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Die
Erfindung deckt die Bereiche der Molekularbiologie, Medizinforschung,
Genomanalyse, kombinatorischen Chemie und allgemein den Bereich
der Analyse von Matrizes von Molekülablagerungen auf Trägern verschiedener
Arten ab. Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren unter Verwendung
von Vorrichtungen, die in der Technik als Biochip-, Mikrochip-,
Chip-Arrays und Mikro-Arrays bekannt sind.
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Solche
Vorrichtungen umfassen für
gewöhnlich
Träger
aus Kunststoff, Glas oder irgendwie kristallinem Material, mit oder
ohne einem abgelagerten Film. Genauer gesagt, kann der Träger aus
Glas, natürlich
oder synthetisch, speziell behandelt oder nicht, sein. Auf dem Träger wird
ein biologisches Material abgelagert. Der Träger wird von nun an auch mit
dem üblicherweise
verwendeten Ausdruck "Objektträger" bezeichnet. Das
biologische Material, für gewöhnlich DNA,
cDNA, mRNA, PNA, Protein oder synthetisches Oligonukleotid oder
irgendein Komplex aus Peptiden, wird in einer geometrischen Matrixanordnung
(Mikro-Array oder Makro-Array genannt) abgelagert. Der Träger ist
nur einige Zentimeter lang, hat eine rechteckige oder quadratische
Form und eine Dicke von wenigen Millimetern. Die Ablagerung wird
für gewöhnlich mit
Systemen durchgeführt,
die für
die Mikro- oder Nanoablagerung geeignet sind, mit denen Ablagerungen
in einer Größenordnung von
Mikrometern in Querrichtung parallel zur Trägerebene möglich sind. Der Abstand zwischen
den Positionen der Ablagerungen (im folgenden auch "Stellen" genannt) kann von
Mitte zu Mitte bis zu mehrere zehn Mikrometer betragen. In den vorliegenden
Systemen betragen die am meisten eingesetzten Größen um die 100 Mikrometer.
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Die
Ablagerungen von biologischem Material werden "Proben" genannt und sollen komplementär zu denen
sein, mit denen sie hybridisieren sollen, "Targets" genannt. Die Analyse besteht in dem
Nachweis, ob tatsächlich
eine Komplementarität
zwischen den Proben und Targets besteht und zu welchem Ausmaß, sowohl
für jede
einzelne Stelle als auch für jede
Stelle in bezug auf die anderen. Sofern eine solche Komplementarität besteht,
hat vermutlich das Hybridisierungsverfahren stattgefunden. Der Ausdruck
Hybridisierung wird üblicherweise
in vielen Bereichen verwendet. Im Folgenden hat er die weiteste Bedeutung
und deckt jede Art einer chemischen Verbindung zwischen den Molekülen, die
die Proben und Targets bil den, ab. Die Moleküle können Proteine, Nukleinsäure oder
können
irgendwelche chemischen oder biologischen Produkte sein. Hybridisierung kann
stattfinden oder nicht. Wenn sie stattfindet, kann sie dies in unterschiedlichen
Ausmaßen
tun. Wenn beispielsweise eine Genstudie durchgeführt wird, wird ein Gen in einem
kleineren oder größeren Ausmaß in einem
Organismus oder einem Individuum "exprimiert". Eine Genexpression ist nicht bei jeder
Anwendung zu finden.
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Im
weitesten Sinne kann das Verfahren zur Messung der Hybridisierung
einen Schritt der Behandlung der Targets umfassen. Bei ihrer Herstellung werden
diese mit farbigen, fluoreszierenden Substanzen, die Licht auf einem
definierten Wellenlängenspektrum
emittieren, oder mit Substanzen, die Teilchen aus radioaktivem Zerfall
emittieren, markiert. Die so markierten Verbindungen, die oftmals
in einer Lösung
enthalten sind, werden auf dem Träger abgelagert. Dort hybridisieren
einige der Targets mit einigen der Proben und bleiben daran haften.
Durch eine geeignete Wäsche
des Objektträgers,
bleiben nur die hybridisierten Targets an den Proben auf dem Träger haften.
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Die
Analyse der Lokalisierung und Quantifizierung einer solchen Hybridisierung
beginnt mit diesem Zeitpunkt und bildet das Ziel der vorliegenden Erfindung.
Eine solche Analyse findet für
gewöhnlich durch
den Nachweis der Teilchen, die durch die Targetmoleküle in den
hybridisierten Stellen emittiert werden, statt. Solche Teilchen
können
Photonen oder Elektronen sein, die durch Nuklearzerfall emittiert
werden. Damit die markierten Moleküle Photonen emittieren können, sofern
sie mit fluoreszierenden Verbindungen wie Cy5 markiert worden sind, müssen sie
bei geeigneten Wellenlängen
durch Strahlung aus einer geeigneten Licht- oder Laserquelle angeregt
werden.
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Das
Lesen der Hybridisierungsstellen wird sowohl zur Bewertung der Expression
einiger Gene als auch zur Bestimmung der Sequenz verwendet, indem
geeignete Genfragmente eingeführt
werden. Die vorliegende Erfindung deckt diese Anwendungen und alle
die, die die Verwendung des Nachweises von Hybridisierungsstellen
nutzt, ab.
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Unter
dem Nachweis von Hybridisierungsstellen verstehen wir hierin den
Nachweis der Position und/oder die Quantifizierung der hybridisierten Moleküle.
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Das
verbreitetste Verfahren zum Nachweis der Hybridisierungsstellen
basiert auf Fluoreszenz. In den meisten der vorliegenden Systeme
führt ein
mechanisches System das Scannen aller Hybridisierungsstellen durch
deren Bestrahlung mit einem Laser durch, um die wahrscheinlichste
Wellenlängenemission
der Färbung
anzuregen. Der Detektor, der das Licht aus dieser Emission sammelt,
ist für
gewöhnlich
ein Photomultiplier. Dies ist die verbreitetste Konfiguration. In
den meisten Fällen
werden Systeme mit Gaslaser und großen Photomultipliern, die außerdem Kühlung erfordern,
verwendet. In den neuesten Systemen werden kompaktere Halbleiterlaser und
bis zu vier fluoreszierende Substanzen verwendet. Unter den jüngsten Versuchssystemen
befinden sich einige, die den Nachweis mit einem CCD-Detektor (Ladungsspeicherbaustein)
durchführen,
der immer mit einem Lasersystem mit geeigneten Linsen und Filtern
und einem geeigneten Kühlsystem
verbunden ist.
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Die
Zeit, die zur Analyse eines Trägers
oder Objektträgers
erforderlich ist, hängt
größtenteils
von der Anzahl der Stellen, der Anzahl der fluoreszierenden Substanzen
und von den Kosten der Ausrüstung ab.
Das verbreitetste Lesesystem ist von einer Firma mit dem Namen Affymetrix
entwickelt worden. Dieses System ermöglicht die eingeschränkte Verwendung von
Proben. Die Zeit zum Scannen, Lesen und zur Analyse kann ein paar
Stunden betragen, mit einem Minimum von ein paar Dutzend Minuten.
Das gleiche gilt für
alle Systeme, die in einem Labor entwickelt wurden (wie "Pat Brown", P. O. Brown et
al. "Exploring the
new world of the genome with DNA microarrays" Nature Genetics suppl. Bd. 21, 33–37 (1999)). Alle
diese Systeme sind langsam und sehr teuer, auch wegen der komplexen
Herstellung und der Verwendung von Markern. Ferner werden in vielen
Laboratorien die Objektträger
während
der Versuchsphase wiederverwendet. Aus diesem Grund müssen sie gewaschen
werden, können
aber nicht immer vollständig,
insbesondere von den fluoreszierenden Substanzen, gereinigt werden,
deren Anwesenheit bei der anschließenden Analyse die Ergebnisse
verfälscht.
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Beispielsweise
zeigen fluoreszierende Substanzen wie die üblichen Cy3 oder Cy5 nicht
immer dieselbe Anhaftung an das Target, wobei dies von vielen physikalischen
und chemischen Faktoren wie den thermodynamischen Bedingungen usw.
abhängt.
Auch die stöchiometrische
Besetzung der Moleküle
kann die Hybridisierungskapazität
beeinflussen. All dies beeinflußt
neben der Beeinflussung der erforderlichen Quantität des Materials
auch die Expressionskapazität.
