WO1999054497A1 - Verfahren und vorrichtung zur konzentrationsbestimmung, bestimmung von adsorbtions- und bindungskinetiken und gleichgewichts- und bindungskonstanten von molekülen durch lumineszenz-messungen - Google Patents

Verfahren und vorrichtung zur konzentrationsbestimmung, bestimmung von adsorbtions- und bindungskinetiken und gleichgewichts- und bindungskonstanten von molekülen durch lumineszenz-messungen Download PDF

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luminescent
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Stefan Seeger
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Stefan Seeger
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"

Definitions

  • the invention relates to a method and a device for luminescence analysis.
  • the invention relates to a fast method for luminescence analysis with a high dynamic measuring range, the determination of adsorption and binding kinetics and equilibrium or binding constants and a device for carrying out this method.
  • Luminescence analysis especially fluorescence analysis, has become established both for visualization and for determining the concentration of a wide variety of analytes in environmental, chemical and biochemical analysis, food chemistry and medical diagnostics.
  • the field of application of luminescence analysis has long been limited to a relatively high concentration range, i.e. the dynamic measuring range was small.
  • Concentration determination serve, however, would be at high analyte concentrations in comparison to classic one-point measurement methods, i.e. Process without scanning many measuring points, slowly and therefore especially for screening processes in the search for active pharmaceutical ingredients with possibly Thousands of samples unsuitable.
  • the first object is achieved according to the invention by a method for determining the density of luminescent molecules on a surface, in which a surface is scanned with a laser beam (Fig. 1).
  • l laser beam
  • 2 surface transparent for the selected light
  • 3 focusing optics
  • 4 adsorbed or bound molecules.
  • the excitation light source, the detector and other optical elements are not shown.
  • the photons emitted by molecules excited by the laser beam are recorded with a detector (Fig. 2, 3).
  • Fig. 2 shows the signals that are detected during scanning, where 1 second was measured at a measuring point. The time during the movement to the next measuring point is not shown on the time axis. There is a signal at every measuring point.
  • Fig. 3 represents
  • S is the relative error of the concentration determination.
  • TV can be the number of all detected photons or all detected photons minus the background photons; if the density of the luminescent molecules on the surface is so small that areas in which there are no molecules occur, the background signal must be subtracted.
  • the number of detected fluorescence photons N is determined within a given measurement time /, and an estimate of the substance quantity Q is then made on the basis of N.
  • the time t is to be determined in which a given number of fluorescence photons N is measured, that is to say after measuring N photons, the measurement is stopped and the amount of substance is then estimated over the measurement time.
  • the number of fluorescence photons N should be given by the relative error of the measurement, which is predetermined. The dependency of the respective number of fluorescence photons N on the relative error of the measurement results as follows.
  • the probability P N _i ( ⁇ to have detected exactly N-1 photons for a quantity of substance q in a given time t is given by the following Poisson distribution: ⁇ N- ⁇
  • the advantage of this method is that the entire surface does not always have to be scanned, but that the measuring time depends on the density of the luminescent molecules; At high concentrations, the required number of detected photons is reached very quickly, while the entire surface only has to be scanned at very low densities.
  • the measurement time is understood only as the time during which the detector can detect photons.
  • the measuring time should preferably not be longer at a measuring point than photons can be expected from the molecule or the molecules. If the measuring time is longer than this time (eg due to photo destruction), the signal-to-noise ratio deteriorates.
  • the luminescent molecules themselves can represent the analyte, or the luminescent molecules bind to the analyte and thus serve as markers for indirect detection.
  • An example of such indirect detection of the analyte is, for example, the binding of a dye-labeled antibody to an antigen.
  • the concentration of the luminescent molecules in solution can be related to the density of the luminescent molecules on the surface via calibration measurements.
  • fluorophores are preferably used as luminescence markers. According to the invention, these fluorophores can be detected both via their color (ie the wavelength of the emitted photons) and via their fluorescence lifetime (eg S. Seeger et al. Ber. Bunsenges. Phys. Chem. 97, 1542 (1993).
  • the dye Cy5 is preferably used as luminescence markers. According to the invention, these fluorophores can be detected both via their color (ie the wavelength of the emitted photons) and via their fluorescence lifetime (eg S. Seeger et al. Ber. Bunsenges. Phys. Chem. 97, 1542 (1993).
  • the choice of the luminescent molecules used in accordance with the invention depends primarily on the laser light used and also on the single molecule detector used.
  • the single molecule detector which can be used according to the invention is not restricted, provided that it allows the detection of a single luminescent molecule given the detection volume, wavelength and power of the laser beam and given luminescent molecule.
  • the requirements for the sensitivity of the single molecule detector increase with increasing detection volume and decreasing power of the laser beam. It is therefore particularly preferred to minimize the detection volume by focusing the laser beam with limited diffraction.
  • the single molecule detector comprises imaging optics, a unit that generates an electrical signal when photons hit it, and a computer including software for evaluating the electrical signals.
  • a commercially available computer plug-in card is used for this, which counts the number of detected fluorescence photons per unit of time.
