DE10123443A1

DE10123443A1 - Analyseverfahren zur Sequenzierung von Atomen/Molekülen und Vorrichtung hierfür

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Publication number: DE10123443A1
Application number: DE10123443A
Authority: DE
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2001-05-14
Filing date: 2001-05-14
Publication date: 2002-11-28

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft mehrere physikalisch-chemische Analyseverfahren mit Einphotonen-Detektion, also im Bereich nahe höchstmöglicher Detektor-Nachweis-Empfindlichkeit bei gleichzeitig ebensolchem lateralem Auflösungsvermögen in atomarer Größenordnung. DOLLAR A Damit ist es möglich geworden, einzelne Atome oder Moleküle über ihre Licht-Absorption, Lumineszenz oder auch elektrischen Strom-Widerstand zu identifizieren, und zwar auch unabhängig, jedoch oberflächennah, von ihrer jeweiligen chemischen Umgebung. Das kann auch mit einer Lese- oder Arbeitstakt-Frequenz in den Größenordnungs-Bereichen Mega-Hertz geschehen. DOLLAR A Der Anwendungsbereich dieser Analyseverfahren ist demnach die Sequenzanalyse von Genen, mit einer bislang üblichen Arbeitstakt-Frequenz im 10-Hertz-Bereich, aber auch die Konformations-/Taktizitäts-Analyse von Polymeren. Ferner stehen damit auch Lesegeräte für andere molekulare Informations- bzw. digitale Daten-Speicher nahe höchstmöglicher atomarer Speicherdichte, also um etwa sechs bis neun Größenordnungen kompakter, im Bereich der Daten-Verarbeitung oder noch leistungsfähigerer Compakt- oder digitaler Video-Disketten (CD, DVD) etc. zur Verfügung.

Description

Technisches Gebiet

Die vorliegende Erfindung betrifft ein physikalisch-chemisches Analyseverfahren zur Sequenzierung/Identifizierung von Atomen und/oder Molekülen, auch größere Aggregate derselben mit eingeschlossen, oder solcher Sequenzen in einer Probe. Die Sequenzen können dabei ein- oder mehrdimensional in beliebiger Formation angeordnet sein.

Stand der Technik

Die Nukleinsäure-Sequenzierung ist das Zentralproblem der genetischen Biochemie /1/. Die bisher angewandten Verfahren gehen vom Aufschluß und der Reinigung von DNA- Makromolekülen aus. Anschließend werden diese mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion (= PCR) vervielfältigt. Spezielle Enzyme zerlegen diese Bio-Makromoleküle an bestimmten Stellen mehrfach in kleinere Bestandteile. Anschließend erfolgt eine gelelektrophoretische Trennung dieser Bruchstücke, deren Identifizierung, auch automatisiert, eine Dokumentation z. B. mit Hilfe der elektronischen Datenverarbeitung, -Speicherung und -Weiterverarbeitung. Für eine komplette Sequenzierung des einfachen Humangenoms benötigt dieses Verfahren mit einer maximalen Arbeitstaktfrequenz um rund 20 Hz immer noch etwa sechs Jahre /2/. Die Fehlerrate liegt bei einem Fehler je 10 000 Basen(-Paare) = 10^-4 /3/. Weitere Methoden auch mit Hilfe der Massenspektrometrie, sind bei /4/ zusammengefaßt.

Bei den bisherigen spektroskopischen Methoden, wie z. B. ESCA /5/ oder UV /6/, genügt die laterale analytische Auflösung um etwa 100 nm /7/ ebensowenig wie bei der herkömmlichen Elektronen-Mikroskopie im kV-Bereich mit rund 10 nm /8/, trotz einer De-Broglie-Wellenlänge im atomaren Größen-Bereich und darunter /9/. Diese kann jedoch in neuerer Sonderversion bereits mit 100-eV-Elektronen einzelne Moleküle abbilden /10/. Auch die neuere (Raster-) Tunnel-Mikroskopie, oder auch als Variante (Raster-)Kraft-Mikroskopie, eignet sich trotz hinreichend hoher lateraler Auflösung nicht für eine direkte Sequenzierung aller Arten von Molekülen, wohl aber hat sie eine atomare Abtastrate im Bereich der Videofrequenz, also von etwa 5 MHz bis 40 MHz und kann auch elektromagnetische Effekte im optischen Spektralbereich erzeugen /11/.

Das DNA-Molekül des längsten menschlichen Chromosoms ist rund 10 cm lang /2/, das entspricht etwa 3.10⁸ Basenpaaren. Andere Arten haben zum Teil noch längere Chromosomen. Bei einer Arbeitstaktfrequenz um 10⁶ Sequenzen, hier gleich Nukleotide, entsprechend einem MHz bedeutet das, ein so langes Chromosom kann mit Hilfe dieser Erfindung, ohne Berücksichtigung der Vorbereitungszeit, als Ein-Strang in rund fünf Minuten kernbasen sequenzweise abgetastet und analysiert werden. Dazu muß das Tunnel-Mikroskop, Kosten ab 5000 Euro, für einen entsprechend langen Probenträger umgebaut werden.

Das diploide Genom einer menschlichen Körper-Zelle ist als hintereinandergereihte Ein-Stränge etwa 4 m lang und rund 2 nm breit, wobei alle 0,34 nm eine weitere Sequenz, hier als eines von in der Regel vier Nukleotiden, folgt /1, 2/. Die helikale Struktur der DNA-Makromoleküle bleibt auch bei der Einstrang-Version erhalten, denn sie sind gleich dick /1/. Nuklein-Säuren bestehen aus den jeweiligen vier Grund-Nukleotiden und über 30 bekannten seltenen Sonder-Nukleotiden /1/. Mit den derzeitigen Techniken kostet eine komplette Sequenz-Analyse 16,5 Mio Euro.

Durch selektive polymeranaloge chemische Reaktionen kann jeweils die eine oder andere Nukleotid-Gattung entfernt werden, was zunächst zur Apurin- oder zur Apyrimidin-Säure führt /1/. Dies kann so fortgesetzt werden, bis nur noch eine Gattung zurückbleibt.

Die fluoreszenz-spektroskopische Analytik singulärer Moleküle, also die Einzel-Molekül- Fluoreszenz-Spektroskopie (EMFS) /12/ und einzelner Photonen /13/ ist inzwischen dank leistungsfähiger hoch nachweisempfindlicher und schneller Photomultiplier im Bereich des Machbaren, wobei unter den Schutzeinrichtungen eines Low-Level-Messplatzes die hierbei störenden Einflüsse durch natürliche Strahlungen noch deutlich vermindert werden können.

Lumineszenz wird in diesem Zusammenhang definiert als Oberbegriff für alle Erscheinungen der Fluoreszenz und der Phosphoreszenz, da beide in der Praxis meist nur sehr aufwendig zu unterscheiden sind. Ihre zeitliche Abfolge liegt je nach Art der Moleküle in der Größenordnung um 10^-8 Sekunden und ihre Quantenausbeute, in der Regel im %-Bereich, kann mit den bekannten (Kryo- = Tieftemperatur-)Techniken noch bis auf 100% gesteigert werden. Ebenso ist damit auch eine wesentliche Verbesserung des Signal-Rausch-Verhältnises erzielbar. Der lichtelektrische Effekt hat bei Photozellen vor 1972 eine zeitliche Auflösung von 10^-9 Sekunden /14/. Es kann auch die Fluoreszenz-Verstärkung mit intensiver und rascher emittierenden Fluorophoren angewandt werden /12/ oder die Messung der Raman-Streuung /7/ im weitesten Sinne oder bei zu langsamer Emission kann diese Zeit mit Hilfe einer stimmulierten Emission nach dem Laser- Prinzip erheblich verkürzt werden /15/.

