixel zugeordneten Oberflächenbereich des Mikrochips angelagert. Die Voraussetzung hierfür ist, dass das Objekt oder das Ver-/Anbindungsobjekt elektrisch geladen ist. Hierauf wird im Konkreten bei den Ausführungsbeispielen eingegangen. Unter einer Anlagerung ist insbesondere eine spezifische Anordnung eines Objekts auf dem Mikrochip zu verstehen.
Besonders bevorzugt wird das selektive Anlagern von Verbindungsobjekten wiederholt. Hierdurch werden mehrere Ver-/Anbindungsobjekte pixelweise synthetisiert. Die so synthetisierten Ver-/Anbindungsobjekte dienen zur spezifischen Anlagerung von den zu detektierenden Objekten. Unter einer Synthetisierung kann insbesondere die aus dem Stand der Technik bekannte, die Schutzgruppen basierte kombinatorische (Festphasen-)Synthese von linearen Oligomeren aus Aminosäuren („Merrifield-Synthese”) zu Peptiden bzw. Nukleotiden zu RNA(Ribonukleinsäure)-, oder DNA(Desoxirobonukleinsäure)-Oligomeren verstanden werden, siehe beispielsweise Merrifield R. B. und Stewart J. M., 1965, Automated peptide synthesis, Nature 207, 522–523. Mit derselben Chemie können auch PNA(Peptidnukleinsäure)-Oligomere kombinatorisch in einer gegebenen Sequenz von Nukleinsäuren synthetisiert werden, die chemisch Gemeinsamkeiten mit RNA und DNA aber ein peptidisches Rückgrad (z. B. N-(2-Aminoethyl)glycin) besitzen. In gleicher Weise können auch Oligonukleotide oder Oligoribonukleotide synthetisiert werden.
Diese Art der Aufbringung ist mit dem in der EP 1 140 977 B1 beschriebenen Verfahren zum Aufbringen von Substanzen auf einen Träger vergleichbar. Dort wird ein Verfahren zum Aufbringen von Substanzen auf einen Träger, insbesondere von Monomeren, für die kombinatorische Synthese von Molekülbibliotheken beschrieben, das sich für die kombinatorische Synthese einer Vielzahl von unterschiedlichen Molekülen auf den Elektrodenpixeln eines in Form eines CMOS-Chips gestalteten Mikrochips eignet. Als Moleküle kommen beispielsweise Peptid-Oligomere, DNA-Oligomere, RNA-Oligomere, oder PNA-Oligomere (im Folgenden kurz Oligomere genannt) in Frage. Diese Substanzen beinhalten Aminosäure- oder Nukleotid-Monomere in einem festen Aggregatszustand. Diese Monomerträger können in Form von Mikropartikeln mit einem typischen Durchmesser von 10 μm hergestellt werden und dienen als Transporteinheit für die Monomere auf die Elektrodenpixel des Mikrochips. In der Dissertation von Alexander Nesterov-Müller, Fakultät für Physik und Astronomie der Universität Heidelberg, 2006, werden Verfahren beschrieben, mit welchen die Mikropartikel elektrisch geladen und selektiv, ortsgenau auf die Elektrodenpixel eines Mikrochips aufgebracht werden können. Dabei ist es vorteilhaft, Hochspannungen in der Größenordnung von 30–100 V selektiv an den Elektrodenpixeln anzulegen. Durch die sehr kleinen Dimensionen der Strukturen auf den CMOS-Mikrochips können bei diesen Spannungen sehr große Feldstärken erreicht werden, die nahezu die Durchschlagsspannung an Luft erreichen können. Dies wiederum ist sehr vorteilhaft für die ortsgenaue Positionierung der geladenen Mikropartikel mit Hilfe der an die individuellen Pixel angelegten Spannungen.
Ebenso wird in der EP 1 140 977 B1 ein Verfahren zur Synthese eines trägergebundenen Arrays von Oligomeren beschrieben. Hierzu werden die oben genannten Mikropartikel schichtweise auf den Träger aufgebracht und anschließend geschmolzen. Dadurch werden die Monomere mobilisiert, so dass sie an den Träger koppeln können. Anschließend werden nicht gebundene Stoffe weggewaschen und die nicht permanente Schutzgruppe, wie z. B. Fmoc (bei der Peptid- oder PNA-Synthese) oder Trityl (bei der Oligonukleotidsynthese) abgespalten. Durch zyklische Wiederholung des Verfahrens, z. B. analog zur Standard Merrifield-Synthese, wenden mehrere Schichten von Partikeln aufgebracht und die Oligomere bzw. die Verbindungsobjekte synthetisiert.
Falls in mindestens einem Verfahrensschritt ortsgenau bzw. in einer vorgegebenen Position auf dem Mikrochip Verbindungsobjekte angelagert sind, kann mindestens ein Objekt spezifisch an dem mindestens einen Verbindungsobjekt angelagert werden. Ein solches Objekt könnte beispielsweise einen Antikörper oder ein Antikörpergemisch, Proteine, Peptide, DNA-Moleküle, RNA-Moleküle, PNA-Moleküle, Zuckermoleküle oder bakterielles Lipopolysaccharid aufweisen.
An die an den Mikrochip durch die oben beschriebene Verfahrensschritte gebundene Vielzahl unterschiedlicher (z. B. in Form von Oligomere ausgebildete) Verbindungsobjekte können die zu untersuchenden Testsubstanzen bzw. Objekte spezifisch angebunden werden, indem die Chipoberfläche in geeigneten Inkubationsmedien wie wässrigen Puffer oder ggf. auch mit Hilfe einer Gasphase mit den Testsubstanzen/Objekten in engen Kontakt gebracht werden. Durch geeignete Konfiguration und Kombinatorik der Verbindungsobjekte auf dem Mikrochip können unbekannte Testsubstanzen/Objekte oder Substanzgemische systematisch nach bestimmten molekularen Eigenschaften analysiert werden („molekulares Screening”). Es können aber auch insbesondere bekannte Testsubstanzen dafür verwendet werden, um ein oder mehrere daran bindende Verbindungsobjekte zu finden, die dann z. B. den Eintritt eines Viruspartikels in seine Wirtszelle verhindern. Als einige Anwendungsbeispiele für molekulares Screening seien genannt: Genomscreening oder mRNA-Screening unbekannter Nukleotidsequenzen, DNA-Sequenzierung mit Hilfe von Oligonukleotidarrays, Antikörperscreening in Blutseren, z. B. bei viralen Infektionen, Charakterisierung von Enzymsubstraten, insbesondere von Kinasen oder Phosphatasen, Untersuchungen zu Protein-Peptid Bindungen, Untersuchungen zu molekularen Wechselwirkungen von therapeutischen Pharmaka mit Zelloberflächen und Peptid- oder Proteintargets. Dementsprechend sind die Verbindungsobjekte dann derart ausgebildet, dass daran jeweils die zu untersuchenden Objekte spezifisch binden können.
Weiterhin ist es auch denkbar, den Mikrochip bzw. die Elektrodenarrays chemisch mit funktionellen Gruppen zu belegen, so dass Aminosäuren oder Nukleotide auf den Elektroden angebunden werden können. Dies ist beispielsweise aus der Veröffentlichung von Beyer et al., Biomaterials, 27, 3505–3514, 2005 oder der Dissertation des Herrn Mario Beyer, Fakultät für Chemie, Universität Heidelberg, 2005, bekannt. Ebenso ist es möglich, mindestens ein spezifisches und/oder synthetisiertes Verbindungsobjekt an den funktionellen Gruppen der Mikrochipoberfläche aufzubringen und/oder zu binden. Die Verbindungsobjekte sind hierbei ebenfalls derart ausgebildet, dass daran jeweils die zu untersuchenden Objekte spezifisch binden können. Gemäß dieser Ausführungsform werden also die Verbindungsobjekte nicht auf dem Mikrochip synthetisiert. Dies erfolgt vorab auf einer anderen Art und Weise. Die Objekte und/oder Verbindungsobjekte könnten dann auf dem Mikrochip durch das Spottingverfahren und/oder das Mikromanipulationsverfahren in Form von ortsgenau deponierten Mikrotröpfchen aufgebracht werden und durch eine chemische Kopplung durch entsprechende funktionelle Gruppen mit dem Mikrochip fixiert werden. Diese Aufbringverfahren sind aus dem Stand der Technik bekannt, so dass hier nicht weiter darauf eingegangen wird.
Ein An-/Verbindungsobjekt kann ein reaktives Molekül aufweisen, insbesondere ein Oligomer, ein Peptid-Oligomer, ein DNA-Oligomer oder ein PNA-Oligomer definierter Aminosäure- oder Nukleotidsequenz.
Weiterhin ist es denkbar, dass das mindestens eine Objekt durch Aufbringen einer Folie auf dem Mikrochip positioniert wird. Das mindestens eine Objekt ist hierbei auf der Folie in einer räumlich vorgebbaren Weise positioniert. Diese Positionierung des mindestens einen Objekts auf der Folie könnte mit den oben beschriebenen Verfahren aufgebracht bzw. daran fixiert werden. Das mindestens eine Objekt könnte in einer alternativen Ausführungsform von einem Mittel, beispielsweise einem Gel, zumindest teilweise umgeben sein. Das Mittel ist hierbei derart ausgebildet, dass damit die Relativposition der Objekte im Wesentlichen unverändert bleibt. Das Mittel samt den Objekten kann dann auf den Mikrochip aufgebracht werden.