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Mit
der Sequenzierung des menschlichen Genoms und einer großen Anzahl
von Mikroorganismen wird es mehr und mehr wichtig, den Unterschied von
Genexpression zwischen Organismen oder Zellen, die verschiedenen
Reizen unterliegen (zum Beispiel Tumorzellen vs. normale Zellen,
Reaktion von Säuger-
oder Bakterienzellen auf verschiedene Arzneimittel ...) zu bestimmen.
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In
den folgenden Jahren wird auch eine neue Technik eine bedeutende
Entwicklung erfahren, nämlich
die Proteomik. Diese Technologie soll sowohl die Funktion verschiedener
Proteine, die durch die Gene codiert werden, die durch systematische
Sequenzierung nachgewiesen wurden, als auch die unterschiedlichen
Wechselwirkungen, die zwischen den Proteinen bestehen, herausfinden.
Der Doppelhybridassay ermöglicht
den Nachweis verschiedener Proteine, die mit einem "Köder"-Protein interagieren. Diese Technik
erfordert es, ein ähnliches
System wie das, das von Finley und Brent (Interaction trap cloning
with yeast, 169–203,
in DNA Cloning, Expression Systems: a practical Approach, 1995,
Oxford Universal Press, Oxford) beschrieben wird, und eine cDNA-Bibliothek,
um die Beute zu finden, zur Verfügung zu
haben.
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Es
wäre daher
sehr vorteilhaft, ein Protein-Array, das einen gesamten Bereich
von Proteinen (Rezeptoren, Enzyme ...) abdeckt, zur Verfügung stellen
zu können,
und unterschiedliche Verbindungen an dem Protein-Array testen zu
können.
So könnte
in einem Experiment nachgewiesen werden, welche Proteine mit den
getesteten Verbindungen interagieren. Die Verbindungen könnten daher
Proteine sein (um Protein-Protein-Interaktionen zu finden), aber
auch andere, wie chemische Verbindungen, die als Arzneimittel, Peptide,
Lipide, Kohlenhydrate oder Hybrid- (Peptid-Lipid, Peptid-Zucker
...) -Verbindungen verwendet werden können. Es wird in Betracht gezogen,
daß eine
Sammlung kleiner Verbindungen in einem Screening mit hohem Durchsatz
nach dem Nachweis interessanter pharmazeutischer Targets, wie Rezeptoren,
getestet werden kann.
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Derzeit
ist es schwierig eine solche Analyse durchzuführen, da die Markierung kleiner
Verbindungen routinemäßig nicht
leicht durchzuführen
ist und da die Markierung der Verbindungen auch die Interaktion
zwischen den Proteinen auf dem Chip und den markierten Verbindungen
hemmen könnte.
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Das
existierende System hat nicht wirklich eine Antwort auf die Probleme.
Wie erkennbar sein wird, ermöglicht
die vorliegende Erfindung die volle Ausnutzung der intrinsischen
Kapazität
des Biochip-Arrays, ungeachtet des Wesens der Proben, die auf dem
Objektträger
fixiert sind (DNA, Protein, andere Arten von Verbindungen).
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Unter
den Anwendern der Systeme ist es eine international weit verbreitete
Meinung, daß diese
noch weiter verbessert werden können.
Dies trifft insbesondere für
die funktionelle Analyse von Tumorzellen und deren Expression zu.
Daher werden die vorliegenden Systeme hauptsächlich für Versuchszwecke verwendet.
Die vorliegende Erfindung kann mit den relevanten Folgen im klinischen
und daher sozialen Bereich in größerem Maßstab angewendet werden.
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Die
Systeme zum Lesen der Expression und experimentell zum Lesen der
Sequenz, die derzeit vermarktet werden, basieren nahezu alle auf
Markern, außer
bei der Nutzung der Massenspektrometrie, einem sehr teuren und wenig
flexiblen System, das überhaupt
für eine
simultane Detektion ungeeignet ist. Als Beispiele können wir
die Firmen anführen, die
fluoreszierende Substanzen verwenden, wie Affymetrix, Molecular
Dymanics, Nanogen Protogene, Synteni oder auch radioaktive Substanzen,
wie Hyseq, Incyte oder auch Massenspektrometer (Brax, Sequenom).
Alle diese Systeme sind sehr teuer und erfordern Zeit zur Herstellung
und zum Scannen. Die fortschrittlichsten und schnellsten Systeme
sind die von Virtek und Asper. Letzteres, noch in der Versuchsphase,
nutzt einen CCD-Detektor (Ladungsspeicherbaustein), der teuer ist,
Kühlung
erfordert und mindestens 1000 Mal langsamer ist, als das hierin
vorgeschlagene.
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Es
sind einige frühere
Patente in ähnlichen Bereichen
wie die vorliegende Erfindung eingereicht worden.
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In
WO-96 07917, eingereicht von Nanogen und veröffentlicht am 14. März 1996,
wird ein elektronisches System mit einer Vielzahl von Elektroden
für den
Nachweis molekularer Prozesse offenbart. Der Nachweis findet durch
elektrische Induktion, d. h. durch den Transport von Ladungen oder
Strom von einer Position an der Hybridisierungsstelle zu einer im
Sammelkreislauf (2b), statt.
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WO-99
32877, eingereicht von Spektrumedix und veröffentlicht am 1. Juli 1999,
offenbart ein Nachweissystem, das einen Transmissionsgitter-Strahlungsteiler
(TGBS) (1) umfaßt, der den Strahl sammelt
und wieder in Richtung eines Detektors ausstrahlt, der die Hybridisierungsstellen
aus der Analyse der Interferenzfiguren, die von einer CCD-Kamera
gesammelt werden, unterscheiden kann.
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US-5
571 410, eingereicht von Hewlett Packard und veröffentlicht am 24. April 1996
betrifft ein Verfahren und ein System zur Analyse der Trennung biologischer
Moleküle.
Es setzt voraus, daß unter den
Nachweisverfahren die sind, die auf der direkten Absorption und
unter Verwendung von Markern basieren, aber nicht für Hybridisierungsstellen
oder für Moleküle an den
Trägern,
da sie in Bewegung sind. Dieses Patentdokument stellt das "Micro-Tas"-System allgemein hinsichtlich seiner
Konfigurationen und Konstruktion und der Implementationsverfahren, aber
nicht deren Nachweis dar.
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Ein
anderes Beispiel für
ein Patent über
die Detektion in Biochip-Arrays oder biochemischen Array-Systemen,
wie erwähnt,
ist US-5 633 724, eingereicht von Hewlett Packard und veröffentlicht
am 27. Mai 1997. Es basiert auf einem Scann- und Nachweisverfahren
mit Licht durch Phasenvariation der elektromagnetischen Strahlung,
nachdem letztere durch einige Materialien gelaufen ist.
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In
US-6 017 435, eingereicht von Imperial College und veröffentlicht
am 14. November 1996, wird der Nachweis durch Elektrophorese unter
Verwendung sich bewegender Moleküle
durchgeführt. Diese
findet durch Absorption statt und sorgt für das Lesen der Ja/Nein-Antwort in Gegenwart
der Moleküle.
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Verschiedene
Patente der oben genannten Firmen betreffen die Verfahren zur Ablagerung
in einer Matrixgeometrie und deren Lesen. Wie bereits erwähnt sind
diese Verfahren sehr spezifisch. Das Lese- oder Nachweissystem ist
typisch für
das Ablagerungssystem. Die von Affymetrix eingereichten Patente,
die diese Systeme betreffen, sind ein Beispiel. Beispielsweise beschreibt
US-5 968 740 ein Nachweisverfahren der Stellen und die Verwendung
des Expressionsgrades. Die in 13 gezeigte
Ablesung nutzt ein Scannsystem mit Markern.
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Keines
der Affymetrix-Patente betrifft die vorliegende Erfindung, die sich
genau genommen nicht mit dem Lesen biologischer Daten (zum Beispiel
einer Mutation aus dem Vergleich unterschiedlicher Expressionen
aus unterschiedlichen Hybridisierungsstellen), jedoch mit dem Nachweis
der Stellen und der Quantifizierung der Hybridisierung beschäftigen.
