WO2008065201A2 - Verfahren und vorrichtung zur detektion mindestens einer eigenschaft von mindestens einem objekt mit einem mikrochip - Google Patents

Verfahren und vorrichtung zur detektion mindestens einer eigenschaft von mindestens einem objekt mit einem mikrochip Download PDF

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WO2008065201A2
WO2008065201A2 PCT/EP2007/063110 EP2007063110W WO2008065201A2 WO 2008065201 A2 WO2008065201 A2 WO 2008065201A2 EP 2007063110 W EP2007063110 W EP 2007063110W WO 2008065201 A2 WO2008065201 A2 WO 2008065201A2
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microchip
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light
fluorescent
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Michael Hausmann
Kai KÖNIG
Volker Lindenstruth
Alexander NESTEROV-MÜLLER
Gloria Maria Torralba Collados
Volker Stadler
Yipin Zhang
Ralf Bischoff
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    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G01N2021/6439—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes" with indicators, stains, dyes, tags, labels, marks
    • G01N2021/6441—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes" with indicators, stains, dyes, tags, labels, marks with two or more labels

Definitions

  • the present invention relates to a method and a device for detecting at least one property of at least one object.
  • the detection is done with a microchip.
  • the microchip has at least one readable detection pixel.
  • a microchip in the sense of the present invention is understood in particular to be a microchip with integrated electronic circuits for control and readout.
  • a microchip could be based on CMOS technology.
  • microchip or chip is usually referred to as a carrier on which arrays of reactive molecules are applied in high density and which are used for screening molecular objects or test substances.
  • chip is used if such a carrier known from the prior art is meant.
  • RNA, PNA, peptides or proteins in particular mixtures of these substances, is now indispensable in biological and biomedical research as well as in medical diagnostics.
  • Different DNA and RNA sequences can be detected in high density a suitable carrier can be applied ("spotted") and be detected by automated read-out coupling reactions to specific partners, for example: genome arrays for the characterization of unknown genomes, cDNA arrays, Genexpressionsarrays or oligonucleotide arrays to search for single nucleotide polymorphisms (SNPs).
  • SNPs single nucleotide polymorphisms
  • oligopeptide arrays can be used to characterize antibodies or antibody mixtures, such as blood serum, to search for pharm azeutically active molecules, e.g. block viral infections, or modulate its function by specific binding to a protein.
  • the microscope-based readers are distinguished by the following components and properties: a separate illumination light source, for example a temperature radiator or a gas discharge lamp with an optical filter, with which only light of a predefinable wavelength or a predefinable wavelength range is selected in order to match the excitation spectrum of the used Fluorescent markers to stimulate these fluorescence emission. It is also possible to use a laser with a suitable wavelength for exciting the fluorescent markers;
  • a separate illumination light source for example a temperature radiator or a gas discharge lamp with an optical filter, with which only light of a predefinable wavelength or a predefinable wavelength range is selected in order to match the excitation spectrum of the used Fluorescent markers to stimulate these fluorescence emission. It is also possible to use a laser with a suitable wavelength for exciting the fluorescent markers;
  • An illumination optical system for focusing the excitation light on the chip surface for example in the form of a microscope objective
  • a support for the chip after appropriate reaction with fluorescently labeled objects or test substances • Separate detection optics with corresponding optical filters for the separation of excitation light and fluorescent light and a collecting optics for the fluorescent light;
  • a photodetector preferably a fluorescence-sensitive CCD camera, for converting the electromagnetic or optical signals into electrical signals (by means of the photoelectric effect); • overall high acquisition and operating costs as well as complex handling.
  • Another advantage of the described array or read-out technology is that even signals of two or even several different fluorescent dyes can be analyzed simultaneously.
  • two test substances are compared within an experiment with each other, whereby reliable statements about the binding signals are possible even if the amount of applied DNA per individual spot varies from array to array.
  • CGH matrix analysis labels a complex DNA mixture (eg as test substance of a tumor sample) with a green fluorescent dye and with a closely related other complex DNA mixture (eg as test substance from normal tissue of the same patient ) which has been labeled with a red fluorescent dye.
  • a mixture of both labeled DNA mixtures (Test substances) gives a yellow signal whenever there are equal amounts of DNA in the tumor sample and in the normal tissue sample which compete for binding to a complementary genomic DNA sequence applied to the support.
  • red or green it is only important that the corresponding genome regions are covered by the complementary DNA sequences applied to the array, but not the intensities of the individual signals themselves, which can vary greatly due to production.
  • This principle of comparative binding of test substances to a molecule library can be applied to all of the test substances or objects described above (eg virus, bacterial and cell variants, defective / functional extracellular matrix, protein mixtures of closely related cells, allergens, arthritic / healthy knee capsules recovered molecules, etc.), but especially for closely related mixtures of these test substances.
  • Molecular Probes in particular offers a large number of fluorescent dyes which can be coupled very simply to amino groups, OH groups and sugar molecules, so that almost all biological objects or test substances can be reacted with fluorescent dyes.
  • a disadvantage of these chip technologies and readout methods consists in the relatively high equipment complexity for the external detection of the fluorescence signals on the chip.
  • By geometric and optical optimization of these readout devices the common chips in shape, size and occupancy density are set. Variations in the chip design require a complete adaptation of the detection device.
  • the present invention is therefore an object of the invention to provide a method and an apparatus of the type mentioned and further, with which the equipment complexity can be reduced and in particular a miniaturization of the array technology is possible.
  • the inventive method of the type mentioned above solves the above problem by the features of claim 1. Thereafter, such a method is characterized in that the at least one object is specifically bound to the microchip in a spatially predetermined position or arranged or is. Illumination light is applied to the at least one object in order to detect the illumination light interacting with the at least one object or the light induced by the illumination light and emanating from the at least one object with the at least one readable detection pixel of the microchip.
  • a detection pixel typically detects the light of the object that is spatially least spaced from the detection pixel.
  • a detection pixel in the sense of the present invention is to be understood in particular as meaning a detection region of the microchip which is arranged at a predeterminable distance from the microchip surface or in a prescribable depth of the microchip and with which light can be detected.
  • detection pixels are optical sensors, such as photogates or photodiodes, which generate an electrical signal. Their signals can be amplified and / or time-resolved measured on the same microchip during the read-out process. The measurement or the detection of the signals can be done by digital-to-analog converters or by programmable analog thresholds and discriminators. Thus, the detection pixels have electrical
  • the object in principle, it is also conceivable for the object to be acted upon by an electromagnetic wave, instead of being exposed to illumination light. Accordingly, with a detection pixel then the electromagnetic wave is detected, which has interacted with the object. It is widely conceivable that a further electromagnetic wave induced by the electromagnetic wave and emanating from the at least one object is detected with the at least one readable detection pixel. This will be discussed further below.
  • Suitable objects or test substances are all types of molecules which are relevant in biology, chemistry, pharmacy and medicine and which, in particular, can form a specific bond with connecting or attachment objects fixedly arranged on the microchip. These specific bonds play an important role in determining the molecular properties of the objects or test substances, but also the compound objects bound on the microchip, which are for example in the form of oligomers.
  • Typical examples of such test substances are antibodies, proteins, peptides, enzymes, DNA, RNA molecules, synthetic drugs and mixtures of these substances.
  • the microchip serves not only as a carrier for the object (s) to be detected and / or for the connection objects or attachment objects in question. Rather, the microchip also serves to detect the light which has interacted with the object or objects or which was induced by the illumination light on the object. If one - as described in the beginning - of a very compact
  • Packing density of the objects to be detected on the microchip emanates, with the microchip acting as a carrier, the object detection of the densely arranged objects can be done simultaneously, without providing additional optical components such as detection optics and CCD cameras.
  • the microchip or slide does not have to be moved relative to a detection optical system (for example with a microscope stage) in order to be completely read out.
  • the detection of the light coming from the object takes place where it arises and not in a distance usual in microscopy, where the light to be detected has to pass through a multiplicity of optical components, in order finally to reach e.g. be detected by a CCD chip of a CCD camera with a comparatively low quantum efficiency.
  • Detection cycles are recorded and averaged, since losses of the detection light by partial reflections on optical components such as lenses, etc. do not occur in the inventive method.
  • the microchip unlike most array technologies, serves only as a "passive" carrier, which only has the task of reducing the applied voltage.
  • Anchor objects to anchor molecules or objects on a substantially two-dimensional surface.
  • the inventive Method can be performed and optimized, in which case the above-mentioned readout components such as detection optics and separate photodetector can be omitted.
  • the inventive Method advantageously, a large number of different objects, a corresponding marking and (predetermined or known) object positioning on the microchip provided they are detected in a relatively short time and thus their information content is recorded.
  • Connection objects and / or the object (s) can be arranged or applied on the microchip in a predefinable or defined position in different ways. In the following, preferred method steps will be discussed with which the connection / attachment objects or the objects can be applied to the microchip.
  • connection / attachment objects or the objects could be positioned on the microchip and bound there by means of electrostatic attraction forces.
  • the microchip has at least one electrode pixel.
  • An electrode pixel could be in the form of a high voltage pixel or a high voltage electrode.
  • a voltage can be applied, which is in a range of 30 to 100 V.
  • the tension can be positive or negative.
  • Such a micropixel typically has an edge length of approximately 30-100 ⁇ m.
  • the microchip can thus have approximately 10,000 to 100,000 pixels / cm 2 .
  • this embodiment variant may be based on a microchip which implements a field of electrode pixels whose electrical potentials can be freely programmed individually or in groups, ie can be activated or deactivated.
  • microchip implements the necessary control and status registers which are orchestrated or controlled by suitable software of a host or control computer (eg a PC) become.
  • a host or control computer eg a PC
  • connection / attachment objects or the at least one object can be attached to the microchip such that an electric field is selectively generated with the at least one electrode pixel.
  • This electric field is generally effective for the objects spatially limited.
  • at least one object or at least one connection / attachment object is deposited on a surface region of the microchip associated with the electrode pixel. The prerequisite for this is that the object or the connection / connection object is electrically charged. This will be discussed in detail in the embodiments.
  • An attachment is to be understood as meaning in particular a specific arrangement of an object on the microchip.
  • connection objects are synthesized pixel by pixel to one (possibly more complex and / or specific) connection object.
  • the connection objects thus synthesized serve for the specific attachment of the objects to be detected.
  • the syntheses known from the prior art the protection groups based combinatorial (solid phase) synthesis of linear oligomers of amino acids ("Merrifield synthesis") to peptides or nucleotides to RNA (ribonucleic acid) -, or DNA (deoxyribonucleic acid ) -
  • Merrifield synthesis combinatorial combinatorial (solid phase) synthesis of linear oligomers of amino acids
  • RNA ribonucleic acid
  • DNA deoxyribonucleic acid
  • PNA peptide nucleic acid
  • oligomers can also be synthesized combinatorially in a given sequence of nucleic acids, which chemically have similarities with RNA and DNA but a peptidic backbone (eg, N- (2-aminoethyl) glycine).
  • a peptidic backbone eg, N- (2-aminoethyl) glycine.
  • oligonucleotides or oligoribonucleotides can also be synthesized.
  • These monomer carriers can be prepared in the form of microparticles with a typical diameter of 10 ⁇ m and serve as a transport unit for the monomers to the electrode pixels of the microchip.
  • methods are described, with which the microparticles can be electrically charged and selectively applied to the electrode pixels of a microchip. It is advantageous to apply high voltages of the order of 30-100 V selectively to the electrode pixels. Due to the very small dimensions of the structures on the CMC 1 S microchips, very large field strengths can be achieved at these voltages, which can almost reach the breakdown voltage in air. This, in turn, is very advantageous for locating the charged microparticles with the help of the voltages applied to the individual pixels.
  • EP 1 140 977 B1 describes a process for the synthesis of a carrier-bound array of oligomers.
  • the above-mentioned microparticles are applied in layers to the carrier and then melted. This mobilizes the monomers so that they can couple to the carrier. Subsequently, unbound materials are washed away and the non-permanent protecting group, e.g. Fmoc (in the peptide or PNA synthesis) or trityl (in the oligonucleotide synthesis) cleaved.
  • the non-permanent protecting group e.g. Fmoc (in the peptide or PNA synthesis) or trityl (in the oligonucleotide synthesis
  • connection objects are attached to the microchip with location accuracy or in a predetermined position
  • at least one object can be attached to the microchip at least one connection object are attached.
  • an object could, for example, comprise an antibody or an antibody mixture, proteins, peptides, DNA molecules, RNA molecules, PNA molecules, sugar molecules or bacterial lipopolysaccharide.
  • test substances or objects to be examined which are bound to the microchip by the method steps described above, can be specifically bound by applying the chip surface in suitable incubation media, such as aqueous buffers or possibly also with the aid of a plurality of compound objects (eg in the form of oligomers) Gas phase with the test substances / objects in close contact.
  • suitable incubation media such as aqueous buffers or possibly also with the aid of a plurality of compound objects (eg in the form of oligomers) Gas phase with the test substances / objects in close contact.
  • connection objects By suitable configuration and combination of the connection objects on the microchip, unknown test substances / objects or mixtures of substances can be systematically analyzed for specific molecular properties ("molecular screening"), but especially known test substances can be used to bind one or more binding objects
  • molecular screening may be mentioned: genome screening or mRNA screening of unknown nucleotide sequences, DNA sequencing using oligonucleotide arrays, antibody screening in blood sera, eg in viral infections, characterization of Enzyme substrates, in particular of kinases or phosphatases, studies on protein-peptide bonds, studies on molecular interactions of therapeutic drugs with cell surfaces and peptide or protein targets
  • the connection objects are then designed such that the objects to be examined can each specifically bind thereto.
  • connection objects are likewise designed in such a way that the objects to be examined can each specifically bind thereto.
  • the connection objects are not synthesized on the microchip. This is done in advance in a different way.
  • An An- ⁇ / binding object may comprise a reactive molecule, in particular an oligomer, a peptide oligomer, a DNA oligomer or a PNA oligomer defined amino acid or nucleotide sequence.
  • the at least one object is positioned on the microchip by applying a foil.
  • the at least one object is hereby positioned on the film in a spatially predeterminable manner. This positioning of the at least one object on the film could be applied or fixed by the methods described above.
  • the at least one object could, in an alternative embodiment, be at least partially surrounded by a means, for example a gel.
  • the means is designed such that the relative position of the objects-in particular with one another and / or with respect to the microchip or with respect to the individual detection pixels of the microchip-remains substantially unchanged. The agent together with the objects can then be applied to the microchip.
  • the at least one object is illuminated with illumination light of at least one predeterminable wavelength or a predefinable wavelength range.
  • the lighting can be punctual or areal. Spot illumination of single or multiple objects can be done with a focused light beam. It could also be the entire microchip e.g. be illuminated with a collimated beam of light.
  • the wavelength range of the illumination light can range from 280 nm to 1000 nm, in particular from UV-C to near IR.
  • the microchip is generally designed such that its detection pixels are arranged at a distance from the microchip surface, for example at a depth of approximately 500 to 1000 nm. Accordingly, it is preferably provided to illuminate the objects in such a way that the illumination or excitation light is not or only slightly penetrates into the microchip. On the one hand, this could be realized by illumination by means of suitable optical components. On the other hand, by a suitable choice of the wavelength or the wavelength range of the illumination light, its penetration depth could be kept low, e.g. in the order of magnitude of 100 nm. Basically, with silicon chips, the penetration depth is shorter with light of short wavelength than with light of greater wavelength. Therefore, with entertaining UV light essentially only the
  • the at least one object could be illuminated evanescently.
  • This could e.g. take place with the aid of a prism, wherein the prism is arranged at a predeterminable distance relative to the microchip or to the objects.
  • Illumination light could now be coupled into the prism in such a way that, owing to the total reflection taking place in the prism, an evanescent field is formed outside the prism and on the side facing the microchip or the objects. This evanescent light field illuminates the at least one object.
  • the intensity of the evanescent light field decreases exponentially with the distance from the prism interface, and with proper placement of the prism relative to the microchip, detectable illumination light intensities typically penetrate less than 100 nm from the microchip surface. As a result, the illumination light does not reach the depth in which the detection pixels of the microchip are located. Accordingly, by such object illumination, the illumination light is not detected by the detection pixels.
  • the fluorescent light emanating from the object can be detected by the detection pixels, since the fluorescent light emanating from the objects has a greater wavelength and / or penetrates deeper into the microchip.
  • the illumination light is generated with a light source which emits continuous and / or pulsed light.
  • the light source could comprise a laser, a thermal radiator or a gas discharge lamp.
  • illumination optics and optionally other optical components e.g., mirrors will be provided to direct or focus the light emitted by the light source onto the microchip.
  • the object is illuminated with pulsed light.
  • the at least one detection pixel is read in a lighting pause.
  • the illumination light passes during the illumination phase to the detection pixels, if its penetration depth is high enough.
  • the signal possibly detected during the lighting phase is not taken into account. In the lighting break, however, no illumination light reaches the
  • Detection pixels so that then, for example, only the luminescence light induced by the illumination light (assuming a sufficient life of the luminescent dye) can be detected by the detection pixels.
  • luminescent or fluorescent labels having a luminescent or fluorescence lifetime on the order of milliseconds could be used for object labeling.
  • Fluorescent light detected Thus, a distinction of the illumination light from the fluorescent light is possible.
