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Anwendungsgebiet der Erfindung
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Die
Erfindung betrifft eine Referenzvorrichtung zur Evaluierung der
Funktion eines konfokalen Laserscanmikroskops.
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Insbesondere
bezieht sich die Erfindung auf eine Referenzvorrichtung zur Evaluierung
der Funktion eines Typs konfokaler Laserscanmikroskope, der dazu
geeignet ist, eine zweidimensionale quantitative Fluoreszenzmessung
an einem Testmaterial durchzuführen,
das auf einer flachen Oberfläche
eines ersten Glassubstrats verteilt ist, insbesondere bei einem DNA
Bindungsarray oder dergleichen, beispielsweise einem DNA-Bindungsarray
des Typs, der in dem
US-Patent
5,143,854 beschrieben ist.
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Die
Erfindung richtet sich auch auf ein Verfahren zur Evaluierung der
Funktion eines konfokalen Laserscanmikroskops, insbesondere eines
konfokalen Laserscanmikroskops des vorstehend erläuterten
Typs.
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In
besonderem Maße
betrifft die Erfindung eine Evaluierungsmethode, die es ermöglicht,
ein konfokales Laserscanmikroskop der vorstehend erläuterten
Art hinsichtlich der quantitativen Signaldetektionsempfindlichkeit,
hinsichtlich der Detektionsgrenze, hinsichtlich der Gleichmäßigkeit
des konfokalen Volumens über
das Scan-Bildfeld, hinsichtlich der räumlichen Auflösung bei
dem Scanprozess und hinsichtlich des dynamischen Verhaltens des
gemessenen Signals über
das Scan-Bildfeld zu überprüfen, wobei
das gemessene Signal dem empfangenen Fluoreszenzlicht entspricht.
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Weiterhin
betrifft die Erfindung ein System zur Evaluierung der Funktion eines
konfokalen Laserscanmikroskops das dazu ausgebildet ist, eine zweidimensionale
quantitative Fluoreszenzmessung eines Testmaterials durchzuführen, das
auf einer flachen Oberfläche
eines Substrats verteilt ist.
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Hintergrund
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Referenzvorrichtungen
zur Evaluierung der Funktion von Instrumenten zur Durchführung optischer
Messungen sind beispielsweise in den
US-Patenten 5,581,631 und
4,662,745 beschrieben.
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Das
US-Patent 5,581,631 beschreibt
eine Vorrichtung zum Testen der Linearität des Bildaufnahmesystems in
einem zytologischen System, beispielsweise einem System, welches
ein Transmissionsmikroskop und biologische Mikroskopobjektive umfasst.
Bei dieser Vorrichtung ist in der Objekt-Fokalebene des Bildaufnahmesystems
ein Primitivbild (image primitive) positioniert, welches eine periodische
Struktur aufweist, beispielsweise ein Kalibrationsplättchen wie
zum Beispiel eine Glasplatte mit einem darauf angebrachten Barcode.
Es wird ein Bild des Primitivbildes erzeugt und die Bildinformation wird
verarbeitet, beispielsweise zur Überprüfung der Linearität des Systems,
wobei "Linearität" definiert ist als
die Änderung
der Ausgangsspannung des Systems bezüglich der Intensität des Licht-Inputs,
oder zur Überprüfung der
Frequenzabhängigkeit
des System unter Benutzung einer Modulations-Transferfunktion und/oder
zur Bestimmung des Signal-/Rausch-Verhältnisses für bestimmte Bereiche des Frequenzspektrums.