Das mindestens eine Objekt wird mit Beleuchtungslicht mindestens einer vorgebbaren Wellenlänge oder eines vorgebbaren Wellenlängenbereichs beleuchtet. Die Beleuchtung kann punktuell oder flächenhaft erfolgen. Eine punktuelle Beleuchtung einzelner oder mehrerer Objekte kann mit einem fokussierten Lichtstrahl erfolgen. Es könnte auch der gesamte Mikrochip z. B. mit einem kollimierten Lichtstrahl beleuchtet werden. Der Wellenlängenbereich des Beleuchtungslichts kann sich von 280 nm bis 1000 nm erstrecken, insbesondere vom UV-C bis zum nahen IR.
Falls vom Objekt ausgehendes Lumineszenzlicht detektiert oder nachgewiesen werden soll, ist es wünschenswert, dass kein zur Anregung der Lumineszenz dienendes Beleuchtungslicht zu den Detektionspixeln gelangt. Lediglich das Lumineszenzlicht soll von den Detektionspixeln detektiert werden. Der Mikrochip ist im Allgemeinen derart ausgebildet, dass seine Detektionspixel von der Mikrochipoberfläche beabstandet angeordnet sind, beispielsweise in einer Tiefe von ungefähr 500 bis 1000 nm. Dementsprechend ist bevorzugt vorgesehen, die Objekte derart zu beleuchten, dass das Beleuchtungs- oder Anregungslicht nicht oder nur geringfügig in den Mikrochip eindringt. Dies könnte einerseits durch eine Beleuchtung mittels geeigneter optischer Komponenten realisiert werden. Andererseits könnte durch eine geeignete Wahl der Wellenlänge bzw. des Wellenlängenbereichs des Beleuchtungslichts dessen Eindringtiefe gering gehalten werden, z. B. in der Größenordnung von 100 nm. Grundsätzlich ist bei Siliziumchips die Eindringtiefe bei Licht kurzer Wellenlänge geringer als bei Licht größerer Wellenlänge. Daher könnten mit kurzweiligem UV-Licht im Wesentlichen nur die Mikrochipoberfläche und die lumineszenzmarkierten Testsubstanzen/Objekte beleuchtet werden, nicht aber die Detektionspixel. Das vom Objekt ausgesendete Lumineszezlicht weist jedoch auf Grund des Stokes-Shifts eine größere Wellenlänge auf und besitzt daher eine größere Eindringtiefe in den Mikrochip und kann somit die photosensitive Schicht bzw. die Detektionspixel im Mikrochip erreichen. Durch den photoelektrischen Effekt kann in dem Detektionspixel ein elektrisches Signal (z. B. in Form eines Photostroms) oder ein Ladungsübergang ausgelöst werden. Diese Signale können durch im Chip integrierte elektronische Schaltungen verstärkt, digital aufbereitet und zur Auslese durch einen externen Computer zur Verfügung gestellt werden, so dass die individuellen Objekte detektiert werden können. Hierzu sind in vorteilhafter Weise weder mikroskopische Auslesesysteme noch Bilderkennungssysteme erforderlich.
Das mindestens eine Objekt wird evaneszent beleuchtet. Dies erfolgt mit Hilfe eines Prismas, wobei das Prisma in einem vorgebbaren Abstand relativ zum Mikrochip bzw. zu den Objekten angeordnet ist. Beleuchtungslicht wird nun derart in das Prisma eingekoppelt, dass aufgrund der im Prisma erfolgenden Totalreflexion sich außerhalb des Prismas und auf der dem Mikrochip bzw. den Objekten zugewandten Seite ein evaneszentes Feld ausbildet. Mit diesem evaneszenten Lichtfeld wird das mindestens eine Objekt beleuchtet. Die Intensität des evaneszenten Lichtfelds fällt exponentiell mit dem Abstand von der Grenzfläche des Prismas ab und bei geeigneter Anordnung des Prismas relativ zu dem Mikrochip dringen nachweisbare Intensitäten des Beleuchtungslichts typischerweise weniger als 100 nm von der Oberfläche des Mikrochips in diesen ein. Hierdurch gelangt das Beleuchtungslicht nicht in die Tiefe, in welcher sich die Detektionspixel des Mikrochips befinden. Dementsprechend wird durch eine solche Objektbeleuchtung das Beleuchtungslicht nicht von den Detektionspixeln nachgewiesen. Dagegen kann beispielsweise das vom Objekt ausgehende Fluoreszenzlicht von den Detektionspixeln nachgewiesen werden, da das von den Objekten ausgehende Fluoreszenzlicht eine größere Wellenlänge aufweist und/oder tiefer in den Mikrochip eindringt.
Das Beleuchtungslicht wird mit einer Lichtquelle erzeugt, welche kontinuierliches und/oder gepulstes Licht emittiert. Die Lichtquelle könnte einen Laser, einen Temperaturstrahler oder eine Gasentladungslampe aufweisen. In der Regel werden eine Beleuchtungsoptik und gegebenenfalls weitere optische Komponenten (z. B. Spiegel) vorgesehen sein, mit welcher das von der Lichtquelle emittierte Licht auf den Mikrochip gerichtet oder fokussiert werden kann.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird das Objekt mit gepulstem Licht beleuchtet. Das mindestens eine Detektionspixel wird in einer Beleuchtungspause ausgelesen. Das Beleuchtungslicht gelangt zwar während der Beleuchtungsphase zu den Detektionspixeln, falls dessen Eindringtiefe hoch genug ist. Das während der Beleuchtungsphase ggf. detektierte Signal wird jedoch nicht berücksichtigt. In der Beleuchtungspause gelangt jedoch kein Beleuchtungslicht zu den Detektionspixeln, so dass dann beispielsweise lediglich das von dem Beleuchtungslicht induzierte Lumineszenzlicht (eine ausreichende Lebensdauer des Lumineszenzfarbstoffs vorausgesetzt) von den Detektionspixeln nachgewiesen wenden kann.
Im Konkreten könnten Lumineszenz- oder Fluoreszenzmarkierungsstoffe mit einer Lumineszenz- bzw. Fluoreszenzlebensdauer in der Größenordnung von Millisekunden zur Objektmarkierung verwendet werden. Durch das Abschalten der Detektionspixel bzw. durch das nicht Berücksichtigen der von den Detektionspixeln generierten Signale während der Beleuchtung und das anschließendes Einschalten der Detektionspixel während der zeitverzögerten Fluoreszenzemission wird lediglich das Fluoreszenzlicht nachgewiesen. Somit ist eine Unterscheidung des Beleuchtungslichtes vom Fluoreszenzlicht möglich.
Die zeitliche Synchronisation mit dem Beleuchtungssystem kann mit Hilfe von Referenz-Photosensoren bzw. -Detektionspixeln durch geeignete Pulssequenzen vor oder während der Messung durchgeführt werden, so dass keine externe Synchronisationsinfrastruktur zwischen dem Beleuchtungssystem und dem Mikrochip erforderlich ist. Diese Referenz-Photosensoren können auch verwendet werden, um zeitliche Veränderungen des Beleuchtungssystems zu erfassen und elektronisch zu korrigieren. Auch zu Kalibrierungszwecken – beispielsweise der Beleuchtungsintensitätsverteilung an der Mikrochipoberfläche – können die Signale der Referenz-Photosensoren eingesetzt wenden.
In einer weiteren Ausführungsform wird bzw. ist das Objekt mit einem Absorptionsfarbstoff markiert. Es wird der Anteil des Beleuchtungslichts detektiert, der durch das Objekt und durch den Absorptionsfarbstoff zu dem jeweiligen Detektionspixel gelangt. Hierbei ist es zweckmäßig, das Beleuchtungslicht hinsichtlich seiner spektralen Eigenschaft derart auszuwählen, dass es vom Absorptionsfarbstoff absorbiert wird und dass es eine große Eindringtiefe in den Mikrochip aufweist, damit in denjenigen Detektionspixeln ein elektrisches Signal (z. B. in Form eines Photostroms) ausgelöst wird, die nicht mit absorptionsmarkierten Objekten abgedeckt sind. Die Detektionspixel, die mit absorptionsmarkierten Objekten abgedeckt sind, werden kein oder lediglich ein vernachlässigbares Signal auslösen.
Besonders bevorzugt ist vorgesehen, dass das Objekt mit mindestens einem Lumineszenzfarbstoff spezifisch markiert Ist und/oder dass das Objekt mit mindestens einem lumineszenzfähigen Nanokristall spezifisch markiert ist. Der mindestens eine Lumineszenzfarbstoff wird von dem Beleuchtungslicht zur Lumineszenz angeregt. Das Lumineszenzlicht wird von einem Detektionspixel detektiert. Der Lumineszenzfarbstoff könnte einen Fluoreszenzfarbstoff oder einen Phosphoreszenzfarbstoff aufweisen. Der Nanokristall könnte fluoreszenz- oder lumineszenzfähig sein. Grundsätzlich sind sämtliche, bei der Fluoreszenzmikroskopie üblichen Beleuchtungs- und Detektionsvarianten auch für das erfindungsgemäße Verfahren anwendbar, wobei den Besonderheiten Rechnung zu tragen ist, wie z. B. der Tatsache, dass in dem Mikrochip üblicherweise keine Separationsfilter vorgesehen sind.