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Es
folgen die signifikantesten Veröffentlichungen
in ähnlichen
Bereichen.
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Der
Nachweis molekularer Substanzen durch Bestrahlung mit elektromagnetischer
Strahlung ist seit den Anfängen
der Molekularbiologie allgemein bekannt. Üblicherweise nutzen wir die
Strahlung, die in einem eingeschränkten Anwendungsbereich der
vorliegenden Erfindung beschrieben wird, in einem Intervall zwischen
rund 190 nm und 300 nm (F-UV) zuvor beschrieben, und dem zwischen
rund 300 nm und 700 nm (UV). Dies ist insbesondere unter dem Namen
der molekularen Bildgebung oder einfach UV-Bildgebung bekannt, worunter
oftmals das Intervall, das hierin richtigerweise als EUV bezeichnet
wird, gemeint ist. Diese Verfahren nutzen das physikalische Prinzip
der Absorption von Molekülen,
die mit mehr oder weniger schädlichen
Markern markiert sind oder nicht (EtBr, P usw.).
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Beispielsweise
beschrieben P. Clarke et al. (Analytical Biochemistry 124, 88–91 (1982) "Ultraviolet Imaging:
a simple method for detecting nucleic acids in preparative gels") ein Verfahren mit
Elektrophoresegelen. Diese vertrauen auf Arbeiten an der Messung
der Absorption, die unter anderem von M. N. Kiseleva et al. (Biofizika
20: Nr. 4. 561–565.
1975, "Absorption
spectra of nucleic acids and related compounds in the spectral region
120–280
nm") beschrieben
werden, d. h. auf ein allgemein bekanntes und gemessenes physikalisches
Phänomen,
auf das ein Teil der vorliegenden Erfindung vertraut. Analog ist dies
bei S. M. Hassur et al. (Analytical Biochemistry 59, 162–164 (1974) "UV shadowing-a new
and convenient method for the location of ultraviolet-absorbing
species in polyacrylamide gels")
der Fall. Diese Veröffentlichungen
beziehen sich auf den Nachweis von Gelfragmenten von Molekülen unterschiedlicher Art
(Nukleinsäuren
und ähnliche
Verbindungen). Die Veröffentlichung
von M. N. Kiseleva et al. liefert einen allgemeineren Überblick,
stellt jedoch nicht ein System bereit.
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In
A. Mahon (IEEE NSS Conf. Rec. 3, 1462 (1996)) wird das Verfahren
von S. Hassard et al. mit einem Beispiel für den Molekülnachweis dank ihrer Bewegung
dargestellt.
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In
A. Mahon et al. (Phys. Med. Biol. 44 (1999) 1529–1541) werden die Ergebnisse
des Nachweises für
die aufgetretene Absorption von DNA-Fragmenten in der Elektrophorese
durch CCD-Detektoren dargestellt, wie in US-6 017 435. Das System
ist nicht empfindlich genug, um damit den Unterschied zwischen einem
Basenpaar nachzuweisen, ein Unterschied, der zur Bestimmung der
Sequenz notwendig ist.
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WO
99/27140, Vo-Dinh, T. et al., ("DNA
Biochip using a phototransistor integrated circuit", Anal. Chem. Bd.
71, 358–363
(1999) und Vo-Dinh ("Development
of a DNA biochip: principle and applications" Sensors and Actuators, Bd. 51, 52–59 (1998),
offenbaren DNA-Biochips,
die Photosensoren, Verstärker, Diskriminatoren
und Logikverschaltungen umfassen, sowie Verfahren zur Verwendung
dieser Chips zum Nachweis markierter Nukleinsäuren, die an Proben hybridisieren,
die an der Oberfläche
der Chips immobilisiert wurden.
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Ein
Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens, das
den Nachweis der Position mehrerer Hybridisierungsstellen auf einem
Träger und
die Quantifizierung der so hybridisierten Targets, insbesondere
des Niveaus der Hybridisierung, leichter und schneller macht.
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Demgemäß liefert
die Erfindung ein Verfahren nach Anspruch 1.
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Demgemäß können die
Ergebnisse für
alle Stellen gleichzeitig erhalten werden, wodurch das Scannen zu
einem optionalen Vorgang wird.
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Unter "Quantifizierung der
Targets" ist der Vorgang
der Bestimmung, ob eine Hybridisierung eines Targets an jeder Stelle
stattgefunden hat oder nicht, und gegebenenfalls das Studium der
stattgefundenen Hybridisierung im Hinblick auf die Targets, die
an der Stelle hybridisiert haben, das Wesen der Targets, ihre räumliche
Disposition usw. zu verstehen.
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Das
Verfahren der Erfindung kann auch zumindest eines der Merkmale nach
den Ansprüchen
2 bis 8 zeigen.
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Das
Verfahren der Erfindung kann mit einer Vorrichtung durchgeführt werden,
die mindestens eines der folgenden Merkmale zeigt:
- – der
Detektor ist so angeordnet, daß er
die Strahlung empfängt,
nachdem diese den Träger
passiert hat;
- – die
Mittel zur Quantifizierung sind so angeordnet, daß die Menge
der hybridisierten Targets an einigen Stellen bestimmt werden kann;
- – die
Quelle ist eine Gasentladungslampe;
- – die
Quelle ist eine Laserquelle, bevorzugt eine Halbleiter- oder Gaslaserquelle;
- – sie
umfaßt
eine Linse oder ein System von Linsen, angeordnet vor oder nach
dem Träger
in der Bahn der Strahlung;
- – sie
umfaßt
ein Mikrolinsensystem, das vor oder nach dem Träger in der Bahn des Trägers angeordnet
ist, so daß die
maximale Intensität
der einfallenden Strahlung passieren kann;
- – sie
umfaßt
einen Monochromator oder ein Filtersystem zur Auswahl der Durchdringungsenergie der
einfallenden Strahlung vor oder nach dem Träger;
- – das
Mittel zur Quantifizierung umfaßt
eine elektronische Leseschaltung, die mit dem Detektor verbunden
ist und bevorzugt direkt an den Detektor geschweißt oder
geklebt oder direkt aus dem Detektor gewachsen ist;
- – die
elektronische Leseschaltung ist eine vom Typ VLSI ("höchstintegrierter Schaltkreis");
- – der
Mikroelektrodendetektor wird durch Anschlüsse auf einem Halbleitermaterial
gebildet;
- – das
Halbleitermaterial wird aus der Gruppe ausgewählt, bestehend aus: Silicium
mit hohem Widerstand, synthetischem Diamant, einer Gallium-basierenden
Verbindung oder einer Verbindung, die Gallium und Aluminium enthält;
- – der
Halbleiter weist implantierte Kontakte auf, mit denen Anschlüsse in Diodenkonfigurationen gebildet
werden können;
- – der
Abstand zwischen den Mikroelektroden ist von Mitte zu Mitte im wesentlichen
derselbe wie der Abstand zwischen den Hybridisierungsstellen;
- – der
Abstand zwischen den Stellen und/oder zwischen den Mikroelektroden
liegt in einem Intervall im Bereich von 1 Mikrometer bis 1 Zentimeter;
- – das
Mittel zur Quantifizierung ist so angeordnet, daß die Ladung in elektrischen
Strom umgewandelt wird;
- – das
Mittel zur Quantifizierung umfaßt
ein Verstärkersystem;
- – der
Träger
für die
Proben ist aus Glas mit dünnen
Filmen aus einem anderen Material; und
- – der
Träger
für die
Proben ist aus einem Kunststoffpolymer.
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Andere
Merkmale und Vorteile der Erfindung werden in der folgenden Beschreibung
der bevorzugten Ausführungsformen
anhand der Zeichnungen ersichtlich, von denen:
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1a einen
Pixelmatrixdetektor einer Ausführungsform
der Vorrichtung, die zur Durchführung des
Verfahrens der Erfindung verwendet wird, zeigt;
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1b eine
Matrix zeigt, die eine Biochip-Array der Vorrichtung aus 1 bildet;
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2a eine
Ausführungsform
der Vorrichtung, die zur Durchführung
des Verfahrens der Erfindung verwendet wird, die keine Marker nutzt,
veranschaulicht;
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2b eine
Ausführungsform
der Vorrichtung, die zur Durchführung
des Verfahrens zum Nachweis der Hybridisierung unter Verwendung
von Markern verwendet wird, veranschaulicht;
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3a eine
perspektivische Explosionsansicht einer Ausführungsform der Vorrichtung,
die zur Durchführung
des Verfahrens der Erfindung verwendet wird, ist;
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3b eine
perspektivische Montageansicht der Vorrichtung aus 3a ist;
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4 eine
reale Veranschaulichung der Vorrichtung, die zur Durchführung des
Verfahrens der Erfindung verwendet wird, ist;
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5 eine
andere Ausführungsform
der Vorrichtung, die zur Durchführung
des Verfahrens der Erfindung verwendet wird, schematisch veranschaulicht.