  • the temporal synchronization with the illumination system can be carried out by means of reference photosensors or detection pixels by means of suitable pulse sequences before or during the measurement, so that no external synchronization infrastructure between the
  • Lighting system and the microchip is required. These reference photosensors can also be used to detect and electronically correct temporal changes in the lighting system. Also for calibration purposes - for example, the illumination intensity distribution on the microchip surface - the signals of the reference photosensors can be used.
  • the object is or is marked with an absorption dye.
  • the proportion of illumination light is detected which passes through the object and through the absorption dye to the respective detection pixel.
  • the absorption dye may be considered after marking with the object as belonging to the object, so that under an interaction of the object with the illumination light in the sense of claim 1, an interaction with the absorption dye can be understood.
  • the detection patches that are covered with absorption-labeled objects will cause no signal or only a negligible signal.
  • a specific absorption detection could also be carried out such that on the microchip a layer is applied, which then changes its optical properties - eg discolored - when it comes in contact with a corresponding reactant.
  • a reactant can each be specifically spatially attached to the surface of the microchip by means of the electrode pixels.
  • Such a layer could, for example, palladium-tungsten, in the concrete Pd-WO 3 , have.
  • Such a layer turns blue on contact with molecular hydrogen, which makes it possible to detect potentially catalytic events with the detection pixels of the microchip, since the discoloration has locally changed the absorption properties of the layer.
  • the dissociative Adsorption of hydrogen leads to the reduction of WO 3 to tungsten bronzes.
  • tungsten oxides of different valences (+5, +6) which have a deep blue color and whose conductivity increases by a factor of more than 106 upon contact with 1% H 2 . Therefore, such layers or films can be used in combination with the detection pixels as optical sensors, wherein the detection sensitivities may be up to 3 ppm. Based on the conductivity of tungsten bronzes, a resistive hydrogen detection can already be realized with the aid of semiconductor structures.
  • the preparation of Pd-WO 3 layers can be carried out either by sol-gel method, by thermal vapor deposition or by sputtering.
  • the object is specifically labeled with at least one luminescent dye and / or that the object is specifically labeled with at least one luminescent nanocrystal.
  • the at least one luminescent dye is of the
  • the luminescent light is detected by a detection pixel.
  • the luminescent dye could comprise a fluorescent dye or a phosphorescent dye.
  • the nanocrystal could be fluorescent or luminescent. In principle, all illumination and detection variants customary in fluorescence microscopy can also be used for the method according to the invention, wherein the
  • the objects can be labeled with light-absorbing molecules and / or fluorescent molecules and / or fluorescent semiconductor nanocrystals directly or indirectly, ie via secondary linker molecules, such as secondary antibodies.
  • the objects or test substances can displace previously bound, in particular labeled substances or modulate their optical properties. Examples include the removal of a fluorescence-labeled peptide portion by the enzymatic activity of a protease, or the displacement of a fluorescently labeled antibody by a competitive binding of the test substance, wherein the antibody may be specifically bound to the individual oligomer, or to an always same fusion portion of the different oligomers which binds with the binding of the test substance to the variable part of the Oligomers competes. This latter point would have the advantage that the test substance need not be marked separately.
  • the fluorescent dyes can be dyes which have predominantly organic dyes and which can be excited in a defined wavelength range between UV-C (ultraviolet C) and IR (infrared). These dyes emit in a wavelength shifted wavelength range ("Stokes shift") compared to the wavelength of the illumination light. "Another characteristic for identifying a fluorescent dye may also be the fluorescence lifetime or fluorescence decay time of the dye molecule.” Absorbance dyes absorb some of the electromagnetic spectrum and set that energy into non-optical interactions.
  • Nanocrystals are typically 10 to 100 nm in size and typically consist of the corresponding semiconductor material (e.g., CdSe) as the core and an activated and / or modified surface for attachment to molecular partners.
  • Nanocrystals are characterized by the fact that, in contrast to organic dyes, they usually do not show any fading of the fluorescence. While the excitation spectrum is determined primarily by the properties of the core material of the nanocrystals, the fluorescence intensity and the Stokes shift and thus the spectrum of the fluorescence emission depend not only on the properties of the material but also on the hydrodynamic radius of the nanocrystals and their direct molecular environment.
  • the hydrodynamic radius is the particle radius before attachment of binding molecules. By binding molecules, the radius may additionally change, but this has primarily no influence on the fluorescence wavelength.
  • the nanocrystal has a predeterminable hydrodynamic radius and / or that the nanocrystal has a predeterminable excitation and emission spectrum, which preferably has a large Stokes shift.
  • nanocrystals have a core
  • the nanocrystal may comprise a core of lanthanide material, for example a eurobium compound.
  • the nanocrystal may have a coating with which a - preferably specific - bonding of the nanocrystal to an object is favored.
  • the fluorescent dye preferably has a predeterminable-in particular high-Stokes shift.
  • Such a fluorescent dye could have lanthanide chelate.
  • the fluorescent dye or the fluorescent nanocrystal preferably has a predefinable fluorescence lifetime. This could preferably be greater than or equal to 1 ms.
  • the objects are specifically labeled with the fluorescent dye or the fluorescent nanocrystal. The objects can be illuminated with pulsed illumination light and in the illumination pauses the detection pixels are activated and read out.
  • At least one detection pixel is provided with which the illumination light is detected directly. On the basis of the detection signal of the detection pixel, it is determined whether there is a lighting pause. Alternatively or additionally, based on the detection signal of the detection pixel - for example, for calibration - to draw conclusions about the local lighting situation, in particular the local illuminance. This has already been explained in the context of microchip reference photosensors.
  • objects are at least two
  • Fluorescent dyes of different excitation properties specifically labeled For a predeterminable time interval, one of the fluorescent dyes is excited to fluorescence with illumination light of a first excitation wavelength. Thereafter, the other fluorescent dye with illumination light of a second, generally different from the first different excitation wavelength to the fluorescence is excited for a further predeterminable time interval.
  • the fluorescent light of the two fluorescent dyes is detected in temporal succession. Again, the illumination light may be pulsed and the fluorescent dyes may be selected such that they have a fluorescence lifetime that is large enough so that the fluorescent light in the illumination breaks is still detectable by the detection pixels.
  • This method can be used in comparative genome hybridization.
  • the different fluorescent dyes used must be excitable by excitation light of different wavelengths, the excitation light as described achieves only a small penetration depth into the chip.
  • the emitted fluorescent light in turn should be able to penetrate relatively deeply into the chip, so that it reaches the detector units and can be detected accordingly.
  • An alternative to the time-delayed detection of two different fluorescent dyes may be that the objects are specifically labeled with at least two fluorescent dyes having different emission properties.
  • the two fluorescent dyes can become a predetermined wavelength due to their excitation characteristics with illumination light. Accordingly, the two fluorescent dyes with illuminating light of a predetermined wavelength can be simultaneously excited to fluoresce.
  • the fluorescent light of the first fluorescent dye has an emission spectrum with a predeterminable first penetration depth into the microchip.
  • the fluorescent light of the second fluorescent dye has a second emission spectrum of a predefinable second penetration depth into the microchip.
  • the two Fluorescent dyes are selected such that the first penetration depth is greater than the second penetration depth.
  • the detection area of the detection pixels is arranged at at least two different distances from the microchip surface in the microchip so that with the detection pixels farther from the microchip surface, the fluorescence light of the first fluorescence dye and with the detection pixels less far from the one
  • Microchip surface are spaced, the fluorescent light of the second (and possibly the first) fluorescent dye are detected.
  • connection object could, but does not need to integrate classical optical filters or focusing elements.
  • the readout of the relevant information or of the detected photons in the field can be carried out with minimal effort.
  • the physical coupling between the individual connection object and the associated photodetector involves data reduction in the detection of individual binding events.
  • Each connection object can thereby be assigned a (measured) photocurrent very simply, so that time-consuming and error-prone image recognition systems or the like can be dispensed with.
  • a spatial assignment of the detected signals to the detected objects can be largely ensured, which is calculated in conventional microscopic detection methods by a possibly complicated Alignement the detected signals to the known arrangement on the carrier got to.
  • the at least one object could be subjected to an electromagnetic wave instead of illumination light.
  • the electromagnetic wave interacting with the at least one object or a further electromagnetic wave induced by the electromagnetic wave and originating from the at least one object could then be detected with the at least one readable detection pixel of the microchip.
  • the device mentioned in the introduction is characterized in that the at least one object is arranged on the microchip in a spatially predeterminable position and / or can be arranged and that the at least one object can be acted upon by illumination light, around the illuminating light interacting with the at least one object or the from the illumination light and induced by the at least one object outgoing light with the at least one readable detection pixel of the microchip to detect.
  • the device according to the invention thus advantageously combines the operation of a slide on the one hand, which - as already described above - allows a very considerable density of objects in a small space.
  • the device according to the invention on her arranged objects detected almost immediately or their information content to be read.
  • the device according to the invention for carrying out a method according to one of claims 1 to 25 is provided.
  • a person skilled in the art will largely be aware of its implementation on a device according to claim 26. Therefore, to avoid repetition, reference is made to the preceding part of the description.
  • the microchip is based in one embodiment on the technology MOS (Metal Oxide Semiconductor).
  • MOS Metal Oxide Semiconductor
  • a microchip will be used, which is based on the CMOS technology (Complementary Metal Oxide Semiconductor).
  • the microchip or at least part of it could be based on the Negative Conducting Channel Metal Oxide Semiconductor (NMOS) technology and / or on the PMOS (Positive Conducting Channel Metal Oxide Semiconductor) technology.
  • NMOS Negative Conducting Channel Metal Oxide Semiconductor
  • PMOS Platinum Conducting Channel Metal Oxide Semiconductor
  • the type of microchip technology used may depend on the specific application and may depend on the choice of illuminating light, specific markers and other boundary conditions.
  • the CMOS technology makes it possible to produce highly complex microchips on the surface of which can be pixel matrices consisting of a plurality of high- or low-voltage electrodes with a typical edge length of, for example, 30 ⁇ m to 100 ⁇ m, such that 10,000 to 100,000 electrode pixels / cm 2 are arranged can be.
  • the pixel electrodes can be addressed individually.
  • Detection pixels can be integrated or arranged in or close to these pixel electrodes and the photosignals of the detection pixels or of a pixel array consisting of detection pixels can be read out individually.
  • a detection pixel comprises a photosensitive electronic unit, in particular a photodiode or a photogate.
  • the quantum efficiency of a photogate is lower than that of a photodiode.
  • the photogates cause less noise because there are no charges flowing through an n-p junction.
  • Photogates have excellent temperature stability. Quantum efficiency is greater for photodiodes than for photogates. With short wavelength illumination light below 400 nm, the quantum efficiency of photogates is extremely low. Accordingly, photogates can be used for example for fluorescence applications, if the fluorescent dye with entertaining
  • Illuminating light is excited and the fluorescence emission takes place in the boring spectral range.
  • the microchip has integrated electronic circuits for controlling and / or reading out the detection pixels and / or for driving the Electrode pixels on.
  • the detection pixels could be read individually or in groups.
  • the programming and reading of this chip can be carried out via standard computer interfaces such as I 2 C, USB or the like, wherein in the microchip the necessary control and status registers can be implemented, which are orchestrated by suitable software of a host computer (eg a PC).
  • a host computer eg a PC
  • the read-out data can be temporarily stored on the chip in corresponding data memories and read out by the computer in a timely manner. If necessary, the microchip could also have further analysis units realized at the hardware level.
  • microchip may have both detection and evaluation units, so that in the ideal case the microchip essentially transmits only the desired results to a control computer.
  • the microchip has at least one electrode pixel.
  • the electrode pixel may be in the form of a high or low voltage pixel.
  • a corresponding drive means a positive or negative voltage to be applied, which is preferably infinitely adjustable.
  • the microchip has at least one
  • Control and / or read-out interface which is designed in particular in the form of an I 2 C (Inter-Integrated Circuit Bus) or a USB (Universal Serial Bus) interface.
  • I 2 C Inter-Integrated Circuit Bus
  • USB Universal Serial Bus
  • a contactless readout interface is also possible, as is the case with transponders, for example.
  • the microchip can be controlled and / or read by a control computer.
  • the microchip could have means for amplifying and / or conditioning the signals which can be read out by a detection pixel.
  • semiconductor based preamplifiers could be provided, for example, based on PMOS and / or NMOS technology.
  • the microchip is wetted or filled with the objects and / or connection objects described above. These are usually given in solid form or in a solution on the microchip.
  • the objects and / or the connection objects may be electrically conductive. Therefore, in a preferred embodiment for electrical isolation of the microchip is provided with a coating.
  • This coating could, for example, comprise silicon nitride.
  • a layer could be provided which has at least one kind of a - especially organic - polymer and / or an element of the genus of polyethylene glycols and / or a silanization layer.
  • the layer preferably has a mixture of these substances.
  • connection objects and / or objects can be added or chemically attached.
  • the silanization or polyethylene glycol layer particularly favors the bonding of connecting objects.
  • the size given to the electrode pixels of a first embodiment the size given to the electrode pixels of a first embodiment
  • reactive molecules or as connecting objects in particular oligomers e.g. Peptide oligomers, DNA oligomers, PNA oligomers defined amino acid or nucleotide sequence in question.
  • Objects or test substances are prepared by standard methods with fluorescent dyes and / or
  • Semiconductor nanocrystals of a particular excitation and wavelength-shifted emission spectrum are labeled and placed on the microchip surface for specific binding to the reactive molecules / compound objects.
  • objects come e.g. Antibodies, or antibody mixtures, DNA molecules, RNA molecules, sugar molecules (for example, from the extracellular matrix, or bacterial lipopolysaccharide) in question.
  • Fluorescent dyes may be, for example, fluorescein (derivatives), cyanine (derivatives) or rhodamine (derivatives).
  • Semiconductor nanocrystals can be CdSe quantum dots of defined size.
  • fluorescence is excited by evanescent illumination.
  • a microprism is arranged on the chip surface at a fixed predetermined distance and illuminated in total reflection. Due to the exponential decay of the evanescent field of illumination within the dimension of a wavelength, detectable intensities of the excitation light typically penetrate less than 100 nm into the surface of the microchip and can thus be differentiated from the fluorescent light of the marker molecules / semiconductor quantum dots having a higher penetration depth.
  • reactive molecules or compound objects are synthesized onto the electrode pixels of given size of a pixel field or spotted by known techniques and bound to the microchip surface by suitable chemical groups.
  • connecting objects could be oligomers, eg peptide oligomers, DNA oligomers, PNA oligomers of defined amino acid or nucleotide sequence.
  • Objects or test substances for example antibodies or antibody mixtures, DNA molecules, RNA molecules, sugar molecules (for example from the extracellular matrix, or bacterial lipopolysaccharide) are prepared by methods according to the prior art with lanthanide chelates and / or lanthanide semiconductor nanocrystals ( - Quantendots) of defined size and added to the specific binding to the reactive molecules / compound objects on the microchip surface.
  • lanthanide chelates and / or lanthanide semiconductor nanocrystals - Quantendots
  • the fluorescence is excited by focused far-field illumination with illumination light in the wavelength range below 400 nm.
  • the penetration depth into the microchip is less than 100 nm in this wavelength range and can be separated from the actual detection pixel by corresponding (doped) silicon layers.
  • the lanthanide fluorescence chelates or semiconductor quantum dots fluoresce in a wavelength range above 600 nm, the light quantum penetrate into the photodetector of the microchip (typically 1 - 3 microns) and thus trigger a photo signal at the detection pixels.
  • connection objects and objects according to the first or the second embodiment are applied to the microchip.
  • fluorescence is excited by focused far-field illumination in the wavelength range below 400 nm by a pulsed light source.
  • the fluorescence lifetime (decay time) of lanthanide dyes is on the order of a few milliseconds. This makes it possible to turn off the detection pixels or the photodetectors in the electrode pixels during illumination with sufficiently short illumination pulses and then to switch on the time-delayed fluorescence detection.
  • connection objects according to the first or the second embodiment are applied to the microchip. Then, two different closely related test substances 1 and 2 are derivatized with respectively different fluorescent molecules 1 and 2 and mixed in equal amounts. After specific binding of the test substances to the connection objects and separation of unbound test substances (eg by washing) the fluorescence 1 is excited by focused far field illumination in the wavelength range between 300 and 400 nm by a pulsed light source and during the dark phase of the excitation light the fluorescence signals 1 by thereby in the individual detection pixels induced photocurrent 1 read out.
  • connection objects and objects according to the first or the second embodiment are applied to the microchip.
  • the objects or test substances are labeled with absorption dyes by prior art methods and applied to the microchip surface for specific binding to the connection objects.
  • the microchip After specific binding and removal of unbound test substance (eg by washing), the microchip is illuminated by focused far-field illumination in the wavelength range above 400 nm. This makes it possible to excite the detection pixels without bound and labeled test substance to a photo signal, while no photoelectrons can be generated in the detection pixels with test substance by the absorption dye.