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In
dem
US-Patent 4,662,745 ist
eine Kalibrationsplatte beschrieben, die sowohl hinsichtlich der Reflektion
als auch hinsichtlich der Lumineszenz eine bekannte Charakteristik
aufweist. Sie dient dazu, ein Instrument im Einsatz zu testen, welches
dazu geeignet ist, Lichtenergie zu messen, die von einem Photolumineszenz-Target
innerhalb eines engen Frequenzbandes im sichtbaren und nahe-sichtbaren
Bereich des Spek trums abgestrahlt wird. Die in dem
US-Patent 4,662,745 beschriebene Kalibrationsplatte
wird hergestellt, indem man auf die Oberfläche eines starren Substrats,
beispielsweise einer Stahlplatte, eine keramische Beschichtung oder
eine Glasbeschichtung aufbringt, wobei die Beschichtung ein photolumineszierendes
Material einer seltenen Erde enthält. Die keramische Beschichtung
wird anschließend
mit feinem Abrieb sandgestrahlt.
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Das
Prinzip eines konfokalen Laserscanmikroskops zur zweidimensionalen
quantitativen Fluoreszenzmessung ist in den 1 und 2 dargestellt. 1 zeigt
den optischen Aufbau eines konfokalen Laserscanmikroskops des Typs "2-D flying spot", wobei zur Fluoreszenzanregung
ein Laserstrahl 11 verwendet wird. Außerdem weist die Anordnung
einen dichroischen Strahlteiler 12, eine zweidimensionale
Scanmaschine 13 zur räumlichen
Strahlablenkung in zwei zueinander orthogonale Richtungen (X-Y)
und eine Linse 14 zur Fokusierung des Laserstrahls in eine
Objektebene 15 auf. Durch die Anregung von fluoreszierenden
Molekülen
in der Objektebene 15 wird Fluoreszenzlicht erzeugt, welches eine
längere
Wellenlänge
als der Anregungslaser 11 hat.
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Fluoreszenzlicht,
welches von Fluorophoren in der Objektebene 15 des abgetasteten
Gebietes emitiert wird, wird von einer Linse 14 gesammelt
und dann mittels der Scanmaschine 13 und des dichroischen
Strahlteilers 12 als Fluoreszenzlichtstrahl 17, der
mittels einer Linse 18 fokusiert ist, in eine Lochblende 19 transmitiert,
welche in einer Konjugatebene 21 vor einem einer Photodetektoreinrichtung 22 angeordnet
ist.
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Das
Konzept der konfokalen Bilderzeugung, welches derzeit dazu verwendet
wird, die im allgemeinen schwachen Fluoreszenzsignale von der Hintergrundstrahlung
zu diskriminieren, ist in 2 dargestellt.
Nur optische Strahlung, die aus dem konfokalen Volumen Vc stammt,
das heißt
das Fluoreszenzsignal, wird von dem Photodetektor 22 detektiert.
Vc ist dabei definiert durch die optische Transferfunktion der Detektionsoptik
(OTFem) und durch die Größe des Detektor-Blendenlochs 19 in der
Konjugatebene 21. Je kleiner das konfokale Volulmen Vc ist,
desto besser ist die Unterdrückung
des Hintergrundsignals.
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Die
Größe des Scan-Sichtfeldes
liegt typischerweise in der Größenordnung
von 20 × 20
Quadratmillimeter. Das konfokale Volumen liegt im allgemeinen in
der Größenordnung
von Vc = 5 × 5 × 50 Kubikmikrometer,
wobei Ac = 5 × 5
Quadratmikrometer und zc = 50 Mikrometer ungefähr die Spotgröße beziehungsweise
den Rayleigh Bereich des fokusierten Laserstrahls beschreiben. Die
Pixelgröße der Scanmaschine 13 beim
Abtasten mittels des Laserstrahls 11 in dem Sichtfeld beträgt typischerweise
1 bis 20 Mikrometer.