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Die
unmittelbare Erfindung liefert ein Verfahren zum Nachweis der Position
von mehreren Hybridisierungsstellen auf einem Träger, der abgelagerte Proben
mit hybridisierten Targets, die nach einem Waschschritt darauf zurückbleiben,
enthält.
Das Verfahren umfaßt
die folgenden Schritte:
- – Emittieren einer Strahlung
aus einer Quelle in Richtung des Trägers;
- – Emittieren
der Strahlung, die aus dem Träger kommt,
an einem Mikroelektrodendetektorsystem, das gegenüber der
Strahlung empfindlich ist; und
- – Quantifizierung
der Targets in unterschiedlichen Stellen des Trägers zur gleichen Zeit.
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Die
Erfindung besteht aus einem Verfahren zum Nachweis der Position
mehrerer Hybridisierungsstellen. Die Targets sind molekulare Verbindungen
wie Nukleinsäuren,
DNA, RNA, Proteine, synthetische PNA usw. Die Erfindung kann einen
solchen Nachweis beispielsweise in tausenden unterschiedlichen Stellen
zur gleichen Zeit durch die Quantifizierung von Molekülen mit
einem Mikroelektrodendetektorsystem durchführen, das gegenüber der
Strahlung empfindlich ist, die direkt aus der Quelle auf den Träger der
hybridisierten Moleküle
und da her auf den Detektor einwirkt, zum Beispiel nachdem sie hindurchgedrungen
ist. Der Träger
enthält
ablagerte Proben und hybridisierte Targets, die nach dem Waschen
weiter anhaften. Das System umfaßt einen Detektor, der die
Position unter Verwendung elektromagnetischer Strahlung oder Kernzerfall,
erstere bevorzugt in einem Intervall zwischen 1 eV und 6 eV, nachweist.
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Genauer
gesagt umfaßt
das System eine Strahlungsquelle. Es können unterschiedliche Arten von
Strahlungsquellen gemäß der Empfindlichkeit des
Detektors, der mit dieser Quelle verbunden ist, verwendet werden.
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Das
System umfaßt
einen Träger,
wo die Hybridisierung stattfindet. Dieser Träger kann aus Glas, Kunststoffpolymer,
Nylon mit oder ohne Glas, Saphir, synthetischem Diamant oder Quarz
sein. Der Träger kann
einen ablagerten Film aus synthetischem Material aufweisen.
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Das
System umfaßt
einen Detektor, bevorzugt in Form eines Wafers, bevorzugt durch
ein Halbleitermaterial gebildet, wo eine Ionisierungsreaktion, hervorgerufen
durch die einfallende Strahlung, stattfindet. Der Wafer enthält Mikroelektroden,
bevorzugt Dioden, erhalten durch Anschlüsse oder Mikroimplantation,
die Ladungen, erzeugt durch die Ionisierung oder einen Strom an
einer elektronischen Schaltung, die bevorzugt integriert ist ("VLSI", "Ultrahöchstintegriert"), sammeln können. Die
Elektroden können
Mikrodioden sein, wobei der Abstand zwischen diesen dem zwischen
den Mitten der Stellen, wo die Hybridisierung stattfinden soll,
gleicht. Die Dioden können
zig Tausend sein.
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Das
System umfaßt
bevorzugt einen kompakten integrierten Schaltkreis, der zum Beispiel
die Ladung oder den Strom, erzeugt durch die Ionisierung, liest,
und, wenn getrennt von dem Detektorwafer, Bondkontakte in Richtung
der Dioden, bevorzugt (jedoch nicht notwendigerweise) mit gleichen
Abständen
dazwischen, aufweist.
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Die
Strahlungsquelle wird über
oder unter dem Träger
der Proben, die diese vollständig
bestrahlt, plaziert. Der Strahlungsquelle folgt der Detektor, an
den der integrierte Schaltkreis möglicherweise befestigt oder
geschweißt
wird. Die Informationen, die von dem elektronischen Schaltkreis
gesammelt werden, werden digitalisiert und auf einen normalen elektronischen
Prozessor der neuesten Art übertragen.
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Das
Verfahren besteht aus dem Nachweis der Stellen, wo die Hybridisierung
der Proben, die an dem Träger
angebracht sind, mit nacheinander abgelagerten und zu studierenden
Targets stattfand. Einige der Targets hybridisieren, andere nicht.
Danach entfernt ein Waschvorgang die Targets, die nicht hybridisierten.
Dann wird der Träger
bestrahlt, möglicherweise
für weniger
als eine Sekunde, wobei die genaue Zeit unter Berücksichtigung
der Anzahl der Hybridisierungsstellen und des Lesens bestimmt wird.
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Alle
Hybridisierungsstellen und Leseelemente (bevorzugt Dioden) werden
gleichzeitig bestrahlt. Jede Diode (oder Elektrode), die die Strahlung
sammelt, hat eine Position, die der Probe des Glasträgers, durch
den diese Strahlung dringt, entspricht.
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Ausführlichere
Ausführungsformen
des Systems, das zur Durchführung
des Verfahrens der Erfindung verwendet wird, werden hierin nachstehend
beschrieben.
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In
bezug auf 1a ist das Schaubild 1001 ein
Pixelmatrixdetektor 1002. Der Detektor umfaßt Pixel,
gebildet aus Elektroden oder komplexeren Systemen 1006 auf
einem Wafer aus Halbleitermaterial mit rechteckiger Form. Alternativ
kann er jedoch die Form einer Scheibe oder eines Quadrats haben. Die
Pixel sind in Säulen
abgeschieden, die voneinander beabstandet sind. Der Abstand 1004 zwischen Pixeln
einer Säule
ist beispielsweise derselbe wie der Abstand 1005 zwischen
Säulen.
Er kann im Bereich von wenigen Mikrometern bis wenigen Zentimetern liegen.
Der Detektor umfaßt
in diesem Fall Sammelleitungen 1003, mit denen die elektrischen
Signale, die in den Pixeln erzeugt werden, gesammelt und nach außen in einen
elektronischen Schaltkreis gebracht werden können.
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In
bezug auf 1b ist das Schaubild ein Beispiel
eines Schemas einer Matrix, die eine Biochip-Array 2001 mit
Adhäsionsstellen 2002 von
Proben zur Hybridisierung zwischen Proben und Targets bildet. Die
Stellen sind auch in Säulen
angeordnet. Die Abstände 2004 zwischen
ihnen sind denen zwischen den Säulen
aus Pixeln gleich. Der Abstand zwischen benachbarten Stellen ist
derselbe wie der Abstand zwischen benachbarten Pixeln. Die Größen jeder
Stelle 2005 des Arrays hierin folgen denen des Detektors,
obgleich diese nicht notwendigerweise gleich sein müssen. Solche
Größen werden
so ausgewählt,
daß sie
höchstens
so viele Stellen wie Detektorpixel enthalten. Die Ecken des Biochips 2006 und
des Detektors 2007 hängen
von einfachen Konstruktionsbeschränkungen ab und sind so, daß sich Detektor
und Biochip überlappen.
Die Zeichnung ist nicht maßstabsgerecht.
Die Größen der
Seiten 2005 liegen zwischen einigen Millimetern und zig
Zentimetern. Liegt der Biochip über
dem Detektor, so korrespondieren die Stellen jeweils mit den Detektorelektroden,
wie in den anderen Figuren gezeigt. Jedem Pixel entspricht eine
Hybridisierungsstelle. Selbstverständlich sind andere räumliche
Anordnungen der Pixel vorstellbar (in Linien, Arrays, isolierten
Pixeln usw.).