  • FIG. 1 is a perspective view of an embodiment of a microchip which is connected to a control and read-out computer
  • FIG. 2 shows the microchip from FIG. 1, on which connection objects are applied in a first method step
  • Fig. 3 shows the microchip of Figure 2, on which in another step further
  • FIG. 4 shows a sectional view of a microchip on which objects are arranged, which are illuminated evanescently
  • FIG. 5 is a sectional view of a microchip on which objects are arranged, which are illuminated areally for fluorescence excitation
  • FIG. 6 shows a sectional view of a microchip on which objects marked with an absorption dye are arranged, which are illuminated areally and
  • Fig. 7 is a sectional view of a part of a microchip.
  • FIG. 1 shows a microchip 1 on which objects (not shown in FIG. 1) can be applied and fixed at a respectively predetermined position.
  • the microchip 1 has a region 2 in which detection pixels 3 are arranged.
  • detection pixels 3 light-sensitive electronic units are provided which are in the form of photodiodes.
  • the microchip 1 and in particular its region 2 is based on the CMOS technology and is therefore an electronic semiconductor device.
  • the microchip 1 is specially designed for the detection of biological or chemical objects.
  • the microchip 1 has - only schematically indicated - integrated electronic circuits 4 for driving or for reading the detection pixels 3 and the other elements of the microchip 1 on.
  • the integrated electronic circuits 4 also serve to amplify and condition the signals generated by the detection pixels 3.
  • the microchip 1 comprises a drive and readout interface 5, which is also shown schematically only in the form of line connections. On the microchip 1, so to speak, the interface is an I 2 C interface.
  • the microchip 1 is connected to a control computer 6 via the external line connections 7, which controls the microchip 1 and with which the measured information or signals of the detection pixels 3 of the microchip 1 can be read out. Externally to the control computer 6, the microchip 1 is connected via a USB interface.
  • each detection pixel 3 is provided in each detection pixel 3, which is not identified with its own reference number, but is arranged closer to the surface of the microchip 1 compared to the detection pixels 3. Accordingly, the detection pixels 3 are further spaced from the surface of the microchip 1.
  • FIG. 2 shows the microchip 1 from FIG. 1 in a state in which a first layer of connection objects 8 is specifically applied to the microchip 1 or the region 2 and connected there.
  • the connection objects 8 are shown only schematically as black squares.
  • the connection objects 8 were electrostatically negatively charged and were applied to the microchip 1 from an aerosol (compared to the toner in the laser printer or according to EP 1 140 977 B1).
  • a voltage was selectively applied to the corresponding electrode pixels (also denoted by reference numeral 3 in FIGS. 1 to 3), so that a positive electric field has formed, as a result of which the negatively charged connection objects 8 located in the aerosol are on the surface of area 2 of the
  • Microchips 1 and thus have attached in the immediate vicinity of the electrode pixels 3. Since the microchip 1 is coated with a silicon nitride layer (not shown in the figures) for the purpose of electrical insulation with respect to the applied mixed solution, and again with a polyethylene glycol layer favoring the attachment of connecting objects 8, the connecting objects 8 can be coated on the respective surface be fixed. In FIG. 3, this method step was repeated, whereby now other connection objects 9 (shaded) were applied in the area 2 of the microchip 1. In this case, for the most part, other electrode pixels 3 were activated, so that at these locations a first layer of the connection objects 9 has deposited on the surface of the microchip 1.
  • a compounding object may comprise a reactive molecule, for example an oligomer, a peptide oligomer, a DNA oligomer or a PNA oligomer of defined amino acid or nucleotide sequence.
  • An object may comprise an antibody or an antibody mixture, proteins, peptides, DNA molecules, RNA molecules, PNA molecules, sugar molecules or bacterial lipopolysaccharide.
  • FIG. 4 shows a part of the microchip 1 in a sectional view.
  • a micro prism 12 Positioned on the microchip 1 is a micro prism 12 having a predeterminable distance D from the surface 13 of the microchip 1.
  • the insulating coating and the layer denoted by the reference numeral 14, which contains the synthesized connection objects - shown by the reference numeral 15 in FIGS. 4 to 6 - and to which the objects 16 to be detected are specifically deposited It is also only schematically indicated that illumination light 17 is coupled into the prism 12 in such a way that it is totally reflected internally on the surface 18 of the micro prism 12 facing the surface 13 of the microchip 1.
  • the arrows 19 indicate the evanescent light field forming on the basis of the total reflection of the illumination light 17, which propagates in the direction of the surface 13 of the microchip 1.
  • the intensity of the evanescent light 19 drops exponentially with the distance from the surface 18 of the prism 12, so that the evanescent light 19 in any case illuminates the objects 16 and possibly even slightly penetrates into the microchip 1.
  • the objects 16 are specifically marked with a fluorescent dye and emit fluorescent light 20 due to the excitation with the evanescent light 19.
  • the fluorescent light 20 propagates in all directions, but only the arrows indicate the components detected by the detection pixels 3 become.
  • the detection pixels 3 are arranged at a distance d from the surface 13 of the microchip 1.
  • FIG. 5 also shows, in a sectional view, the microchip 1 from FIG. 4 on which objects 16 are also specifically attached.
  • the objects 16 are illuminated with illuminating light 17 in a substantially planar manner.
  • the objects 16 are specifically marked with nanocrystals not shown separately. Also in this embodiment, with the illumination light 17 having a wavelength of 280 nm, the
  • Nanocrystals excited for fluorescence Since the illumination light 17 has a relatively short wavelength, its penetration into the microchip 1 is only very small, so that the illumination light 17 can not in any case reach the detection pixels 3.
  • the fluorescent light of the nanocrystals has a sufficient penetration depth (greater than d), so that the fluorescent light 20 can be detected by the detection pixels 3.
  • the illumination light 17 could also be focused on individual objects 16 so that they can be selectively excited.
  • FIG. 6 substantially the same situation as in FIG. 5 is shown.
  • some of the objects 16A shown in Figure 5 are specifically marked with an absorption dye. These are drawn darker.
  • the remaining objects 16 are not marked with the absorption dye.
  • the objects 16, 16A and the microchip 1 are illuminated with illumination light 17. With the arrows 20 is indicated that the
  • Illumination light 17 can then propagate through the objects 16, if they are not marked with the absorption dye.
  • the corresponding detection pixels 3, to which the respective arrows 20 point, can thus detect the illumination light 17.
  • the illumination light 17 can not pass through the absorption dye specifically labeled objects 16A, so that the detection pixels 3 located thereunder can not detect a light signal.
  • FIG. 7 shows in a sectional view a part of the microchip 1 in which also the detection pixels 3 not explicitly shown in FIG. 7 are arranged.
  • a scale is shown which shows the distance Z from the surface 13 of the microchip in ⁇ m.
  • 1 different areas are shown in the microchip.
  • reference numeral 21 shows the PPLUS, 22 the NWELL, and 23 the PEPI region of a photodiode.
  • the arrows 24 to 29 are intended to represent the penetration depths of light of different wavelengths.
  • the arrow 24 represents a wavelength of approximately 260 nm, the arrow 25 a wavelength of approximately 350 nm, the arrow 26 a wavelength of approximately 480 nm, the arrow 27 a wavelength of approximately 520 nm, and the arrow 28 a Wavelength of about 620 nm and the arrow 29 has a wavelength of about 750 nm. On the scale can be read, how deep the light of the respective wavelength in the microchip into the silicon can penetrate.
  • a suitable fluorescent dye can be selected with which the objects 16 are to be specifically marked that only the fluorescent light emitted by the objects (or by the fluorescent dye which is bound to the objects) can penetrate into the microchip as far as the detection pixels 3, but not the illumination or excitation light.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Detektion mindestens einer Eigenschaft von mindestens einem Objekt (16). Die Detektion erfolgt mit einem Mikrochip (1). Der Mikrochip (1) weist mindestens einen auslesbaren Detektionspixel (3) auf. Zum Verringern des gerätetechnischen Aufwands bei der Objektdetektion ist das erfindungsgemäße Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass das mindestens eine Objekt (16) an dem Mikrochip (1) in einer räumlich vorgebbaren Position angeordnet wird. Das mindestens eine Objekt (16) wird mit Beleuchtungslicht (17, 19) beaufschlagt, um das mit dem mindestens einen Objekt (16) wechselwirkende Beleuchtungslicht (17, 19) oder das von dem Beleuchtungslicht (17, 19) induzierte und von dem mindestens einen Objekt ausgehende Licht (20) mit dem mindestens einen auslesbaren Detektionspixel (3) des Mikrochips (1) zu detektieren.

Description

"Verfahren und Vorrichtung zur Detektion mindestens einer Eigenschaft von mindestens einem Objekt mit einem Mikrochip"
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Detektion mindestens einer Eigenschaft von mindestens einem Objekt. Die Detektion erfolgt mit einem Mikrochip. Der Mikrochip weist mindestens einen auslesbaren Detektionspixel auf.
Unter einem Mikrochip im Sinn der vorliegenden Erfindung wird insbesondere ein Mikrochip mit integrierten elektronischen Schaltungen zur Steuerung und Auslese verstanden. Ein solcher Mikrochip könnte beispielsweise auf der CMOS-Technologie basieren.
In der Biologie, Chemie, Pharmazie und Medizin wird unterdessen mit dem Begriff Mikrochip oder Chip üblicherweise ein Träger bezeichnet, auf den Arrays reaktiver Moleküle in hoher Dichte aufgebracht werden und die zum Screening molekularer Objekte bzw. Testsubstanzen genutzt werden. Im Folgenden wird daher der Begriff Chip verwendet, falls ein solcher aus dem Stand der Technik bekannter Träger gemeint ist.
Molekulares Screening mittels DNA, RNA, PNA, Peptiden oder Proteinen, insbesondere auch von Gemischen dieser Substanzen, stellen in der biologischen und biomedizinischen Forschung sowie in der medizinischen Diagnostik mittlerweile unverzichtbare Techniken dar. So können unterschiedliche DNA- und RNA-Seguenzen in hoher Dichte auf einen geeigneten Träger aufgebracht („gespottet") werden und über automatisierte Auslesegeräte Kopplungsreaktionen an spezifischen Partnern nachgewiesen werden. Als Beispiel seien genannt: Genomarrays zur Charakterisierung unbekannter Genome, cDNA Arrays, Genexpressionsarrays oder Oligonukleotid-Arrays zur Suche nach Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs). Im Gegensatz zu Oligonukleotiden ist die Spot- oder Synthesedichte bei Peptid-Arrays aus technischen Gründen wesentlich geringer. Peptid-, oder genauer Oligopeptid-Arrays können eingesetzt werden zur Charakterisierung von Antikörpern oder Antikörpergemischen, wie z.B. Blutserum, zur Suche nach pharmazeutisch wirksamen Molekülen, die z.B. virale Infektionen blockieren, oder durch die spezifische Bindungen an ein Protein dessen Funktion modulieren.
Bei all diesen Chiptechnologien für molekulares Screening, insbesondere in der Biologie, Biotechnologie, Chemie, Pharmazie und Medizin, ist es üblich, dass nach Aufbringen der (fluoreszenz)markierten Objekte bzw. Testsubstanzen und spezifischer Reaktion mit Trägermolekülen auf dem Chip unspezifisch angelagerte Reaktionspartner weggewaschen werden. Die auf den Chips befindlichen, spezifisch an Träger gebundenen Testsubstanzen werden dann mit einem Mikroskop oder mit einem speziellen Lesegerät auf Basis optischer Mikroskoptechniken ausgelesen bzw. detektiert. Als Beispiele für solche Technologien seien die Peptidarrays der Firma Jerini Biotools, Affymetrix GeneChip oder Abbott-Vysis Genosensor erwähnt.
Die mikroskopbasierten Lesegeräte zeichnen sich durch folgende Komponenten und Eigenschaften aus: • eine separate Beleuchtungslichtquelle, beispielsweise ein Temperaturstrahler oder eine Gasentladungslampe mit optischem Filter, mit welchem lediglich Licht einer vorgebbaren Wellenlänge bzw. einem vorgebbaren Wellenlängenbereich selektiert wird, um damit angepasst auf das Anregungsspektrum der verwendeten Fluoreszenzmarkierungsstoffe diese zur Fluoreszenzemission anzuregen. Es kann auch ein Laser mit geeigneter Wellenlänge zur Anregung der Fluoreszenzmarkierungsstoffe eingesetzt werden;
• eine Beleuchtungsoptik zur Fokussierung des Anregungslichtes auf die Chipoberfläche, beispielsweise in Form eines Mikroskopobjektivs;
• einen Träger für den Chip nach entsprechender Reaktion mit fluoreszenzmarkierten Objekten bzw. Testsubstanzen; • eine separate Detektionsoptik mit entsprechenden optischen Filtern zur Separation von Anregungslicht und Fluoreszenzlicht und einer Sammeloptik für das Fluoreszenzlicht;
• einen Photodetektor, vorzugsweise eine fluoreszenzlichtempfindliche CCD-Kamera, zur Umwandlung der elektromagnetischen bzw. optischen Signale in elektrische Signale (mittels des Photoelektrischen Effekts); • insgesamt hohe Anschaffungs- und Betriebskosten sowie komplexe Handhabung.
Ein weiterer Vorteil der beschriebenen Array- bzw. Auslesetechnologie besteht darin, dass auch Signale zweier oder sogar mehrerer unterschiedlicher Fluoreszenzfarbstoffe gleichzeitig analysiert werden können. Damit können z.B. bei der vergleichenden Genomhybridisierung mit Hilfe aufgebrachter DNA-Spots (CGH-Matrixanalyse) zwei Testsubstanzen innerhalb eines Experimentes miteinander verglichen werden, wodurch verlässliche Aussagen über die Bindesignale auch dann möglich werden, wenn die Menge an aufgebrachter DNA pro individuellem Spot von Array zu Array schwankt. Aufgrund der komplizierten Herstellungsverfahren, insbesondere von hochkomplexen Arrays, ist ein solches Schwanken der aufgebrachten Molekülmenge pro Spot sicherlich eher die Regel als die Ausnahme, wodurch ein durch die Fertigungstoleranzen bedingtes Rauschen in der Stärke der Bindungssignale entsteht.
Um trotz dieses Rauschens verlässliche Daten zu erhalten, wird bei der CGH-Matrixanalyse ein komplexes DNA-Gemisch (z.B. als Testsubstanz einer Tumorprobe) mit einem grünen Fluoreszenzfarbstoff markiert und mit einem nah verwandten anderen komplexen DNA-Gemisch (z.B. als Testsubstanz aus Normalgewebe desselben Patienten) verglichen, das mit einem roten Fluoreszenzfarbstoff markiert wurde. Eine Mischung beider markierten DNA-Gemische (Testsubstanzen) ergibt immer dann ein gelbes Signal, wenn gleiche DNA-Mengen in der Tumorprobe und in der Normalgewebsprobe vorhanden sind, die miteinander um die Bindung an eine auf dem Träger aufgebrachte komplementäre genomische DNA-Sequenz kompetitieren. Wenn aber bestimmte Genombereiche der Tumorprobe fehlen oder vervielfältigt wurden, so entsteht ein leicht detektierbares rotes bzw. grünes Signal. Neben der Farbe des Fluoreszenzsignals (rot, gelb oder grün) ist dabei nur wichtig, dass die entsprechenden Genombereiche durch die auf dem Array aufgebrachten komplementären DNA-Sequenzen abgedeckt werden, nicht aber die Intensitäten der einzelnen Signale selbst, die fertigungsbedingt stark schwanken können.
Das hier für die vergleichende Genomhybridisierung beschriebene Prinzip kann natürlich auch für analoge Fragestellungen verwendet werden, indem z.B. das jeweilige Antikörperserum eines
Menschen vor und nach einer Immunisierung mit roten bzw. grünen Fluoreszenzfarbstoffen markiert wird (z.B. durch den von der Firma Molecular Probes erhältlichen Xenon Labelling Kit). Wird ein Peptidarray mit einem Gemisch dieser beiden Antikörperseren gefärbt, so würden rot und grün gefärbte Peptidspots für den Impferfolg sehr interessante Unterschiede in den vorliegenden Antikörpern vor und nach der Immunisierung verraten, wobei die erhaltenen Signale - wie für die CGH beschrieben - weitgehend unabhängig von fertigungsbedingten Schwankungen in der aufgebrachten Menge der individuellen Peptide wären. Dieses Prinzip der vergleichenden Bindung von Testsubstanzen an eine Molekülbibliothek kann für alle der oben beschriebenen Testsubstanzen bzw. Objekte angewendet werden (z.B. Virus-, Bakterien- und Zellvarianten, defekte / funktionsfähige extrazelluläre Matrix, Proteingemische nah verwandter Zellen, Allergene, aus arthritischen / gesunden Kniekapseln gewonnene Moleküle etc.), insbesondere aber für nah verwandte Gemische dieser Testsubstanzen. Dabei bietet insbesondere die Firma Molecular Probes eine Vielzahl von Fluoreszenzfarbstoffen an, die sehr einfach an Aminogruppen, OH-Gruppen und Zuckermoleküle koppelbar sind, so dass nahezu alle biologischen Objekte bzw. Testsubstanzen mit Fluoreszenzfarbstoffen umgesetzt werden können.
Ein Nachteil dieser Chiptechnologien und Auslesemethoden besteht in dem relativ hohen gerätetechnischen Aufwand zur externen Detektion der Fluoreszenzsignale auf dem Chip. Durch geometrische und optische Optimierung dieser Auslesegeräte sind die gängigen Chips in Form, Größe und Belegungsdichte festgelegt. Variationen im Chipdesign bedürfen einer kompletten Anpassung der Detektionseinrichtung.
Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren und eine Vorrichtung der eingangs genannten Art anzugeben und weiterzubilden, mit welchem der gerätetechnische Aufwand verringert werden kann und insbesondere eine Miniaturisierung der Arraytechnologie möglich wird. Das erfindungsgemäße Verfahren der eingangs genannten Art löst die voranstehende Aufgabe durch die Merkmale des Patentanspruchs 1. Danach ist ein solches Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass das mindestens eine Objekt an dem Mikrochip in einer räumlich vorgebbaren Position spezifisch gebunden oder angeordnet wird bzw. ist. Das mindestens eine Objekt wird mit Beleuchtungslicht beaufschlagt, um das mit dem mindestens einen Objekt wechselwirkende Beleuchtungslicht oder das von dem Beleuchtungslicht induzierte und von dem mindestens einen Objekt ausgehende Licht mit dem mindestens einen auslesbaren Detektionspixel des Mikrochips zu detektieren.
Da das bzw. die Objekte in einer räumlich vorgebbaren Position bzw. in einer räumlich definierten Position an dem Mikrochip spezifisch gebunden bzw. angeordnet sind, ist durch das erfindungsgemäße Verfahren eine pixelkorrelierte Detektion der Objekte möglich. Dies insbesondere deshalb, weil ein Detektionspixel in der Regel das Licht des Objekts detektiert, welches räumlich am geringsten von dem Detektionspixel beabstandet ist. Unter einem Detektionspixel im Sinn der vorliegenden Erfindung ist insbesondere ein Detektionsbereich des Mikrochips zu verstehen, welcher in einem vorgebbaren Abstand von der Mikrochipoberfläche bzw. in einer vorgebbaren Tiefe des Mikrochips angeordnet ist und mit welchem Licht detektierbar ist.
Somit sind Detektionspixel optische Sensoren, wie zum Beispiel Photogates oder Photodioden, welche ein elektrisches Signal erzeugen. Deren Signale können auf demselben Mikrochip während des Auslesevorgangs verstärkt und/oder zeitaufgelöst gemessen werden. Die Messung bzw. der Nachweis der Signale kann durch Digital-Analogwandler oder durch programmierbare Analogschwellen und Diskriminatoren erfolgen. Somit weisen die Detektionspixel elektrische
Ladungen bzw. Potentiale auf, die einzeln ausgelesen werden könnten. Es ist also nicht wie bei einer CCD Kamera erforderlich, alle Pixel (z.B. durch Pixelshift) gleichzeitig möglichst genau zu erfassen. Die Auslese und möglicherweise auch die Verstärkung der optischen Signale kann also auch zum Beispiel durch eine Serie von Beleuchtungsereignissen zeilenweise erfolgen. Im Allgemeinen wird eine gruppenweise Auslesung der Detektionspixel bevorzugt.
Grundsätzlich ist es auch denkbar, dass das Objekt mit einer elektromagnetischen Welle zu beaufschlagen, anstatt es mit Beleuchtungslicht zu beaufschlagen. Dementsprechend wird mit einem Detektionspixel dann die elektromagnetische Welle detektiert, welche mit dem Objekt wechselgewirkt hat. Es ist weithin denkbar, dass eine von der elektromagnetischen Welle induzierte und von dem mindestens einen Objekt ausgehende weitere elektromagnetische Welle mit dem mindestens einen auslesbaren Detektionspixel detektiert wird. Hierauf wird im Folgenden noch weiter eingegangen.
Als Objekte bzw. Testsubstanzen kommen alle Arten von Moleküle in Frage, die in der Biologie, Chemie, Pharmazie und Medizin relevant sind und die insbesondere mit auf dem Mikrochip ortsfest angeordnete Verbindungs- bzw. Anbindungsobjekte eine spezifische Bindung eingehen können. Diese spezifischen Bindungen spielen eine wichtige Rolle bei der Bestimmung der molekularen Eigenschaften der Objekte bzw. Testsubstanzen, aber auch der auf dem Mikrochip gebundenen Verbindungsobjekte, welche beispielsweise in Form von Oligomeren ausgebildet sind. Typische Beispiele solcher Testsubstanzen sind Antikörper, Proteine, Peptide, Enzyme, DNA-, RNA-Moleküle, synthetische Pharmaka und Gemische dieser Stoffe.
Erfindungsgemäß ist erkannt worden, dass der Mikrochip nicht nur als Träger für das bzw. die zu detektierenden Objekte und/oder für die in Frage kommenden Verbindungsobjekte bzw. Anbindungsobjekte dient. Der Mikrochip dient vielmehr auch zur Detektion des Lichts, welches mit dem bzw. den Objekten wechselgewirkt hat oder welches von dem Beleuchtungslicht am Objekt induziert wurde. Wenn man - wie dies eingangs beschrieben - von einer sehr kompakten
Packungsdichte der zu detektierenden Objekte auf dem Mikrochip ausgeht, kann mit dem als Träger wirkenden Mikrochip gleichzeitig die Objektdetektion der dicht angeordneten Objekte erfolgen, und zwar ohne hierzu weitere optische Komponenten wie Detektionsoptiken sowie CCD-Kameras vorzusehen. Hierzu muss der Mikrochip bzw. Objektträger nicht relativ zu einer Detektionsoptik (beispielsweise mit einem Mikroskoptisch) bewegt werden, um vollständig ausgelesen zu werden. Die Detektion des vom Objekt kommenden Lichts erfolgt dort, wo sie entsteht und nicht in einer bei der Mikroskopie üblichen Entfernung, wo das zu detektierende Licht eine Vielzahl optischer Bauteile durchlaufen muss, um schließlich z.B. von einem CCD-Chip einer CCD-Kamera mit einer vergleichsweise geringen Quantenausbeute detektiert zu werden. Insoweit ist es auch nicht unbedingt erforderlich, dass - verglichen zur Detektion mit einer CCD-Kamera - mehrere Bilder bzw.
Detektionszyklen aufgenommen und gemittelt werden, da Verluste des Detektionslichts durch teilweise Reflexionen an optischen Komponenten wie Linsen usw. bei dem erfindungsgemäßen Verfahren nicht auftreten.
Somit dient der Mikrochip im Sinn der vorliegenden Erfindung nicht wie bei den meisten Arraytechnologien nur als „passiver" Träger, welcher nur die Aufgabe hat, die aufgebrachten Ver-
/Anbindungsobjekte, Moleküle bzw. Objekte auf einer im Wesentlichen zweidimensionalen Oberfläche zu verankern.
Insbesondere in den Ausführungsbeispielen, auf weiche noch eingegangen wird, wird verdeutlicht, dass durch eine geeignete Kombination von Beleuchtungsoptik, Wahl der Absorptions- bzw. Fluoreszenzmarkierungsstoffe für die Objekte und Aufbau bzw. Anordnung der Photodetektoren hinsichtlich absorbierenden Siliziumschichtdicken, Oberflächenschichten und/oder Dotierungen das erfindungsgemäße Verfahren durchgeführt und optimiert werden kann, wobei dann die oben erwähnten Auslesekomponenten wie Detektionsoptiken und separater Photodetektor entfallen können. Hierdurch kann in vorteilhafter Weise eine große Anzahl unterschiedlicher Objekte, eine entsprechende Markierung und (vorgegebene oder bekannte) Objektpositionierung auf dem Mikrochip vorausgesetzt, in relativ kurzer Zeit detektiert und somit deren Informationsgehalt aufgenommen werden.
Ver-/Anbindungsobjekte und/oder das bzw. die Objekte können auf dem Mikrochip in einer vorgebbaren oder definierten Position auf unterschiedliche Weisen angeordnet bzw. aufgebracht werden. Im Folgenden wird auf bevorzugte Verfahrensschritte eingegangen, mit welchen die Ver- /Anbindungsobjekte bzw. die Objekte auf dem Mikrochip aufgebracht werden können.
So könnten die Ver-/Anbindungsobjekte bzw. die Objekte mittels elektrostatischer Anziehungskräfte auf dem Mikrochip positioniert und dort gebunden werden. Hierzu weist der Mikrochip mindestens einen Elektrodenpixel auf. Ein Elektrodenpixel könnte in Form eines Hochspannungspixels bzw. einer Hochspannungselektrode ausgebildet sein. An einem Elektrodenpixel kann eine Spannung angelegt werden, welche in einem Bereich von 30 bis 100 V liegt. Die Spannung kann positiv oder negativ sein. Ein solcher Mikropixel weist üblicherweise eine Kantenlänge ca. 30 - 100 μm auf. Der Mikrochip kann somit ca. 10.000 bis 100.000 Pixel/cm2 aufweisen. Somit kann in dieser Ausführungsvariante ein Mikrochip zu Grunde liegen, der ein Feld aus Elektrodenpixeln implementiert, deren elektrische Potentiale individuell oder in Gruppen frei programmierbar, d.h. aktivierbar oder deaktivierbar sind. Die Programmierung eines solchen Mikrochips wird über übliche Computerschnittstellen wie I2C, USB oder ähnliche durchgeführt, wobei der Mikrochip die notwendigen Control- und Statusregister implementiert, die durch geeignete Software eines Host- oder Steuer-Rechners (z.B. eines PC) orchestriert bzw. angesteuert werden.
Nun können die Ver-/Anbindungsobjekte oder das mindestens eine Objekt an dem Mikrochip derart angelagert werden, dass selektiv mit dem mindestens einen Elektrodenpixel ein elektrisches Feld erzeugt wird. Dieses elektrische Feld ist in der Regel für die Objekte räumlich begrenzt wirksam. Durch das elektrische Feld wird mindestens ein Objekt oder mindestens ein Ver-/Anbindungsobjekt an einem dem Elektrodenpixel zugeordneten Oberflächenbereich des Mikrochips angelagert. Die Voraussetzung hierfür ist, dass das Objekt oder das Ver-/Anbindungsobjekt elektrisch geladen ist. Hierauf wird im Konkreten bei den Ausführungsbeispielen eingegangen. Unter einer Anlagerung ist insbesondere eine spezifische Anordnung eines Objekts auf dem Mikrochip zu verstehen.
Besonders bevorzugt wird das selektive Anlagern von Verbindungsobjekten wiederholt. Hierdurch werden mehrere Ver-/Anbindungsobjekte pixelweise zu jeweils einem (ggf. komplexeren und/oder spezifischen) Verbindungsobjekt synthetisiert. Die so synthetisierten Ver-/Anbindungsobjekte dienen zur spezifischen Anlagerung von den zu detektierenden Objekten. Unter einer Synthetisierung kann insbesondere die aus dem Stand der Technik bekannte, die Schutzgruppen basierte kombinatorische (Festphasen-)Synthese von linearen Oligomeren aus Aminosäuren („Merrifield-Synthese") zu Peptiden bzw. Nukleotiden zu RNA (Ribonukleinsäure)-, oder DNA (Desoxirobonukleinsäure)- Oligomeren verstanden werden, siehe beispielsweise Merrifield R.B. und Stewart J. M., 1965, Automated peptide synthesis, Nature 207, 522-523. Mit derselben Chemie können auch PNA (Peptidnukleinsäure )-Oligomere kombinatorisch in einer gegebenen Sequenz von Nukleinsäuren synthetisiert werden, die chemisch Gemeinsamkeiten mit RNA und DNA aber ein peptidisches Rückgrad (z.B. N-(2-Aminoethyl)glycin) besitzen. In gleicher Weise können auch Oligonukleotide oder Oligoribonukleotide synthetisiert werden.
Diese Art der Aufbringung ist mit dem in der EP 1 140 977 B1 beschriebenen Verfahren zum Aufbringen von Substanzen auf einen Träger vergleichbar. Dort wird ein Verfahren zum Aufbringen von Substanzen auf einen Träger, insbesondere von Monomeren, für die kombinatorische Synthese von Molekülbibliotheken beschrieben, das sich für die kombinatorische Synthese einer Vielzahl von unterschiedlichen Molekülen auf den Elektrodenpixeln eines in Form eines CMOS-Chips gestalteten Mikrochips eignet. Als Moleküle kommen beispielsweise Peptid-Oligomere, DNA-Oligomere, RNA- Oligomere, oder PNA-Oligomere (im Folgenden kurz Oligomere genannt) in Frage. Diese Substanzen beinhalten Aminosäure- oder Nukleotid-Monomere in einem festen Aggregatszustand. Diese Monomerträger können in Form von Mikropartikel mit einem typischen Durchmesser von 10 μm hergestellt werden und dienen als Transporteinheit für die Monomere auf die Elektrodenpixel des Mikrochips. In der Dissertation von Alexander Nesterov-Müller, Fakultät für Physik und Astronomie der Universität Heidelberg, 2006, werden Verfahren beschrieben, mit welchen die Mikropartikel elektrisch geladen und selektiv, ortsgenau auf die Elektrodenpixel eines Mikrochips aufgebracht werden können. Dabei ist es vorteilhaft, Hochspannungen in der Größenordnung von 30 - 100 V selektiv an den Elektrodenpixeln anzulegen. Durch die sehr kleinen Dimensionen der Strukturen auf den CMC1S- Mikrochips können bei diesen Spannungen sehr große Feldstärken erreicht werden, die nahezu die Durchschlagsspannung an Luft erreichen können. Dies wiederum ist sehr vorteilhaft für die ortsgenaue Positionierung der geladenen Mikropartikel mit Hilfe der an die individuellen Pixel angelegten Spannungen.
Ebenso wird in der EP 1 140 977 B1 ein Verfahren zur Synthese eines trägergebundenen Arrays von Oligomeren beschrieben. Hierzu werden die oben genannten Mikropartikel schichtweise auf den Träger aufgebracht und anschließend geschmolzen. Dadurch werden die Monomere mobilisiert, so dass sie an den Träger koppeln können. Anschließend werden nicht gebundene Stoffe weggewaschen und die nicht permanente Schutzgruppe, wie z.B. Fmoc (bei der Peptid- oder PNA- Synthese) oder Trityl (bei der Oligonukleotidsynthese) abgespalten. Durch zyklische Wiederholung des Verfahrens, z.B. analog zur Standard Merrifield-Synthese, werden mehrere Schichten von Partikeln aufgebracht und die Oligomere bzw. die Verbindungsobjekte synthetisiert.
Falls in mindestens einem Verfahrensschritt ortsgenau bzw. in einer vorgegebenen Position auf dem Mikrochip Verbindungsobjekte angelagert sind, kann mindestens ein Objekt spezifisch an dem mindestens einen Verbindungsobjekt angelagert werden. Ein solches Objekt könnte beispielsweise einen Antikörper oder ein Antikörpergemisch, Proteine, Peptide, DNA-Moleküle, RNA-Moleküle, PNA- Moleküle, Zuckermoleküle oder bakterielles Lipopolysaccharid aufweisen.
An die an den Mikrochip durch die oben beschriebene Verfahrensschritte gebundene Vielzahl unterschiedlicher (z.B. in Form von Oligomere ausgebildete) Verbindungsobjekte können die zu untersuchenden Testsubstanzen bzw. Objekte spezifisch angebunden werden, indem die Chipoberfläche in geeigneten Inkubationsmedien wie wässrigen Puffern oder ggf. auch mit Hilfe einer Gasphase mit den Testsubstanzen/Objekten in engen Kontakt gebracht werden. Durch geeignete Konfiguration und Kombinatorik der Verbindungsobjekte auf dem Mikrochip können unbekannte Testsubstanzen/Objekten oder Substanzgemische systematisch nach bestimmten molekularen Eigenschaften analysiert werden („molekulares Screening"). Es können aber auch insbesondere bekannte Testsubstanzen dafür verwendet werden, um ein oder mehrere daran bindende Verbindungsobjekte zu finden, die dann z.B. den Eintritt eines Viruspartikels in seine Wirtszelle verhindern. Als einige Anwendungsbeispiele für molekulares Screening seien genannt: Genomscreening oder mRNA-Screening unbekannter Nukleotidsequenzen, DNA-Sequenzierung mit Hilfe von Oligonukleotidarrays, Antikörperscreening in Blutseren, z.B. bei viralen Infektionen, Charakterisierung von Enzymsubstraten, insbesondere von Kinasen oder Phosphatasen, Untersuchungen zu Protein-Peptid Bindungen, Untersuchungen zu molekularen Wechselwirkungen von therapeutischen Pharmaka mit Zelloberflächen und Peptid- oder Proteintargets. Dementsprechend sind die Verbindungsobjekte dann derart ausgebildet, dass daran jeweils die zu untersuchenden Objekte spezifisch binden können.