  • a fast electronic correlator card is used for a time-resolved measurement in the nanosecond range (e.g. Digital Time 70, SL Microtest, Jena or SPC-300, Picoquant).
  • the imaging optics preferably enables the emitted photons to be confocal to the focus of the laser beam on the unit for generating an electrical signal.
  • This unit is preferably a photodiode, particularly preferably a single photon count avalanche photodiode.
  • a photomultiplier or a reinforced CCD camera can also be used.
  • a pulsed or modulated light source and a fast detector are required.
  • the time-dependent detection of the fluorescence photons enables a distinction to be made between molecules bound to the surface and dye-labeled molecules that move freely in the supernatant solution. It is taken into account that free dyes or dye-labeled molecules usually have diffusion constants in the range of 10 ⁇ 5 to 10 "6 cm 2 / s, which with free diffusion at transit times through the confocal volume of about 100 ms, not when passing through the detection volume through the center, but in peripheral areas, even shorter, whereas the molecules attached to the surface remain in the detection volume for any length of time (practically until photo-destruction) Unbound dye-labeled molecules have to be removed from the supernatant solution, signals that appear briefly are assigned to freely mobile molecules, while signals that occur long, eg longer than 100 ms, are assigned to bound molecules on the surface.
  • Laser light with a wavelength of 600 nm and more is preferred to excite the luminescence marker in order to minimize the occurrence of scattered light and auto-fluorescence.
  • semiconductor lasers and helium-neon lasers in this wavelength range are preferred for reasons of cost for the method according to the invention.
  • the beam of this laser light is scanned across the surface.
  • the raster device is not limited, provided that it changes the position of the laser beam by a defined distance at time intervals.
  • Raster devices such as those used in conventional laser scanning microscopes, and commercially available x, y shift tables are also suitable in the method according to the invention.
  • the measuring time per measuring point is preferably 1 ms to 1 s.
  • the measurement card forwards the number of detected fluorescence photons per time interval, preferably 1 ms, to the control program, which terminates the measurement process when the predetermined number of photons is reached, and stores the measurement time that has elapsed so far and the measurement data.
  • the desired number of photons can be achieved at a single measuring point.
  • About the signal intensity, i.e. the number of photons detected can thus directly determine the concentration of the analyte.
  • the signal intensity is proportional to the analyte concentration in this area. In the case of a raster device that approaches 100 times 100 measuring points, stopping the measurement after the first measuring point leads to a 10,000-fold acceleration of the measuring method with sufficient measuring accuracy.
  • a third measuring range is finally reached, in which molecules are no longer detected at every measuring point.
  • the average number of molecules detected per measuring point can then be less than 1.
  • the signal level at the measuring points with signal is constant within the framework of statistical fluctuations.
  • the concentration of the molecules on the surface in this area is approximately proportional to the ratio of the number of measuring points with signal to the total number of measuring points.
  • Measuring points with a signal are set by setting a signal threshold for the fluorescence intensity of measuring points without a signal, i.e. only differentiated underground signal.
  • the three measuring ranges can cover more than 8 orders of magnitude.
  • a further increase in the sensitivity of the method according to the invention can be achieved by selecting the surface of the support that is scanned in such a way that the analyte or the luminescent molecule is easily bound to it. This can be achieved by utilizing ionic or hydrophobic interactions between the surface and the analyte or the luminescent molecule. In particular, however, it is preferred that the luminescent molecules are selectively bound to the surface by an affinity reaction. In such an affinity reaction, the luminescent molecule or the analyte is immobilized on the surface via a capture molecule.
  • Capture molecules preferred according to the invention are proteins or nucleic acids immobilized on the surface which selectively bind the luminescent molecule or the analyte
  • Preferred proteins are antibodies that bind corresponding antigens.
  • Another protein that is preferably used according to the invention is (strept) avidin, which is able to bind the luminescent molecule derivatized with biotin or the analyte thus derivatized very selectively.
  • Nucleic acids which are preferably used according to the invention are, in particular, DNA oligomers which specifically bind certain DNA segments.
  • the capture molecules are immobilized on the surface via a Langmuir-Blodgett film, preferably a Langmuir-Blodgett film of a cellulose derivative. It is particularly preferred to first coat the surface with 1 to 8 monolayers of aminoalkyltrimethylsilyl ether cellulose (ATMSC) and then 1 to 8 monolayers of trimethylsilyl ether cellulose cinnammoate (TMSCC). The cinnamoyl groups of the TMSCC are then oxidized to aldehyde groups for the covalent coupling of the capture molecules.
  • ATMSC aminoalkyltrimethylsilyl ether cellulose
  • TMSCC trimethylsilyl ether cellulose cinnammoate
  • the second object of the invention is achieved by a method in which the surface is scanned with a laser beam, the photons emitted by molecules excited with the laser beam are recorded with a single molecule detector and the recording of the photons is stopped.
  • the equilibrium of the adsorption or the binding to the surface is reached when the same number of photons is detected at least two successive measuring points within the framework of statistical fluctuations.