So können die Objekte mit Licht absorbierenden Molekülen und/oder Fluoreszenzmolekülen und/oder fluoreszenten Halbleiter-Nanokristallen direkt oder indirekt, d. h. über sekundäre Linkermoleküle wie z. B. Zweitantikörper, markiert wenden. Alternativ können die Objekte bzw. Testsubstanzen vorher gebundene, insbesondere markierte Substanzen verdrängen oder in ihren optischen Eigenschaften modulieren. Beispiele hierfür sind die Abspaltung eines fluoreszenzmarkierten Peptidanteils durch die enzymatische Aktivität einer Protease, oder das Verdrängen eines fluoreszenzmarkierten Antikörpers durch eine kompetitive Bindung der Testsubstanz, wobei der Antikörper spezifisch an das individuelle Oligomer gebunden sein kann, oder aber an einen immer gleichen Fusionsanteil der unterschiedlichen Oligomere bindet, wobei diese Bindung mit der Bindung der Testsubstanz an den variablen Teil des Oligomers kompetitiert. Dieser letztgenannte Punkt hätte den Vorteil, dass die Testsubstanz nicht gesondert markiert werden muss.
Bei den Fluoreszenzfarbstoffen kann es sich um Farbstoffe handeln, welche vorwiegend organische Farbstoffe aufweisen und die in einem definierten Wellenlängenbereich zwischen UV-C (Ultra-Violett-C) und IR (Infrarot) angeregt werden können. Diese Farbstoffe emittieren verglichen zur Wellenlänge des Beleuchtungslichts in einem zum langwelligen verschobenen Wellenlängenbereich („Stokes Shift”). Ein weiteres Charakteristikum zur Identifizierung eines Fluoreszenzfarbstoffes kann auch die Fluoreszenzlebensdauer oder Fluoreszenzabklingzeit des Farbstoffmoleküls sein. Absorptionsfarbstoffe absorbieren dagegen einen Teil des elektromagnetischen Spektrums und setzen diese Energie in nicht-optische Wechselwirkungen um.
Halbleiter-Nanokristalle, kurz als Nanokristalle oder auch als Quantendots bezeichnet, besitzen eine typische Größe von 10 bis 100 nm. Sie bestehen üblicherweise aus dem entsprechenden Halbleitermaterial (z. B. CdSe) als Kern und einer aktivierten und/oder modifizierten Oberfläche zur Bindung an molekulare Partner. Nanokristalle zeichnen sich dadurch aus, dass sie im Gegensatz zu organischen Farbstoffen üblicherweise kein Ausbleichen der Fluoreszenz zeigen. Während das Anregungsspektrum in erster Linie durch Eigenschaften des Kern-Materials der Nanokristalle bestimmt wird, hängt die Fluoreszenzintensität und der Stokes Shift und damit das Spektrum der Fluoreszenzemission neben den Eigenschaften des Materials auch vom hydrodynamischen Radius der Nanokristalle und deren direkter molekularer Umgebung ab. Der hydrodynamische Radius ist der Partikelradius vor einer Anbindung von Bindungsmolekülen. Durch Bindungsmoleküle kann sich der Radius zusätzlich ändern, was jedoch primär keinen Einfluss auf die Fluoreszenzwellenlänge hat.
Dementsprechend kann für bestimmte Applikationen des erfindungsgemäßen Verfahrens vorgesehen sein, dass der Nanokristall einen vorgebbaren hydrodynamischen Radius aufweist und/oder dass der Nanokristall ein vorgebbares Anregungs- und Emissionsspektrum aufweist, welches vorzugsweise einen großen Stokes Shift aufweist. Grundsätzlich weisen Nanokristalle einen Kern aus Halbleitermaterial auf. Alternativ kann der Nanokristall einen Kern aus Lanthanidenmaterial aufweisen, beispielsweise eine Europiumverbindung. Ebenso kann der Nanokristall eine Beschichtung aufweisen, mit welcher ein – vorzugsweise spezifisches – Anbinden des Nanokristalls an einem Objekt begünstigt wird.
Bevorzugt weist der Fluoreszenzfarbstoff einen vorgebbaren – insbesondere hohen – Stokes Shift auf. Ein solcher Fluoreszenzfarbstoff könnte Lanthaniden-Chelat aufweisen.
Der Fluoreszenzfarbstoff oder der fluoreszierende Nanokristall weist bevorzugt eine vorgebbare Fluoreszenzlebensdauer auf. Diese könnte vorzugsweise größer gleich 1 ms sein. Die Objekte sind mit dem Fluoreszenzfarbstoff bzw. dem fluoreszierenden Nanokristall spezifisch markiert. Die Objekte können mit gepulstem Beleuchtungslicht beleuchtet werden und in den Beleuchtungspausen werden die Detektionspixel aktiviert und ausgelesen.
Bevorzugt ist mindestens ein Detektionspixel vorgesehen, mit welchem unmittelbar das Beleuchtungslicht detektiert wird. Anhand des Detektionssignals des Detektionspixels wird festgestellt, ob eine Beleuchtungspause vorliegt. Alternativ oder zusätzlich kann anhand des Detektionssignals des Detektionspixels – beispielsweise zur Kalibrierung – auf die lokale Beleuchtungssituation rückgeschlossen werden, insbesondere auf die lokale Beleuchtungsstärke. Dies wurde schon im Zusammenhang mit am Mikrochip vorgesehenen Referenz-Photosensoren erläutert.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform sind Objekte mit mindestens zwei Fluoreszenzfarbstoffen unterschiedlicher Anregungseigenschaften spezifisch markiert. Für ein vorgebbares Zeitintervall wird einer der Fluoreszenzfarbstoffe mit Beleuchtungslicht einer ersten Anregungswellenlänge zur Fluoreszenz angeregt. Danach wird für ein weiteres vorgebbares Zeitintervall der andere Fluoreszenzfarbstoff mit Beleuchtungslicht einer zweiten, im Allgemeinen von der ersten unterschiedlichen Anregungswellenlänge zur Fluoreszenz angeregt. Das Fluoreszenzlicht der zwei Fluoreszenzfarbstoffe wird zeitlich hintereinander detektiert. Auch hierbei kann das Beleuchtungslicht gepulst sein und die Fluoreszenzfarbstoffe können derart ausgewählt werden, dass diese eine Fluoreszenzlebensdauer besitzen, die groß genug ist, damit das Fluoreszenzlicht in den Beleuchtungspausen noch von den Detektionspixeln nachweisbar ist.
Dieses Verfahren kann bei der vergleichenden Genomhybridisierung angewandt werden. Dafür müssen die verwendeten unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffe durch Anregungslicht unterschiedlicher Wellenlänge anregbar sein, wobei das Anregungslicht wie beschrieben nur eine geringe Eindringtiefe in den Chip erreicht. Das ausgesendete Fluoreszenzlicht wiederum sollte vergleichsweise tief in den Chip eindringen können, so dass es die Detektoreneinheiten erreicht und entsprechend nachgewiesen werden kann.
Eine Alternative zur zeitversetzten Detektion zweier unterschiedlicher Fluoreszenzfarbstoffe kann sein, dass die Objekte mit mindestens zwei Fluoreszenzfarbstoffen unterschiedlicher Emissionseigenschaften spezifisch markiert sind. Die zwei Fluoreszenzfarbstoffe können jedoch aufgrund ihrer Anregungseigenschaften mit Beleuchtungslicht einer vorgegebenen Wellenlänge werden. Dementsprechend können die zwei Fluoreszenzfarbstoffe mit Beleuchtungslicht einer vorgebbaren Wellenlänge gleichzeitig zur Fluoreszenz angeregt werden. Das Fluoreszenzlicht des ersten Fluoreszenzfarbstoffs weist ein Emissionsspektrum mit einer vorgebbaren ersten Eindringtiefe in den Mikrochip auf. Das Fluoreszenzlicht des zweiten Fluoreszenzfarbstoffs weist ein zweites Emissionsspektrum einer vorgebbaren zweiten Eindringtiefe in den Mikrochip auf. Die zwei Fluoreszenzfarbstoffe sind derart gewählt, dass die erste Eindringtiefe größer als die zweite Eindringtiefe ist. Der Detektionsbereich der Detektionspixel ist in mindestens zwei unterschiedlichen Abständen von der Mikrochipoberfläche in dem Mikrochip angeordnet, so dass mit den Detektionspixeln, die weiter von der Mikrochipoberfläche beabstandet sind, das Fluoreszenzlicht des ersten Fluoreszenzfarbstoffs und mit den Detektionspixeln, die weniger weit von der Mikrochipoberfläche beabstandet sind, das Fluoreszenzlicht des zweiten (und ggf. des ersten) Fluoreszenzfarbstoffs detektiert werden.