Weiterhin ist es auch denkbar, den Mikrochip bzw. die Elektrodenarrays chemisch mit funktionellen Gruppen zu belegen, so dass Aminosäuren oder Nukleotide auf den Elektroden angebunden werden können. Dies ist beispielsweise aus der Veröffentlichung von Beyer et al., Biomaterials, 27, 3505- 3514, 2005 oder der Dissertation des Herrn Mario Beyer, Fakultät für Chemie, Universität Heidelberg, 2005, bekannt. Ebenso ist es möglich, mindestens ein spezifisches und/oder synthetisiertes Verbindungsobjekt an den funktionellen Gruppen der Mikrochipoberfläche aufzubringen und/oder zu binden. Die Verbindungsobjekte sind hierbei ebenfalls derart ausgebildet, dass daran jeweils die zu untersuchenden Objekte spezifisch binden können. Gemäß dieser Ausführungsform werden also die Verbindungsobjekte nicht auf dem Mikrochip synthetisiert. Dies erfolgt vorab auf einer anderen Art und Weise. Die Objekte und/oder Verbindungsobjekte könnten dann auf dem Mikrochip durch das Spottingverfahren und/oder das Mikromanipulationsverfahren in Form von ortsgenau deponierten Mikrotröpfchen aufgebracht werden und durch eine chemische Kopplung durch entsprechende funktionelle Gruppen mit dem Mikrochip fixiert werden. Diese Aufbringverfahren sind aus dem Stand der Technik bekannt, so dass hier nicht weiter darauf eingegangen wird. Ein An-Λ/erbindungsobjekt kann ein reaktives Molekül aufweisen, insbesondere ein Oligomer, ein Peptid-Oligomer, ein DNA-Oligomer oder ein PNA-Oligomer definierter Aminosäure- oder Nukleotidsequenz.
Weiterhin ist es denkbar, dass das mindestens eine Objekt durch Aufbringen einer Folie auf dem Mikrochip positioniert wird. Das mindestens eine Objekt ist hierbei auf der Folie in einer räumlich vorgebbaren Weise positioniert. Diese Positionierung des mindestens einen Objekts auf der Folie könnte mit den oben beschriebenen Verfahren aufgebracht bzw. daran fixiert werden. Das mindestens eine Objekt könnte in einer alternativen Ausführungsform von einem Mittel, beispielsweise einem Gel, zumindest teilweise umgeben sein. Das Mittel ist hierbei derart ausgebildet, dass damit die Relativposition der Objekte - insbesondere untereinander und/oder bezüglich des Mikrochips bzw. bezüglich der einzelnen Detektionspixel des Mikrochips - im Wesentlichen unverändert bleibt. Das Mittel samt den Objekten kann dann auf den Mikrochip aufgebracht werden.
Das mindestens eine Objekt wird mit Beleuchtungslicht mindestens einer vorgebbaren Wellenlänge oder eines vorgebbaren Wellenlängenbereichs beleuchtet. Die Beleuchtung kann punktuell oder flächenhaft erfolgen. Eine punktuelle Beleuchtung einzelner oder mehrerer Objekte kann mit einem fokussierten Lichtstrahl erfolgen. Es könnte auch der gesamte Mikrochip z.B. mit einem kollimierten Lichtstrahl beleuchtet werden. Der Wellenlängenbereich des Beleuchtungslichts kann sich von 280 nm bis 1000 nm erstrecken, insbesondere vom UV-C bis zum nahen IR.
Falls vom Objekt ausgehendes Lumineszenzlicht detektiert oder nachgewiesen werden soll, ist es wünschenswert, dass kein zur Anregung der Lumineszenz dienendes Beleuchtungslicht zu den Detektionspixeln gelangt. Lediglich das Lumineszenzlicht soll von den Detektionspixeln detektiert werden. Der Mikrochip ist im Allgemeinen derart ausgebildet, dass seine Detektionspixel von der Mikrochipoberfläche beabstandet angeordnet sind, beispielsweise in einer Tiefe von ungefähr 500 bis 1000 nm. Dementsprechend ist bevorzugt vorgesehen, die Objekte derart zu beleuchten, dass das Beleuchtungs- oder Anregungslicht nicht oder nur geringfügig in den Mikrochip eindringt. Dies könnte einerseits durch eine Beleuchtung mittels geeigneter optischer Komponenten realisiert werden. Andererseits könnte durch eine geeignete Wahl der Wellenlänge bzw. des Wellenlängenbereichs des Beleuchtungslichts dessen Eindringtiefe gering gehalten werden, z.B. in der Größenordnung von 100 nm. Grundsätzlich ist bei Siliziumchips die Eindringtiefe bei Licht kurzer Wellenlänge geringer als bei Licht größer Wellenlänge. Daher könnte mit kurzweiligem UV-Licht im Wesentlichen nur die
Mikrochipoberfläche und die lumineszenzmarkierten Testsubstanzen/Objekte beleuchtet werden, nicht aber die Detektionspixel. Das vom Objekt ausgesendete Lumineszezlicht weist jedoch auf Grund des Stokes-Shifts eine größere Wellenlänge auf und besitzt daher eine größere Eindringtiefe in den Mikrochip und kann somit die photosensitive Schicht bzw. die Detektionspixel im Mikrochip erreichen. Durch den photoelektrischen Effekt kann in dem Detektionspixel ein elektrisches Signal (z.B. in Form eines Photostroms) oder ein Ladungsübergang ausgelöst werden. Diese Signale können durch im Chip integrierte elektronische Schaltungen verstärkt, digital aufbereitet und zur Auslese durch einen externen Computer zur Verfügung gestellt werden, so dass die individuellen Objekte detektiert werden können. Hierzu sind in vorteilhafter weise weder mikroskopische Auslesesysteme noch Bilderkennungssysteme erforderlich.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform könnte das mindestens eine Objekt evaneszent beleuchtet werden. Dies könnte z.B. mit Hilfe eines Prismas erfolgen, wobei das Prisma in einem vorgebbaren Abstand relativ zum Mikrochip bzw. zu den Objekten angeordnet ist. Beleuchtungslicht könnte nun derart in das Prisma eingekoppelt werden, dass aufgrund der im Prisma erfolgenden Totalreflexion sich außerhalb des Prismas und auf der dem Mikrochip bzw. den Objekten zugewandten Seite ein evaneszentes Feld ausbildet. Mit diesem evaneszenten Lichtfeld wird das mindestens eine Objekt beleuchtet. Die Intensität des evaneszenten Lichtfelds fällt exponentiell mit dem Abstand von der Grenzfläche des Prismas ab und bei geeigneter Anordnung des Prismas relativ zu dem Mikrochip dringen nachweisbare Intensitäten des Beleuchtungslichts typischerweise weniger als 100 nm von der Oberfläche des Mikrochips in diesen ein. Hierdurch gelangt das Beleuchtungslicht nicht in die Tiefe, in welcher sich die Detektionspixel des Mikrochips befinden. Dementsprechend wird durch eine solche Objektbeleuchtung das Beleuchtungslicht nicht von den Detektionspixeln nachgewiesen. Dagegen kann beispielsweise das vom Objekt ausgehende Fluoreszenzlicht von den Detektionspixeln nachgewiesen werden, da das von den Objekten ausgehende Fluoreszenzlicht eine größere Wellenlänge aufweist und/oder tiefer in den Mikrochip eindringt.
Das Beleuchtungslicht wird mit einer Lichtquelle erzeugt, welche kontinuierliches und/oder gepulstes Licht emittiert. Die Lichtquelle könnte einen Laser, einen Temperaturstrahler oder eine Gasentladungslampe aufweisen. In der Regel werden eine Beleuchtungsoptik und gegebenenfalls weitere optische Komponenten (z.B. Spiegel) vorgesehen sein, mit welcher das von der Lichtquelle emittierte Licht auf den Mikrochip gerichtet oder fokussiert werden kann.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird das Objekt mit gepulstem Licht beleuchtet. Das mindestens eine Detektionspixel wird in einer Beleuchtungspause ausgelesen. Das Beleuchtungslicht gelangt zwar während der Beleuchtungsphase zu den Detektionspixeln, falls dessen Eindringtiefe hoch genug ist. Das während der Beleuchtungsphase ggf. detektierte Signal wird jedoch nicht berücksichtigt. In der Beleuchtungspause gelangt jedoch kein Beleuchtungslicht zu den
Detektionspixeln, so dass dann beispielsweise lediglich das von dem Beleuchtungslicht induzierte Lumineszenzlicht (eine ausreichende Lebensdauer des Lumineszenzfarbstoffs vorausgesetzt) von den Detektionspixeln nachgewiesen werden kann. Im Konkreten könnten Lumineszenz- oder Fluoreszenzmarkierungsstoffe mit einer Lumineszenz- bzw. Fluoreszenzlebensdauer in der Größenordnung von Millisekunden zur Objektmarkierung verwendet werden. Durch das Abschalten der Detektionspixel bzw. durch das nicht Berücksichtigen der von den Detektionspixeln generierten Signalen während der Beleuchtung und das anschließendes Einschalten der Detektionspixel während der zeitverzögerten Fluoreszenzemission wird lediglich das
Fluoreszenzlicht nachgewiesen. Somit ist eine Unterscheidung des Beleuchtungslichtes vom Fluoreszenzlicht möglich.
Die zeitliche Synchronisation mit dem Beleuchtungssystem kann mit Hilfe von Referenz- Photosensoren bzw. -Detektionspixel durch geeignete Pulssequenzen vor oder während der Messung durchgeführt werden, so dass keine externe Synchronisationsinfrastruktur zwischen dem
Beleuchtungssystem und dem Mikrochip erforderlich ist. Diese Referenz-Photosensoren können auch verwendet werden, um zeitliche Veränderungen des Beleuchtungssystems zu erfassen und elektronisch zu korrigieren. Auch zu Kalibrierungszwecken - beispielsweise der Beleuchtungsintensitätsverteilung an der Mikrochipoberfläche - können die Signale der Referenz- Photosensoren eingesetzt werden.
In einer weiteren Ausführungsform wird bzw. ist das Objekt mit einem Absorptionsfarbstoff markiert. Es wird der Anteil des Beleuchtungslichts detektiert, der durch das Objekt und durch den Absorptionsfarbstoff zu dem jeweiligen Detektionspixel gelangt. Insoweit kann der Absorptionsfarbstoff nach der Markierung mit dem Objekt als zu dem Objekt gehörig angesehen werden, so dass unter einer Wechselwirkung des Objekts mit dem Beleuchtungslicht im Sinn des Anspruchs 1 auch eine Wechselwirkung mit dem Absorptionsfarbstoff verstanden werden kann. Hierbei ist es zweckmäßig, das Beleuchtungslicht hinsichtlich seiner spektralen Eigenschaft derart auszuwählen, dass es vom Absorptionsfarbstoff absorbiert wird und dass es eine große Eindringtiefe in den Mikrochip aufweist, damit in denjenigen Detektionspixeln ein elektrisches Signal (z.B. in Form eines Photostroms) ausgelöst wird, die nicht mit absorptionsmarkierten Objekten abgedeckt sind. Die Detektionspxel, die mit absorptionsmarkierten Objekten abgedeckt sind, werden kein oder lediglich ein vernachlässigbares Signal auslösen.
Eine spezifische Absorptionsdetektion könnte auch derart erfolgen, dass auf dem Mikrochip eine Schicht aufgebracht ist, welche dann ihre optischen Eigenschaften verändert - sich z.B. verfärbt -, wenn sie in Kontakt mit einem entsprechenden Reaktanten kommt. Ein solcher Reaktant kann jeweils mit Hilfe der Elektrodenpixel spezifisch räumlich an der Oberfläche des Mikrochips angelagert werden. Eine solche Schicht könnte beispielsweise Palladium-Wolfram, im Konkreten Pd-WO3 , aufweisen. Eine solche Schicht färbt sich bei Kontakt mit molekularem Wasserstoff blau, wodurch die Detektion potenziell katalytischer Ereignisse mit den Detektionspixeln des Mikrochips möglich ist, da sich durch die Verfärbung lokal die Absorptionseigenschaften der Schicht verändert haben. Die dissoziative Adsorption von Wasserstoff führt zur Reduktion des WO3 zu Wolframbronzen. Diese bestehen aus Wolframoxiden unterschiedlicher Valenzen (+5, +6), die eine tiefblaue Färbung aufweisen und deren Leitfähigkeit bei Kontakt mit 1 % H2 um einen Faktor von mehr als 106 steigt. Daher können derartige Schichten bzw. Filme in Kombination mit den Detektionspixeln als optische Sensoren verwendet werden, wobei die Nachweisempfindlichkeiten von bis zu 3 ppm betragen können. Auf Grundlage der Leitfähigkeit von Wolframbronzen kann bereits ein resistiver Wasserstoffnachweis mit Hilfe von Halbleiterstrukturen realisiert werden. Die Herstellung von Pd-WO3-Schichten kann entweder über Sol-Gel-Verfahren, durch thermisches Aufdampfen oder mittels Sputtern erfolgen. Insoweit erfolgt gemäß dieser Ausführungsvariante keine Absorptionsdetektion von spezifisch an Objekte angebundenem Absorptionsfarbstoff, sondern es werden die Absorptionseigenschaften der Bereiche der Schicht des Mikrochips detektiert, welche sich auf Grund spezifisch angelagerter Objekte bzw. Reaktanten hinsichtlich ihrer optischen Eigenschaften verändert haben. Hierdurch absorbieren diese Bereiche einen größeren Teil des Beleuchtungslichts als optisch unverändert gebliebene Bereiche der Schicht. Grundsätzlich ist es auch denkbar, die Schicht des Mikrochips mit einem hohen Absorptionskoeffizienten auszugestalten und nach erfolgter spezifischer Reaktion mit einem entsprechenden Rektanten verändern sich die optischen Eigenschaften der veränderten Bereiche zu einem niedrigeren Absorptionskoeffizienten hin.
Besonders bevorzugt ist vorgesehen, dass das Objekt mit mindestens einem Lumineszenzfarbstoff spezifisch markiert ist und/oder dass das Objekt mit mindestens einem lumineszenzfähigen Nanokristall spezifisch markiert ist. Der mindestens eine Lumineszenzfarbstoff wird von dem
Beleuchtungslicht zur Lumineszenz angeregt. Das Lumineszenzlicht wird von einem Detektionspixel detektiert. Der Lumineszenzfarbstoff könnte einen Fluoreszenzfarbstoff oder einen Phosphoreszenzfarbstoff aufweisen. Der Nanokristall könnte fluoreszenz- oder lumineszenzfähig sein. Grundsätzlich sind sämtliche, bei der Fluoreszenzmikroskopie üblichen Beleuchtungs- und Detektionsvarianten auch für das erfindungsgemäße Verfahren anwendbar, wobei den
Besonderheiten Rechnung zu tragen ist, wie z.B. der Tatsache, dass in dem Mikrochip üblicherweise keine Separationsfilter vorgesehen sind.
So können die Objekte mit Licht absorbierenden Molekülen und/oder Fluoreszenzmolekülen und/oder fluoreszenten Halbleiter-Nanokristallen direkt oder indirekt, d.h. über sekundäre Linkermoleküle wie z.B. Zweitantikörper, markiert werden. Alternativ können die Objekte bzw. Testsubstanzen vorher gebundene, insbesondere markierte Substanzen verdrängen oder in ihren optischen Eigenschaften modulieren. Beispiele hierfür sind die Abspaltung eines fluoreszenzmarkierten Peptidanteils durch die enzymatische Aktivität einer Protease, oder das Verdrängen eines fluoreszenzmarkierten Antikörpers durch eine kompetitive Bindung der Testsubstanz, wobei der Antikörper spezifisch an das individuelle Oligomer gebunden sein kann, oder aber an einen immer gleichen Fusionsanteil der unterschiedlichen Oligomere bindet, wobei diese Bindung mit der Bindung der Testsubstanz an den variablen Teil des Oligomers kompetitiert. Dieser letztgenannte Punkt hätte den Vorteil, dass die Testsubstanz nicht gesondert markiert werden muss.
Bei den Fluoreszenzfarbstoffen kann es sich um Farbstoffe handeln, welche vorwiegend organische Farbstoffe aufweisen und die in einem definierten Wellenlängenbereich zwischen UV-C (Ultra-Violett- C) und IR (Infrarot) angeregt werden können. Diese Farbstoffe emittieren verglichen zur Wellenlänge des Beleuchtungslichts in einem zum langwelligen verschobenen Wellenlängenbereich („Stokes Shift"). Ein weiteres Charakteristikum zur Identifizierung eines Fluoreszenzfarbstoffes kann auch die Fluoreszenzlebensdauer oder Fluoreszenzabklingzeit des Farbstoffmoleküls sein. Absorptionsfarbstoffe absorbieren dagegen einen Teil des elektromagnetischen Spektrums und setzen diese Energie in nicht-optische Wechselwirkungen um.
Halbleiter-Nanokristalle, kurz als Nanokristalle oder auch als Quantendots bezeichnet, besitzen eine typische Größe von 10 bis 100 nm. Sie bestehen üblicherweise aus dem entsprechenden Halbleitermaterial (z.B. CdSe) als Kern und einer aktivierten und/oder modifizierten Oberfläche zur Bindung an molekulare Partner. Nanokristalle zeichnen sich dadurch aus, dass sie im Gegensatz zu organischen Farbstoffen üblicherweise kein Ausbleichen der Fluoreszenz zeigen. Während das Anregungsspektrum in erster Linie durch Eigenschaften des Kern-Materials der Nanokristalle bestimmt wird, hängt die Fluoreszenzintensität und der Stokes Shift und damit das Spektrum der Fluoreszenzemission neben den Eigenschaften des Materials auch vom hydrodynamischen Radius der Nanokristalle und deren direkten molekularen Umgebung ab. Der hydrodynamische Radius ist der Partikelradius vor einer Anbindung von Bindungsmolekülen. Durch Bindungsmoleküle kann sich der Radius zusätzlich ändern, was jedoch primär keinen Einfluss auf die Fluoreszenzwellenlänge hat.