  • the substance to be bound or adsorbed is placed in solution over a correspondingly prepared surface and the scanning of the surface is initiated with the fluorescence detector. The time at which a respective spot was measured during scanning is then plotted against the fluorescence detected in the spot. This applies to
  • x (t) is the mean concentration of the molecules bound at time t
  • c is the constant concentration of free molecules in solution
  • ⁇ the total number of free binding sites on the surface
  • k + , k_ are the binding or detachment constants to be determined.
  • the fluorescence intensity of the spots can thus be used to determine the size k + c + k_ directly, without having to have knowledge of ⁇ 0 . If one also takes the same measurement at different values of c, the constants k + and k_ can also be determined separately.
  • the invention also provides a device for determining the density of luminescent molecules on a surface, comprising a laser, an individual molecule detector, a scanning device and a means for stopping the measurement after detection of a predetermined number of photons.
  • a device for determining the density of luminescent molecules on a surface comprising a laser, an individual molecule detector, a scanning device and a means for stopping the measurement after detection of a predetermined number of photons.
  • the laser used in the device according to the invention, the single molecule device used, the scanning device used and the means used to abort the measurement after detection of a predetermined number of photons correspond to those given above for the method according to the invention.
  • the time it takes for sufficient photons (e.g. 10,000) to be detected is measured. After a suitable calibration, i.e. the measurement of this time as a function of the concentration, the concentration on c-Aktm can be determined.

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Abstract

Die Erfindung beschreibt ein Verfahren und eine Vorrichtung, die durch Abrastern einer Oberfläche mit einem fokussierten Laser und der Detektion von Lumineszenzphotonen die Bestimmung der Konzentration, der Bindungskinetik bzw. Adsorptionskinetik sowie der Gleichgewichts- bzw. Bindungskonstante von lumineszenzmarkierten Molekülen an Oberflächen erlaubt.

Description

Verfahren und Vorrichtung zur
Konzentrationsbestimmung, Bestimmung von Adsorptions- und
Bindungskinetiken und Gleichgewichts- und Bindungskonstanten von Molekülen durch Lumineszenz-Messungen
Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Lumineszenz-Analyse. Insbesondere betrifft die Erfindung ein schnelles Verfahren zur Lumineszenz-Analyse mit einem hohen dynamischen Meßbereich, die Bestimmung von Adsorptions- und Bindungskinetiken und Gleichgewichts- bzw. Bindungskonstanten sowie eine Vorrichtung zur Durchführung dieses Verfahrens.
Die Lumineszenzanalyse, insbesondere die Fluoreszenzanalyse, hat sich sowohl zur Visualisierung wie auch zur Konzentrationsbestimmung verschiedenster Analyte in der Umwelt-, chemischen und biochemischen Analytik, Lebensmittelchemie und medizinischen Diagnostik etabliert. Der Anwendungsbereich der Lumineszenzanalyse war jedoch lange auf einen relativ hohen Konzentrationsbereich beschränkt, d.h. der dynamische Meßbereich war klein.
Andererseits ist in den letzten Jahren versucht worden, die Empfindlichkeit der Lumineszenzanalyse durch eine Verringerung des Detektionsvolumens zu erhöhen. Hierbei stand die Verwendung konfokaler Techniken im Vordergrund, mit der sich das Detektionsvolumen bis hinab auf Femtoliter verringern ließ (siehe z.B. R. Rigler, Ü. Mets, J. Widengren, P. Kask, Eur. Biophys. J. 22, 169 (1993)). Sogar der Nachweis einzelner Moleküle wurde so möglich. Jedoch tritt bei geringer Konzentration nur selten ein Molekül in das Detektionsvolumen ein, so daß die Meßdauer bei kleinen Konzentrationen so groß ist, daß das Verfahren für praktische Fragestellungen nicht anwendbar ist. Macklin et al. (Science, Vol.272, 255, 1996) beschreiben ein Spektroskopie-Verfahren an einzelnen Molekülen, bei dem eine Oberfläche abgerastert wird, um so die Moleküle schnell zur weiteren spektroskopischen Analyse lokalisieren zu können. Ein solches Verfahren könnte zwar bei geringen Analyt- Konzentrationen, bei denen pro Meßpunkt maximal nur einige wenige Moleküle detektiert werden, auch zur
Konzentrationsbestimmung dienen, wäre jedoch bei hohen Analyt- Konzentrationen im Vergleich zu klassischen Ein-Punkt- Meßverfahren, d.h. Verfahren ohne Abrastern vieler Meßpunkte, langsam und damit insbesondere für Screening-Verfahren bei der Suche nach pharmazeutischen Wirkstoffen mit u.U. Tausenden von Proben nicht geeignet.
Daher ist es Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren und eine Vorrichtung bereitzustellen, um Analyt-Konzentrationen in einem weiten Konzentrationsbereich schnell nachzuweisen.
Weiterhin ist es Aufgabe der Erfindung, Adsorptions- und Bindungskinetiken und Gleichgewichts- bzw. Bindungskonstanten zu bestimmen.