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2a veranschaulicht
eine Ausführungsform
des Systems aus den 1a und 1b, das keine
Marker nutzt. Die Quelle 3001 ist eine Entladungs-, Elektroden-
oder Plasmalampe oder sogar ein Gas-, Halbleiter- oder Plasmalaser,
die in einer oder mehreren Wellenlängen der maximalen Absorption
für die
Elemente, aus denen die bestrahlten Moleküle bestehen, emittiert. In
diesem Beispiel liegt die Quelle über dem Träger. Die Quelle bestrahlt alle Proben
des Biochips 2001, das heißt die Proben 3002,
die allein bleiben, ebenso wie die Proben, die mit den hybridisierten
Targets 3003 verbunden sind. Die Strahlung 3004 dringt
zuerst durch diese hindurch (im Biochipstadium), erreicht dann den
Detektor 1002, der unter dem Biochip 2001 abgelagert
ist. In dem Detektor 1002 wird der Halbleiter durch die Strahlung
ionisiert und erzeugt Ladungen, die gesammelt und in einen digitalen
integrierten Schaltkreis 3006 übertragen werden, mit dem zum
Beispiel die Menge der absorbierten Strahlungsenergie an jeder Stelle
quantifiziert werden kann. Der elektronische Schaltkreis wird mit
Bondkugeln 3008 an den Detektor gelötet. Die Ergebnisse werden
mittels computergestützter
Verarbeitungsmittel 3007 verarbeitet.
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2b veranschaulicht
eine Ausführungsform
des Systems, das Marker nutzt. Die Quelle 4001 ist eine
Entladungs-, Elektroden- oder Plasmalampe oder ein Gas-, Halbleiter-
oder Plasmalaser, die in einer oder mehreren der Wellenlängen der
maximalen Absorption und Reemission der Marker, mit denen die Moleküle des bestrahlten
Organismus oder der bestrahlten Verbindung gemischt werden, emittieren. In
dem Beispiel werden die Proben 4002, die nicht hybridisieren
sowie die Proben mit hybridisierten Targets 4003 bestrahlt.
Die Strahlung 4004 dringt zuerst durch diese hindurch und
erreicht dann den Detektor 4005. Der Detektor 2001 wird
durch einen Halbleiter gebildet, der durch die Strahlung ionisiert
wird und in dem Ladungen erzeugt, gesammelt und zu einem digitalen
integrierten Schaltkreis 4006 übertragen werden, mit dem die
Menge der Strahlungsenergie pro Wellenlänge quantifiziert wer den kann.
Die Ergebnisse werden wiederum mit computergestützten Verarbeitungsmitteln 4007 verarbeitet,
die zum Beispiel einen Standard-PC umfassen.
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Die
Ausführungsform
aus 2a wird in 3a in
Explosionsansicht gezeigt, und der Schaltkreis 3006 ist
ein elektronischer VLSI-Schaltkreis. Die kugelförmigen Elemente 3008 sind
Verschweißungen zur Bindung des Biochips 2001 an
den Detektor 1002, der auf der Oberseite des Schaltkreises 3006 unter
dem Biochip 2001 plaziert ist, der durchsichtig mit hybridisierten
Targets 3003 dargestellt wird. Proben mit oder ohne Targets
werden in jedem Quadrat plaziert. Die Ausführungsform hier umfaßt auch
Karten 5007 für
die weitere Digitalisierung und Übertragung
von Daten zu einem Prozessor, der in dem Schaltkreis enthalten sein
kann oder nicht. 3b zeigt dieselben Elemente
wie 3a, die nun zusammengebaut sind. Die Größen sind
dieselben wie die der Beispiele 1a und 1b.
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In 4 wird
eine schematische Veranschaulichung des endgültigen Systems nur anhand eines
Beispiels gezeigt. Sie zeigt die beschriebene Quelle 3001 (zum
Beispiel eine UV-Quelle),
die sich in einem Gehäuse
mit einer Öffnung
zur Aufnahme der Hybridisierungstargets 3003 auf dem Glasträger 2001 und
des Schaltkreises, der an den Detektor 1002 angebaut ist,
befindet.
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Da
die Targets keine Marker enthalten, hängt die Quantität der Ladung
von der Anzahl hybridisierter Moleküle ab. Genauer gesagt, je kleiner
die Ladung, um so größer die
Anzahl hybridisierter Moleküle
und umgekehrt. Sind die Targets markiert, können wir den Bindungsgrad bestimmen,
in dem die Quantität
der durch den Detektor gesammelten Ladung an dem möglichen
Energieintervall der reemittierten Strahlung in Betracht gezogen
wird. Tatsächlich hängt die
Intensität
der gesammelten Strahlung von der Größe des hybridisierten Fragments
ab. Enthalten die Targets eine fluoreszierende Substanz, wird die
Strahlung mit einer anderen Energie gemäß der Substanz und der Quantität des tatsächlich an
der Probe befestigten Targets reemittiert. Soll ein Energieintervall
gewählt
werden, können
wir eine geeignete Monochromatorstrahlung oder eine Reihe von Filtern
sowohl zwischen die Quelle und den Träger als auch zwischen den Träger und
den Detektor einschieben, um einen Detektor mit integrierter Energiewahl
durch das darin abgelagerte Material einzukalkulieren. Dieses Material
kann zum Beispiel eine Verbindung aus Al, Ga und N sein. Siehe zum
Beispiel J. L. Pau et al. "High
visible rejection AlGaN photodetectors on Si(111) substrates", Appl. Phys. Lett.
76, 2785 (2000), E. Monroy et. al., "AlxGal – xN:Si Schottky barrier photodiodes
with fast response and high detectivity" Appl. Phys. Lett. 73, 2146 (1998),
M. Razeghi et al., "Semiconductor
ultravioletdetectors" J.
Appl. Phys. 79, 10 (1996) 7433–7473.
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Die
sammelnden elektrischen Elemente (Elektroden oder Dioden) werden
fest positioniert, eines für
jede Probenstelle. Da man weiß,
welche Probe in einer bestimmten Stelle des Trägers plaziert wurde und unter
Berücksichtigung
der Stellen, die als hybridisiert nachgewiesen wurden, ist es möglich, die Genexpression
zu bestimmen, wenn geeignete Proben abgelagert wurden, da diese
gleichzeitig mit dem jeweiligen elektrischen Signal verbunden sind.
Das Verfahren ist im allgemeinen auf jede Art der Probenbefestigung
auf Glasträgern,
Polymer oder Quarz oder dergleichen, mit oder ohne weitere Ablagerungen,
z. B. polymerisierte, anwendbar. Beispielsweise können wir
Oligonukleotide, DNA für
Genmutationsprofile oder den Extrakt aus Tumorzellen für das Studium
der Anlagerung von Grundsubstanzen für Antitumorarzneimittel usw.
verwenden.
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Der
Abstand zwischen den Nachweiselementen kann jeder Abstand bis zu
einigen zig Mikrometern in beide Richtungen, quer zu der einfallenden Strahlung,
sein. Im Moment ist es die Technologieimplementierung in den integrierten
Schaltkreisen, die diese Größe auf rund
50 Mikrometer oder etwas weniger beschränken. Die Querschnittsgrößen des Glasträgers, anderer
alternativer Träger
oder des Halbleiterwafers sind nicht speziell eingeschränkt und
sollten sie es doch sein, werden sie den Anwendungsbereich des Verfahrens
nicht aufheben. Die Einschränkung
kann entweder von mechanischen und Konstruktionseinschränkungen
der Maschinen kommen, die die Proben hybridisieren oder ablagern, oder
von den Maschinen, die Halbleiterwafer erzeugen. Im Moment ermöglichen
die letzteren Technologien die Erzeugung von Systemen von bis zu
32 Zentimetern. Nicht einmal die Dicke des Detektors und des Trägers schränken die
Eignung des Betriebs, die Zuverlässigkeit
und die Anwendbarkeit des Verfahrens der Erfindung ein.
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Das
System nutzt Halbleiterdetektoren. Die Detektoren können auch
lageempfindliche Photomultiplier umfassen, die Hybride von Photomultipliern und
Halbleiterdetektoren sind, die in anderen Bereichen an sich bekannt
sind. Das System kann zur automatischen Auswahl von Wellenlängen Filter
umfassen, die in dem Detektor integriert oder daran befestigt sind.