Dementsprechend kann für bestimmte Applikationen des erfindungsgemäßen Verfahrens vorgesehen sein, dass der Nanokristall einen vorgebbaren hydrodynamischen Radius aufweist und/oder dass der Nanokristall ein vorgebbares Anregungs- und Emissionsspektrum aufweist, welches vorzugsweise einen großen Stokes Shift aufweist. Grundsätzlich weisen Nanokristalle einen Kern aus
Halbleitermaterial auf. Alternativ kann der Nanokristall einen Kern aus Lanthanidenmaterial aufweisen, beispielsweise eine Eurobiumverbindung. Ebenso kann der Nanokristall eine Beschichtung aufweisen, mit welcher ein - vorzugsweise spezifisches - Anbinden des Nanokristalls an einem Objekt begünstigt wird.
Bevorzugt weist der Fluoreszenzfarbstoff einen vorgebbaren - insbesondere hohen - Stokes Shift auf. Ein solcher Fluoreszenzfarbstoff könnte Lanthaniden-Chelat aufweisen.
Der Fluoreszenzfarbstoff oder der fluoreszierende Nanokristall weist bevorzugt eine vorgebbare Fluoreszenzlebensdauer auf. Diese könnte vorzugsweise größer gleich 1 ms sein. Die Objekte sind mit dem Fluoreszenzfarbstoff bzw. dem fluoreszierenden Nanokristall spezifisch markiert. Die Objekte können mit gepulstem Beleuchtungslicht beleuchtet werden und in den Beleuchtungspausen werden die Detektionspixel aktiviert und ausgelesen.
Bevorzugt ist mindestens ein Detektionspixel vorgesehen, mit welchem unmittelbar das Beleuchtungslicht detektiert wird. Anhand des Detektionssignals des Detektionspixels wird festgestellt, ob eine Beleuchtungspause vorliegt. Alternativ oder zusätzlich kann anhand des Detektionssignals des Detektionspixels - beispielsweise zur Kalibrierung - auf die lokale Beleuchtungssituation rückgeschlossen werden, insbesondere auf die lokale Beleuchtungsstärke. Dies wurde schon im Zusammenhang mit am Mikrochip vorgesehenen Referenz-Photosensoren erläutert.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform sind Objekte mit mindestens zwei
Fluoreszenzfarbstoffen unterschiedlicher Anregungseigenschaften spezifisch markiert. Für ein vorgebbares Zeitintervall wird einer der Fluoreszenzfarbstoffe mit Beleuchtungslicht einer ersten Anregungswellenlänge zur Fluoreszenz angeregt. Danach wird für ein weiteres vorgebbares Zeitintervall der andere Fluoreszenzfarbstoff mit Beleuchtungslicht einer zweiten, im Allgemeinen von der ersten unterschiedlichen Anregungswellenlänge zur Fluoreszenz angeregt. Das Fluoreszenzlicht der zwei Fluoreszenzfarbstoffe wird zeitlich hintereinander detektiert. Auch hierbei kann das Beleuchtungslicht gepulst sein und die Fluoreszenzfarbstoffe können derart ausgewählt werden, dass diese eine Fluoreszenzlebensdauer besitzen, die groß genug ist, damit das Fluoreszenzlicht in den Beleuchtungspausen noch von den Detektionspixeln nachweisbar ist.
Dieses Verfahren kann bei der vergleichenden Genomhybridisierung angewandt werden. Dafür müssen die verwendeten unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffe durch Anregungslicht unterschiedlicher Wellenlänge anregbar sein, wobei das Anregungslicht wie beschrieben nur eine geringe Eindringtiefe in den Chip erreicht. Das ausgesendete Fluoreszenzlicht wiederum sollte vergleichsweise tief in den Chip eindringen können, so dass es die Detektoreneinheiten erreicht und entsprechend nachgewiesen werden kann.
Eine Alternative zur zeitversetzten Detektion zweier unterschiedlicher Fluoreszenzfarbstoffe kann sein, dass die Objekte mit mindestens zwei Fluoreszenzfarbstoffen unterschiedlicher Emissionseigenschaften spezifisch markiert sind. Die zwei Fluoreszenzfarbstoffe können jedoch aufgrund ihrer Anregungseigenschaften mit Beleuchtungslicht einer vorgegebenen Wellenlänge werden. Dementsprechend können die zwei Fluoreszenzfarbstoffe mit Beleuchtungslicht einer vorgebbaren Wellenlänge gleichzeitig zur Fluoreszenz angeregt werden. Das Fluoreszenzlicht des ersten Fluoreszenzfarbstoffs weist ein Emissionsspektrum mit einer vorgebbaren ersten Eindringtiefe in den Mikrochip auf. Das Fluoreszenzlicht des zweiten Fluoreszenzfarbstoffs weist ein zweites Emissionsspektrum einer vorgebbaren zweiten Eindringtiefe in den Mikrochip auf. Die zwei Fluoreszenzfarbstoffe sind derart gewählt, dass die erste Eindringtiefe größer als die zweite Eindringtiefe ist. Der Detektionsbereich der Detektionspixel ist in mindestens zwei unterschiedlichen Abständen von der Mikrochipoberfläche in dem Mikrochip angeordnet, so dass mit den Detektionspixeln, die weiter von der Mikrochipoberfläche beabstandet sind, das Fluoreszenzlicht des ersten Fluoreszenzfarbstoffs und mit den Detektionspixeln, die weniger weit von der
Mikrochipoberfläche beabstandet sind, das Fluoreszenzlicht des zweiten (und ggf. des ersten) Fluoreszenzfarbstoffs detektiert werden.
In den Mikrochip könnten zwar, müssen jedoch keine klassischen optischen Filter oder fokussierende Elemente integriert werden. Dadurch kann das Auslesen der relevanten Informationen bzw. der detektierten Photonen im Feld mit minimalem Aufwand durchgeführt werden. Die physische Kopplung zwischen individuellem Verbindungsobjekt und zugehörigem Photodetektor bringt eine Datenreduktion bei der Erfassung der individuellen Bindungsereignisse mit sich. Jedem Verbindungsobjekt kann dadurch sehr einfach ein (gemessener) Photostrom zugeordnet werden, so dass auf aufwändige und fehleranfällige Bilderkennungssysteme oder ähnliches verzichtet werden kann. Auch kann hierbei auf Grund der pixelkorrelierten Anordnung der Objekte an dem Mikrochip eine räumliche Zuordnung der detektierten Signale zu den detektierten Objekten weitgehend sichergestellt werden, was bei herkömmlichen mikroskopischen Detektionsverfahren durch ein unter Umständen aufwendiges Alignement der detektierten Signale zu der bekannten Anordnung auf dem Träger berechnet werden muss.
Ganz allgemein könnte das mindestens eine Objekt anstatt mit Beleuchtungslicht mit einer elektromagnetischen Welle beaufschlagt werden. Die mit dem mindestens einen Objekt wechselwirkende elektromagnetische Welle oder eine von der elektromagnetischen Welle induzierte und von dem mindestens einen Objekt ausgehende weitere elektromagnetische Welle könnte dann mit dem mindestens einen auslesbaren Detektionspixel des Mikrochips detektiert werden.
In vorrichtungsmäßiger Hinsicht wird die eingangs genannte Aufgabe durch die Merkmale des
Anspruchs 26 gelöst. Demnach ist die eingangs genannte Vorrichtung dadurch gekennzeichnet, dass das mindestens eine Objekt an dem Mikrochip in einer räumlich vorgebbaren Position angeordnet und/oder anordenbar ist und dass das mindestens eine Objekt mit Beleuchtungslicht beaufschlagbar ist, um das mit dem mindestens einen Objekt wechselwirkende Beleuchtungslicht oder das von dem Beleuchtungslicht induzierte und von dem mindestens einen Objekt ausgehende Licht mit dem mindestens einen auslesbaren Detektionspixel des Mikrochips zu detektieren.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung verbindet also in vorteilhafter Weise die Funktionsweise eines Objektträgers einerseits, welche - wie bereits oben beschrieben - eine ganz erhebliche Objektdichte auf kleinem Raum ermöglicht. Andererseits können mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung die auf ihr angeordneten Objekte nahezu unmittelbar detektiert bzw. deren Informationsgehalt ausgelesen werden.
Ganz besonders bevorzugt ist die erfindungsgemäße Vorrichtung zum Durchführen eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 25 vorgesehen. Für einen Fachmann erschließt sich in Kenntnis des erfindungsgemäßen Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 25 dessen Durchführung auf einer Vorrichtung gemäß Anspruch 26 weitgehend. Daher wird zur Vermeindung von Wiederholungen auf den vorangegangenen Teil der Beschreibung verwiesen.
Der Mikrochip basiert in einer Ausführungsform auf der MOS-Technologie (Metal Oxide Semiconductor). Bevorzugt wird ein Mikrochip zum Einsatz kommen, der auf der CMOS-Technologie (Complementary Metal Oxide Semiconductor) basiert. Alternativ könnte der Mikrochip oder zumindest ein Teil davon auf der NMOS-Technologie (Negative conducting Channel Metal Oxide Semiconductor) und/oder auf der PMOS-Technologie (Positive conducting Channel Metal Oxide Semiconductor) basieren. Welche Art von Mikrochip-Technologie zum Einsatz kommt, kann von der konkreten Anwendung abhängen und von der Auswahl des eingesetzten Beleuchtungslichts, der spezifischen Marker und der sonstigen Randbedingungen abhängen.
Die CMOS Technologie erlaubt es, hochkomplexe Mikrochips herzustellen, an deren Oberfläche sich Pixelmatrices befinden können, die aus einer Vielzahl von Hoch- oder Niederspannungselektroden mit einer typischen Kantenlänge von beispielsweise 30 μm bis 100 μm bestehen, so dass 10.000 bis 100.000 Elektrodenpixel/cm2 angeordnet werden können. Die Pixelelektroden können einzeln adressiert werden. In oder nahe zu diesen Pixelelektroden können Detektionspixel integriert werden bzw. angeordnet sein und die Photosignale der Detektionspixel bzw. eines aus Detektionspixel bestehenden Pixelarrays können einzeln ausgelesen.
Ganz besonders bevorzugt weist ein Detektionspixel eine lichtempfindliche elektronische Einheit auf, insbesondere eine Photodiode oder ein Photogate. Üblicherweise ist die Quantenausbeute eines Photogates geringer als die einer Photodiode. Von den Photogates wird weniger Rauschen verursacht, da dort keine Ladungen durch einen n-p Übergang fließen. Photogates weisen eine exzellente Temperaturstabilität auf. Die Quanteneffizienz ist bei Photodioden größer als bei Photogates. Bei Beleuchtungslicht kurzer Wellenlänge unterhalb 400 nm ist die Quanteneffizienz von Photogates extrem niedrig. Dementsprechend können Photogates beispielsweise für Fluoreszenzanwendungen eingesetzt werden, falls der Fluoreszenzfarbstoff mit kurzweiligem
Beleuchtungslicht angeregt und die Fluoreszenzemission im langweiligen Spektralbereich erfolgt.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform weist der Mikrochip integrierte elektronische Schaltungen zur Ansteuerung und/oder zum Auslesen der Detektionspixel und/oder zum Ansteuern der Elektrodenpixel auf. Die Detektionspixel könnten einzeln oder gruppenweise auslesbar sein. Die Programmierung und Auslese dieses Chips kann über übliche Computerschnittstellen wie I2C, USB oder ähnliche durchgeführt werden, wobei in dem Mikrochip die notwendigen Control- und Statusregister implementiert sein können, die durch geeignete Software eines Host Rechners (z.B. eines PC) orchestriert werden. Es werden hierzu in der Regel keine besonderen Anforderungen an Latenz oder Durchsatz an diese Schnittstelle gestellt. Die ausgelesenen Daten können auf dem Chip in entsprechenden Datenspeichern zwischengespeichert und vom Rechner zeitnah ausgelesen werden. Falls erforderlich, könnte der Mikrochip auch weitergehende Analyseeinheiten aufweisen, welche auf der Hardwareebene realisiert sind. Ein Beispiel hierfür könnte eine hardwaremäßig implementierte digitale Fourieranalyse sein, mit welcher beispielsweise die Autokorrelationsfunktion eines Fluoreszenzsignals ausgewertet werden kann. Hierzu ist es dann in vorteilhafter Weise nicht erforderlich, dass das Fluoreszenzsignal mit einer hohen Zeitauflösung zu digitalisieren und dieses mit einer unter Umständen rechnerintensiven Softwareroutine zu berechnen. Insoweit kann der Mikrochip sowohl Detektions- als auch Auswerteeinheiten aufweisen, so dass im Idealfall der Mikrochip im Wesentlichen nur die gewünschten Ergebnisse an einen Steuerrechner übermittelt.
Ganz besonders bevorzugt weist der Mikrochip mindestens einen Eletrodenpixel auf. Das Elektrodenpixel kann in Form eines Hoch- oder Niederspannungspixels ausgebildet sein. An ihm kam mit einer entsprechenden Ansteuereinrichtung eine positive oder eine negative Spannung angelegt werden, welche vorzugsweise stufenlos einstellbar ist.
Zur Kommunikation mit einem externen Ansteuersystem weist der Mikrochip mindestens eine
Ansteuer- und/oder Ausleseschnittstelle auf, welche insbesondere in Form einer I2C (Inter-Integrated- Circuit-Bus) oder einer USB (Universal Serial Bus)-Schnittstelle ausgebildet ist. Grundsätzlich ist auch eine kontaktlose Ausleseschnittstelle möglich, wie dies beispielsweise bei Transpondern zum Einsatz kommt. Somit kann der Mikrochip von einem Steuerrechner angesteuert und/oder ausgelesen werden.
Weiterhin könnte der Mikrochip Mittel zur Verstärkung und/oder Aufbereitung der Signale aufweisen, welche von einem Detektiospixel auslesbar sind. Hierzu könnten im Konkreten auf Halbleitertechnologie basierende Vorverstärker vorgesehen sein, beispielsweise auf PMOS- und/oder NMOS-Technologie basierend.
Der Mikrochip wird mit den oben beschriebenen Objekten und/oder Verbindungsobjekten benetzt bzw. belegt. Diese werden in der Regel in fester Form oder in einer Lösung auf den Mikrochip aufgegeben. Die Objekte und/oder die Verbindungsobjekte können elektrisch leitfähig sein. Daher wird in einer bevorzugten Ausführungsform zur elektrischen Isolierung der Mikrochip mit einer Beschichtung versehen. Diese Beschichtung könnte beispielsweise Silizium-Nitrid aufweisen. Auf der Isolationsbeschichtung und/oder unmittelbar auf dem Mikrochip könnte eine Schicht vorgesehen sein, welche mindestens eine Gattung eines - insbesondere organischen - Polymers und/oder ein Element der Gattung der Polyethylenglycole und/oder eine Silanisierungsschicht aufweist. Bevorzugt weist die Schicht ein Gemisch aus diesen Stoffen auf. An einer solchen Schicht sind Verbindungsobjekte und/oder Objekte anlagerbar bzw. chemisch anbindbar. Durch die Silanisierungs- oder Polyethylenglycol-Schicht wird insbesondere das Anbinden von Verbindungsobjekten begünstigt.
Im Folgenden wird im Konkreten auf einige Ausführungsbeispiele des erfindungsgemäßen Verfahrens eingegangen:
In einem ersten Ausführungsbeispiel werden auf die Elektrodenpixel gegebener Größe eines
Pixelfeldes des Mikrochips reaktive Moleküle als Verbindungsobjekte synthetisiert oder mit bekannten Techniken gespottet und an der Mikrochipoberfläche durch geeignete chemische Gruppen gebunden. Als reaktive Moleküle bzw. als Verbindungsobjekte kommen insbesondere Oligomere, z.B. Peptid- Oligomere, DNA-Oligomere, PNA-Oligomere definierter Aminosäure- oder Nukleotidsequenz in Frage. Objekte bzw. Testsubstanzen werden mit Standardverfahren mit Fluoreszenzfarbstoffen und/oder
Halbleiternanokristallen (-quantendots) eines bestimmten Anregungs- und wellenlängenverschobenen Emissionsspektrums markiert und zur spezifischen Bindung an die reaktiven Moleküle/Verbindungsobjekte auf die Mikrochipoberfläche gegeben. Als Objekte kommen z.B. Antikörper, oder Antikörpergemische, DNA-Moleküle, RNA-Moleküle, Zuckermoleküle (zum Beispiel aus der Extrazellulären Matrix, oder bakterielles Lipopolysaccharid) in Frage. Fluoreszenzfarbstoffe können beispielsweise Fluorescein(derivate), Cyanin(derivate) oder Rhodamin(derivate) sein. Halbleiternanokristallen (-quantendots) können CdSe-Quantendots definierter Größe sein. Nach spezifischer Bindung und Abtrennung ungebundener Testsubstanz (z.B. durch Waschen) wird die Fluoreszenz durch evaneszente Beleuchtung angeregt. Dazu wird beispielsweise in einer bevorzugten Ausführung ein Mikroprisma auf die Chipoberfläche in einem fest vorgegebenen Abstand angeordnet und in Totalreflexion beleuchtet. Durch den exponentiellen Abfall des evaneszenten Feldes der Beleuchtung innerhalb der Dimension einer Wellenlänge dringen nachweisbare Intensitäten des Anregungslichtes typischerweise weniger als 100 nm in die Oberfläche des Mikrochips ein und können so vom Fluoreszenzlicht der Markierungsmoleküle/Halbleiter-Quantendots, welches eine höhere Eindringtiefe besitzt unterschieden werden. Durch Wahl eines Intervalls des
Anregungsspektrums im Blauen oder UV kann dieser Effekt zusätzlich aufgrund der niedrigen Durchlässigkeit von Silizium verstärkt werden.