Die erste Aufgabe wird erfindungsgemäß durch ein Verfahren zur Bestimmung der Dichte lumineszierender Moleküle an einer Oberfläche gelöst, bei dem eine Oberfläche mit einem Laserstrahl abgerastert wird (Abb. 1) . In der Abbildung 1 ist l=Laserstrahl, 2=für das gewählte Licht transparente Oberfläche, 3=fokussierende Optik, 4=adsorbierte oder gebundene Moleküle. Die Anregungslichtquelle, der Detektor und weitere optische Elemente sind nicht dargestellt. Die von mit dem Laserstrahl angeregten Molekülen emittierten Photonen werden mit einem Detektor aufgenommen (Abb. 2, 3) . Abb. 2 zeigt die Signale, die beim Abrastern detektiert werden, wobei an einem Meßpunkt 1 Sekunde gemessen wurde. Die Zeit während der Bewegung zum nächsten Meßpunkt ist auf der Zeitachse nicht dargestellt. An jedem Mepunkt findet man Signal. Abb. 3 stellt
2 eine Messung bei wesentlich geringerer Moleküldichte auf der Oberfläche dar. Die Zahl der Moleküle in einem Meßpunkt ist geringer (geringere Signalhöhe) , außerdem treten die Signale weniger häufig auf. Die Aufnahme der Photonen wird nach der
Detektion von N Photonen abgebrochen, wobei N - l / S2 + 2), wobei
S der relative Fehler der Konzentrationsbestimmung ist. TV kann hierbei die Zahl aller detektierten Photonen oder aller detektierten Photonen abzüglich der Untergrundphotonen sein; ist die Dichte der lumineszierenden Moleküle auf der Oberfläche so klein, daß Flächenbereiche auftreten, in denen sich kein Molekül befindet, so muß das Untergrundsignal abgezogen werden.
Bei gewöhnlichen Substanzmengenbestimmungen wird die Zahl der detektierten Fluoreszenzphotonen N innerhalb einer gegebenen Meßzeit / bestimmt, und auf der Grundlage von N dann eine Abschätzung der Substanzmenge Q gemacht. Erfindungsgemäß soll im Gegensatz dazu die Zeit t bestimmt werden, in welcher eine gegebene Zahl von Fluoreszenzphotonen N gemessen wird, das heißt nach Messung von N Photonen wird die Messung abgebrochen und über die Meßzeit dann die Substanzmenge abgeschätzt. Die Zahl der Fluoreszenzphotonen N soll hierbei durch den relativen Fehler der Messung, der vorbestimmt ist, gegeben sein. Die Abhängigkeit der jeweiligen Zahl der Fluoreszenzphotonen N von dem relativen Fehler der Messung ergibt sich wie folgt.
Es sei angenommen, daß die Wahrscheinlichkeit, für eine tatsächliche Substanzmenge q in einer Zeiteinheit ein Photon zu detektieren, gleich K ist, wobei Kein Konstante ist, in welche die Laserintensität , der Absorptionsquerschnitt, die Fluoreszenzquanteneffizienz und die Detektionseffizienz eingehen. Es soll nun abgeschätzt werden, mit welcher
3 Genauigkeit eine solche Susbtanzmengenbestimmung durchgeführt werden kann.
Die Wahrscheinlichkeit PN_i(ή , für eine Substanzmenge q in einer gegebenen Zeit t genau N-1 Photonen detektiert zu haben, ist durch die folgende Poissonverteilung gegeben: \ N-\
Somit ist die Wahrscheinlichkeitsdichte πN(t) , im Zeitintervall
{t,t + dt} das N-te Photon zu detektieren, durch πN(t) = κqPN_](ή gegeben.
Wenn man für eine gemessene Zeit t die Substanzmenge über die
Beziehung ß = (N - l)/(κt) bestimmt, so ist die entsprechende
Wahrscheinlichkeitsverteilung P[Q) gegeben durch [D.T.
Gillespie "A theorem for physicists in the theory of random variables" Am . J. Phys . 51(6), (1983), 520]
/ v Γ ( N - \\ , , N - 1 N-r
Kt κß Kß
Das k-te Moment dieser Verteilung ist (£ < N - l)
In [9(N- l)]k{N- k- l)l ^ 1 - (N-1)!
Mittelwert und Standardabweichung sind damit gegeben durch:
q σö _ N^2 "
Der relative Fehler der Konzentrationsbestimmung ist S = σQ I q
Folglich gilt für die zum Erreichen einer bestimmten Genauigkeit der Konzentrationsbestimmung erforderliche Zahl
Photonen N = 1 / (s2 + 2] . Somit läßt sich die Genauigkeit der
Messung durch die Festlegung der Zahl der zu messenden Photonen festlegen. Für einen relativen Meßfehler von 1% genügt z.B. die Messung von ca. N=104 Fluoreszenzphotonen.