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DNA-Bindungsarrays,
beispielsweise diejenigen, die in dem
US-Patent
5,143,854 dargestellt sind, bestehen aus einem Glasplättchen,
welches ein chemisches System trägt,
wobei das Plättchen
in benachbarte Zellen unterteilt ist, die üblicherweise als Features bezeichnet
werden. Die Features sind durch spezifische Sonden (probes) charakterisiert. Spezifische
Nukleinsäuresequenzen
werden durch die Sonden immobilisiert (gefangen) und mittels eines
Fluoreszenzfarbstoffes markiert. Die Menge der gefangenen Nukleinsäure an einem
bestimmten Feature wird mittels einer quantitativen Fluoreszenzmessung
detektiert (der Fluoreszenzfarbstoff emitiert Licht, wenn er mit
Licht einer vorgegebenen Wellenlänge
angeregt wird), wobei ein sequenzielles pixelweises Lesen (scannen)
der Features durchgeführt wird.
Durch die Scanprozedur werden die Features räumlich über-abgetastet (oversampled,
d.h. die Zahl der Pixel ist größer als
die Zahl der Features) um eine genaue räumliche Bezugnahme innerhalb
des Glasplättchens
zu ermöglichen,
wobei eine numerische Datenanalyse durchgeführt wird und wobei zur Verbesserung
der Feature-Signalqualität
eine Mittelwertbildung der physikalisch gemessenen Lichtintensitäten durchgeführt wird.
Typische Pixelgrößen liegen
in der Größenordnung
von 1 bis 20 Mikrometer.
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Bei
der konfokalen Lasermikroskopie ist das Verhältnis zwischen dem Scan-Bildfeld
und dem Querschnitt Ac des konfokalen Volumens typischerweise hoch,
d. h. "Scan-Bildfeld"/"Querschnit Ac des konfokalen Volumens" >> 1.
Dies führt
ohne weiteres zu einer von der x-y Position abhängenden optischen Tranferfunktion
OTF (x, y) = OTFex·OTFem,
wobei OTFex und OTFem die optischen Transferfunktionen der Anregungsoptik
beziehungsweise der Emissionsoptik sind. Die Abhängigkeit von der x-y Position
resultiert hauptsächlich
aus mechanischer Missjustierung sowie aus Imperfektionen der optischen
und optomechanischen Komponenten, beispielsweise der zum Abtasten
verwendeten Scanmaschine. Daraus resultiert eine inhomogene Empfindlichkeit
innerhalb des Scan-Bildfeldes, wie sie in den
3a,
3b und
3c dargestellt
wird. Dies wiederum führt
zu fehlerhaften quantitativen Fluoreszenzmessungen. Beispielsweise
zeigt
4 schematisch das abgetastete Bild eines DNA-Bindungsarray,
z. B. des in dem
US-Patent 5,143,854 beschriebenen
Typs, wobei dieses Array ein Schachbrettmuster hat. Wie nachfolgend
unter Bezugnahme auf
4 beschrieben wird, hat das
gescannte Bild in der rechten oberen Ecke eine geringere Signalstärke, wobei
dies entweder auf eine inhomogene Fluorophordichte des gescannten
Objektes oder auf eine inhomogene Sensitivität des konfokalen Laserscanmikroskops über das
Scan-Bildfeld zurückzuführen ist.
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Auf
dieser Grundlage besteht ein Bedürfnis nach
einer verlässlichen
quantitativen Messung und Evaluierung der Sensitivität eines
konfokalen Laserscanmikroskops des beschriebenen Typs über dessen
Scan-Bildfeld.
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Wenn
ein geeignetes Referenz-Standardtarget verfügbar wäre, bestünde die Möglichkeit, zwischen Beiträgen zu der
beispielsweise in
1 dargestellten Ungleichmäßigkeit
zu differenzieren, welche einerseits durch das Instrument und andererseits durch
das gescannte Objekt (z. B. ein DNA-Bindungsarray des in dem
US-Patent 5,143,854 beschriebenen
Typs) verursacht werden. Es liegen aber keine Berichte über ein
Referenz-Targetobjekt vor, das dazu geeignet ist, die entscheidenden
Leistungsmerkmale eines konfokalen Laserscanmikroskops, das heißt dessen
Empfindlichkeit und Detektionsgrenze sowie dessen Verhalten hinsichtlich
Gleichmäßigkeit,
räumlicher
Auflösung
und Signaldynamik über
das Scan-Bildfeld zu charakterisieren.