Die bisherigen Geräte, wie z. B. Elektronen-Mikroskope (10 nm) oder ESCA, in XPS- oder in UPS-Version arbeiten mit einem Brennfleck, der etwa 10 nm bis 200 nm Durchmesser hat. Das ist hier gegenüber den erforderlichen 0,34 nm immer noch viel zu groß. Ferner hat der Anregungs- Strahl eine relativ hohe Eindringtiefe im 100-µm-Bereich, die sogenannte Eindring- oder Tiefenwirkungs-Birne oder auch -Sphäroid /5/. Dadurch werden viel zu viele überwiegend sequenzunspezifische Atome bzw. Atom-Gruppen mit angeregt, die dann den Detektor überfordern.

Ein ESCA-Gerät kostete um 1985 etwa 660 000 Euro und ein REM etwa 150 000 Euro. Ein sehr hohes Vakuum ist bei beiden Geräten Voraussetzung /5/. Um die untersuchte Oberfläche durch den Röntgen-Strahl nicht allzu sehr zu verändern und um trotzdem eine für den Detektor hinreichende Intensität des Mess-Signals zu erhalten, wird der Brennfleck bei ESCA mindestens auf etwa 100 nm Durchmesser vergrößert /5/. Obwohl solche Geräte der Oberflächenanalytik zugeordnet werden, führt die Tiefenwirkung der Anregungs-Strahlung zu einer oberflächennahen Volumen-Analyse. Sofern ein Probenträger stört, wie auch zu zahlreichen molekularen Mikromanipulationen, auch mit "Lichtpinzetten", kann die Probe auch an Spitzen von Tunnel- oder Kraft-Mikroskopen an einem oder beiden Enden befestigt werden /11, 16/. Der Tunnel- Effekt wirkt über die relativ starke relativistische Abhängigkeit seines Stromes vom Abstand auch im Sinne einer Fokussierung, wobei 0,1 nm Annäherung zu einer Verzehnfachung dieses Stromes führen /11/. Übliche Spitzen für Tunnel-Mikroskope (24) haben Krümmungs-Radien von 10 bis 50 nm /16/.

Literatur

/1/ A. L. Lehninger: "Biochemie"; 2. Aufl., Verlag Chemie, Weinheim 1977; Nukleotide: 5. 249-269 und DNA: S. 703-729.
/2/ Gen-Welten - Leben aus dem Labor? Ausstellungskatalog des Landesmuseums für Technik und Arbeit, Mannheim 1998.
/3/ "Genomforschung"; Nachr. a. d. Chemie /48/ März 2000/www.gdch.de, S. 298-300.
/4/ EP 1 038 031.
/5/ "Oberflächenspezifische Analyseverfahren und ihr Einsatz zur Untersuchung von Verschleiß-Schutzschichten"; Z. Werkstofftech. 13, (1982) S. 361-369; persönliche Mitteilugen durch Geschäftsführung und wissenschaftliche Betreuer der Fa. Perkin-Elmer, Physical Electronics Division, Vaterstetten b. München um 1983.
/6/ Nachr. Chem. Tech. Lab. 37 (1989) Sonderheft Spektroskopie.
/7/ "Optische Nahfeldmikroskopie"; Chem. Rundschau Nr. 19 vom 23.10.1998, S. 17.
/8/ Meyers großes Taschen-Lexikon, 2. Aufl. Bd. 6, B.I-Taschenbuchverlag Mannheim 1987, S. 109.
/9/ W. J. Moore/D. O. Hummel: "Physikalische Chemie"; 2. Aufl., Verlag W. de Gruyter, Berlin 1976, S. 931-934.
/10/ "Charakterisierung von Polymeren"; Nachr. Chem. Tech. Lab. 43 (1995) Nr. 2, S. 235.
/11/ "Tunnelmikroskopie und organische Moleküle"; Nachr. Chem. Tech. Lab. 37 (1989) Nr. 12, S. 1270-1274.
/12/ "Biophysikalische Chemie"; Nachr. Chem. Tech. Lab. 43 (1995) Nr. 2, S. 199-202.
/13/ "Hamamatsu C 4780"; Nachr. Chem. Tech. Lab. 42 (1994) Nr. 11, S. M21.
/14/ Dorn: "Physik Oberstufe Ausgabe A"; 16. Aufl., Verlag H. Schroedel KG, Hannover 1972, S. 211.
/15/ W. J. Moore/D. O. Hummel: "Physikalische Chemie"; 2. Aufl., Verlag W. de Gruyter, Berlin 1976, S. 901-903.
/16/ "Kräftemessen molekular"; Nachr. Chem. Tech. Lab. 47 (1999) Nr. 4, S. 391-396.

Darstellung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung löst das technische Problem, ein Verfahren anzugeben, das eine exakte, zuverlässige und wirtschaftliche Sequenz-Analyse durchzuführen erlaubt. Ein Hauptanwendungsgebiet soll die Genom-Analyse werden sowie auch die Polymer-Analytik. Das Ziel ist ein Lesegerät für die Baupläne der belebten Schöpfung, der Lösung eines Zentralproblems der genetischen Biochemie. Dabei geht es um die Sequenz-Analyse der Erbsubstanz biologischer Spezies, auch zur Identifizierung von Gattungen und Individuen, zu diagnostischen Zwecken. Das ist Voraussetzung für eine erfolgreichere, also schnellere, preiswertere und zuverlässigere, Prävention bzw. Therapie und Prognose von Erbkrankheiten, -Belastungen, -Dispositionen, auch Infektionskrankheiten, und ihren Folgen sowie für effektivere Züchtungen und den sogenannten Gen-TÜV.

Mit dieser Erfindung kann z. B. die Zeit zur Bestimmung exotischer Erreger von drei auf etwa 0,5 Tage verkürzt werden. Ferner ist so ein effektiver Nachweis von genetischen Veränderungen auch durch mutagene Belastungen möglich, z. B. bei bestrahlten Lebensmitteln oder durch Arznei- bzw. Gefahrstoffe sowie Früherkennung genetischer Schäden. Damit lassen sich ebenso auch patentierbare anthropogene informationscodierende Sequenzen nahe höchstmöglicher Daten speicherdichte bestimmen. Aber es gibt auch noch weitere analytische Anwendungen, z. B. in der Polymer-Analytik zur exakten Bestimmung der Taktizität oder Konformation von Makro molekülen oder von deren Sequenz-/Blocklänge bei Copolymeren. Kurz bei dieser Erfindung geht es um mehr Lebensqualität zu erschwinglichen Preisen.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Sequenz-Analyse zeichnet sich demgemäß durch die Merkmale des unabhängigen Anspruchs 1) aus. Vorteilhafte Ausgestaltungen und Weiter bildungen sind Gegenstand der von Anspruch 1) direkt oder indirekt abhängigen Ansprüche. Die erfindungsgemäße Vorrichtung ist durch die Ansprüche 9) und 10) gegeben.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß

A) jeweils der Ort und/oder die Größe der Atome/Moleküle innerhalb der Probe im atomaren/molekularen Größenbereich festgestellt und/oder festgehalten wird,
B) jeweils die Atome/Moleküle der Probe (12) z. B. in dem in Schritt A) festgestellten Ort einem Anregungs-Signal (20) ausgesetzt werden mit einer Ortsauflösung im atomaren/molekularen Größenbereich zur Erzeugung eines Antwort-Signals, insbesondere als Lumineszenz (30) oder als elektrischer Widerstand bei einem dem Tunnel-Strom überlagertem Wechselstrom-Signal ausgebildet ist,
C) das jeweilige Antwort-Signal detektiert und ausgewertet wird, auch mit der Möglichkeit anschließender Datenspeicherung, wobei eine Detektoreinrichtung (14) eingesetzt wird, deren Nachweisempfindlichkeit z. B. im Bereich eines Photons liegt,
D) die Detektierung mit einer relativ hohen Arbeitstaktfrequenz, insbesondere im Bereich ab ein Kilo-Hertz (kHz) bis in den Giga-Hertz-Bereich (GHz) hinein durchgeführt wird, und
E) die Schritte A) bis D) an weiteren Sequenzen der Probe wiederholt werden können, bevorzugt an deren informationsspezifischen Teilen.