4 Der Vorteil dieses Verfahrens ist, daß nicht immer die gesamte Oberfläche abgerastert werden muß, sondern, daß die Meßzeit von der Dichte der lumineszierenden Moleküle abhängt; ei hohen Konzentrationen ist die erforderliche Zahl an detektierten Photonen schon sehr schnell erreicht, während nur bei sehr geringen Dichten die gesamte Oberfläche abgerastert werden muß. Als Meßzeit wird nur die Zeit verstanden, während der der Detektor Photonen detektieren kann. Die Meßzeit soll vorzugsweise an einem Meßpunkt nicht größer sein, als Photonen von dem Molekül bzw. den Molekülen erwartet werden können. Ist die Meßzeit größer als diese Zeit (z.B. aufgrund der Photozerstörung) , verschlechtert sich das Signal-zu-Rausch- Verhältnis .
Da die Zahl der detektierten Lumineszenzphotonen, die von einem Molekül emittiert werden, von der Dauer der Detektion abhängt, ist eine Kalibrierung für die Bestimmung der Dichte erforderlich.
Erfindungsgemäß können die lumineszierenden Moleküle selbst den Analyten darstellen, oder die lumineszierenden Moleküle binden an den Analyten und dienen so als Marker für den indirekten Nachweis. Beispiel für einen solchen indirekten Nachweis des Analyten ist beispielsweise das Binden eines Farbstoff-markierten Antikörpers an ein Antigen. Die Konzentration der lumineszierenden Moleküle in Lösung läßt sich über Eichmessungen zur Dichte der lumineszierenden Moleküle an der Oberfläche in Beziehung setzen.
Erfindungsgemäß werden bevorzugt Fluorophore als Lumineszenz- marker verwendet. Diese Fluorophore können erfindungsgemäß sowohl über ihre Farbe (d.h. der Wellenlänge der emittierten Photonen) wie auch über ihre Fluoreszenzlebensdauer detektiert werden (z.B. S. Seeger et al. Ber. Bunsenges. Phys . Chem. 97, 1542 (1993) . Beispielsweise kann der Farbstoff Cy5
S erfindungsgemäß verwendet werden. Die Wahl der jeweils erfindungsgemäß verwendeten lumineszierenden Moleküle hängt jedoch in erster Linie von dem verwendeten Laserlicht wie auch von dem verwendeten Einzelmoleküldetektor ab.
Der erfindungsgemäß verwendbare Einzelmoleküldetektor ist nicht beschränkt, sofern er bei gegebenem Detektionsvolumen, gegebener Wellenlänge und Leistung des Laserstrahles und gegebenem lumineszierenden Molelül die Detektion eines einzelnen lumineszierenden Moleküls erlaubt. Die Anforderungen an die Empfindlichkeit des Einzelmoleküldetektors steigen hierbei mit zunehmendem Detektionsvolumen und sinkender Leistung des Laserstrahles. Es ist daher insbesondere bevorzugt, das Detektionsvolumen zu minimieren, indem man den Laserstrahl beugungsbegrenzt fokussiert.
Der Einzelmoleküldetektor umfaßt eine Abbildungsoptik, eine Einheit, die bei Auftreffen von Photonen ein elektrisches Signal erzeugt sowie einen Computer samt Software zur Auswertung der elektrischen Signale. Hierfür wird eine kommerziell erhältliche Computer-Einsteckkarte verwendet, die die Zahl der detektierten Fluoreszenzphotonen pro Zeiteinheit zählt. Für eine zeitaufgelöste Messung im Nanosekundenbereich wird eine schnelle elektronische Korrelatorkarte verwendet (z.B. Digital Time 70, SL Microtest, Jena oder SPC-300, Picoquant) . Die Abbildungsoptik ermöglicht vorzugsweise eine zu dem Fokus des Laserstrahles konfokale Abbildung der emittierten Photonen auf die Einheit zur Erzeugung eines elektrischen Signals. Diese Einheit ist vorzugsweise eine Photodiode, insbesondere bevorzugt eine Einzelphotonenzähl- Avalanche-Photodiode . Alternativ kann auch ein Photomultiplier oder eine verstärkte CCD-Kamera verwendet werden. Insbesondere wird bevorzugt, den erfindungsgemäß verwendbaren Einzelmoleküldetektor derart einzurichten, daß die Detektion erst nach einer bestimmten Zeit nach der Anregung durch den Laser beginnt ("Gating") . Weiterhin ist es möglich, zeitaufgelöste Messungen im Nanosekundenbereich durchzuführen. Hierbei ist neben einer schnellen Elektronik eine gepulste oder modulierte Lichtquelle und ein schneller Detektor erforderlich.