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Es
besteht deshalb ein Bedürfnis
nach einem geeigneten Referenz-Standard-Targetobjekt,
das es ermöglicht,
zwischen Beiträgen
zu differenzieren, die einerseits von dem Instrument und andererseits
von dem gescannten Objekt herrühren
und dem in 4 beispielhaft dargestellten
Typ zuzurechnen sind.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Auf
dieser Grundlage verfolgt die Erfindung das Ziel, eine Referenzvorrichtung,
ein Verfahren und ein System der oben erläuterten Art zur Verfügung zu
stellen, durch die es ermöglicht
wird, die Funktion eines konfokalen Laserscanmikroskopes, das zur
Durchführung
zweidimensionaler quantitativer Fluoreszenzmessungen geeignet ist,
quantitativ zu evaluieren.
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Gemäß einem
ersten Aspekt der Erfindung wird dieses Ziel durch eine Referenzvorrichtung,
die die Merkmale des Anspruchs 1 aufweist, erreicht.
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Gemäß einem
zweiten Aspekt der Erfindung wird das vorstehend erläuterte Ziel
durch ein Verfahren gemäß Anspruch
6 erreicht.
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Gemäß einem
dritten Aspekt der Erfindung wird das vorstehend erläuterte Ziel
durch ein System gemäß Anspruch
10 erreicht.
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Wichtige
Vorteile, die mit einer Referenzvorrichtung, einem Verfahren und
einem System gemäß der Erfindung
erreicht werden können,
bestehen darin, dass diese eine quantitative und sehr genaue Evaluierung
der Funktion eines konfokalen Lasermikroskopes, das zum Scannen
von DNA-Bindungsarrays der oben erläuterten Art geeignet ist, ermöglichen;
und dass diese Evaluierung die Möglichkeit bietet,
Messergebnisse, die durch Scannen mit einem solchen Mikroskop gewonnen
werden, quantitativ zu evaluieren, also zum Beispiel eine DNA- Bindungsarray einer
zu analysierenden Probe. In diesem Zusammenhang ist es wichtig,
sich zu verdeutlichen, dass eine erfindungsgemäß ausgeführte Evaluierung die Messung
folgender Charakteristika umfasst:
- a) die quantitative
Signaldetektionsempfindlichkeit,
- b) die quantitative Signaldetektionsgrenze,
- c) die Gleichmäßigkeit
des konfokalen Volumens über
das Scan-Bildfeld,
- d) die räumliche
Auflösung
des Scanprozesses, und
- e) das dynamische Verhalten des gemessenen Signals über das
Scan-Bildfeld, wobei das gemessene Signal dem empfangenen Fluoreszenzlicht
entspricht.
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Kurze Beschreibung der Zeichnungen
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Nachfolgend
werden bevorzugte Ausgestaltungen der Erfindung unter Bezugnahme
auf die beigefügten
Zeichnungen erläutert.
Darin zeigen:
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1 Eine
schematische Darstellung des grundlegenden Aufbaus eines konfokalen
Laserscanmikroskops zur Durchführung
einer zweidimensionalen quantitativen Fluoreszenzmessung;
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2 eine
schematische Darstellung eines konfokalen Volumens Vc in einer Objektebene;
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3a, 3b 3c schematische
Darstellungen verschiedener Formen einer Nicht-Gleichmäßigkeit
des gescannten konfokalen Volumens über das Scan-Bildfeld;
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4 eine
schematische Darstellung eines gescannten Bildes eines DNA-Bindungsarrays;
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5a eine
Aufsicht auf eine erste Ausführungsform
einer erfindungsgemäßen Referenzvorrichtung;
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5b ein
Querschnitt durch eine Ebene A-A der Ausführungsform gemäß 5a;
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6 die
Form eines representativen elektrischen Signals, welches gemessen
wird, wenn man das Fluoreszenzlicht misst, das von den fluoreszierenden
Zonen ausgesandt wird, die in einer Reihe des in den 5a und 5b dargestellten
Arrays angeordnet sind;
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7a eine
Aufsicht auf eine zweite Ausführungsform
einer erfindungsgemäßen Referenzvorrichtung;
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7b ein
Querschnitt der in 7a dargestellten Ausführungsform.