Eine bevorzugte Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens zeichnet sich dadurch aus, daß für die Schritte A) und/oder B) ein Tunnel-Mikroskop, d. h. ein Mikroskop, das den sogenannten Tunnel-Effekt nutzt, eingesetzt wird.

Gemäß einer bevorzugten Ausgestaltung können die Schritte A) und B) gleichzeitig durchgeführt werden, d. h. der Tunnel-Strom, die abgegebene Elektonen-Strahlung dient einerseits zur Feststellung des Ortes und/oder der Größe und andererseits bewirkt er bei höherer Spannung, die Durchschlagspannung mit eingeschlossen, und in der Regel niedrigerem Strom auch eine Kathodo-, ggf. auch Elektro- bzw. Plasma-Lumineszenz der Probe.

In einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung werden die zwei Schritte A) und B) zeitlich und/oder örtlich unmittelbar nacheinander durchgeführt.

In einer alternativen Ausgestaltung kann der Schritt B) in einem weiteren Durchlauf ausgeführt werden.

Zur Anregung kann eine Vielzahl von Strahlungsarten verwendet werden, wie beispielsweise elektromagnetische Strahlung, also: Radiowellen-, Mikrowellen-, Infrarot- (= IR), Strahlung im Bereich des sichtbaren Lichts, Ultraviolett- (= UV), Röntgen- und γ-Strahlung, aber auch Ionen- und Elementarteilchen-Strahlung, wie z. B. Elektronen-Strahlung, auch in Form von Wechselstrom, wobei die elektronische (System-)Anregung und die optische Strahlung als System-Antwort bevorzugt werden.

Für die Verfahrensschritte A) und/oder B) kann bevorzugt ein Raster-Tunnel-Mikroskop eingesetzt werden.

In einer vorteilhaften Ausgestaltung ist das Anregungs-Signal so ausgebildet, daß die angeregten Atome/Moleküle eine Fluoreszenz ausstrahlen.

Bevorzugt liegt die Arbeitstaktfrequenz für die Ortung, die System-Anregung, die Detektierung und für den Vorschub zur nachfolgenden Sequenz im Videofrequenzbereich.

Bei Anregung der Luminophore mit Lichtstrahlen kann auch kohärentes Licht (Laser) eingesetzt werden. Ist deren Wellenlänge λ im Bereich des Sequenz-Abstandes (bei Nuklein-Säuren = 0,34 nm) oder größer, so empfiehlt sich der Einsatz von polarisiertem Licht durch den Pico-Spalt (70).

Eine besonders bevorzugte Ausgestaltung, die insbesondere für den Fall einer gleichzeitigen Anregung mehrerer, vor allem benachbarter, Atome/Moleküle bzw. Luminophore eingesetzt wird, zeichnet sich dadurch aus, daß die Auswertung der Lumineszenzen über den sinngemäßen Einsatz von Differenz-Spektren erfolgt. Ebenso ist es möglich, dies mit Hilfe der optischen Spreizung zu bewerkstelligen. Dabei befindet sich die zu analysierende Sequenz unmittelbar im Brennpunkt eines Hohl- oder Parabol-Spiegels. Benachbarte Seqenzen liegen außerhalb davon. Ihre Lumineszenz wird nach den Regeln der geometrischen Strahlen-Optik nicht parallel zur optischen Achse reflektiert, so daß über einen relativ langen Lichtweg über mehrere km, z. B. Lichtleiter- Kabel oder planparallele Spezial-Spiegel, eine Spreizung und damit auch eine Abtrennung von den Brennpunkts-Strahlen möglich ist.

Eine weitere bevorzugte Ausgestaltung nutzt für die Auswertung der Lumineszenz mehrere Photomultiplier-Einheiten oder auch einen Impulshöhen- bzw. Vielkanal-Analysator oder eine CCD-Kamera oder andere geeignete Photo-Detektoren auf Halbleiterbasis, wie z. B. Avalanche Photo-Dioden (= APDs).

Zur Erhöhung der Genauigkeit bzw. zur Erzielung einer möglichst hohen lateralen Auflösung kann erfindungsgemäß eine Fokussier-Einrichtung eingesetzt werden, die auf die abgegebenen Anregungs-Signale einwirkt. Auch der Tunnel-Effekt selbst wirkt über die relativ starke relativistische Abhängigkeit seines Stromes vom Abstand in diesem Sinne. Die Fokussier- Einrichtung kann aus elektrischen und/oder magnetischen Linsen bestehen oder auch aus gezielt bis zur Größe einer Sequenz verkleinerten Brennflecken bei entsprechend angepasster Licht- Intensität.

Sehr gute Ergebnisse lassen sich dadurch erzielen, daß die Elektronen-Strahlung zur Anregung einen Durchmesser im Größenordnungsbereich der De-Broglie-Wellenlänge oder auch noch kleiner aufweist.

Um die Effizienz der Detektion zu verbessern, zeichnet sich eine bevorzugte Ausgestaltung dadurch aus, daß eine Einrichtung zur Umlenkung und Sammlung der Lumineszenz verwendet wird. Die Umlenk- und Sammel-Einrichtung besteht aus geeigneten Reflektoren, wobei die Luminophore der Probe bevorzugt im Brennpunkt eines Parabol-Spiegels, es kann auch ein Teil davon genügen, platziert wird. Die so kollimierte Strahlung wird auf eine Detektor-Einrichtung gelenkt. Diese Reflektoren können aber auch bereits die zur spektralen Zerlegung erforderlichen Gitter-Striche enthalten, bevorzugt vom Echelette-Typ.

Die Erfindung betrifft auch eine Vorrichtung zum Durchführen des oben genannten Verfahrens. Dabei sind Vorrichtung bzw. Einheiten vorhanden, die die Durchführung der oben genannten Verfahrensschritte sinngemäß ermöglichen.

Das Prinzip der Erfindung wird im folgenden anhand der Anregung einer Probe zur Aussendung einer Lumineszenz erläutert.

Die Lumineszenz, wie jede Art von Emission, wie elektromagnetische Strahlung, Materie- Strahlung, ihren Teilchen und deren beliebige Kombinationen, läßt sich nicht nur mit Hilfe elektromagnetischer Strahlung, wie z. B. UV-Licht, anregen, sondern auch mit Hilfe von Teilchen- Strahlung, wie z. B. Elektronen - diese bringen auch den Fernseh-Bildschirm und spezielle Halbleiter-Leuchtdioden (= LED's) zum leuchten - oder jede Art von Materie, deren Teilchen und deren beliebige Kombinationen. Das bedeutet, die Kombination von Raster-Tunnel- Mikroskop und Einzel-Molekül-Fluoreszenz-Spektroskopie (= EMFS) mit nahezu höchst möglicher Nachweisempfindlichkeit des Detektors führt hier zum Ziel, indem die äußerst feine Spitze, die auch als Pico-Spitze (24) ausgebildet sein kann, nicht nur zum bildgebenden Abtasten eingesetzt wird, sondern auch als Elektrode zur Anregung einer (Kathodo-)Lumineszenz dient. Dies erfolgt prinzipiell ähnlich wie bei der Funken-Emissions-Spektroskopie, allerdings mit dem wesentlichen Unterschied, daß mit der Elektrode des Tunnel-Mikroskops eine laterale Auflösung auch in molekular/atomarer Größenordnung möglich ist, unter meist noch moderateren Bedingungen als bei Leuchtdioden gearbeitet wird und statt eines Linien-Spektrums bei wiederholter Anregung lediglich einzelne Leuchtpunkte erhalten werden, die auf den Flächen solcher "Linien" liegen.