Es können
Mehranodenphotomultiplier verwendet werden, zum Beispiel die aus
dem Katalog HAMAMATSU CORPORATION, März 2001, Beispielprodukt H6568.
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Halbleiterdetektoren
können
eine kleine oder große
(direkte oder indirekte) Energielücke aufweisen und können auch
natürlich
sein oder synthetisch aus Legierungen erhalten werden. Ihre Zusammensetzung
und Behandlung ändern
das Nachweispotential. Einige dieser Materialien können gemäß bestimmten
Nomenklaturen eher als "Isolatoren" als echte "Halbleiter" betrachtet werden.
Diese sind alle im Gebiet dieser Erfindung enthalten. Beispielsweise sind
synthetische Diamant enthalten. Das gleiche gilt für Verbindungen,
die Indium, Aluminium, Gallium und Silicium enthalten, mit oder
ohne Stickstoff. Diese Materialien können freiwillig oder unfreiwillig
angereichert sein und können
daher andere Atome unterschiedlicher Art enthalten. Ihr Reinheitsgrad
hängt von
vielen Voraussetzungen ab: den Kosten, der Verfügbarkeit und der Leichtigkeit
der Herstellung. Auf dem Gebiet der vorliegenden Erfindung liegen
die Vorteile dieser Materialien in ihrer Fähigkeit, daß sie durch die einfallende
Strahlung ionisiert werden können
und die erzeugte Ladung größtenteils
in diesen Materialien verbleibt, ohne daß sie wieder absorbiert wird.
Dies ist dank eines elektrischen Feldes, das von einem Ende zum
anderen angelegt wird, möglich. Das
Feld kann in einer Oberseite-Unterseite-Konfiguration
oder quer in derselben Oberfläche
angelegt werden.
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In
den üblichsten
Anwendungen wird das Material in Form dünner Scheiben mit einem Durchmesser
zwischen 3 cm bis zu 10 cm oder mehr hergestellt. Die Dicke der
Scheiben wird in Mikrometern von ein- bis mehr als eintausend (mehreren
Millimetern) gemessen.
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Zum
Nachweis der Strahlung können
unterschiedliche Verfahren verwendet werden. Die üblichsten
von ihnen sind die einfache Ablagerung von Filmen, die die Elektroden
bilden, an die das elektrische Feld angelegt werden soll, oder die
Ablagerung von komplexeren Verbindungen zum Erhalt geeigneter Kontakte,
um so eine ausreichende Ladung sammeln zu können, und nicht zu lautes Hintergrundrauschen
zu erzeugen. Beispielsweise kann im Falle von Diamant das erste
Verfahren angewendet werden, wohingegen mit angereicherten Siliciumanschlüssen ("n"- oder "p"-Typ)
elektrische Konfigurationen in Form einer "Diode" verwendet werden können. Diese Verfahren bilden
Elektroden, und der Detektor wird Ionisationsdetektor genannt. Die
Elektroden können unterschiedliche
Formen haben, wie lange Streifen oder Rechtecke oder Quadrate, mit
einer Größe zwischen
Zehn und mehreren Hundert Mi krometern. Sie können eine Struktur bilden,
die sich selbst so lange wiederholt, bis sie die gesamte Oberfläche der
Scheibe bedeckt.
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Die
Vorteile der vorliegenden Erfindung liegen in der Verwendung dieser
Materialien zum Nachweis der Strahlung, die durch den Biochip dringt.
Daher betrifft das Gebiet der vorliegenden Erfindung die Verwendung
dieser Detektoren mit Biochips. Genauer gesagt, wird ein Fachmann
Wert auf die Einstellung des Materials zur Optimierung des Signals,
die Einstellung der Größe der Elektrode
(oder des "Pixels"), auf die der Stelle,
wo die Hybridisierung stattfinden soll, und die Einstellung der
Größe der Scheibe,
die nacheinander in Größen geschnitten
wird, die für
die, die in dem Biochip zur Ablagerung der Proben verwendet werden,
nützlich
sind. Die Pixeldetektoren auf dem Halbleiter werden verhältnismäßig wenig
genutzt und ihre Vermarktung ist eingeschränkt. Zur Zeit werden sie manchmal
CMOS-Detektoren (kombiniertes Metalloxid-Silicium) genannt. Die
vorliegende Erfindung nutzt jedoch alle diese Detektoren in ihrer üblichsten
Definition, da sich unter den hierin beschriebenen Detektoren oftmals
Kombinationen aus Metall und Siliciumoxiden befinden.
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Alle
diese Detektoren können
mit üblichen Laborgeräten gelesen
werden, die eine Abweichung der Ladungs- oder Strommenge (Ladungsmenge
in Zeit) in den hybridisierten Stellen in bezug auf die in nicht
hybridisierten Stellen messen. Es wird aber nicht nur die Abweichung
gemessen, sondern auch deren Wert. Dieser Nachweis ist ein wesentlicher
Bestandteil dieser Erfindung. Er ermöglicht die Bewertung, wie viele
Moleküle
an derselben Stelle hybridisierten (die möglicherweise eine Vielzahl
von Proben enthalten) und deren Position und auch, wie viele Stellen
die Bewertung einer vorgegebenen Expression liefern und welche Stellen.
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Das
Gebiet der vorliegenden Erfindung nutzt auch das Lesesystem, basierend
auf einem integrierten elektronischen Schaltkreis (VLSI) zur Digitalisierung
der Hybridisierungsinformationen, dies ist jedoch keine wesentliche
Voraussetzung. Man sollte jedoch in Betracht ziehen, daß, obgleich
dieses System in vielen Ausführungsformen
der Erfindung verwendet wird, dies nicht das einzig mögliche System zur
Digitalisierung der Signale für
den gleichzeitigen Nachweis der Hybridisierungsstellen ist.
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Die
Wirkungsmerkmale des Schaltkreises hängen von den Merkmalen des
Systems, insbesondere von der Art der verwendeten Proben und Targets
und daher von der Art der Strahlung und der Energie der Strahlungsquelle
ab. Der Schaltkreis wird andere Merkmale haben, die auch von seiner
Anwendung abhängen
und ob Marker enthalten sind oder nicht und welche das sind.
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Der
Schaltkreis kann die Ladung in einem Intervall im Bereich von zig
Nanosekunden bis Millisekunden sammeln und ermöglicht eine Zählung, wie viele
Photonen den Detektor tatsächlich
erreichen. Der Wert der Energie für jedes von ihnen (d. h. ihre Wellenlänge) wird
durch irgendeine geeignete und bereits bekannte Anordnung von Transistoren
ausgelesen.
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Die
Anwendung des Schaltkreises auf die Strahlung, die durch den Biochip
dringt, bildet eines der Innovationsgebiete der vorliegenden Erfindung.
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Der
Schaltkreis, der mit jeder Technologie hergestellt werden kann,
die als geeignet erachtet wird (die vorliegenden werden zwischen
0,6 und 0,13 Mikrometer definiert), hängt zu einem großen Teil
von den geometrischen Eigenschaften des in Betracht gezogenen Mikrochips
ab.
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Der
Schaltkreis wird auch auf einer Halbleiterscheibe erzeugt. Diese
kann dieselbe Größe haben,
wie der Detektor oder größer oder
kleiner sein. Im letzteren Fall sollte er in einer Dominokonfiguration
angeordnet sein. Der Schaltkreis wird dann geschnitten und mittels
industrieller Schweißtechniken an
den Detektor angebaut. Es ist auch möglich, Verfahren zu übernehmen,
die auf dem Markt zur Übertragung
zu einem weiteren Informationsverarbeitungssystem bis zur Visualisierung
auf einem Bildschirm, wie einem Personalcomputer, verfügbar sind. Diese
Lösungen
sind nur Beispiele. Die Erfindung führt zu Informationen, die für genetische
oder andere Überlegungen
verarbeitet werden können.
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Die
vorliegende Erfindung soll allgemeinen Charakter haben und auf einen
breiten Bereich wie auch immer abgelagerter biologischer Verbindungen und
auf irgendeine der Oberflächen,
die derzeit verwendet werden (Polymere, Glas, Kristalle usw. alle beschichtet
und/oder behandelt oder nicht), anwendbar sein.