Gemäß einem zweiten Ausführungsbeispiel werden auf die Elektrodenpixel gegebener Größe eines Pixelfeldes reaktive Moleküle bzw. Verbindungsobjekte synthetisiert oder mit bekannten Techniken gespottet und an der Mikrochipoberfläche durch geeignete chemische Gruppen gebunden. Verbindungsobjekte könnten insbesondere Oligomere, z.B. Peptid-Oligomere, DNA-Oligomere, PNA- Oligomere definierter Aminosäure- oder Nukleotidsequenz sein. Objekte bzw. Testsubstanzen, z.B. Antikörper oder Antikörpergemische, DNA-Moleküle, RNA-Moleküle, Zuckermoleküle (zum Beispiel aus der Extrazellulären Matrix, oder bakterielles Lipopolysaccharid) werden mit Verfahren nach dem Stand der Technik mit Lanthaniden-Chelaten und/oder Lanthaniden-Halbleiternanokristallen (- quantendots) definierter Größe markiert und zur spezifischen Bindung an die reaktiven Moleküle/Verbindungsobjekte auf die Mikrochipoberfläche gegeben. Nach spezifischer Bindung und Abtrennung ungebundener Testsubstanz (z.B. durch Waschen) wird die Fluoreszenz durch fokussierte Fernfeldbeleuchtung mit Beleuchtungslicht im Wellenlängenbereich unter 400 nm angeregt. Die Eindringtiefe in den Mikrochip ist in diesem Wellenlängenbereich kleiner als 100 nm und kann durch entsprechende (dotierte) Siliziumschichten vom eigentlichen Detektionspixel getrennt werden. Die Lanthaniden-Fluoreszenzchelate bzw. Halbleiterquantendots fluoreszieren in einem Wellenlängenbereich über 600 nm, dessen Lichtquanten bis in den Photodetektor des Mikrochips vordringen (typischerweise 1 - 3 μm) und ein Photosignal bei den Detektionspixeln damit auslösen.
Gemäß einem dritten Ausführungsbeispiel werden Verbindungsobjekte und Objekte gemäß dem ersten oder dem zweiten Ausführungsbeispiel auf den Mikrochip aufgebracht. Nach spezifischer Bindung und Abtrennung ungebundener Testsubstanz (z.B. durch Waschen) wird die Fluoreszenz durch fokussierte Fernfeldbeleuchtung im Wellenlängenbereich unter 400 nm durch eine gepulste Lichtquelle angeregt. Die Fluoreszenzlebensdauer (-abklingzeit) von Lanthaniden-Farbstoffen liegt in der Größenordnung einiger Millisekunden. Dadurch wird es möglich, die Detektionspixel bzw. die Photodetektoren in den Elektrodenpixeln während der Beleuchtung bei hinreichend kurzen Beleuchtungspulsen ab- und anschließend zur zeitverzögerten Fluoreszenzdetektion anzuschalten.
Gemäß einem vierten Ausführungsbeispiel werden Verbindungsobjekte gemäß dem ersten oder dem zweiten Ausführungsbeispiel auf den Mikrochip aufgebracht. Sodann werden zwei unterschiedliche nah verwandte Testsubstanzen 1 und 2 mit jeweils unterschiedlichen Fluoreszenzmolekülen 1 und 2 derivatisiert und in gleichen Mengen gemischt. Nach spezifischer Bindung der Testsubstanzen an den Verbindungsobjekten und Abtrennung ungebundener Testsubstanzen (z.B. durch Waschen) wird die Fluoreszenz 1 durch fokussierte Fernfeldbeleuchtung im Wellenlängenbereich zwischen 300 und 400 nm durch eine gepulste Lichtquelle angeregt und während der Dunkelphase des Anregungslichtes die Fluoreszenzsignale 1 durch den dadurch in den individuellen Detektionspixeln induzierten Photostrom 1 ausgelesen. Anschließend wird die Fluoreszenz 2 durch fokussierte Fernfeldbeleuchtung im Wellenlängenbereich unter 300 nm durch eine gepulste Lichtquelle angeregt und während der Dunkelphase des Anregungslichtes die Fluoreszenzsignale 2, bzw. die dadurch induzierten Photoströme 2 ausgelesen. Anschließend wird der Quotient der Photoströme 1 und 2 für jeden individuellen Detektionspixel berechnet. Dieser Quotient ist ein Maß für das Verhältnis der an die jeweiligen individuellen Verbindungsobjekte gebundenen Testsubstanzen 1 und 2. Gemäß einem fünften Ausführungsbeispiel werden Verbindungsobjekte und Objekte gemäß dem ersten oder dem zweiten Ausführungsbeispiel auf den Mikrochip aufgebracht. Die Objekte bzw. Testsubstanzen sind mit Verfahren nach dem Stand der Technik mit Absorptionsfarbstoffen markiert und zur spezifischen Bindung an die Verbindungsobjekte auf die Mikrochipoberfläche gegeben. Nach spezifischer Bindung und Abtrennung ungebundener Testsubstanz (z.B. durch Waschen) wird der Mikrochip durch fokussierte Fernfeldbeleuchtung im Wellenlängenbereich über 400 nm beleuchtet. Dadurch wird es möglich, die Detektionspixel ohne gebundene und markierte Testsubstanz zu einem Photosignal anzuregen, während in den Detektionspixeln mit Testsubstanz durch den Absorptionsfarbstoff keine Photoelektronen erzeugt werden können.
Es gibt nun verschiedene Möglichkeiten, die Lehre der vorliegenden Erfindung in vorteilhafter Weise auszugestalten und weiterzubilden. Dazu ist einerseits auf die dem Patentanspruch 1 nachgeordneten Patentansprüche und andererseits auf die nachfolgende Erläuterung der bevorzugten Ausführungsbeispiele der Erfindung anhand der Zeichnung zu verweisen. In Verbindung mit der Erläuterung der bevorzugten Ausführungsbeispiele der Erfindung anhand der Zeichnung werden auch im allgemeinen bevorzugte Ausgestaltungen und Weiterbildungen der Lehre erläutert. In der Zeichnung zeigen jeweils in einer schematischen Darstellung
Fig. 1 in einer perspektivischen Ansicht ein Ausführungsbeispiel eines Mikrochips, welcher an einen Steuer- und Ausleserechner angeschlossen ist,
Fig. 2 den Mikrochip aus Figur 1 , auf welchem in einem ersten Verfahrensschritt Verbindungsobjekte aufgebracht sind,
Fig. 3 den Mikrochip aus Figur 2, auf welchem in einem weiteren Verfahrensschritt weitere
Verbindungsobjekte aufgebracht sind,
Fig. 4 in einer Schnittansicht einen Mikrochip, auf welchem Objekte angeordnet sind, welche evaneszent beleuchtet werden,
Fig. 5 in einer Schnittansicht einen Mikrochip, auf welchem Objekte angeordnet sind, welche flächenhaft zur Fluoreszenzanregung beleuchtet werden,
Fig. 6 in einer Schnittansicht einen Mikrochip, auf welchem mit einem Absorptionsfarbstoff markierte Objekte angeordnet sind, welche flächenhaft beleuchtet werden und
Fig. 7 in einer Schnittansicht ein Teil eines Mikrochips.
In den Figuren sind gleiche oder ähnliche Bauteile mit denselben Bezugszeichen gekennzeichnet. Figur 1 zeigt einen Mikrochip 1 auf welchem (in Figur 1 nicht gezeigte) Objekte an einer jeweils vorgegebenen Position aufgebracht und fixiert werden können. Der Mikrochip 1 weist einen Bereich 2 auf, in welchem Detektionspixel 3 angeordnet sind. Als Detektionspixel 3 sind lichtempfindliche elektronische Einheiten vorgesehen, die in Form von Photodioden ausgebildet sind. Der Mikrochip 1 und insbesondere dessen Bereich 2 basiert auf der CMOS-Technologie und ist daher ein elektronischer Halbleiterbaustein. Der Mikrochip 1 ist speziell für die Detektion von biologischen oder chemischen Objekten ausgebildet. Der Mikrochip 1 weist - lediglich schematisch angedeutet - integrierte elektronische Schaltungen 4 zur Ansteuerung bzw. zum Auslesen der Detektionspixel 3 und der weiteren Elemente des Mikrochips 1 auf. Die integrierten elektronischen Schaltungen 4 dienen auch zur Verstärkung und Aufbereitung der von den Detektionspixeln 3 erzeugten Signale. Der Mikrochip 1 umfasst eine Ansteuer- und Ausleseschnittstelle 5, welche ebenfalls schematisch lediglich in Form von Leitungsverbindungen dargestellt ist. Sozusagen auf dem Mikrochip 1 handelt es sich bei der Schnittstelle um eine I2C- Schnittstelle. Der Mikrochip 1 ist mit einem Steuerrechner 6 über die externen Leitungsverbindungen 7 verbunden, welcher den Mikrochip 1 ansteuert und mit welchem die gemessenen Informationen bzw. Signale der Detektionspixel 3 des Mikrochips 1 ausgelesen werden können. Extern zum Steuerrechner 6 ist der Mikrochip 1 über eine USB-Schnittstelle verbunden.
In dem Bereich 2 des Mikrochips 1 ist bei jedem Detektionspixel 3 jeweils ein Elektrodenpixel vorgesehen, welches nicht mit einem eigenen Bezugszeichen gekennzeichnet ist, jedoch verglichen zu den Detektionspixeln 3 näher an der Oberfläche des Mikrochips 1 angeordnet ist. Dementsprechend sind die Detektionspixel 3 weiter von der Oberfläche des Mikrochips 1 beabstandet angeordnet.
Figur 2 zeigt den Mikrochip 1 aus Figur 1 in einem Zustand, in welchem eine erste Lage von Verbindungsobjekten 8 auf den Mikrochip 1 bzw. den Bereich 2 spezifisch aufgebracht und dort angebunden sind. Die Verbindungsobjekte 8 sind lediglich schematisch als schwarze Vierecke eingezeichnet. Die Verbindungsobjekte 8 wurden elektrostatisch negativ aufgeladen und sind aus einem Aerosol (verglichen zum Toner beim Laserdrucker bzw. entsprechend der EP 1 140 977 B1 ) auf den Mikrochip 1 aufgebracht worden. Selektiv wurde an den entsprechenden Elektrodenpixeln (im Folgenden in den Fig. 1 bis 3 ebenfalls mit dem Bezugszeichen 3 gekennzeichnet) eine Spannung angelegt, so dass sich ein positives elektrisches Feld ausgebildet hat, wodurch die sich im Aerosol befindlichen negativ aufgeladen Verbindungsobjekte 8 an der Oberfläche des Bereichs 2 des
Mikrochips 1 und somit in unmittelbarer räumlicher Nähe zu den Elektrodenpixeln 3 angelagert haben. Da der Mikrochip 1 zur elektrischen Isolierung gegenüber dem aufgebrachte Lösungsgemisch mit einer Silizium-Nitrid-Schicht (in den Figuren nicht gezeigt) und hierauf wiederum mit einer die Anlagerung von Verbindungsobjekten 8 begünstigenden Polyethylenglycol-Schicht beschichtet ist, können die Verbindungsobjekte 8 an der jeweiligen Oberfläche fixiert werden. In Figur 3 wurde dieser Verfahrensschritt wiederholt, wobei nunmehr andere Verbindungsobjekte 9 (schraffiert eingezeichnet) in dem Bereich 2 des Mikrochips 1 aufgebracht wurden. Hierbei wurden größtenteils andere Elektrodenpixel 3 aktiviert, so dass an diesen Stellen sich eine erste Lage der Verbindungsobjekte 9 auf der Oberfläche des Mikrochips 1 angelagert haben. An Stellen, welche mit dem Bezugszeichen 10 gekennzeichnet sind, wurden die entsprechenden Elektrodenpixel 3 auch bei diesem Anlagerungsvorgang aktiviert, so dass sich auf das an dieser Stelle angelagerte Verbindungsobjekt 8 eine weitere Lage von Verbindungsobjekten 9 angelagert hat. Nun kann dieser Verfahrensschritt mehrmals wiederholt werden, so dass im Ergebnis an den jeweiligen Elektrodenpixeln bzw. Detektionspixeln sich eine vorgebbare Abfolge von unterschiedlichen Verbindungsobjekten 8, 9 spezifischen angelagert hat. An diesen spezifischen Abfolgen von Verbindungsobjekten können dann die zu detektierenden Objekte spezifisch angelagert werden. Ein Verbindungsobjekt kann ein reaktives Molekül aufweisen, beispielsweise ein Oligomer, ein Peptid-Oligomer, ein DNA-Oligomer oder ein PNA-Oligomer definierter Aminosäure- oder Nukleotidsequenz. Ein Objekt kann einen Antikörper oder ein Antikörpergemisch, Proteine, Peptide, DNA-Moleküle, RNA-Moleküle, PNA- Moleküle, Zuckermoleküle oder bakterielles Lipopolysaccharid aufweisen.
In Figur 4 ist ein Teil des Mikrochips 1 in einer Schnittdarstellung gezeigt. Auf den Mikrochip 1 ist mit Positioniermitteln 11 ein Mikroprisma 12 in einem vorgebbaren Abstand D zu Oberfläche 13 des Mikrochips 1 angeordnet. Ebenfalls auf der Oberfläche 13 des Mikrochips 1 ist schematisch die Isolationsbeschichtung und die Schicht mit dem Bezugszeichen 14 gezeigt, welche die synthetisierten Verbindungsobjekte - in den Figuren 4 bis 6 mit dem Bezugszeichen 15 gezeigt - enthält und an welchen die zu detektierenden Objekte 16 spezifischen angelagert sind. Es ist ebenfalls lediglich schematisch angedeutet, dass Beleuchtungslicht 17 derart in das Prisma 12 eingekoppelt wird, dass es intern an der der Oberfläche 13 des Mikrochips 1 zugewandten Oberfläche 18 des Mikroprismas 12 total reflektiert wird. Mit den Pfeilen 19 ist das sich auf Grund der Totalreflexion des Beleuchtungslichts 17 ausbildende evaneszente Lichtfeld angedeutet, welches sich in Richtung der Oberfläche 13 des Mikrochips 1 ausbreitet. Die Intensität des evaneszenten Lichts 19 fällt exponenziell mit dem Abstand von der Oberfläche 18 des Prismas 12 ab, so dass das evaneszente Licht 19 jedenfalls die Objekte 16 beleuchtet und ggf. noch geringfügig in den Mikrochip 1 eindringt. Die Objekte 16 sind mit einem Fluoreszenzfarbstoff spezifisch markiert und emittieren auf Grund der Anregung mit dem evaneszenten Licht 19 Fluoreszenzlicht 20. Das Fluoreszenzlicht 20 breitet sich in alle Richtungen aus, es sind jedoch lediglich mit den Pfeilen die Anteile angedeutet, welche von den Detektionspixeln 3 nachgewiesen werden. Die Detektionspixel 3 sind in einem Abstand d von der Oberfläche 13 des Mikrochips 1 angeordnet. Da das Fluoreszenzlicht 20 eine Wellenlänge aufweist, welche größer als die Wellenlänge des Beleuchtungslichts 17 ist, besitzt das Fluoreszenzlicht 20 auch einen größere Eindringtiefetiefe in den Mikrochip 1 , so dass das Fluoreszenzlicht 20 von den in dem Abstand d von der Oberfläche 13 des Mikrochips 1 angeordneten Detektionspixeln 3 nachgewiesen werden kann. Figur 5 zeigt in einer Schnittansicht ebenfalls den Mikrochip 1 aus Figur 4, auf welchem ebenfalls Objekte 16 spezifisch angelagert sind. Bei dem Ausführungsbeispiel gemäß Figur 5 werden die Objekte 16 mit Beleuchtungslicht 17 im Wesentlichen flächenhaft beleuchtet. Die Objekt 16 sind mit nicht separat eingezeichneten Nanokristallen spezifisch markiert. Auch in diesem Ausführungsbeispiel werden mit dem Beleuchtungslicht 17, welches eine Wellenlänge von 280 nm aufweist, die
Nanokristalle zur Fluoreszenz angeregt. Da das Beleuchtungslicht 17 eine relativ kurz Wellenlänge aufweist, ist seine Eindringtiefe in den Mikrochip 1 nur sehr gering, so dass das Beleuchtungslicht 17 jedenfalls nicht zum den Detektionspixeln 3 gelangen kann. Das Fluoreszenzlicht der Nanokristalle hingegen besitzt eine ausreichende Eindringtiefe (größer als d), so dass das Fluoreszenzlicht 20 von den Detektionspixeln 3 nachgewiesen werden kann. Obwohl dies in Figur 5 nicht dargestellt ist, könnte das Beleuchtungslicht 17 auch auf einzelne Objekte 16 fokussiert werden, so dass diese selektiv angeregt werden können. Bei diesem Ausführungsbeispiel ist es auch möglich, die Objekte 16 mit gepulstem Beleuchtungslicht zur Fluoreszenz anzuregen, wobei lediglich in den Beleuchtungspausen die Detektionspixel 3 ausgelesen bzw. deren Signale nur in den Beleuchtungspausen berücksichtigt werden.