Alternativ kann eine solche Anregung auch mit UV- bzw. sichtbarer Licht-Strahlung erfolgen, auch kohärent und jeweils auch polarisiert, die z. B. durch einen hinreichend langen (cm) Rechteck-Schlitz nur auf einer Breite von etwa 0,3 nm, dem Pico-Spalt (70), durchgelassen wird. In Folge von Beugungserscheinungen werden dabei aber in der Regel auch die Luminophore mehrerer benachbarter Sequenzen angeregt, deren Signale dann aus dem Summenspektrum zu eliminieren sind. Zu berücksichtigen ist hierbei auch die mögliche Richtungsabhängigkeit (= Anisotropie) von Anregung und Emission.

Um die Auflösung nicht zu überfordern, können etwaige Doppelstrang-Moleküle zuvor in Einstrang-Moleküle mit Hilfe der bekannten Techniken aufgeschmolzen und einzeln untersucht werden. Alternativ besteht die Möglichkeit, daß die zu sequenzierenden Moleküle z. B. in einer Kapillare durch chemische und/oder physikalische Methoden, wie z. B. der Hydrolyse, in von einander räumlich weiter trennbare Teileinheiten aufgeteilt werden, die dann der lateralen Auflösung problemloser zugänglich sind. Ebeso kann eine Kopie der Probe mit intensiver und schneller emittierenden, jedoch bevorzugt fluoreszierenden, Luminophoren synthetisiert und danach vorteilhafter sequenziert werden. Möglich ist auch eine Kombination beider Methoden.

Alle Atome/Moleküle der einschlägigen Proben können beliebiger Herkunft, Art und Größe, auch z. B. Ionen, also elektrisch geladen sein.

So können einfache, automatisierbare, schnelle, preiswerte, direkte und sequenztreue Analysen von (Makro-)Molekülen und ihren Teilen erfolgen.

Eine annähernd zweidimensionale Analyse ist inzwischen mit der Tunnel-Mikroskopie machbar. Hier spielen tiefere Atom-Lagen nur noch selten und dann auch nur eine geringe Rolle. Die helikale Struktur der DNA-Makromoleküle mit m = 10 = primäre-/sekundäre Identitätsperiode bleibt auch bei der Einstrang-Version erhalten. Das bedeutet, um stets von der selben Position auf den spezifischen Teil der Sequenz zu schauen, siehe Fig. 4 und 5, ist es erforderlich, das Makromolekül nach jeder Sequenz oder w-mal (w = 1 bis m) wiederholtem vollem Durchlauf mit 360°/m oder eventuell auch einem Mehrfachen davon um die Längs-Achse zu drehen. Alternativ können auch w parallele um je 360°/m oder eventuell auch einem Mehrfachen davon verdreht gelagerte identische Einstränge der Probe untersucht werden. Zu einer solchen Mikromanipulation eignen sich die Spitzen eines Tunnel- oder Kraft-Mikroskops vorzüglich, ebenso auch sogenannte "Lichtpinzetten".

Zur Steigerung der lateralen Auflösung kann der bevorzugte Elektronen-Strahl aus der Spitze des Tunnel-Mikroskops erfindungsgemäß mit Hilfe geeigneter zusätzlicher elektrischer und/oder magnetischer Felder noch weiter auf den für eine Sequenz-Periode spezifischen Teil einer Probe fokussiert werden. Dafür sorgt aber auch schon die extreme Abstandsabhängigkeit des Tunnel- Stromes. Auch eine Optimierung der Spitze (24), bis hin zu einem einzigen Atom in vorderster Lage an einer relativ dünnen Nadel, der Pico-Spitze, wirkt hierfür günstig.

Um möglichst jedes emittierte Photon auf den Detektor zu lenken, sollten möglichst alle Komponenten ideal transparent, absorbierend oder reflektierend sein. Ferner ist es erforderlich, die gerade leuchtende Sequenz einer Probe vorzugsweise im Brennpunkt eines Parabol-Spiegels anzuordnen. Sofern dabei auch gleichzeitig eine Konvergenz der Strahlung erzielt werden soll, ist diese Sequenz zwischen dem Brennpunkt F auf der optischen Achse in Richtung 2.F = M zu verschieben.

So gelangt fast alle Lumineszenz als parallele Strahlung auf den Detektor, dessen Öffnung und sensorische Fläche nicht kleiner als jene von kollimiertem Licht durchstrahlte am Ausgang des Parabol-Spiegels in den Fig. 7 und 8 sein soll. Anschließend erfolgt ihre übliche spektrale Zerlegung mit Hilfe eines Prismas und/oder auch eines holographisch erzeugten Gitters mit bauartbedingt optimierter Helligkeit für z. B. die 2. oder 3. Ordnung. Ist das Gitter auch noch konkav, so kann auf die Linsen vor den Detektoren verzichtet werden.

Erfindungsgemäß werden die sequenz-perioden-spezifischen Photonen, die ja bekanntlich von einer oder mehreren einfach oder höher angeregten Zuständen unterschiedlicher beliebiger aber eindeutiger Spezies, neutral oder geladen, auch von reversiblen oder irreversiblen Umwandlungs- und Folge-Produkten etc. stammen können., zur Erzielung möglichst hoher Lesetaktfrequenzen unter einer Milli-Sekunde pro Sequenz-Periode (kHz) und höher gemeinsam auf jeweils einen Photomultiplier pro sequenzspezifischer Gattung gelenkt. Im Falle von DNA-Proben sind das also die Signale der Desoxyribonukleotide: dAMP, dGMP, dCMP und dTMP und bei RNA jene der Ribonukleotide: AMP, GMP, CMP und UMP sowie jene der über 30 bekannten seltenen Sonder- Nukleotide. So geht für das herkömmliche Umschalten keine hier wesentliche Zeit verloren und nebenbei entfallen wartungsintensivere bewegte Teile.

Bei Einsatz von z. B. nur sechs Photomultipliern - die 8 Haupt- und über 30 Sonder-Nukleotide werden hierbei zu sechs Gattungen zusammengefasst - kann so einfach und rasch automatisch festgestellt werden, ob DNA oder RNA vorliegt, deren Anteil an seltenen Sonder-Nukleotiden sowie der genaue individuelle Polymerisationsgrad, auch bei zweidimensionalen Proben und ggf auch mit Bestimmung des Molekulargewichts eines (Makro-)Moleküls.

Sowohl die Herstellung solcher Geräte, auch als Vollautomaten, als auch deren Anwendung als analytische Dienstleistung vorzugsweise für den biologisch-medizinischen und chemisch- analytischen Bereich, insbesondere also für die Gen- und Polymer-Analytik, ist möglich.

Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung weist drei wesentliche Merkmale auf:

1. Eine relativ hohe laterale Auflösung im atomaren/molekularen Größenordnungs-Bereich, insbesondere zur Analyse von DNA-/RNA-Molekülen in der Größenordnung von etwa 0,34 nm, d. h. von einer primären Sequenz-Periode der Nukleotide, und
2. eine relativ hohe Nachweisempfindlichkeit der Detektoren im Größenordnungs-Bereich von etwa einem Photon und
3. eine relativ hohe Detektions-Geschwindigkeit oder Arbeitstakt-Frequenz, z. B. ab etwa 1 kHz und darüber hinaus bis in den GHz-Bereich.

Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 bis 3 schematische Darstellungen einer Vorrichtung (10) zum Durchführen eines Sequenz-Analyse- Verfahrens mit einem Raster-Tunnel-Mikroskop (16), einer Detektoreinrichtung (14) und einer Steuer-, Auswert- und Speicher-Einrichtung (18), wobei eine Probe (12) jeweils an einer vorgegebenen Stelle hinsichtlich Ort und ggf. auch Größe ihrer Atome/Moleküle dieser Sequenz detektiert und an dieser Stelle die System-Anregung mit einem Anregungs-Signal (20) beaufschlagt wird, so daß das System ein Antwort-Signal, z. B. eine Lumineszenz (30) abgibt, das die Detektoreinrichtung (14) erfasst und einer Steuer-, Auswert- und Speicher-Einrichtung (18) zuführt.

Fig. 4 liegt modifiziert und schematisiert das von Watson und Crick entwickelte Modell für eine DNA- Doppelhelix (40) zugrunde. So fehlt der Komplementär-Strang, die Lage der Sauerstoffatome und der Gegenionen am Phosphat (41) ist nicht eingezeichnet und die räumliche Aufteilung von Zucker (42) und den vier Basen (43) bis (46), in der Reihenfolge zunehmender Größe, ist an der Stelle, an der nur jeweils eine davon sitzt, dazugekommen. Es zeichnet sich dabei klar ab, daß die spezifische Information der Sequenz-Perioden im Innern, also um die Längsachse, gruppiert ist und somit von außen, außer mit dieser Erfindung, in der Regel nicht zugänglich ist. Übliche Spitzen des Tunnel-Mikroskops (24) haben einen Krümmungs-Radius von 10 bis 50 nm, wobei 10 nm als 5-facher Durchmesser der Einstrang-Helix (40) eingezeichnet sind. Ein Tunnel- Mikroskop kann also mit einer Spitze, die einen Radius von 50 nm hat, Atome, die 2 bis 3 Größenordnungen kleiner sind, wirklichkeitsnah abbilden. Kleine Ein-Ring-Basen sind die Pyrimidin-Basen: Cytosin (C) (43), Thymin (T) (44) sowie bei RNA Uracil (U) (ähnlich 44) und große Zwei-Ring-Basen sind die Purin-Basen: Adenin (A) (45) und Guanin (G) (46).

Fig. 5 zeigt dasselbe DNA-Molekülfragment (40) in Längsrichtung. Im äußeren Ring sind die Phosphat (41)- und Zucker (42)-Brücken, im mittleren Ring (48) befinden sich alternativ die jeweiligen Kernbasen (43) bis (46) und im inneren Ring (49) ist die mittige Grenzlinie der Wasserstoff- Brücken zwischen den größten (46) zu den hierzu komplementären kleinsten Basen (43) gezeichnet. Der zugehörige Mittelpunkt markiert sowohl die Längs-Achse (x) als auch die mittige Grenzlinie der Wasserstoff-Brücken zwischen den zweitgrößten zu den hierzu komplementären zweit-kleinsten Basen (44) und (45).

Fig. 6 bis 9 zeigen klassische Versionen des Strahlenganges für die Spektrometrie. Bei geeignetem Abstand zwischen der Lochblende (50), dem Schnittpunkt der Randstrahlen (58), und den Photomultipliern (64) kann auf die Linsen (66) zur Kollimation verzichtet werden.

In Fig. 6 ist die ganze Vorrichtung (10) innerhalb eines hinreichend großen ganzen bzw. halben Parabol-Spiegels (52) angeordnet. Bei Platzierung der leuchtenden Sequenz der Probe (12) auf der optischen Achse zwischen F1 und M schneiden sich die ausgehenden Strahlen im Brennpunkt F2 und fallen nach der Kollimation parallel auf die Detektor-Einrichtung (14).

In Fig. 7, mit Blick von oben, ist der halbe Parabol-Spiegel (52) wesentlich kleiner. Er schließt passend an die Detektor-Einrichtung (14) an, analog einem klassischen Spektral-Apparat. Das Prisma (56) zerlegt die einfallende Strahlung entsprechend ihrer jeweiligen Wellenlänge. Die Lochblende (50) mit Lochdurchmesser um 2 mm filtert unspezifische Stör-Strahlung (68) heraus. Für die Emission einer jeden Molekül-Gattung, G1 bis G6, steht jeweils ein extra Photomultiplier (64) zu Verfügung. Bei G3 wird beispielhaft gezeigt, wie für eine Gattung zwei, ggf. analog auch mehrere, sequenz-spezifische Strahlungen gesammelt und mit Hilfe einer oder ggf mehrerer Umlenk-Vorrichtungen zusammen auf einen Photomultiplier (64) gelenkt werden können. Mit G6 wird gezeigt, wie spezifische Strahlungen diverser sonstiger Atome/Moleküle vor oder nach der Lochblende (50) gesammelt und zusammen auf einen Photomultiplier (64) gelenkt werden können.

In Fig. 8 ist der Probenteil dazu seitlich aufgezeichnet. Die Probe (12), mit Brennpunkt F1 in ihrer Mitte, liegt ganz auf dem ebenen Probenträger (22) hinter einer etwas größeren Blende (60), die in den Parabol-Halbspiegel (52) eingebaut ist. Sie soll diffuse Strahlung auf den Parabol- Halbspiegel (52) reflektieren, so daß diese ebenfalls zumindest annähernd parallel den Halbspiegel verläßt.

Fig. 9 zeigt eine Variante von Fig. 8, bei der die Probe (12) in einer hinreichend tiefen möglichst parabolisch geformten Rinne im Probenträger (22) liegt. Mit der Probe (12) liegt hier auch der Brennpunkt F1 entsprechend tiefer. Die Blende (60) kann dabei deutlich kleiner ausgebildet sein oder sogar ganz wegfallen.

Fig. 10 zeigt die einfachste Variante, bei welcher der Probenträger (22) mit der Detektor-Einrichtung (13) auf Basis eines Halbleiter-Impulshöhen- oder Vielkanal-Analysators identisch ist. Jeder Gattung entsprechen ein oder mehrere meist auseinanderliegende Kanäle. Die elektrische Ladung ist hierbei eine definierte Funktion der Photonen-Menge und die elektrische Spannung am Detektor- Ausgang eine solche der Photonen-Energie, respektive ihrer Frequenz bzw. Wellenlänge. Bei dieser Anordnung können allein wegen der Geometrie nur rund 40% der Strahlung erfasst werden.

Fig. 11 zeigt eine effektivere Variante der Detektor-Einrichtung (14), die in Dosenform (15) ausgebildet ist. Damit können rund 70% der Strahlung erfasst werden.

Fig. 12 zeigt eine mögliche Kombination beider obiger Varianten, wobei die Dose (15) einen hinreichend großen reflektierenden Deckel (21) in geringem Abstand übereinander hat, der von der Spitze (24) getragen werden kann. So ist gewährleistet, daß praktisch jeder (Licht-)Strahl auf den Detektor fällt.