Durch die zeitabhängige Detektion der Fluoreszenzphotonen ist eine Unterscheidung zwischen an der Oberfläche gebundenen Molekülen und farbstoffmarkierten Molekülen, die sich frei in der überstehenden Lösung befinden bewegen, möglich. Dabei wird berücksichtigt, daß freie Farbstoffe bzw. farbstoffmarkierte Moleküle gewöhnlicherweise Diffusionskonstanten im Bereich von 10~5 bis 10"6 cm2/s aufweisen, was bei freier Diffusion zu Durchgangszeiten durch das konfokale Volumen von etwa 100 ms, beim Durchtritt durch das Detektionsvolumen nicht durch das Zentrum, sondern in Randbereichen, noch kürzer, führt, wogegen die an der Oberfläche fixierten Moleküle beliebig lange (praktisch bis zur Photozerstörung) im Detektionsvolumen verweilen. Somit werden Bindungsereignisse zwischen immobilisierten Rezeptormolekülen und Liganden bzw. immobiliserten Liganden und Rezeptormolekülen nachgewiesen, ohne das nichtgebundene farbstoffmarkierte Moleküle aus der überstehenden Lösung entfernt werden müssen. Signale, die kurz auftreten, werden dabei frei beweglichen Molekülen zugeordnet, während Signale, die lange auftreten, z.B. länger als 100 ms, an der Oberfläche gebundenen Molekülen zugeordnet werden.
Zur Anregung des Lumineszenzmarkers wird Laserlicht mit einer Wellenlänge von 600 nm und mehr bevorzugt, um das Auftreten von Streulicht und Autofluoreszenz zu minimieren. Insbesondere sind Halbleiterlaser und Helium-Neon-Laser in diesem Wellenlängenbereich aus Kostengründen für das erfindungsgemäße Verfahren bevorzugt. Der Strahl dieses Laserlichtes wird über die Oberfläche gerastert.
7 Die Rastervorrichtung ist erfmdungsgemaß nicht beschrankt, sofern sie in Zeitabstanden die Position des Laserstrahles um einen definierten Abstand verändert. Rastervorrichtungen, wie sie in herkömmlichen Laser-Scannmg-Mikroskopen verwendet werden, sowie kommerziell erhaltliche x, y-Verschiebetische sind auch im erfindungsgemaßen Verfahren geeignet. Die Meßzeit pro Meßpunkt betragt vorzugsweise 1 ms bis 1 s. Die Meßkarte gibt die Zahl der detektierten Fluoreszenzphotonen je Zeitintervall, vorzugsweise 1 ms, an das Steuerprogramm weiter, welches bei Erreichen der vorbestimmten Photonenzahl den Meßvorgang abbricht, die bis dahin verflossene Meßzeit und die Meßdaten abspeichert.
Hierbei lassen sich prinzipiell drei unterschiedliche Meßbereiche unterscheiden.
Bei hohen Analytkonzentrationen kann die erwünschte Photonenzahl schon bei einem einzelnen Meßpunkt erreicht werden. Über die Signalmtensitat, d.h. die Anzahl der detektierten Photonen laßt sich so direkt die Konzentration des Analyten bestimmen. Die Signalintensitat ist in diesem Bereich der Analytkonzentration proportional. Bei einer Rastereinrichtung, die 100 mal 100 Meßpunkte anfahrt, fuhrt das Abstoppen der Messung schon nach dem ersten Meßpunkt bei ausreichender Meßgenauigkeit zu einer 10000 fachen Beschleunigung des Meßverfahrens.
Bei mittleren Analytkonzentrationen sind zunehmend mehr Meßpunkte zum Erreichen der gewünschten Meßgenauigkeit erforderlich. Pro Meßpunkt wird die Anzahl der detektierten Photonen integriert und ein Durchschnittswert über alle Meßpunkte gebildet, um so die Konzentration m der gewünschten Genauigkeit zu bestimmen. Die erwünschte Meßgenauigkeit wäre in diesem Bereich nicht ohne Messungen an verschiedenen Meßpunkten möglich. Wurden Messungen lediglich an demselben Meßpunkt mehrfach wiederholt werden, so verschlechterte sich
8 das Signal-Rausch-Verhältnis u.a. aufgrund der Photozerstörung der lumineszierenden Moleküle.
Wird die Konzentration des Analyten weiter erniedrigt, so wird schließlich ein dritter Meßbereich erreicht, bei dem nicht mehr an jedem Meßpunkt Moleküle detektiert werden. Hier kann dann die durchschnittliche Anzahl der detektierten Moleküle pro Meßpunkt weniger als 1 betragen. Die Signalhöhe an den Meßpunkten mit Signal ist im Rahmen statistischer Schwankungen konstant. Die Konzentration der Moleküle an der Oberfläche ist in diesem Bereich dem Verhältnis aus der Anzahl der Meßpunkte mit Signal zu der Gesamtanzahl der Meßpunkte annähernd proportional. Meßpunkte mit Signal werden durch das Setzen einer Signalschwelle für die Fluoreszenzintensität von Meßpunkten ohne Signal, d.h. ausschließlich Untergrundsignal unterschieden.
Die drei Meßbereiche können mehr als 8 Größenordnungen umfassen.