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Die
Messung des Stroms in hochohmigem Siliciumdetektoren mit daran montierten
Halbleiterverbindungen und die Polarisierung des Detektors mit einem
Rückspannungspotential
werden hierin nachstehend als ein nicht einschränkendes Beispiel der Empfindlichkeit
des Systems angegeben. Für
ein DNA-Fragment mit 70 Basenpaaren wurde eine Stromabweichung mit
oder ohne Beleuchtung im Bereich von 1 nA bis 20 nA pro 250 Basenpaare
bei rund 260 nm nachgewiesen. Für
Oligonukleotidfragmente, die in Glas vom "Coming glass"-Typ
hybridisierten, wurde eine Stromabweichung von rund 100 nA nachgewiesen.
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Das
vorgeschlagene Verfahren ist kosteneffektiver, zuverlässiger und
schneller als Verfahren, die momentan in Laboratorien in Versuchen
verwendet werden, und als kommerzielle Verfahren. Das System fokussiert
auf die weiteste Verbreitung und Verwendung von Biochip-, DNA-Chip-
oder Biochip-Array-Mikrosystemen, die auf diesem Gebiet verschiedenartig
bekannt sind, ohne daß sie
eine deutliche Definition aufweisen.
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Die
Vorteile der vorliegenden Erfindung sind zahlreich. Sie basieren
im wesentlichen aber nicht ausschließlich auf zwei Innovationen:
dem gleichzeitigen Nachweis aller Hybridisierungsstellen und der potentiellen
Eliminierung der Marker. Die zweite Innovation schließt die erste
nicht aus und umgekehrt. Die Vorteile des gleichzeitigen Nachweises
werden auch erhalten, wenn Marker verwendet werden. Analog können die
Vorteile des Nachweises ohne Marker auch ohne den gleichzeitigen
Nachweis erhalten werden. Die vorliegende Erfindung umfaßt beide
Lösungen,
da sie auf Halbleiterdetektoren mit dem direkten Lesen von Strom
oder Ladung basiert.
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Die
Vorteile des gleichzeitigen Nachweises sind außerordentlich: leichte Konstruktion
und Verwendung des Systems und geringe Kosten. Zum Erhalt dieser
Vorteile müssen
einige, bevorzugt alle Hybridisierungsstellen gleichzeitig bestrahlt
werden. Das vorgeschlagene System liefert eine geeignete Bestrahlung
gemäß der verwendeten
Strahlungsquelle. Es sind unterschiedliche Arten der letzteren mit
geeigneten optischen Systemen möglich.
Eine andere Voraussetzung für
den gleichzeitigen Nachweis ist, daß die entsprechenden Signale
gleichzeitig gesammelt werden. Um dies zu erreichen, muß jeder Hybridisierungsstelle
ein einzelnes Leseelement entsprechen. Die Verwendung eines Pixeldetektors,
in dem jeder Pixel einer Hybridisierungsstelle entspricht, befindet
sich unter den Innovationen der vorliegenden Erfindung.
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Ein
schneller Nachweis der Hybridisierung ermöglicht den Erhalt einer großen Anzahl
an Informationen in sehr kleinen Zeitintervallen von rund einer
Mikrosekunde über
die Expression einer großen Anzahl
an Genen. Dies macht die Arbeit vieler Klinik- und Pharmazieforscher
schneller und leichter. Die vorliegende Erfindung ermöglicht die
vollständige Ausnutzung
der Biochipvorteile.
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Mit
der Erfindung kann der Nachweis der Strahlung, die nach der Absorption übertragen
wird, erhalten werden. Offensichtlich kann auch radioaktive Strahlung
nachgewiesen werden, obgleich dies immer seltener angewendet wird.
Auch in der Versuchsphase sind Systeme, die einzelne Teilchen aus nuklearen
Verfahren, wie der Herstellung von Paaren aus Elektronen, Positronen
oder nuklearen Fragmenten und der Herstellung elektromagnetischer
Strahlung bei hohen Energien (mehr als 6 eV und bis zu einigen GeVs),
emittieren. Die vorliegende Erfindung deckt alle diese Arten von
Strahlung ab. Aus den oben genannten Grünen deckt sie den Nachweis
in Wellenlängenintervallen
von rund 700 nm bis zu 190 nm ab, da im Moment diese Umsetzung des
vorgeschlagenen Verfahrens die näherliegendere
ist.
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Wir
sahen, daß die
Absorption der Strahlung, die durch den Biochip dringt, nachgewiesen
werden kann. Jede Ablagerungs- und Hybridisierungsstelle wird die
einfallende Strahlung anders absorbieren. Die Stellen, in denen
die Hybridisierung stattfand, wird mehr absorbieren, als die, an
denen nur die befestigte Probe zurückblieb. Ferner wird die Absorption
unter Hybridisierungsstellen, die direkt proportional zu der Anzahl
von Molekülen
ist, die diese hybridisieren, von Stelle zu Stelle variieren. Daher
wird der Hybridisierungsgrad durch die Strahlung, zum Beispiel die
Anzahl an Photonen, die bei dem Detektor ankommen, gemessen, d.
h. durch die Quantität
an Ladungen, die in dem Halbleiter erzeugt und durch den elektronischen
Schaltkreis, der die Digitalisierung nach einer analogen Lesung
durchführt,
gesammelt wird.
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Ein
Vorteil des Nachweises ohne Marker ist, daß die Messung direkt und möglicherweise
analog ist. Das Bild ist in bezug auf die Reemission von Fluoreszenz,
die andererseits isotrop und daher größtenteils im Raum verteilt
wird, schärfer.
Ferner ist die Absorptionsmenge eine allgemein bekannte Funktion
für alle
verwendeten Materialien, so daß die
Ergebnisse durch die Einschätzung
durch mathematische Verfahren schnell verifiziert werden können. Im Ge gensatz
dazu sind die Gründe
für die
Absorption und Reemission fluoreszierender Substanzen, die an Proben
oder Targets befestigt sind, nicht wirklich allgemein bekannt. Viele
Ursachen können
die Befestigung beeinflussen, wobei die stöchiometrische Besetzung das
Hauptelement ist. Dann müssen
thermodynamische Voraussetzungen erfüllt werden, um zu beweisen,
daß die
Ergebnisse mit der Theorie übereinstimmen,
und dies hängt
stark von dem Versuch selbst ab. Überdies ist die Verwendung
fluoreszierender Substanzen auch aus physikalischen und chemischen
Gründen
und ihren Kosten weniger attraktiv. Solche Voraussetzungen gelten
im allgemeinen für die
Verwendung aller Marker.
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Gemäß der Erfindung
kann die Absorptionsmessung in einem breiten Energiespektrum durchgeführt werden.
Die Quelle muß auf
der Grundlage der verwendeten Proben und Targets geeignet ausgewählt werden.
Beispielsweise wird im Falle von DNA-basierenden Hybridisierungen
die maximale Absorption bei einer Wellenlänge von rund 260 nm erhalten.
Daher ist eine Quelle, die ihre maximale Intensität in diesem
Intervall emittiert, die geeignetste. Beispielsweise können wir
Quellen verwenden, die auf dem Markt existieren, die Deuterium und
Quecksilber umfassen, oder geeignete Laser oder Plasmaquellen. Solche
Quellen sind auch hinsichtlich der Empfindlichkeit optimal. Für die Zwecke
der vorliegenden Erfindung ist bei der üblichen Verwendung eines Biochips
eine Deuteriumquelle mit geringer Intensität, von denen die auf dem Markt
erhältlich
sind, perfekt geeignet. Das Verfahren, das in der vorliegenden Erfindung
beschrieben wird, deckt alle möglichen
Quellen, die Laser mit einer vorbestimmten Wellenlänge oder
einem breiten Spektrum umfassen, sowie die, die mit Filtern oder
Monochromatoren verbunden sind, ab. Die Absorption kann auch in
einem anderen Wellenlängenintervall
als die Absorption von Basen, die reine DNA bilden (Absorptionspeak
bei 265 nm) gemessen werden. Die Verwendung anderer Quellen kann
sich sowohl hinsichtlich der Kosten als auch der erforderlichen
Energie oder hinsichtlich anderer praktischer Bedürfnisse,
umfassend die Anregung zur Beobachtung eines anderen Absorptionspeaks
für komplexere
Molekularmassen wie Proteine und andere Organismen, als günstig erweisen.