Fig. 13 zeigt eine reflektierende Blende 60 mit dem Pico-Spalt 70, welcher senkrecht zur Probe 12 bzw. 40 steht und polarisiertes Licht zur Anregung auf möglichst nur eine Molekül-Gattung der Sequenz durchläßt. Diese Gattung Gi,_n an der Stelle x_n der Probe, mit z. B. i = 1 bis 6 unter schiedlichen Gattungen und n = 1 bis 3.10⁹ Sequenzeinheiten mit n_max. = dem Poly merisationsgrad, ist unter der Lupe stark vergrößert dargestellt. Zweckmäßigerweise wird der Koordinaten-Ursprung auf den Beginn der ersten Sequenz der Probe auf der Längsachse gelegt. Die positive x-Richtung führt den Blick auf das gegenüberliegende Ende der hier linear angeordneten Probe zu. Die positive y-Richtung verläuft dazu senkrecht und nach rechts. Die z- Richtung erstreckt sich senkrecht zu beiden positiv in die Höhe bzw. nach hinten und negativ in die Tiefe bzw. nach vorne. Längeneinheit ist z. B. eine durchschnittliche typische Sequenz-Periode oder das metrische System.

Fig. 14 zeigt den Aufbau von oben nach unten, beginnend mit der Lichtquelle 76, welche im Brennpunkt eines Parabolspiegels 52 angeordnet ist, gefolgt von einem Kondensor 77, einem oder ggf. auch mehreren Monochromatoren 78, einem Polarisator 80 und alternativ entweder einem Chopper 82 oder einer Lichtquelle 76 mit relativ hoher Blinkfrequenz nach welcher auch der Detektor 14 getriggert ist. Ein Teil des so polarisierten und parallelen Lichts tritt durch den Pico-Spalt 70 der reflektierenden Blende 60 hindurch und trifft dann auf möglichst nur eine Sequenzperiode der Probe 12, so daß dort nur jeweils eine Gattung angeregt wird, welche sich im Brennpunkt F1 eines Parabolspiegels 52 befindet, der die Emission sammelt und parallel ausrichtet, so daß sie kollimiert mit einer Breite von z. B. 2 mm zum Detektor 14 gelangt. Die Probe 12 bzw. 40 kann dabei z. B. auf einem transparenten Probenträger liegen oder an der Spitze 24 eines Tunnel- oder Atom-Kraft-Mikroskopes hängen oder zwischen zwei solcher Spitzen aufgespannt sein. Sie kann aber auch durch Oberflächenadsorption oder elektostatische Kräfte an die Unterseite eines transparenten Probenträgers gebunden sein.

Zur Lichtsammlung kann auch eine Vorrichtung verwendet werden, bei welcher die Probe auf einem transparenten Träger, z. B. aus Plexiglas, ggf. auch mit Deckel- und Flanken-Abdeckung, liegt. Das Material muß dabei relativ zur Umgebung einen hohen Brechungsindex aufweisen, um Totalreflexionen zu gewährleisten. Bis auf eine Seite, den Lichtaustritt, sind alle verspiegelt. Zum Zwecke der Kollimation können diese Seiten auch parabolisch geformt sein, wobei der angeregte Teil der Probe im Brennpunkt F1 liegt. Alternativ kann die Probe auch in ein geeignetes Polymer eingegossen werden, welches hernach z. B. erkaltet oder auspolymerisiert. Aus dem Brenn-Fleck wird dabei dann eine Brenn-Linie, die Brennebene. Die Stärke oder auch Dicke bzw. Breite dieser Anordnung entspricht der Spaltbreite für die anschließende Analyse im Spektralapparat und deren Länge der Spalthöhe, jeweils bezogen auf die offene Stirnfläche für den Lichtaustritt.

Fig. 15 zeigt den Anfangsteil einer Einstrang-DNA mit den Koordinatenpfeilen x und y. Die Richtung, aus der die Strahlung kommt, kann dabei sowohl +y (von rechts) als auch -y (von links) sein. Die Teilfigur a) zeigt am Beispiel des Nukleotids in Position 1 exemplarisch einen schraffierten Doppel-Kegel des selektiven optischen Anregungs-Signals mit zugehörigem Brennpunkt F(1). Dieses kann z. B. aus einem Lichtmikroskop stammen, dessen Strahlungsrichtung umgekehrt wurde oder einem Hohl-Spiegel.

Entsprechend zeigt die Teilfigur d) den Strahlengang bei einem hinreichend dünnen parallelen Lichtbündel, welches bei maximaler Breite selektiv nur mit einem Nukleotid, exemplarisch in Position 10, in Wechselwirkung tritt und dabei senkrecht auftrifft.

In der Teilfigur b) trifft ein ähnliches, jedoch schmaleres, Lichtbündel schräg von unten nach oben auf das Nukleotid exemplarisch in Position 6.

In der Teilfigur c) verläuft ein solches Lichtbündel schräg von oben nach unten. Der Bewegungspfeil steht für die Richtungen, in der diese beiden Teilfiguren in die jeweils andere übergehen.

Fig. 16 erläutert das Arbeitsprinzip dieser Erfindung und zeigt schematisiert als Probe (12) eine Ein strang-DNA/RNA (40) mit besonderer Hervorhebung eines Nukleotids, welches gerade selektiv die System-Anregung (20) erfahren hat und die Antwort in Richtung Detektor (14) emittiert.

Wege zum Ausführen der Erfindung

Das folgende spezielle Ausführungsbeispiel wird anhand der Sequenz-Analyse von DNA- Molekülen beschrieben. Liegen sie als Doppel-Helix vor, so werden sie bevorzugt über die thermische Methode, unter räumlicher Trennung der Wasserstoff-Brücken-Bindungen, aufgeschmolzen. Jeweils einer der Einstränge, Probe (12) bzw. (40) wird auf einen hinreichend geeigneten lumineszenzarmen und möglichst atomar ebenen beweglichen Probenträger (22) verbracht und mit der Spitze (24) in Längsrichtung (x) ausgebreitet und mit einem Raster-Tunnel- Mikroskop (16) zu einer ersten Bestimmung der Lage (Topographie) grob untersucht (siehe Fig. 1). Die so erhaltenen Koordinaten (x, y und z) werden abgespeichert, wobei vorteilhafterweise y und z = 0 gesetzt werden (Oberkannte der Sequenzen) und die erste Sequenz bei x = 0 beginnt. Bei einem weiteren feinen Durchlauf erfolgt die Bestimmung der Sequenz-Koordinaten und deren Speicherung oder auch die elektronische Anregung zur Lumineszenz-Emission oder gleich die Messungen des elektrischen Widerstandes mit einer Spannung, die nach Frequenz, Signalform und Höhe gerade so gewählt wird, daß sie für eine Anregung ausreicht (Zustand gemäß Fig. 2). Ferner kann sowohl ein separater zweiter Fein-Durchlauf gemäß Fig. 2 durchgeführt werden, als auch ein Anregungs-Signal (20) über eine unmittelbar dahinter angeordnete zweite Abtast-Spitze (28) abgegeben werden (siehe Fig. 3).

Nach den Fig. 1 und 2 ist eine Vorrichtung (10) vorhanden, die ein Raster-Tunnel-Mikroskop (16) mit einer Spitze (24), eine Detektor-Vorrichtung (14) und eine Steuer-, Auswert- und Speicher-Einrichtung (18) aufweist. Diese Einrichtung wertet die Signale des Raster-Tunnel- Mikroskops (16) und der Detektor-Einrichtung (14) aus. Wird über elektrische Leitungen (32) eine Gleichspannung angelegt, so ist die zugespitzte Elektrode (24) bevorzugt als Kathode und der auch hinreichend elektrisch leitfähige und reflektierende Probenträger (22) als Anode geschaltet.