In den Mikrochip könnten zwar, müssen jedoch keine klassischen optischen Filter oder fokussierende Elemente integriert wenden. Dadurch kann das Auslesen der relevanten Informationen bzw. der detektierten Photonen im Feld mit minimalem Aufwand durchgeführt werden. Die physische Kopplung zwischen individuellem Verbindungsobjekt und zugehörigem Photodetektor bringt eine Datenreduktion bei der Erfassung der individuellen Bindungsereignisse mit sich. Jedem Verbindungsobjekt kann dadurch sehr einfach ein (gemessener) Photostrom zugeordnet werden, so dass auf aufwändige und fehleranfällige Bilderkennungssysteme oder ähnliches verzichtet werden kann. Auch kann hierbei auf Grund der pixelkorrelierten Anordnung der Objekte an dem Mikrochip eine räumliche Zuordnung der detektierten Signale zu den detektierten Objekten weitgehend sichergestellt werden, was bei herkömmlichen mikroskopischen Detektionsverfahren durch ein unter Umständen aufwendiges Alignement der detektierten Signale zu der bekannten Anordnung auf dem Träger berechnet werden muss.
Ganz allgemein könnte das mindestens eine Objekt anstatt mit Beleuchtungslicht mit einer elektromagnetischen Welle beaufschlagt werden. Die mit dem mindestens einen Objekt wechselwirkende elektromagnetische Welle oder eine von der elektromagnetischen Welle induzierte und von dem mindestens einen Objekt ausgehende weitere elektromagnetische Welle könnte dann mit dem mindestens einen auslesbaren Detektionspixel des Mikrochips detektiert werden.
In vorrichtungsmäßiger Hinsicht wird die eingangs genannte Aufgabe durch die Merkmale des Anspruchs 25 gelöst. Demnach ist die eingangs genannte Vorrichtung dadurch gekennzeichnet, dass das mindestens eine Objekt an dem Mikrochip in einer räumlich vorgebbaren Position angeordnet ist und dass das mindestens eine Objekt mit Beleuchtungslicht beaufschlagbar ist, um das mit dem mindestens einen Objekt wechselwirkende Beleuchtungslicht oder das von dem Beleuchtungslicht induzierte und von dem mindestens einen Objekt ausgehende Licht mit dem mindestens einen auslesbaren Detektionspixel des Mikrochips zu detektieren. Das mindestens eine Objekt ist mit Hilfe eines Prismas evaneszent beleuchtbar. Das Prisma ist in einem vorgebbaren Abstand relativ zum Mikrochip angeordnet. Beleuchtungslicht ist derart in das Prisma einkoppelbar, dass sich aufgrund der im Prisma erfolgenden Totalreflexion auf der den Objekten zugewandten Seite des Prismas ein evaneszentes Feld ausbildet.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung verbindet also in vorteilhafter Weise die Funktionsweise eines Objektträgers einerseits, welche – wie bereits oben beschrieben – eine ganz erhebliche Objektdichte auf kleinem Raum ermöglicht. Andererseits können mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung die auf ihr angeordneten Objekte nahezu unmittelbar detektiert bzw. deren Informationsgehalt ausgelesen werden.
Ganz besonders bevorzugt ist die erfindungsgemäße Vorrichtung zum Durchführen eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 24 vorgesehen. Für einen Fachmann erschließt sich in Kenntnis des erfindungsgemäßen Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 24 dessen Durchführung auf einer Vorrichtung gemäß Anspruch 25 weitgehend. Daher wird zur Vermeindung von Wiederholungen auf den vorangegangenen Teil der Beschreibung verwiesen.
Der Mikrochip basiert in einer Ausführungsform auf der MOS-Technologie (Metal Oxide Semiconductor). Bevorzugt wird ein Mikrochip zum Einsatz kommen, der auf der CMOS-Technologie (Complementary Metal Oxide Semiconductor) basiert. Alternativ könnte der Mikrochip oder zumindest ein Teil davon auf der NMOS-Technologie (Negative conducting channel Metal Oxide Semiconductor) und/oder auf der PMOS-Technologie (Positive conducting channel Metal Oxide Semiconductor) basieren. Welche Art von Mikrochip-Technologie zum Einsatz kommt, kann von der konkreten Anwendung abhängen und von der Auswahl des eingesetzten Beleuchtungslichts, der spezifischen Marker und der sonstigen Randbedingungen abhängen.
Die CMOS Technologie erlaubt es, hochkomplexe Mikrochips herzustellen, an deren Oberfläche sich Pixelmatrices befinden können, die aus einer Vielzahl von Hoch- oder Niederspannungselektroden mit einer typischen Kantenlänge von beispielsweise 30 μm bis 100 μm bestehen, so dass 10.000 bis 100.000 Elektrodenpixel/cm² angeordnet werden können. Die Pixelelektroden können einzeln adressiert werden. In oder nahe zu diesen Pixelelektroden können Detektionspixel integriert werden bzw. angeordnet sein und die Photosignale der Detektionspixel bzw. eines aus Detektionspixel bestehenden Pixelarrays können einzeln ausgelesen werden.
Ganz besonders bevorzugt weist ein Detektionspixel eine lichtempfindliche elektronische Einheit auf, insbesondere eine Photodiode oder ein Photogate. Üblicherweise ist die Quantenausbeute eines Photogates geringer als die einer Photodiode. Von den Photogates wird weniger Rauschen verursacht, da dort keine Ladungen durch einen n-p Übergang fließen. Photogates weisen eine exzellente Temperaturstabilität auf. Die Quanteneffizienz ist bei Photodioden größer als bei Photogates. Bei Beleuchtungslicht kurzer Wellenlänge unterhalb 400 nm ist die Quanteneffizienz von Photogates extrem niedrig. Dementsprechend können Photogates beispielsweise für Fluoreszenzanwendungen eingesetzt wenden, falls der Fluoreszenzfarbstoff mit kurzweiligem Beleuchtungslicht angeregt und die Fluoreszenzemission im langweiligen Spektralbereich erfolgt.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform weist der Mikrochip integrierte elektronische Schaltungen zur Ansteuerung und/oder zum Auslesen der Detektionspixel und/oder zum Ansteuern der Elektrodenpixel auf. Die Detektionspixel könnten einzeln oder gruppenweise auslesbar sein. Die Programmierung und Auslese dieses Chips kann über übliche Computerschnittstellen wie I²C, USB oder ähnliche durchgeführt werden, wobei in dem Mikrochip die notwendigen Control- und Statusregister implementiert sein können, die durch geeignete Software eines Host Rechners (z. B. eines PC) orchestriert werden. Es werden hierzu in der Regel keine besonderen Anforderungen an Latenz oder Durchsatz an diese Schnittstelle gestellt. Die ausgelesenen Daten können auf dem Chip in entsprechenden Datenspeichern zwischengespeichert und vom Rechner zeitnah ausgelesen werden. Falls erforderlich, könnte der Mikrochip auch weitergehende Analyseeinheiten aufweisen, welche auf der Hardwareebene realisiert sind. Ein Beispiel hierfür könnte eine hardwaremäßig implementierte digitale Fourieranalyse sein, mit welcher beispielsweise die Autokorelationsfunktion eines Fluoreszenzsignals ausgewertet werden kann. Hierzu ist es dann in vorteilhafter Weise nicht erforderlich, das Fluoreszenzsignal mit einer hohen Zeitauflösung zu digitalisieren und dieses mit einer unter Umständen rechnerintensiven Softwareroutine zu berechnen. Insoweit kann der Mikrochip sowohl Detektions- als auch Auswerteeinheiten aufweisen, so dass im Idealfall der Mikrochip im Wesentlichen nur die gewünschten Ergebnisse an einen Steuerrechner übermittelt.
Ganz besonders bevorzugt weist der Mikrochip mindestens einen Elektrodenpixel auf. Das Elektrodenpixel kann in Form eines Hoch- oder Niederspannungspixels ausgebildet sein. An ihm kam mit einer entsprechenden Ansteuereinrichtung eine positive oder eine negative Spannung angelegt werden, welche vorzugsweise stufenlos einstellbar ist.
Zur Kommunikation mit einem externen Ansteuersystem weist der Mikrochip mindestens eine Ansteuer- und/oder Ausleseschnittstelle auf, welche insbesondere in Form einer I²C (Inter-Integrated-Circuit-Bus) oder einer USB(Universal Serial Bus)-Schnittstelle ausgebildet ist. Grundsätzlich ist auch eine kontaktlose Ausleseschnittstelle möglich, wie dies beispielsweise bei Transpondern zum Einsatz kommt. Somit kann der Mikrochip von einem Steuerrechner angesteuert und/oder ausgelesen werden.
Weiterhin könnte der Mikrochip Mittel zur Verstärkung und/oder Aufbereitung der Signale aufweisen, welche von einem Detektiospixel auslesbar sind. Hierzu könnten im Konkreten auf Halbleitertechnologie basierende Vorverstärker vorgesehen sein, beispielsweise auf PMOS- und/oder NMOS-Technologie basierend.
Der Mikrochip wird mit den oben beschriebenen Objekten und/oder Verbindungsobjekten benetzt bzw. belegt. Diese werden in der Regel in fester Form oder in einer Lösung auf den Mikrochip aufgegeben. Die Objekte und/oder die Verbindungsobjekte können elektrisch leitfähig sein. Daher wird in einer bevorzugten Ausführungsform zur elektrischen Isolierung der Mikrochip mit einer Beschichtung versehen. Diese Beschichtung könnte beispielsweise Silizium-Nitrid aufweisen.