Eine weitere Steigerung der Empfindlichkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens läßt sich dadurch erreichen, daß die Oberfläche des Trägers, die abgerastert wird, derart ausgewählt wird, daß an ihr der Analyt bzw. das lumineszierende Molekül leicht gebunden wird. Dies kann durch Ausnutzung ionischer oder hydrophober Wechselwirkungen zwischen der Oberfläche und dem Analyten bzw. dem lumineszierenden Molekül erreicht werden. Insbesondere ist es jedoch bevorzugt, daß die lumineszierenden Moleküle durch eine Affinitätsreaktion selektiv an der Oberfläche gebunden werden. Bei einer solchen Affinitätsreaktion wird das lumineszierende Molekül bzw. der Analyt über ein Fangmolekül an der Oberfläche immobilisiert.
Erfindungsgemäß bevorzugte Fangmoleküle sind an der Oberfläche immobilisierte Proteine oder Nukleinsäuren, die das lumineszierende Molekül bzw. den Analyten selektiv zu binden
9 vermögen. Bevorzugte Proteine sind Antikörper, die entsprechende Antigene binden. Ein weiteres erfindungsgemäß bevorzugt verwendetes Protein ist (Strept-) Avidin, welches das mit Biotin derivatisierte lumineszierende Molekül bzw. den so derivatisierten Analyten sehr selektiv zu binden vermag. Erfindungsgemäß bevorzugt verwendete Nukleinsäuren sind insbesondere DNS-Oligomere, die spezifisch bestimmte DNS- Abschnitte binden.
Insbesondere wird es erfindungsgemäß bevorzugt, die Fangmoleküle kovalent an die Oberfläche zu binden. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform werden die Fangmoleüle über einen Langmuir-Blodgett-Film, vorzugsweise einem Langmuir-Blodgett-Film eines Cellulosederivates, auf der Oberfläche immobilisiert. Insbesondere bevorzugt ist es, die Oberfläche zunächst mit 1 bis 8 Monolagen Aminoalkyltrimethyl- silylethercellulose (ATMSC) und anschließend 1 bis 8 Monolagen Trimethylsilylethercellulosecinnammoat (TMSCC) zu beschichten. Für die kovalente Ankopplung der Fangmoleküle werden dann die Cinnamoyl-Gruppen des TMSCC zu Aldehyd-Gruppen oxidiert.
Die zweite erfindungsgemäße Aufgabe wird durch ein Verfahren gelöst, bei dem die Oberfläche mit einem Laserstrahl abgerastert wird, die von mit dem Laserstrahl angeregten Molekülen emittierten Photonen mit einem Einzelmoleküldetektor aufgenommen werden und die Aufnahme der Photonen abgebrochen wird. Das Gleichgewicht der Adsorption bzw. der Bindung an die Oberfläche ist dann erreicht, wenn an mindestens zwei aufeinanderfolgenden Meßunkten die im Rahmen statistischer Schwankungen gleiche Zahl Photonen detektiert werden. Dazu wird die zu bindende bzw. adsorbierende Substanz in Lösung über eine entsprechend präparierte Oberfläche gegeben und das Abrastern der Oberfläche mit dem Fluoreszenzdetektor eingeleitet. Die Zeit, zu welcher ein jeweiliger Spot beim Abrastern vermessen wurde, wir dann gegen die im Spot detektierte Fluoreszenz abgetragen. Dies gilt für
10 Konzentrationen der Substanz in der Lösung, die zu einer Dichte an der Oberfläche nach der Adsorption bzw. Bindung ' führt, bei der mehrere Moleküle in einem Meßpunkt gebunden bzw. adsorbiert sind. Hierbei können auch die Signale mehrerer Meßpunkte zusammengefaßt werden und einem Zeitintervall zugeordnet werden, z.B. 5 Sekunden. Es werden dann 5 Sekunden lang mehrere Meßpunkte abgerastert, die Zahl der detektierten Photonen ggf. nach der Subtraktion von Untergrundsignal zusammengefaßt und in einem Signal-Zeit-Diagramm aufgetragen. Dies wird nun in 5 Sekunden dauernden Intervallen fortgesetzt und die mit der Zeit ansteigende Photonenzahl aufgetragen. Eine weitere Möglichkeit ist die Messung der Zeit zwischen der Detektion von Lumineszenzphotonen, die mit zunehmender Adsorption bzw. Bindung an der Oberfläche kleiner wird, da die Moleküldichte mit der Zeit zunimmt.
Es sei zum Beispiel die Vermessung einer einfachen Bindungskinetik der Art k K sS.,
(t) - exp -(k+c + k_)t]\ k k+ cc + + k k^_ angenommen, wobei x(t) die mittlere Konzentration der zur Zeit t gebundenen Moleküle, c die als konstant angenommene Konzentration der freien Moleküle in Lösung,^ die Gesamtzahl der freien Bindungsstellen auf der Oberfläche, und k+ ,k_ die zu bestimmenden Bindungs- bzw. Ablösungskonstanten sind. Durch Vermessung des zeitlichen Verlaufs (über die Zuordnung Zeit- Spot) der zu x(t) proportional angenommenen
Fluoreszenzintensität der Spots kann damit direkt die Größe k+c + k_ bestimmt werden, ohne Kenntnis von ^0 haben zu müssen. Nimmt man darüber hinaus dieselbe Messung bei verschiedenen Werten von c vor, so lassen sich außerdem die Konstanten k+ und k_ getrennt bestimmen.