Die Höhe der Spannung richtet sich auch danach, ob im Hochvakuum oder in der Atmosphäre gearbeitet wird. Sie beträgt z. B. im Hochvakuum mindestens 4 Volt, entsprechend der niedrigsten Anregungs-Energie des langwelligsten Ausläufers der langwelligsten Absorptions-Bande für UV- Licht (bei λ = 310 nm). An Luft oder auch in einem anderen geeigneten fluiden Medium mit geringem Lichtverlust ist eine entsprechend höhere Anregungs-Spannung anzulegen, ggf. die Durchschlag-Spannung mit eingeschlossen, auch bei größeren erforderlichen Abständen zwischen Spitze und Probe. Die zugehörige Stromstärke ist so zu bemessen, daß die Emission intensiv genug ist, bei möglichst geringer Beeinträchtigung der Probe. Im Prinzip genügt ein Elektron, das die Sequenz trifft und dabei genügend kinetische Energie an den Luminophor abgibt. Beispielsweise beträgt die Stromstärke bei einer Sequenzierung mit einer Arbeitstaktfrequenz von einem MHz mindestens 0,16 pA. Bei einprozentiger Quantenausbeute sind es demnach 16 pA.

Die exakte Positionierung der Vorrichtung (10) hinsichtlich des Ortes der Atome/Moleküle der Probe (12) ist in den Fig. 1 bis 3 schematisch durch den nach links weisenden Längs- Koordinaten-Pfeil x dargestellt. Gemäß Fig. 1 wird zunächst über das Raster-Tunnel-Mikroskop (16) die Orts-Koordinate x (längs), y (quer) und z (hoch) der jeweiligen Sequenz fest bestimmt.

Bei den nachfolgenden Sequenzen genügt in der Regel die Bestimmung der x-Koordinate, da y und z meist konstant bleiben, bevorzugt beim Wert 0. In einem weiteren Durchlauf gemäß Fig. 2 wird dann an dieser Stelle X = n der Luminophor mit dem Anregungs-Signal (20) beaufschlagt, woraufhin dieser die Lumineszenz (30) abgibt, welche von einer der Detektor-Einrichtungen (13), (14) oder (15) aufgenommen und anschließend von der Steuer-, Auswert- und Speicher- Einrichtung (18) ausgewertet und gespeichert wird.

Gemäß Fig. 3 ist eine unmittelbar der Spitze (24) des ersten Raster-Tunnel-Mikroskops (16) nachgeschaltete Spitze (28) eines zweiten RTMs (17) vorhanden, wobei diese die Anregungs- Signale (20) aussendet.

In Fig. 4 ist schematisch ein einsträngiges DNA/RNA-Fragment (40) dargestellt. Bevorzugt wird die relativ hohe laterale Auflösung des Elektronen-Strahls (26) im Größenordnungs-Bereich von etwa 0,34 nm (Schritt B) gewählt, d. h. in der Größenordnung der jeweiligen primären Sequenz- Periode. Damit die Anregung an den Luminophor gelangt, ist es nötig entweder eine Pico-Spitze zu verwenden oder aus größerem y- und/oder z-Abstand mit einer Durchschlagspannung zu arbeiten oder von der Zucker-Phosphat-Seite her durch diese Teile hindurch anzuregen. Sofern die üblichen Natrium-Ionen dabei stören, können sie entweder mit anderen günstigeren Liganden komplexiert oder durch andere Ionen wie z. B. Ammonium-Ionen oder durch geeignete organische Kationen ersetzt werden.

Als erfindungswesentliche Merkmale sind bei diesem Verfahren anzusehen, daß örtlich eine selektive Anregung im atomaren/molekularen Größenordnungs-Bereich erfolgt und gleichzeitig eine Detektion des resultierenden Antwort-Signals im Bereich nahezu höchstmöglicher Nachweisempfindlichkeit sequenz-spezifisch selektiv vom Ort der Anregung durchgeführt wird.

Durch den Einsatz der Tunnel-Mikroskopie-Technik wird sowohl die Positionierung und die laterale Auflösung im atomaren/molekularen Bereich ermoglicht, als auch die örtlich begrenzte Anregung, auch ohne daß die Struktur der Probe zerstört wird. Mit den Mitteln der Spektrometrie wird anschließend eine Analyse der resultierenden Antwort-Signale vorgenommen z. B. als Lumineszenz oder Wechselstrom-Widerstand, da jede Sequenz-Gattung auch eine unterschiedliche Dielektrizitätskonstante aufweist. Aufgrund der relativ hohen möglichen Detektions-Geschwindigkeit und der zuverlässigen Erfassung der Antwort-Signale ist eine nach dem Stand der Technik nicht mögliche äußerst schnelle und zuverlässige Sequenzierung erzielbar.

Bezugszeichenliste

10

Vorrichtung

12

Probe

13

einfacher Impulshöhen- bzw. Vielkanal-Analysator auf Halbleiterbasis

14

Detektor(-Einrichtung)

15

verlustarmer Impulshöhen- bzw. Vielkanal-Analysator auf Halbleiterbasis

16

Raster-Tunnel-Mikroskop (RTM)

17

2. Raster-Tunnel-Mikroskop

18

Steuer-, Auswert- und Speicher-Einrichtung

20

Anregungs-Signal

21

Reflektor(-Einrichtung)

22

Probenträger

24

RTM-Spitze, allgemein bzw. 1.

26

Elektronen-Strahl

28

2. RTM-Spitze

30

Lumineszenz(-Strahlung)

32

elektrische Leitung

40

Einstrang-DNA-Fragment als Probe (

12

)

41

Phosphat, meist als Natrium-Salz

42

Zucker = 2-Desoxy-D-ribose (bei DNA, bzw. Ribose bei RNA)

43

Cytosin

44

Thymin (bei DNA, bzw. Uracil bei RNA)

45

Adenin

46

Guanin

47

vorderstes (Wolfram-)Atom der Spitze (

24

)

48

mittlerer Ring mit allen Kernbasen

49

innerer Ring = Längendifferenz größte (

46

) - kleinste (

43

) Kern-Base = mittige Grenz-Linie der Basenpaare (

46

) und (

43

)

50

absorbierende Loch-Blende

52

Parabol-Spiegel(-Hälfte)

54

Loch für RTM-Spitze

24

56

Zerlegungs-Prisma

58

Randstrahlen der Lumineszenz

30

60

reflektierende Spiegel-Blende

62

Umlenk-Vorrichtung = Spiegel oder Prisma

64

Photomultiplier, SEV

66

Sammellinse

68

unspezifische Stör-Strahlung

70

Pico-Spalt

72

kurzwellige Seite des Spektrums

74

langweilige Seite des Spektrums

75

-

76

Lichtquelle

77

Kondensor

78

Monochromator

79

-

80

Polarisator

81

-

82

Chopper

83

-

84

Durchführung
x Längs-Koordinate
y Quer-Koordinate
z Höhen-Koordinate
F1, F2 Brennfleck

1

,

2

F(1) Brennfleck zu Position

1

G1-G6 Einzel-Sequenz-Gattung

1

bis

6

G_i,n

Sequenz der Gattung i auf Position n der Sequenz-Reihenfolge
M Punkt bei doppelter Brennweite, Mittelpukt bei sphärischen Krümmungen
S Scheitelpunkt

Claims

1. Analyseverfahren zur Sequenzierung/Identifizierung von Atomen und/oder Molekülen, auch größere Aggregate derselben mit eingeschlossen, oder solcher Sequenzen in einer Probe (12), wobei die Sequenzen dabei ein- oder mehrdimensional in beliebiger Formation angeordnet sein können, dadurch gekennzeichnet, daß

A) jeweils der Ort und/oder die Größe der Atome/Moleküle innerhalb der Probe im atomaren/molekularen Größenbereich festgestellt und/oder festgehalten wird,
B) jeweils die Atome/Moleküle der Probe (12) in dem in Schritt A) festgestellten Ort einem Anregungs-Signal (20) ausgesetzt werden mit einer lateralen Auflösung im atomaren/molekularen Bereich zur Erzeugung eines Antwort-Signals,
C) das jeweilige Antwort-Signal detektiert, ausgewertet und/oder gespeichert wird,
D) die Analyse einer Sequenz mit einer relativ hohen Arbeitstaktfrequenz durchgeführt wird, und
E) die Schritte A) bis D) an weiteren Sequenzen wiederholt werden können.