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Im
Hinblick auf den oben zitierten Stand der Technik sind die Vorteile
der Erfindung die folgenden.
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In
WO-96 07917 kann der Nachweis nicht gleichzeitig stattfinden. Insbesondere
hat der bereitgestellte Sammelschaltkreis nicht die gleiche Geometrie
der Pixel wie in dieser Erfindung.
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In
bezug auf die vorliegende Erfindung ist das Nachweissystem aus US-5
633 724 weder das der direkten Bestrahlung der Probe, noch führt es den
Nachweis gleichzeitig oder zum selben Zeitpunkt mit der Bestrahlung
durch. Die Bestrahlung kann auch gleichzeitig stattfinden, der Nachweis
findet jedoch durch Scannen statt und ist indirekt. Der Nachweis
wird in dem Strahlungsteil durchgeführt, der der inneren Reflexion
(TIR "Gesamte Innere
Reflexion") auf
dem inneren Teil des Substrats, wo die Moleküle abgelagert werden, folgt.
Im Gegensatz dazu erreicht in der vorliegenden Erfindung die Strahlung
den Detektor, nachdem sie durch dessen Träger (oder Substrat) gedrungen
ist.
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Das
Dokument US-6 017 435 liefert keine Möglichkeit zur Verwendung von
Pixeldetektoren, die die Ladung oder den Strom lesen. Die Möglichkeit der
Messung der Absorption wird nicht bereitgestellt. Es kann nur bestätigt werden,
daß sie
durch den Nachweis ihrer Gegenwart durch die Identifizierung von
Licht- und Schattenflächen,
durch die die Moleküle
liefen, stattgefunden hat. Dieses Ereignis kann als eine Stromabweichung
in bezug auf ein bestimmtes Niveau nachgewiesen werden, es quantifiziert
jedoch nicht die Molekularmasse. Ferner wird die Anwendung auf Biochip-Arrays
nicht bereitgestellt. Es offenbart kein System wie das, das für das Verfahren der
vorliegenden Erfindung verwendet wird, wo nicht nur die Position
zum Nachweis der Stelle ermöglicht wird,
sondern auch die Quantifizierung der Molekularmasse, die an dieser
Position vorliegt. Dies ist in der vorliegenden Erfindung dank der
analogen Lesung der Detektorladung durch den elektronischen Schaltkreis
möglich.
Ferner setzt in US-6017 435 der Nachweis die Bewegung der analysierten
Moleküle voraus.
Die Verwendung der Pixeldetektoren besagt nur, ob das Molekül in der
Elektrophoresebewegung durchgedrungen ist oder nicht. So sieht das
Dokument einen digitalen Nachweis, keine analoge Bewertung zur Quantifizierung
der Ladung in dem Schaltkreis vor.
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Die
vorliegende Erfindung unterscheidet sich von der Vorrichtung aus
WO-99 32877, da sich der Nachweis auf Strahlung jeder Art und nicht
nur auf optische bezieht (Nachweis für Photonen in Wellenlängenintervallen
von rund 500–1000
nm). Ferner führt
diese Vorrichtung den Nachweis nur an fluoreszierenden Substanzen
durch.
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Die
von A. Mahon et al. (Phys. Med. Biol. 44 (1999) 1529–1541) bereitgestellte
Vorrichtung hat eine Nachweisgrenze, die von einer Masse von rund 1
ng abhängig
ist. Dieser Grenzwert wirkt sich nicht nachteilig auf die vorliegende
Erfindung aus, die Fragmente mit kleineren Größen nachweisen kann.
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Keine
der existierenden Vorrichtungen führt einen gleichzeitigen Nachweis
aller Stellen für
eine Standardgröße des Objektträgers durch.
Im derzeitigen Stand der Technologie weisen die Standardobjektträger, die
in Mikro-Arrays verwendet werden, eine Seite von etwa 1 oder 2 cm
und Tausende daran befestigte Proben auf. Daher kann keines der
derzeitigen Systeme mit dem, das für das Verfahren dieser Erfindung
verwendet wird, verglichen werden, das den gleichzeitigen und mehrfachen
Nachweis an tausenden Stellen ermöglicht, wie beschrieben wird.
Die vorliegende Technologie des hierin vorgeschlagenen Detektors
wird rund 5 Millionen oder mehr Nachweisstellen ermöglichen.
Ferner ermöglicht
es den Nachweis ohne Verwendung von Markern.
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Die
Erfindung ermöglicht
auf einem Bildschirm mittels eines Computers den Erhalt einer tatsächlichen
und Echtzeitrepräsentation
des Zustandes (hybridisiert oder nicht) jeder Stelle des Trägers. Derselbe
Computer kann diese Informationen verarbeiten und die Entwicklung
jeder Stelle im Verlauf der Zeit analysieren (und wiedergeben).
Es können
Bildfolgen des Trägers
zu unterschiedlichen Zeitpunkten, zum Beispiel alle 20 Mikrosekunden,
erhalten werden. Wenn der Träger
kontinuierlich bestrahlt wird und das Signal kontinuierlich verarbeitet
und wiedergegeben wird, ist eine kameraähnliche Darstellung des Trägers möglich, wodurch
der Bewertung jeder Stelle in Echtzeit gefolgt werden kann. Demgemäß ermöglicht die
Erfindung eine dynamische Behandlung der Experimentergebnisse. Der
Vergleich der Ergebnisse einiger Stellen ermöglicht eine effiziente Kalibrierung
der Vorrichtung und auch ihre Nachkalibrierung während des Versuchs. Er ermöglicht den Nachweis
der Stellen, an denen eine Hybridisierung stattgefunden hat, und
der Vergleich solcher Stellen untereinander ermöglicht auch die Bestimmung
der Menge an Targets an den jeweiligen Stellen. Die Erfindung vermeidet
eine Verzögerung
beim Scannen.
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Die
Erfindung kann in Bereichen wie der Genomforschung, der Proteomforschung
usw. angewendet werden.
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Eine
andere Ausführungsform
wird in 5 veranschaulicht, die die Strahlung
zeigt, die von der Quelle 3001, die auf den Stellen der
Biochips 1002 mit Proben und möglichen Tar gets auftrifft,
emittiert wird. Die Strahlung geht dann weiter zum Detektor 3006,
ohne durch den Biochip zu dringen. In diesem Fall kann fluoreszierendes
Licht verwendet werden. Diese Ausführungsform kann unter Verwendung
der Technologie der Firma BIACORE, die an sich bekannt ist, durchgeführt werden.
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Die
Erfindung kann andere Merkmale zeigen, wie die folgenden:
- – die
Vorrichtung kann ein Mikrolinsensystem aus einem Material umfassen,
das das Durchdringen der maximalen Intensität der einfallenden Strahlung
ermöglicht,
angeordnet in der Bahn der Strahlung vor oder nach dem Träger;
- – Eingeschoben
vor oder nach dem Träger
kann ein Monochromator- oder Filtersystem zur Auswahl der Durchgangsenergie
aus einem Material, das das Durchdringen der maximalen Intensität der einfallenden
Strahlung ermöglicht,
bereitgestellt werden;
- – das
Mittel zur Quantifizierung (der elektronische Leseschaltkreis) kann
die Ladung in elektrischen Strom umwandeln oder die Ladung direkt
zu dem Verstärkersystem,
mit oder ohne Kapazität und/oder
Widerstandsfilter, übertragen.
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Die
Erfindung liefert auch ein Verfahren zum Nachweis einer Position
mehrerer Hybridisierungsstellen auf einem Träger mit hybridisierten Targets, wobei
das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt:
- – Emittieren
einer Strahlung auf den Träger;
und
- – Empfangen
der Strahlung, die von dem Träger kommt,
auf einem Detektor, der gegenüber
der Strahlung empfindlich ist.
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Dieses
Verfahren kann auch mindestens einen der folgenden Schritte umfassen:
- – Bestimmung
der Stellen mit hybridisierten Targets; und
- – Berechnung
der Menge an Targets, die an jeder dieser Stellen hybridisierten.
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Das
Verfahren der Erfindung kann bei nicht PCR-behandelten Verbindungen
angewendet werden.