Auf der Isolationsbeschichtung und/oder unmittelbar auf dem Mikrochip könnte eine Schicht aus einem Element der Gattung der Polyethylenglykole oder eine Silanisierungsschicht aufgebracht sein. An einer solchen Schicht sind Verbindungsobjekte und/oder Objekte anlagerbar bzw. chemisch anbindbar. Durch die Silanisierungs- oder Polyethylenglykol-Schicht wird insbesondere das Anbinden von Verbindungsobjekten begünstigt.
Im Folgenden wird im Konkreten auf einige Ausführungsbeispiele des erfindungsgemäßen Verfahrens eingegangen:
In einem ersten Ausführungsbeispiel werden auf die Elektrodenpixel gegebener Größe eines Pixelfeldes des Mikrochips reaktive Moleküle als Verbindungsobjekte synthetisiert oder mit bekannten Techniken gespottet und an der Mikrochipoberfläche durch geeignete chemische Gruppen gebunden. Als reaktive Moleküle bzw. als Verbindungsobjekte kommen insbesondere Oligomere, z. B. Peptid-Oligomere, DNA-Oligomere, PNA-Oligomere definierter Aminosäure- oder Nukleotidsequenz in Frage. Objekte bzw. Testsubstanzen werden mit Standardverfahren mit Fluoreszenzfarbstoffen und/oder Halbleiternanokristallen(-quantendots) eines bestimmten Anregungs- und wellenlängenverschobenen Emissionsspektrums markiert und zur spezifischen Bindung an die reaktiven Moleküle/Verbindungsobjekte auf die Mikrochipoberfläche gegeben. Als Objekte kommen z. B. Antikörper, oder Antikörpergemische, DNA-Moleküle, RNA-Moleküle, Zuckermoleküle (zum Beispiel aus der Extrazellulären Matrix, oder bakterielles Lipopolysaccharid) in Frage. Fluoreszenzfarbstoffe können beispielsweise Fluorescein(derivate), Cyanin(derivate) oder Rhodamin(derivate) sein. Halbleiternanokristallen(-quantendots) können CdSe-Quantendots definierter Größe sein. Nach spezifischer Bindung und Abtrennung ungebundener Testsubstanz (z. B. durch Waschen) wird die Fluoreszenz durch evaneszente Beleuchtung angeregt. Dazu wird beispielsweise in einer bevorzugten Ausführung ein Mikroprisma auf die Chipoberfläche in einem fest vorgegebenen Abstand angeordnet und in Totalreflexion beleuchtet. Durch den exponentiellen Abfall des evaneszenten Feldes der Beleuchtung innerhalb der Dimension einer Wellenlänge dringen nachweisbare Intensitäten des Anregungslichtes typischerweise weniger als 100 nm in die Oberfläche des Mikrochips ein und können so vom Fluoreszenzlicht der Markierungsmoleküle/Halbleiter-Quantendots, welches eine höhere Eindringtiefe besitzt, unterschieden werden. Durch Wahl eines Intervalls des Anregungsspektrums im Blauen oder UV kann dieser Effekt zusätzlich aufgrund der niedrigen Durchlässigkeit von Silizium verstärkt werden.
Gemäß einem zweiten Ausführungsbeispiel werden auf die Elektrodenpixel gegebener Größe eines Pixelfeldes reaktive Moleküle bzw. Verbindungsobjekte synthetisiert oder mit bekannten Techniken gespottet und an der Mikrochipoberfläche durch geeignete chemische Gruppen gebunden. Verbindungsobjekte könnten insbesondere Oligomere, z. B. Peptid-Oligomere, DNA-Oligomere, PNA-Oligomere definierter Aminosäure- oder Nukleotidsequenz sein. Objekte bzw. Testsubstanzen, z. B. Antikörper oder Antikörpergemische, DNA-Moleküle, RNA-Moleküle, Zuckermoleküle (zum Beispiel aus der Extrazellulären Matrix, oder bakterielles Lipopolysaccharid) werden mit Verfahren nach dem Stand der Technik mit Lanthaniden-Chelaten und/oder Lanthaniden-Halbleiternanokristallen(-quantendots) definierter Größe markiert und zur spezifischen Bindung an die reaktiven Moleküle/Verbindungsobjekte auf die Mikrochipoberfläche gegeben. Nach spezifischer Bindung und Abtrennung ungebundener Testsubstanz (z. B. durch Waschen) wird die Fluoreszenz durch fokussierte Fernfeldbeleuchtung mit Beleuchtungslicht im Wellenlängenbereich unter 400 nm angeregt. Die Eindringtiefe in den Mikrochip ist in diesem Wellenlängenbereich kleiner als 100 nm und kann durch entsprechende (dotierte) Siliziumschichten vom eigentlichen Detektionspixel getrennt werden. Die Lanthaniden-Fluoreszenzchelate bzw. Halbleiterquantendots fluoreszieren in einem Wellenlängenbereich über 600 nm, dessen Lichtquanten bis in den Photodetektor des Mikrochips vordringen (typischerweise 1–3 μm) und ein Photosignal bei den Detektionspixeln damit auslösen.
Gemäß einem dritten Ausführungsbeispiel werden Verbindungsobjekte und Objekte gemäß dem ersten oder dem zweiten Ausführungsbeispiel auf den Mikrochip aufgebracht. Nach spezifischer Bindung und Abtrennung ungebundener Testsubstanz (z. B. durch Waschen) wird die Fluoreszenz durch fokussierte Fernfeldbeleuchtung im Wellenlängenbereich unter 400 nm durch eine gepulste Lichtquelle angeregt. Die Fluoreszenzlebensdauer(-abklingzeit) von Lanthaniden-Farbstoffen liegt in der Größenordnung einiger Millisekunden. Dadurch wird es möglich, die Detektionspixel bzw. die Photodetektoren in den Elektrodenpixeln während der Beleuchtung bei hinreichend kurzen Beleuchtungspulsen ab- und anschließend zur zeitverzögerten Fluoreszenzdetektion anzuschalten.
Gemäß einem vierten Ausführungsbeispiel werden Verbindungsobjekte gemäß dem ersten oder dem zweiten Ausführungsbeispiel auf den Mikrochip aufgebracht. Sodann werden zwei unterschiedliche nah verwandte Testsubstanzen 1 und 2 mit jeweils unterschiedlichen Fluoreszenzmolekülen 1 und 2 derivatisiert und in gleichen Mengen gemischt. Nach spezifischer Bindung der Testsubstanzen an den Verbindungsobjekten und Abtrennung ungebundener Testsubstanzen (z. B. durch Waschen) wird die Fluoreszenz 1 durch fokussierte Fernfeldbeleuchtung im Wellenlängenbereich zwischen 300 und 400 nm durch eine gepulste Lichtquelle angeregt und während der Dunkelphase des Anregungslichtes die Fluoreszenzsignale 1 durch den dadurch in den individuellen Detektionspixeln induzierten Photostrom 1 ausgelesen. Anschließend wird die Fluoreszenz 2 durch fokussierte Fernfeldbeleuchtung im Wellenlängenbereich unter 300 nm durch eine gepulste Lichtquelle angeregt und während der Dunkelphase des Anregungslichtes die Fluoreszenzsignale 2, bzw. die dadurch induzierten Photoströme 2 ausgelesen. Anschließend wird der Quotient der Photoströme 1 und 2 für jeden individuellen Detektionspixel berechnet. Dieser Quotient ist ein Maß für das Verhältnis der an die jeweiligen individuellen Verbindungsobjekte gebundenen Testsubstanzen 1 und 2.
Gemäß einem fünften Ausführungsbeispiel werden Verbindungsobjekte und Objekte gemäß dem ersten oder dem zweiten Ausführungsbeispiel auf den Mikrochip aufgebracht. Die Objekte bzw. Testsubstanzen sind mit Verfahren nach dem Stand der Technik mit Absorptionsfarbstoffen markiert und zur spezifischen Bindung an die Verbindungsobjekte auf die Mikrochipoberfläche gegeben. Nach spezifischer Bindung und Abtrennung ungebundener Testsubstanz (z. B. durch Waschen) wird der Mikrochip durch fokussierte Fernfeldbeleuchtung im Wellenlängenbereich über 400 nm beleuchtet. Dadurch wird es möglich, die Detektionspixel ohne gebundene und markierte Testsubstanz zu einem Photosignal anzuregen, während in den Detektionspixeln mit Testsubstanz durch den Absorptionsfarbstoff keine Photoelektronen erzeugt werden können.