2. Verfahren nach Anspruch 1), dadurch gekennzeichnet, daß für die Schritte A) und/oder B) ein Tunnel-Mikroskop, insbesondere ein Raster-Tunnel- Mikroskop, d. h. ein Mikroskop, das den sogenannten Tunnel-Effekt nutzt, oder auch im Sinne eines Atom-Kraft-Mikroskops wirkt, eingesetzt wird und/oder das Antwort-Signal aus Schritt B) als Lumineszenz (30) ausgebildet ist oder als elektrisches Strom-/ Spannungs-Signal, auch mit überlagertem Wechselstrom, auch mit unterschiedlichen Frequenzen und/oder dabei eine Detektor-Einrichtung (14) eingesetzt wird, deren Nachweisempfindlichkeit z. B. im Bereich eines Photons bzw. Atoms/Moleküls liegt und/oder die Schritte A) bis E) mit einer Arbeitstaktfrequenz im Bereich ab 1 kHz bis in den GHz-Bereich hinein durchgeführt werden.

3. Verfahren nach Anspruch 1) und/oder 2), dadurch gekennzeichnet, daß die Schritte A) und B) gleichzeitig oder unmittelbar hintereinander oder der Schritt B) in einem weiteren Durchlauf ausgeführt werden.

4) Verfahren nach einem oder mehreren der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Anregungs-Signal als elektromagnetische Strahlung ausgebildet ist, also als Radiowellen-, Mikrowellen-, Infrarot-, insbesondere sichtbares Licht und Ultraviolett-, Röntgen- oder γ-Strahlung oder als Teilchen-Strahlung, insbesondere als Ionen-Strahlung oder vor allem als Elektronen-Strahlung, einschließlich Gleich- und/oder Wechselströme aller Art, ausgebildet ist.

5. Verfahren nach einem oder mehreren der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß zwischen der Abgabe und der Aufnahme des Anregungs-Signals eine Fokussier- Einrichtung einwirkt und/oder das Anregungs-Signal der Atome/Moleküle so ausgebildet ist, daß das Antwort-Signal als Lumineszenz (30) emittiert wird und/oder kohärentes und/oder auf alle Arten polarisiertes Licht eingesetzt wird und/oder bei gleichzeitiger Anregung mehrerer, in der Regel benachbarter, Luminophore die Auswertung der sequenzspezifischen Lumineszenz über den Einsatz von Differenz-Spektren erfolgt und/oder über die optische Spreizung und/oder zur Analyse der Lumineszenz Photomultiplier-Einheiten oder andere spezielle Halbleiter(-Photo-Dioden) wie Avalanche Photodioden (= APDs), auch als Dioden-Zeilen (Arrays), insbesondere Impulshöhen- bzw. Vierkanal-Analysatoren oder CCD- (charge coupled device) Bildwandler oder Kameras eingesetzt werden.

6. Verfahren nach Anspruch 5), dadurch gekennzeichnet, daß die Fokussier-Einrichtung der relativistische Tunnel-Effekt selbst sein kann und/oder eine elektrische Feld-Linse und/oder eine magnetische Feld-Linse und/oder ein Pico-Spalt und/oder ein konvergenter Licht-Strahl mit hinreichend kleinem Brennfleck im atomaren/ molekularen Bereich.

7. Verfahren nach Anspruch 4), dadurch gekennzeichnet, daß der Elektronen-Strahl einen Durchmesser im Größenordnungs-Bereich der De-Broglie- Wellenlänge eines Elektrons oder darunter aufweist.

8. Verfahren nach einem oder mehreren der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die laterale Auflösung des Anregungs-Signals im Bereich einer Sequenz z. B. unter 1 nm, insbesondere bei etwa 0,34 nm gewählt wird und/oder die Lumineszenz in einem Parabol-Spiegel oder auch nur einem Teil davon gesammelt/gebündelt und zumindest annähernd parallel gerichtet wird und/oder der Parabol-Spiegel ein geeignetes Strich- Gitter zur spektralen Zerlegung enthält und/oder die DNA-Doppelstrang-Probe vor der Sequenzierung bevorzugt thermisch in Einstrang-Moleküle aufgeschmolzen wird und/oder eine Kopie des Einstrages mit besonderen Luminophoren hergestellt wird, die intensiver und schneller emittieren als die ursprünglichen Luminophore und so eine bessere Detektierbarkeit erzielt wird und/oder bei zu langsamer Emission eine stimullierte Emission nach dem Laser-Prinzip angewandt wird und/oder die Probe nach jeder Analyse einer Sequenz oder bis zu zehnmal wiederholtem vollen Durchlauf (vom Anfang bis zum Ende der Probe) um je ca. 36° bei DNA-RNA (= 360°.primäre-/ sekundäre Identitätsperiode) oder einem geeigneten Mehrfachen davon um seine Längsachse gedreht wird und/oder für jede nötige Analysen-Lage Kopien der Einstränge angefertigt werden, die parallel um je 36° verdreht, oder einem geeigneten Mehrfachen davon, auf dem Probenträger abgelegt werden, um anschließend gemäß den Schritten A) bis E) sequenziert zu werden und/oder die laterale und/oder zeitliche Auflösung mit Hilfe der selektiven Abspaltung z. B. einzelner Nukleotide, deren Fragmente oder Kernbasen- Gattungen zu Apurin-Säure oder Apyrimidin-Säure oder noch weitergehender definierter Abbauprodukte der Probe noch weiter verbessert wird.

9. Vorrichtung zum Durchführen des Verfahrens nach einem oder mehreren der Ansprüche 1) bis 8).

10. Vorrichtung nach Anspruch 9), dadurch gekennzeichnet, daß zur Erzeugung der Anregungs-Signale zumindest die wesentlichen Bestandteile von Raster-Tunnel-Mikroskopen oder Elektronen-Mikroskopen und/oder Kraft-Mikroskopen und/oder Pico-Spalte und/oder Pico-Spitzen verwendet werden und/oder auch zur Analyse der Antwort-Signale zumindest die wesentlichen Bestandteile von Einzel- Molekül-Fluoreszenz-Spektrometern verwendet werden und/oder zur Steigerung der Detektions-Quanten-Ausbeute eine geeignete kältetechnische Vorrichtung eingesetzt wird und/oder eine Umlenk- und Sammel-Einrichtung und/oder durchoptimierte Strahlengänge und optische Komponenten und/oder zur Bewegung der Probe besonders feingängige, elektronisch steuerbare Manipulatoren z. B. auf Basis von Hydraulik, Piezoelektrik und/oder Elektromechanik verwendet werden.