11 Durch die Kenntnis von &+und k_ kann die Gleichgewichtskonstante bzw. Bindungskonstante des beobachteten Vorgangs errechnet werden.
Die Erfindung stellt zudem eine Vorrichtung zur Bestimmung der Dichte lummeszierender Moleküle an einer Oberflache bereit, umfassend einen Laser, einen Emzelmolekuldetektor, eine Rastereinrichtung und ein Mittel zum Abbrechen der Messung nach Detektion einer vorherbestimmten Anzahl Photonen. Der m der erfmdungsgemaßen Vorrichtung verwendete Laser, die verwendete Emzelmolekulvorrichtung, die verwendete Rastereinrichtung und das verwendete Mittel zum Abbrechen der Messung nach Detektion einer vorherbestimmten Anzahl Photonen entsprechen den oben für das erfmdungsgemaße Verfahren angegebenen.
Ausfuhrungsbeispiel 1:
Es werden gemäß dem bei F. Loscher et al. (Proc. SPIE beschriebenen Verfahren Huhn-anti-c-Aktin-Immunglobulm G auf einem Objektträger immobilisiert. Nach Waschen mit Phosphat- Puffer PBS wird mit einer c-Aktm-haltigen Losung etwa 15 Minuten mkubiert und nach einem weiteren Waschschritt mit PBS eine Losung eines polyklonalen Huhn-anti-c-Aktm-IgY- Antikorpers, der zuvor nach Standardverfahren mit dem Fluoreszenzfarbstoff Cy5 markiert wurde, zugegeben. Nach weiteren 15 Minuten wird die Oberflache mit einem konfokalen Detektor abgerastert, wobei Aregung und Detektion durch das Deckglas hindurch geschieht.
Die Zeit, die benotigt wird, bis ausreichend Photonen (z.B. 10000) detektiert werden, wird gemessen. Ach geeigneter Kalibrierung, also der Messung dieser Zeit als Funktion der Konzentration laßt sich die Kozentration an c-Aktm bestimmen.
Ausfuhrungsbeispiel 2:
12 Auf eine Glasplatte, auf der wie im Ausführungsbeispiel 1 Ziege-anti-Maus-Antikörper immobilisiert wurden, wird eine Lösung von 10"12 mol/1 Maus-anti-Hase-Antikörper, die zuvor mit Cy5-Fluoreszenzfarbstoffen markiert wurden, zugegeben und sofort begonnen, die Oberfläche mit einem konfokalen Laserraster-Detektor abgerastert. Die Zahl der detektierten Photonen wird gegen die Zeit aufgetragen. Aufgrund der zunehmenden Dichte der fluoreszierenden Moleküle auf der Oberfläche nimmt die registrierte Zahl der Fuoreszenzphotonen mit der Zeit zu (Abb. 4).
13

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Bestimmung der Dichte lumineszierender Moleküle an einer Oberfläche, bei dem die Oberfläche mit einem Laserstrahl abgerastert wird, die von mit dem Laserstrahl angeregten Molekülen emittierten Photonen mit einem Einzelmoleküldetektor aufgenommen werden und die Aufnahme der Photonen nach Detektion von N Photonen abgebrochen wird, wobei N = 1 / (S2 +2) , wobei S der Fehler bei der Bestimmung der Dichte ist.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die lumineszierenden Moleküle fluoreszierende Marker für einen Analyten darstellen.
3. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Einzelmoleküldetektor eine Avalanche-Photodiode ist.
4. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß an der Oberfläche gebundene Moleküle aufgrund der längeren Detektionszeit der Lumineszenzphotonen von denen die frei in Lösung diffundieren unterschieden werden.
5. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die lumineszierenden Moleküle durch eine Affinitätsreaktion selektiv an der Oberfläche gebunden werden.
6. Verfahren gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die lumineszierenden Moleküle durch an der Oberfläche immobilisierte Proteine, organische Moleküle oder Nukleinsäuren selektiv gebunden werden.
14
7. Verfahren gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Proteine, organischen Moleküle oder Nukleinsäuren kovalent an der Oberfläche immobilisiert sind.
8. Verfahren gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Proteine oder Nukleinsäuren kovalent über einen Langmuir- Blodgett-Film an der Oberfläche immobilisiert sind.
9. Verfahren zur Bestimmung der Adsorptionskinetik oder Bindungskinetik lumineszierender Moleküle an einer Oberfläche, bei dem die Oberfläche mit einem Laserstrahl während dem Ablauf der Reaktion abgerastert wird, und die von mit dem Laserstrahl angeregten Molekülen emittierten Photonen mit einem Detektor aufgenommen werden.
10. Vorrichtung zur Bestimmung der Dichte lumineszierender Moleküle an einer Oberfläche umfassend einen Laser, einen Detektor, eine Rastereinrichtung und ein Mittel zum Abbrechen der Messung nach Detektion einer vorherbestimmten Anzahl Photonen.
15
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