Es gibt nun verschiedene Möglichkeiten, die Lehre der vorliegenden Erfindung in vorteilhafter Weise auszugestalten und weiterzubilden. Dazu ist einerseits auf die dem Patentanspruch 1 nachgeordneten Patentansprüche und andererseits auf die nachfolgende Erläuterung der bevorzugten Ausführungsbeispiele der Erfindung anhand der Zeichnung zu verweisen. In Verbindung mit der Erläuterung der bevorzugten Ausführungsbeispiele der Erfindung anhand der Zeichnung werden auch im allgemeinen bevorzugte Ausgestaltungen und Weiterbildungen der Lehre erläutert. In der Zeichnung zeigen jeweils in einer schematischen Darstellung
1 in einer perspektivischen Ansicht ein Ausführungsbeispiel eines Mikrochips, welcher an einen Steuer- und Ausleserechner angeschlossen ist,
2 den Mikrochip aus 1, auf welchem in einem ersten Verfahrensschritt Verbindungsobjekte aufgebracht sind,
3 den Mikrochip aus 2, auf welchem in einem weiteren Verfahrensschritt weitere Verbindungsobjekte aufgebracht sind,
4 in einer Schnittansicht einen Mikrochip, auf welchem Objekte angeordnet sind, welche evaneszent beleuchtet werden,
5 in einer Schnittansicht einen Mikrochip, auf welchem Objekte angeordnet sind, welche flächenhaft zur Fluoreszenzanregung beleuchtet werden,
6 in einer Schnittansicht einen Mikrochip, auf welchem mit einem Absorptionsfarbstoff markierte Objekte angeordnet sind, welche flächenhaft beleuchtet werden und
7 in einer Schnittansicht ein Teil eines Mikrochips.
In den Figuren sind gleiche oder ähnliche Bauteile mit denselben Bezugszeichen gekennzeichnet.
1 zeigt einen Mikrochip 1 auf welchem (in 1 nicht gezeigte) Objekte an einer jeweils vorgegebenen Position aufgebracht und fixiert werden können. Der Mikrochip 1 weist einen Bereich 2 auf, in welchem Detektionspixel 3 angeordnet sind. Als Detektionspixel 3 sind lichtempfindliche elektronische Einheiten vorgesehen, die in Form von Photodioden ausgebildet sind. Der Mikrochip 1 und insbesondere dessen Bereich 2 basiert auf der CMOS-Technologie und ist daher ein elektronischer Halbleiterbaustein. Der Mikrochip 1 ist speziell für die Detektion von biologischen oder chemischen Objekten ausgebildet. Der Mikrochip 1 weist – lediglich schematisch angedeutet – integrierte elektronische Schaltungen 4 zur Ansteuerung bzw. zum Auslesen der Detektionspixel 3 und der weiteren Elemente des Mikrochips 1 auf. Die integrierten elektronischen Schaltungen 4 dienen auch zur Verstärkung und Aufbereitung der von den Detektionspixeln 3 erzeugten Signale. Der Mikrochip 1 umfasst eine Ansteuer- und Ausleseschnittstelle 5, welche ebenfalls schematisch lediglich in Form von Leitungsverbindungen dargestellt ist. Sozusagen auf dem Mikrochip 1 handelt es sich bei der Schnittstelle um eine I²C-Schnittstelle. Der Mikrochip 1 ist mit einem Steuerrechner 6 über die externen Leitungsverbindungen 7 verbunden, welcher den Mikrochip 1 ansteuert und mit welchem die gemessenen Informationen bzw. Signale der Detektionspixel 3 des Mikrochips 1 ausgelesen werden können. Extern zum Steuerrechner 6 ist der Mikrochip 1 über eine USB-Schnittstelle verbunden.
In dem Bereich 2 des Mikrochips 1 ist bei jedem Detektionspixel 3 jeweils ein Elektrodenpixel vorgesehen, welches nicht mit einem eigenen Bezugszeichen gekennzeichnet ist, jedoch verglichen zu den Detektionspixeln 3 näher an der Oberfläche des Mikrochips 1 angeordnet ist. Dementsprechend sind die Detektionspixel 3 weiter von der Oberfläche des Mikrochips 1 beabstandet angeordnet.
2 zeigt den Mikrochip 1 aus 1 in einem Zustand, in welchem eine erste Lage von Verbindungsobjekten 8 auf den Mikrochip 1 bzw. den Bereich 2 spezifisch aufgebracht und dort angebunden sind. Die Verbindungsobjekte 8 sind lediglich schematisch als schwarze Vierecke eingezeichnet. Die Verbindungsobjekte 8 wurden elektrostatisch negativ aufgeladen und sind aus einem Aerosol (verglichen zum Toner beim Laserdrucker bzw. entsprechend der EP 1 140 977 B1 ) auf den Mikrochip 1 aufgebracht worden. Selektiv wurde an den entsprechenden Elektrodenpixeln (im Folgenden in den 1 bis 3 ebenfalls mit dem Bezugszeichen 3 gekennzeichnet) eine Spannung angelegt, so dass sich ein positives elektrisches Feld ausgebildet hat, wodurch die sich im Aerosol befindlichen negativ aufgeladen Verbindungsobjekte 8 an der Oberfläche des Bereichs 2 des Mikrochips 1 und somit in unmittelbarer räumlicher Nähe zu den Elektrodenpixeln 3 angelagert haben. Da der Mikrochip 1 zur elektrischen Isolierung gegenüber dem aufgebrachten Lösungsgemisch mit einer Silizium-Nitrid-Schicht (in den Figuren nicht gezeigt) und hierauf wiederum mit einer die Anlagerung von Verbindungsobjekten 8 begünstigenden Polyethylenglykol-Schicht beschichtet ist, können die Verbindungsobjekte 8 an der jeweiligen Oberfläche fixiert werden. in 3 wunde dieser Verfahrensschritt wiederholt, wobei nunmehr andere Verbindungsobjekte 9 (schraffiert eingezeichnet) in dem Bereich 2 des Mikrochips 1 aufgebracht wurden. Hierbei wurden größtenteils andere Elektrodenpixel 3 aktiviert, so dass an diesen Stellen sich eine erste Lage der Verbindungsobjekte 9 auf der Oberfläche des Mikrochips 1 angelagert haben. An Stellen, welche mit dem Bezugszeichen 10 gekennzeichnet sind, wurden die entsprechenden Elektrodenpixel 3 auch bei diesem Anlagerungsvorgang aktiviert, so dass sich auf das an dieser Stelle angelagerte Verbindungsobjekt 8 eine weitere Lage von Verbindungsobjekten 9 angelagert hat. Nun kann dieser Verfahrensschritt mehrmals wiederholt werden, so dass im Ergebnis an den jeweiligen Elektrodenpixeln bzw. Detektionspixeln sich eine vorgebbare Abfolge von unterschiedlichen Verbindungsobjekten 8, 9 spezifischen angelagert hat.
An diesen spezifischen Abfolgen von Verbindungsobjekten können dann die zu detektierenden Objekte spezifisch angelagert wenden. Ein Verbindungsobjekt kann ein reaktives Molekül aufweisen, beispielsweise ein Oligomer, ein Peptid-Oligomer, ein DNA-Oligomer oder ein PNA-Oligomer definierter Aminosäure- oder Nukleotidsequenz. Ein Objekt kann einen Antikörper oder ein Antikörpergemisch, Proteine, Peptide, DNA-Moleküle, RNA-Moleküle, PNA-Moleküle, Zuckermoleküle oder bakterielles Lipopolysaccharid aufweisen.
In 4 ist ein Teil des Mikrochips 1 in einer Schnittdarstellung gezeigt. Auf den Mikrochip 1 ist mit Positioniermitteln 11 ein Mikroprisma 12 in einem vorgebbaren Abstand D zu Oberfläche 13 des Mikrochips 1 angeordnet. Ebenfalls auf der Oberfläche 13 des Mikrochips 1 ist schematisch die Isolationsbeschichtung und die Schicht mit dem Bezugszeichen 14 gezeigt, welche die synthetisierten Verbindungsobjekte – in den 4 bis 6 mit dem Bezugszeichen 15 gezeigt – enthält und an welchen die zu detektierenden Objekte 16 spezifischen angelagert sind. Es ist ebenfalls lediglich schematisch angedeutet, dass Beleuchtungslicht 17 derart in das Prisma 12 eingekoppelt wird, dass es intern an der der Oberfläche 13 des Mikrochips 1 zugewandten Oberfläche 18 des Mikroprismas 12 total reflektiert wird. Mit den Pfeilen 19 ist das sich auf Grund der Totalreflexion des Beleuchtungslichts 17 ausbildende evaneszente Lichtfeld angedeutet, welches sich in Richtung der Oberfläche 13 des Mikrochips 1 ausbreitet. Die Intensität des evaneszenten Lichts 19 fällt exponenziell mit dem Abstand von der Oberfläche 18 des Prismas 12 ab, so dass das evaneszente Licht 19 jedenfalls die Objekte 16 beleuchtet und ggf. noch geringfügig in den Mikrochip 1 eindringt. Die Objekte 16 sind mit einem Fluoreszenzfarbstoff spezifisch markiert und emittieren auf Grund der Anregung mit dem evaneszenten Licht 19 Fluoreszenzlicht 20. Das Fluoreszenzlicht 20 breitet sich in alle Richtungen aus, es sind jedoch lediglich mit den Pfeilen die Anteile angedeutet, welche von den Detektionspixeln 3 nachgewiesen werden. Die Detektionspixel 3 sind in einem Abstand d von der Oberfläche 13 des Mikrochips 1 angeordnet. Da das Fluoreszenzlicht 20 eine Wellenlänge aufweist, welche größer als die Wellenlänge des Beleuchtungslichts 17 ist, besitzt das Fluoreszenzlicht 20 auch eine größere Eindringtiefe in den Mikrochip 1, so dass das Fluoreszenzlicht 20 von den in dem Abstand d von der Oberfläche 13 des Mikrochips 1 angeordneten Detektionspixeln 3 nachgewiesen werden kann.