In dem Ausführungsbeispiel gemäß Figur 6 ist im Wesentlichen die gleiche Situation wie in Figur 5 gezeigt. Allerdings sind in diesem Ausführungsbeispiel einige der in Figur 5 gezeigten Objekte 16A mit einem Absorptionsfarbstoff spezifisch markiert. Diese sind dunkler eingezeichnet. Die restlichen Objekte 16 sind nicht mit dem Absorptionsfarbstoff markiert. Die Objekte 16, 16A bzw. der Mikrochip 1 wird mit Beleuchtungslicht 17 beleuchtet. Mit den Pfeilen 20 ist angedeutet, dass das
Beleuchtungslicht 17 dann durch die Objekte 16 sich ausbreiten kann, wenn diese nicht mit dem Absorptionsfarbstoff markiert sind. Die entsprechenden Detektionspixel 3, auf weiche die jeweiligen Pfeile 20 zeigen, können somit das Beleuchtungslicht 17 detektieren. Das Beleuchtungslicht 17 kann jedoch nicht durch die mit Absorptionsfarbstoff spezifisch markierten Objekte 16A treten, so dass die darunter angeordneten Detektionspixel 3 kein Lichtsignal detektieren können.
Figur 7 zeigt in einer Schnittansicht einen Teil des Mikrochips 1 , in welchem auch die in Figur 7 nicht explizit gezeigten Detektionspixel 3 angeordnet sind. Rechts neben dem Mikrochip 1 ist eine Skala gezeigt, welche den Abstand Z von der Oberfläche 13 des Mikrochips in μm zeigt. Weiterhin sind bei dem Mikrochip 1 verschiedene Bereiche gezeigt. Mit dem Bezugszeichen 21 ist beispielsweise der PPLUS-, mit 22 der NWELL- und mit 23 der PEPI-Bereich einer Photodiode gezeigt. Die Pfeile 24 bis 29 sollen die Eindringtiefen von Licht jeweils unterschiedlicher Wellenlängen repräsentieren.
Der Pfeil 24 repräsentiert hierbei eine Wellenlänge von ca. 260 nm, der Pfeil 25 eine Wellenlänge von ca. 350 nm, der Pfeil 26 eine Wellenlänge von ca. 480 nm, der Pfeil 27 eine Wellenlänge von ca. 520 nm, der Pfeil 28 eine Wellenlänge von ca. 620 nm und der Pfeil 29 eine Wellenlänge von ca. 750nm. An der Skala kann abgelesen werden, wie tief das Licht der jeweiligen Wellenlänge in den Mikrochipl in das Silizium eindringen kann. Dementsprechend kann durch geeignete Wahl der Wellenlänge des Beleuchtungslichts bei gegebenen Eigenschaften des Mikrochips 1 (z.B. bei einem gegebenen Abstand d der Detektionspixel 3 von der Oberfläche 13 des Mikrochips) ein geeigneter Fluoreszenzfarbstoff ausgewählt werden, mit welchem dann die Objekte 16 spezifisch zu markieren sind, so dass nur das von den Objekten (bzw. das von dem Fluoreszenzfarbstoff, welcher an den Objekten gebunden ist) ausgehende Fluoreszenzlicht bis zu den Detektionspixeln 3 in den Mikrochip eindringen kann, das Beleuchtungs- bzw. Anregungslicht jedoch nicht.
Abschließend sei ganz besonders darauf hingewiesen, dass die voranstehend erörterten Ausführungsbeispiele lediglich zur Beschreibung der beanspruchten Lehre dienen, diese jedoch nicht auf die Ausführungsbeispiele einschränken.

Claims

P a t e n t a n s p r ü c h e
1. Verfahren zur Detektion mindestens einer Eigenschaft von mindestens einem Objekt (16), wobei die Detektion mit einem Mikrochip (1 ) erfolgt, wobei der Mikrochip (1 ) mindestens einen auslesbaren Detektionspixel (3) aufweist, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t, dass das mindestens eine Objekt (16) an dem Mikrochip (1) in einer räumlich vorgebbaren Position angeordnet wird und dass das mindestens eine Objekt (16) mit Beleuchtungslicht (17) beaufschlagt wird, um das mit dem mindestens einen Objekt (16) wechselwirkende Beleuchtungslicht (17) oder das von dem Beleuchtungslicht (17) induzierte und von dem mindestens einen Objekt (16) ausgehende Licht (20) mit dem mindestens einen auslesbaren Detektionspixel (3) des Mikrochips (1 ) zu detektieren.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass der Mikrochip (1 ) mindestens einen Elektrodenpixel (3) aufweist, wobei ein Elektrodenpixel (3) in Form eines Hochspannungspixels bzw. einer Hochspannungselektrode ausgebildet sein kann, wobei an einem Elektrodenpixel eine Spannung angelegt werden kann, welche in einem Bereich von 30 bis 100 V liegt.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das mindestens eine Objekt (16) oder mindestens ein Verbindungsobjekt (8, 9) an dem Mikrochip (1 ) derart angelagert wird, dass selektiv mit dem mindestens einen Elektrodenpixel (3) ein elektrisches Feld erzeugt wird, wodurch mindestens ein Objekt (16) oder mindestens ein Verbindungsobjekt (8, 9) an einem dem Elektrodenpixel (3) zugeordneten Oberflächenbereich (13) des Mikrochips (1 ) angelagert wird.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das selektive Anlagern von Verbindungsobjekten (8, 9) wiederholt wird, wodurch mehrere Verbindungsobjekte (15) pixelweise synthetisiert werden.
5. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens ein Objekt (16) spezifisch an dem mindestens einen Verbindungsobjekt (8, 9, 15) angelagert wird, wobei das mindestens eine Objekt (16) einen Antikörper oder ein Antikörpergemisch, Proteine, Peptide, DNA- Moleküle, RNA-Moleküle, PNA-Moleküle, Zuckermoleküle oder bakterielles Lipopolysaccharid darstellen oder aufweisen kann.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens ein spezifisches und/oder synthetisiertes Verbindungsobjekt (15) an der Mikrochipoberfläche (13) aufgebracht und/oder gebunden werden, dass die Verbindungsobjekte (15) derart ausgebildet sind, dass daran jeweils die zu untersuchenden Objekte (16) spezifisch binden.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass ein Verbindungsobjekt (8, 9, 15) ein reaktives Molekül aufweist, insbesondere ein Oligomer, ein Peptid- Oligomer, ein DNA-Oligomer oder ein PNA-Oligomer definierter Aminosäure- oder Nukleotidsequenz.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass das mindestens eine Objekt (16) durch Aufbringen einer Folie auf dem Mikrochip (1 ) positioniert wird, wobei auf der
Folie das mindestens eine Objekt (16) in einer räumlich vorgebbaren Weise positioniert ist.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass das mindestens eine Objekt (16) von einem Mittel zumindest teilweise umgeben ist, dass das Mittel derart ausgebildet ist, dass damit die Relativposition der Objekte (16) im Wesentlichen unverändert bleibt und dass das Mittel samt den Objekten (16) auf den Mikrochip (1 ) aufgebracht wird.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass das mindestens eine Objekt (16) mit Beleuchtungslicht (17) mindestens einer vorgebbaren Wellenlänge oder eines vorgebbaren Wellenlängenbereichs punktuell oder flächenhaft beleuchtet wird, wobei der Wellenlängenbereich sich von 280 nm bis 1000 nm erstrecken kann.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass das mindestens eine Objekt (16) evaneszent beleuchtet wird, vorzugsweise mit Hilfe eines Prismas (12), welches in einem vorgebbaren Abstand relativ zum Mikrochip (1 ) angeordnet ist und in welches Beleuchtungslicht (17) derart eingekoppelt wird, dass sich ein evaneszentes Feld (19) ausbildet, mit welchem das mindestens eine Objekt (16) beleuchtet wird.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11 , dadurch gekennzeichnet, dass das
Beleuchtungslicht (17) mit einer Lichtquelle erzeugt wird, welche kontinuierliches und/oder gepulstes Licht emittiert, und dass die Lichtquelle einen Laser, einen Temperaturstrahler oder eine Gasentladungslampe aufweisen kann.
13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass das Objekt (16) mit gepulstem Licht beleuchtet wird und dass das mindestens eine Detektionspixel (3) in einer Beleuchtungspause ausgelesen wird.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass das Objekt (16A) mit einem Absorptionsfarbstoff markiert ist und dass der Anteil des Beleuchtungslichts detektiert wird, welcher durch das Objekt (16A, 16) zu dem jeweiligen Detektionspixel (3) gelangt.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass das Objekt (16) mit mindestens einem Lumineszenzfarbstoff spezifisch markiert ist und/oder dass das Objekt (16) mit mindestens einem lumineszenzfähigen Nanokristall spezifisch markiert ist.
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass der mindestens eine Lumineszenzfarbstoff von dem Beleuchtungslicht zur Lumineszenz angeregt wird und dass das
Lumineszenzlicht von einem Detektionspixel (3) detektiert wird.
17. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass der Lumineszenzfarbstoff einen Fluoreszenzfarbstoff oder einen Phosphoreszenzfarbstoff aufweist und/oder dass der Nanokristall fluoreszenz- oder lumineszenzfähig ist.
18. Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass der
Nanokristall einen vorgebbaren hydrodynamischen Radius aufweist und/oder dass der Nanokristall ein vorgebbares Anregungs- und Emissionsspektrum aufweist, welches vorzugsweise einen hohen Stokes Shift aufweist.
19. Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass der Nanokristall einen ein Halbleitermaterial oder ein Lanthanidenmaterial aufweisenden Kern aufweist, beispielsweise eine Eurobiumverbindung, und/oder dass der Nanokristall eine Beschichtung aufweist, mit welcher ein - vorzugsweise spezifisches - Anbinden des Nanokristalls an einem Objekt begünstigt wird.
20. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass der Fluoreszenzfarbstoff einen vorgebbaren - insbesondere hohen - Stokes Shift aufweist und dass der Fluoreszenzfarbstoff
Lanthaniden-Chelat aufweisen könnte.
21. Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass der Fluoreszenzfarbstoff oder der fluoreszierende Nanokristall eine vorgebbare Fluoreszenzlebensdauer aufweist, welche vorzugsweise größer gleich 1 ms ist, dass die Objekte (16) mit dem Fluoreszenzfarbstoff bzw. dem fluoreszierenden Nanokristall spezifisch markiert sind, dass die Objekte (16) mit gepulstem Beleuchtungslicht beleuchtet werden können und dass in den Beleuchtungspausen die Detektionspixel (3) ausgelesen werden können.
22. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 21 , dadurch gekennzeichnet, dass mindestens ein Detektionspixel (3) vorgesehen ist, mit welchem das Beleuchtungslicht (17) detektiert wird, dass anhand des Detektionssignals des Detektionspixels (3) festgestellt wird, ob eine Beleuchtungspause vorliegt und/oder dass anhand des Detektionssignals des Detektionspixels (3) - beispielsweise zur Kalibrierung - auf die lokale Beleuchtungssituation rückgeschlossen werden kann, insbesondere auf die lokale Beleuchtungsstärke.
23. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass die Objekte (16) mit mindestens zwei Fluoreszenzfarbstoffen unterschiedlicher Anregungseigenschaften spezifisch markiert sind, dass für ein vorgebbares Zeitintervall einer der Fluoreszenzfarbstoffe mit
Beleuchtungslicht einer ersten Anregungswellenlänge zur Fluoreszenz angeregt wird, dass danach für ein weiteres vorgebbares Zeitintervall der andere Fluoreszenzfarbstoff mit Beleuchtungslicht einer zweiten Anregungswellenlänge zur Fluoreszenz angeregt wird und dass das Fluoreszenzlicht der zwei Fluoreszenzfarbstoffe zeitlich hintereinander detektiert wird.
24. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 23, dadurch gekennzeichnet, dass die Objekte
(16) mit mindestens zwei Fluoreszenzfarbstoffen unterschiedlicher Emissionseigenschaften spezifisch markiert sind, dass die zwei Fluoreszenzfarbstoffe mit Beleuchtungslicht einer vorgebbaren Wellenlänge zur Fluoreszenz angeregt werden, dass das Fluoreszenzlicht des ersten Fluoreszenzfarbstoffs eine erste vorgebbare Eindringtiefe in den Mikrochip (1 ) aufweist, dass das Fluoreszenzlicht des zweiten Fluoreszenzfarbstoffs eine zweite vorgebbare Eindringtiefe in den
Mikrochip (1 ) aufweist, dass die erste Eindringtiefe größer als die zweite Eindringtiefe ist und dass der Detektionsbereich der Detektionspixel (3) in mindestens zwei unterschiedlichen Abständen von der Mikrochipoberfläche (13) angeordnet sind, so dass mit den Detektionspixeln (3), die weiter von der Mikrochipoberfläche (13) beabstandet sind, das Fluoreszenzlicht des ersten Fluoreszenzfarbstoffs und mit den Detektionspixeln (3), die weniger weit von der Mikrochipoberfläche (13) beabstandet sind, das Fluoreszenzlicht des zweiten Fluoreszenzfarbstoffs detektiert werden.
25. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 24, dadurch gekennzeichnet, dass das mindestens eine Objekt (16) anstatt mit Beleuchtungslicht mit einer elektromagnetischen Welle beaufschlagt wird, um die mit dem mindestens einen Objekt (16) wechselwirkende elektromagnetische Welle oder eine von der elektromagnetischen Welle induzierte und von dem mindestens einen Objekt (16) ausgehende elektromagnetische Welle mit dem mindestens einen auslesbaren Detektionspixel (3) des Mikrochips (1 ) zu detektieren.
26. Vorrichtung zur Detektion mindestens einer Eigenschaft von mindestens einem Objekt (16), insbesondere zum Durchführen eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 25, mit einem Mikrochip (1 ), welcher mindestens einen auslesbaren Detektionspixel (3) aufweist, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t, dass das mindestens eine Objekt (16) an dem Mikrochip (1) in einer räumlich vorgebbaren Position anordenbar ist und dass das mindestens eine Objekt (16) mit Beleuchtungslicht (17) beaufschlagbar ist, um das mit dem mindestens einen Objekt (16) wechselwirkende Beleuchtungslicht (17) oder das von dem Beleuchtungslicht (17) induzierte und von dem mindestens einen Objekt (16) ausgehende Licht (20) mit dem mindestens einen auslesbaren Detektionspixel (3) des Mikrochips (1 ) zu detektieren.
27. Vorrichtung nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, dass der Mikrochip (1 ) auf der MOS- Technologie basiert, insbesondere auf der CMOS-Technologie, auf der NMOS-Technologie und/oder auf der PMOS-Technologie.
28. Vorrichtung nach Anspruch 26 oder 27, dadurch gekennzeichnet, dass ein Detektionspixel (3) eine lichtempfindliche elektronische Einheit aufweist, insbesondere eine Photodiode oder ein Photogate.
29. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 26 bis 28, dadurch gekennzeichnet, dass der Mikrochip (1 ) integrierte elektronische Schaltungen (4) zur Ansteuerung und/oder zum Auslesen der Detektionspixel (3) und/oder der Elektrodenpixel (3) aufweist und dass die Detektionspixel (3) vorzugsweise einzeln oder gruppenweise auslesbar sind.
30. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 26 bis 29, dadurch gekennzeichnet, dass der Mikrochip (1 ) mindestens einen Eletrodenpixel (3) aufweist, welcher in Form eines Hoch- oder Niederspannungspixels ausgebildet ist.
31. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 26 bis 30, dadurch gekennzeichnet, dass der Mikrochip (1) mindestens eine Ansteuer- und/oder Ausleseschnittstelle (5, 6) aufweist, welche insbesondere in Form einer I2C oder einer USB-Schnittstelle ausgebildet ist.
32. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 26 bis 31 , dadurch gekennzeichnet, dass der Mikrochip (1) von einem Steuerrechner (6) ansteuerbar und/oder auslesbar ist.
33. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 26 bis 32, dadurch gekennzeichnet, dass der Mikrochip (1) Mittel zur Verstärkung und/oder Aufbereitung der Signale aufweist, welche von einem Detektionspixel (3) auslesbar sind.
34. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 26 bis 33, dadurch gekennzeichnet, dass der Mikrochip (1) zur elektrischen Isolierung eine Beschichtung (14) aufweist, welche bevorzugt Silizium- Nitrid aufweist.
35. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 26 bis 34, dadurch gekennzeichnet, dass auf dem Mikrochip (1) eine Schicht (14) aufgebracht ist, an welcher Verbindungsobjekte (8, 9, 15) und/oder Objekte (16) anlagerbar sind, und dass die Schicht (14) mindestens eine Gattung eines Polymers und/oder ein Element der Gattung der Polyethylenglycole und/oder eine Silanisierungsschicht aufweist und dass die Schicht insbesondere ein Gemisch aus diesen Stoffen aufweist.
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