5 zeigt in einer Schnittansicht ebenfalls den Mikrochip 1 aus 4, auf welchem ebenfalls Objekte 16 spezifisch angelagert sind. Bei dem Ausführungsbeispiel gemäß 5 werden die Objekte 16 mit Beleuchtungslicht 17 im Wesentlichen flächenhaft beleuchtet. Die Objekte 16 sind mit nicht separat eingezeichneten Nanokristallen spezifisch markiert. Auch in diesem Ausführungsbeispiel werden mit dem Beleuchtungslicht 17, welches eine Wellenlänge von 280 nm aufweist, die Nanokristalle zur Fluoreszenz angeregt. Da das Beleuchtungslicht 17 eine relativ kurze Wellenlänge aufweist, ist seine Eindringtiefe in den Mikrochip 1 nur sehr gering, so dass das Beleuchtungslicht 17 jedenfalls nicht zu den Detektionspixeln 3 gelangen kann. Das Fluoreszenzlicht der Nanokristalle hingegen besitzt eine ausreichende Eindringtiefe (größer als d), so dass das Fluoreszenzlicht 20 von den Detektionspixeln 3 nachgewiesen werden kann. Obwohl dies in 5 nicht dargestellt ist, könnte das Beleuchtungslicht 17 auch auf einzelne Objekte 16 fokussiert werden, so dass diese selektiv angeregt werden können. Bei diesem Ausführungsbeispiel ist es auch möglich, die Objekte 16 mit gepulstem Beleuchtungslicht zur Fluoreszenz anzuregen, wobei lediglich in den Beleuchtungspausen die Detektionspixel 3 ausgelesen bzw. deren Signale nur in den Beleuchtungspausen berücksichtigt werden.
In dem Ausführungsbeispiel gemäß 6 ist im Wesentlichen die gleiche Situation wie in 5 gezeigt. Allerdings sind in diesem Ausführungsbeispiel einige der in 5 gezeigten Objekte 16A mit einem Absorptionsfarbstoff spezifisch markiert. Diese sind dunkler eingezeichnet. Die restlichen Objekte 16 sind nicht mit dem Absorptionsfarbstoff markiert. Die Objekte 16, 16A bzw. der Mikrochip 1 wird mit Beleuchtungslicht 17 beleuchtet. Mit den Pfeilen 20 ist angedeutet, dass das Beleuchtungslicht 17 dann durch die Objekte 16 sich ausbreiten kann, wenn diese nicht mit dem Absorptionsfarbstoff markiert sind. Die entsprechenden Detektionspixel 3, auf welche die jeweiligen Pfeile 20 zeigen, können somit das Beleuchtungslicht 17 detektieren. Das Beleuchtungslicht 17 kann jedoch nicht durch die mit Absorptionsfarbstoff spezifisch markierten Objekte 16A treten, so dass die darunter angeordneten Detektionspixel 3 kein Lichtsignal detektieren können.
7 zeigt in einer Schnittansicht einen Teil des Mikrochips 1, in welchem auch die in 7 nicht explizit gezeigten Detektionspixel 3 angeordnet sind. Rechts neben dem Mikrochip 1 ist eine Skala gezeigt, welche den Abstand Z von der Oberfläche 13 des Mikrochips in μm zeigt. Weiterhin sind bei dem Mikrochip 1 verschiedene Bereiche gezeigt. Mit dem Bezugszeichen 21 ist beispielsweise der PPLUS-, mit 22 der NWELL- und mit 23 der PEPI-Bereich einer Photodiode gezeigt. Die Pfeile 24 bis 29 sollen die Eindringtiefen von Licht jeweils unterschiedlicher Wellenlängen repräsentieren.
Der Pfeil 24 repräsentiert hierbei eine Wellenlänge von ca. 260 nm, der Pfeil 25 eine Wellenlänge von ca. 350 nm, der Pfeil 26 eine Wellenlänge von ca. 480 nm, der Pfeil 27 eine Wellenlänge von ca. 520 nm, der Pfeil 28 eine Wellenlänge von ca. 620 nm und der Pfeil 29 eine Wellenlänge von ca. 750 nm. An der Skala kann abgelesen werden, wie tief das Licht der jeweiligen Wellenlänge in den Mikrochip 1 in das Silizium eindringen kann. Dementsprechend kann durch geeignete Wahl der Wellenlänge des Beleuchtungslichts bei gegebenen Eigenschaften des Mikrochips 1 (z. B. bei einem gegebenen Abstand d der Detektionspixel 3 von der Oberfläche 13 des Mikrochips) ein geeigneter Fluoreszenzfarbstoff ausgewählt werden, mit welchem dann die Objekte 16 spezifisch zu markieren sind, so dass nur das von den Objekten (bzw. das von dem Fluoreszenzfarbstoff, welcher an den Objekten gebunden ist) ausgehende Fluoreszenzlicht bis zu den Detektionspixeln 3 in den Mikrochip eindringen kann, das Beleuchtungs- bzw. Anregungslicht jedoch nicht.

Claims

Verfahren zur Detektion mindestens einer Eigenschaft von mindestens einem Objekt (16, 16A), wobei die Detektion mit einem Mikrochip (1) erfolgt, wobei der Mikrochip (1) mindestens ein auslesbares Detektionspixel (3) aufweist, wobei das mindestens eine Objekt (16, 16A) an dem Mikrochip (1) in einer räumlich vorgebbaren Position angeordnet wird und wobei das mindestens eine Objekt (16, 16A) mit Beleuchtungslicht (17) beaufschlagt wird, um das mit dem mindestens einen Objekt (16, 16A) wechselwirkende Beleuchtungslicht (17) oder das von dem Beleuchtungslicht (17) induzierte und von dem mindestens einen Objekt (16) ausgehende Licht (20) mit dem mindestens einen auslesbaren Detektionspixel (3) des Mikrochips (1) zu detektieren, dadurch gekennzeichnet, dass das mindestens eine Objekt (16, 16A) mit Hilfe eines Prismas (12) evaneszent beleuchtet wird, dass das Prisma (12) in einem vorgebbaren Abstand (D) relativ zum Mikrochip (1) angeordnet ist und dass Beleuchtungslicht (17) derart in das Prisma (12) eingekoppelt wird, dass sich aufgrund der im Prisma erfolgenden Totalreflexion auf der den Objekten (16, 16A) zugewandten Seite des Prismas (12) ein evaneszentes Feld (19) ausbildet.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Mikrochip (1) mindestens einen Elektrodenpixel (3) aufweist, wobei ein Elektrodenpixel (3) in Form eines Hochspannungspixels bzw. einer Hochspannungselektrode ausgebildet sein kann, wobei an einem Elektrodenpixel eine Spannung angelegt werden kann, welche in einem Bereich von 30 bis 100 V liegt.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das mindestens eine Objekt (16, 16A) oder mindestens ein Verbindungsobjekt (8, 9) an dem Mikrochip (1) derart angelagert wird, dass selektiv mit dem mindestens einen Elektrodenpixel (3) ein elektrisches Feld erzeugt wird, wodurch mindestens ein Objekt (16, 16A) oder mindestens ein Verbindungsobjekt (8, 9) an einem dem Elektrodenpixel (3) zugeordneten Oberflächenbereich (13) des Mikrochips (1) angelagert wird.
Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das selektive Anlagern von Verbindungsobjekten (8, 9) wiederholt wird, wodurch mehrere Verbindungsobjekte (15) pixelweise synthetisiert werden.
Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens ein Objekt (16, 16A) spezifisch an dem mindestens einen Verbindungsobjekt (8, 9, 15) angelagert wird, wobei ein Objekt (16, 16A) einen Antikörper darstellen oder aufweisen kann oder wobei Objekte (16, 16A) ein Antikörpergemisch, Proteine, Peptide, DNA-Moleküle, RNA-Moleküle, PNA-Moleküle, Zuckermoleküle oder bakterielles Lipopolysaccharid darstellen oder aufweisen können.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens ein spezifisches und/oder synthetisiertes Verbindungsobjekt (15) an der Mikrochipoberfläche (13) aufgebracht und/oder gebunden werden, dass die Verbindungsobjekte (15) derart ausgebildet sind, dass daran jeweils die zu untersuchenden Objekte (16, 16A) spezifisch binden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass ein Verbindungsobjekt (8, 9, 15) ein reaktives Molekül aufweist, insbesondere ein Oligomer, ein Peptid-Oligomer, ein DNA-Oligomer oder ein PNA-Oligomer definierter Aminosäure- oder Nukleotidsequenz.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass das mindestens eine Objekt (16, 16A) durch Aufbringen einer Folie auf dem Mikrochip (1) positioniert wird, wobei auf der Folie das mindestens eine Objekt (16, 16A) in einer räumlich vorgebbaren Weise positioniert ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass das mindestens eine Objekt (16, 16A) von einem Mittel zumindest teilweise umgeben ist, dass das Mittel derart ausgebildet ist, dass damit die Relativposition der Objekte (16, 16A) zum Mikrochip im Wesentlichen unverändert bleibt und dass das Mittel samt den Objekten (16, 16A) auf den Mikrochip (1) aufgebracht wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass das mindestens eine Objekt (16, 16A) mit Beleuchtungslicht (17) mindestens einer vorgebbaren Wellenlänge oder eines vorgebbaren Wellenlängenbereichs punktuell oder flächenhaft beleuchtet wird, wobei der Wellenlängenbereich sich von 280 nm bis 1000 nm erstrecken kann.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Beleuchtungslicht (17) mit einer Lichtquelle erzeugt wird, welche kontinuierliches und/oder gepulstes Licht emittiert, und dass die Lichtquelle einen Laser, einen Temperaturstrahler oder eine Gasentladungslampe aufweisen kann.
Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass das Objekt (16) mit gepulstem Licht beleuchtet wird und dass das mindestens eine Detektionspixel (3) in einer Beleuchtungspause ausgelesen wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass das Objekt (16A) mit einem Absorptionsfarbstoff markiert ist und dass der Anteil des Beleuchtungslichts detektiert wird, welcher durch das Objekt (16A, 16) zu dem jeweiligen Detektionspixel (3) gelangt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass das Objekt (16) mit mindestens einem Lumineszenzfarbstoff spezifisch markiert ist und/oder dass das Objekt (16) mit mindestens einem lumineszenzfähigen Nanokristall spezifisch markiert ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass der mindestens eine Lumineszenzfarbstoff von dem Beleuchtungslicht zur Lumineszenz angeregt wird und dass das Lumineszenzlicht von einem Detektionspixel (3) detektiert wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass der Lumineszenzfarbstoff einen Fluoreszenzfarbstoff oder einen Phosphoreszenzfarbstoff aufweist und/oder dass der Nanokristall fluoreszenz- oder lumineszenzfähig ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass der Nanokristall einen vorgebbaren hydrodynamischen Radius aufweist und/oder dass der Nanokristall ein vorgebbares Anregungs- und Emissionsspektrum aufweist, welches vorzugsweise einen hohen Stokes Shift aufweist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass der Nanokristall einen ein Halbleitermaterial oder ein Lanthanidenmaterial aufweisenden Kern aufweist, beispielsweise eine Europiumverbindung, und/oder dass der Nanokristall eine Beschichtung aufweist, mit welcher ein – vorzugsweise spezifisches – Anbinden des Nanokristalls an einem Objekt begünstigt wird.
Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass der Fluoreszenzfarbstoff einen vorgebbaren – insbesondere hohen – Stokes Shift aufweist und dass der Fluoreszenzfarbstoff Lanthaniden-Chelat aufweist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 16 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass der Fluoreszenzfarbstoff oder der fluoreszierende Nanokristall eine vorgebbare Fluoreszenzlebensdauer aufweist, welche vorzugsweise größer gleich 1 ms ist, dass die Objekte (16) mit dem Fluoreszenzfarbstoff bzw. dem fluoreszierenden Nanokristall spezifisch markiert sind, dass die Objekte (16) mit gepulstem Beleuchtungslicht beleuchtet werden können und dass in den Beleuchtungspausen die Detektionspixel (3) ausgelesen werden können.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens ein Detektionspixel (3) vorgesehen ist, mit welchem das Beleuchtungslicht (17) detektiert wird, dass anhand des Detektionssignals des Detektionspixels (3) festgestellt wird, ob eine Beleuchtungspause vorliegt und/oder dass anhand des Detektionssignals des Detektionspixels (3) – beispielsweise zur Kalibrierung – auf die lokale Beleuchtungssituation rückgeschlossen werden kann, insbesondere auf die lokale Beleuchtungsstärke.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass die Objekte (16) mit mindestens zwei Fluoreszenzfarbstoffen unterschiedlicher Anregungseigenschaften spezifisch markiert sind, dass für ein vorgebbares Zeitintervall einer der Fluoreszenzfarbstoffe mit Beleuchtungslicht einer ersten Anregungswellenlänge zur Fluoreszenz angeregt wird, dass danach für ein weiteres vorgebbares Zeitintervall der andere Fluoreszenzfarbstoff mit Beleuchtungslicht einer zweiten Anregungswellenlänge zur Fluoreszenz angeregt wird und dass das Fluoreszenzlicht der zwei Fluoreszenzfarbstoffe zeitlich hintereinander detektiert wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass die Objekte (16) mit mindestens zwei Fluoreszenzfarbstoffen unterschiedlicher Emissionseigenschaften spezifisch markiert sind, dass die zwei Fluoreszenzfarbstoffe mit Beleuchtungslicht einer vorgebbaren Wellenlänge zur Fluoreszenz angeregt werden, dass das Fluoreszenzlicht des ersten Fluoreszenzfarbstoffs eine erste vorgebbare Eindringtiefe in den Mikrochip (1) aufweist, dass das Fluoreszenzlicht des zweiten Fluoreszenzfarbstoffs eine zweite vorgebbare Eindringtiefe in den Mikrochip (1) aufweist, dass die erste Eindringtiefe größer als die zweite Eindringtiefe ist und dass der Detektionsbereich der Detektionspixel (3) in mindestens zwei unterschiedlichen Abständen von der Mikrochipoberfläche (13) angeordnet sind, so dass mit den Detektionspixeln (3), die weiter von der Mikrochipoberfläche (13) beabstandet sind, das Fluoreszenzlicht des ersten Fluoreszenzfarbstoffs und mit den Detektionspixeln (3), die weniger weit von der Mikrochipoberfläche (13) beabstandet sind, das Fluoreszenzlicht des zweiten Fluoreszenzfarbstoffs detektiert werden.
Vorrichtung zur Detektion mindestens einer Eigenschaft von mindestens einem Objekt (16, 16A) mit einem Mikrochip (1), welcher mindestens ein auslesbares Detektionspixel (3) aufweist, wobei das mindestens eine Objekt (16, 16A) an dem Mikrochip (1) in einer räumlich vorgebbaren Position angeordnet ist und dass das mindestens eine Objekt (16, 16A) mit Beleuchtungslicht (17) beaufschlagbar ist, um das mit dem mindestens einen Objekt (16, 16A) wechselwirkende Beleuchtungslicht (17) oder das von dem Beleuchtungslicht (17) induzierte und von dem mindestens einen Objekt (16, 16A) ausgehende Licht (20) mit dem mindestens einen auslesbaren Detektionspixel (3) des Mikrochips (1) zu detektieren, dadurch gekennzeichnet, dass das mindestens eine Objekt (16, 16A) mit Hilfe eines Prismas (12) evaneszent beleuchtbar ist, dass das Prisma (12) in einem vorgebbaren Abstand (D) relativ zum Mikrochip (1) angeordnet ist und dass Beleuchtungslicht (17) derart in das Prisma (12) einkoppelbar ist, dass sich aufgrund der im Prisma erfolgenden Totalreflexion auf der den Objekten (16, 16A) zugewandten Seite des Prismas (12) ein evaneszentes Feld (19) ausbildet.
Vorrichtung nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, dass der Mikrochip (1) auf der MOS-Technologie basiert, insbesondere auf der CMOS-Technologie, auf der NMOS-Technologie und/oder auf der PMOS-Technologie.
Vorrichtung nach Anspruch 24 oder 25, dadurch gekennzeichnet, dass ein Detektionspixel (3) eine lichtempfindliche elektronische Einheit aufweist, insbesondere eine Photodiode oder ein Photogate.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 24 bis 26, dadurch gekennzeichnet, dass der Mikrochip (1) integrierte elektronische Schaltungen (4) zur Ansteuerung und/oder zum Auslesen der Detektionspixel (3) und/oder der Elektrodenpixel (3) aufweist und dass die Detektionspixel (3) vorzugsweise einzeln oder gruppenweise auslesbar sind.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 24 bis 27, dadurch gekennzeichnet, dass der Mikrochip (1) mindestens einen Eletrodenpixel (3) aufweist, welcher in Form eines Hoch- oder Niederspannungspixels ausgebildet ist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 24 bis 28, dadurch gekennzeichnet, dass der Mikrochip (1) mindestens eine Ansteuer- und/oder Ausleseschnittstelle (5, 6) aufweist, welche insbesondere in Form einer I²C oder einer USB-Schnittstelle ausgebildet ist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 24 bis 29, dadurch gekennzeichnet, dass der Mikrochip (1) von einem Steuerrechner (6) ansteuerbar und/oder auslesbar ist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 24 bis 30, dadurch gekennzeichnet, dass der Mikrochip (1) Mittel zur Verstärkung und/oder Aufbereitung der Signale aufweist, welche von einem Detektionspixel (3) auslesbar sind.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 24 bis 31, dadurch gekennzeichnet, dass der Mikrochip (1) zur elektrischen Isolierung eine Beschichtung (14) aufweist, welche bevorzugt Silizium-Nitrid aufweist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 24 bis 32, dadurch gekennzeichnet, dass auf dem Mikrochip (1) eine Schicht (14) aufgebracht ist, an welcher Verbindungsobjekte (8, 9, 15) und/oder Objekte (16, 16A) anlagerbar sind, und dass die Schicht (14) insbesondere ein Element der Gattung der Polyethylenglykole oder eine Silanisierungsschicht aufweist.