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Detaillierte Beschreibung
der Erfindung
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Nachfolgend
wird die Erfindung anhand bevorzugter Ausführungsformen beschrieben. Diese Ausführungsformen
sollen dazu dienen, das Verständnis
der Erfindung zu verbessern, sind aber nicht beschränkend zu
verstehen.
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1 zeigt
schematisch den grundsätzlichen
Aufbau eines konfokalen Laserscanmikroskops zur zweidimensionalen
quantitativen Fluoreszenzmessung für den Fall eines zweidimensionalen Flying
Spot. Ein Anregungslaserstrahl 11, der durch einen dichroischen
Strahlteiler 12 transmitiert wird, macht mittels einer
zweiachsigen Scanmaschine 13, beispielsweise mittels eines
Galvo-Scanners, eine räumliche
Abtastbewegung entlang zweier Achsen X und Y, die senkrecht zueinander
verlaufen. Er wird mittels einer Linse 14 in eine Objektebene 15 fokusiert,
welche parallel zu der X-Y Ebene verläuft, die durch die Achsen X
und Y definiert wird. Die Objektebene 15 verläuft senkrecht
zu einer dritten Achse Z, die sich im rechten Winkel zu der X-Y
Ebene erstreckt.
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Fluorophore
innerhalb des konfokalen Volumens Vc in der Objektebene 15 werden
von dem fokusierten Laserspot 16 angeregt und das durch
die Anregung erzeugte Fluoreszenzlicht 17 dieser Fluorophore
wird gesammelt und mittels einer Linse 18 in ein Detektor-Blendenloch 19 in
der Konjugatebene 21 abgebildet und von dem Photodetektor 22 detektiert.
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2 zeigt
schematisch ein konfokales Volumen Vc (wobei Vc = Ac·zc) in
der Objektebene 15. Idealerweise ist das konfokale Volumen
Vc ein zylindrisches Volumen, dessen Rotationsachse parallel zu
der Z-Achse verläuft und
das einen kreisförmigen Querschnitt
hat. Das konfokale Volumen Vc ist definiert durch die optische Transferfunktion
(OTFem) der Detektionsoptik und die Größe und Form der Detektor-Lochblende 19 in
der Konjugatebene 21. Nur optische Strahlung, die aus dem
konfokalen Volumen Vc kommt, wird von dem Photodetektor 22 detektiert. Das
Konzept der konfokalen Abbildung ermöglicht hohe Untergrund-Unterdrückungsraten
zur Detektion schwacher Signalintensitäten, wie sie üblicherweise bei
Fluoreszenzmessungen auftreten.
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Die 3a, 3b und 3c zeigen
schematische Darstellungen in der Y-Z Ebene von Nicht-Gleichmäßigkeiten
des gescannten konfokalen Volumens Vc, mit anderen Worten von Abweichungen
der Form des Volumens von der in 2 dargestellten
idealen Form. Solche Abweichungen verursachen Inhomogenitäten der
Amplitude des Intensitätssignals
des Fluoreszenzlichts, das über
die gescannte Fläche
gemessen wird.
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3a zeigt
ein gescanntes konfokales Volumen 24, das relativ zu einem
idealen oder nominalen konfokalen Volumen 23 geneigt ist. 3b zeigt ein
gescanntes konfokales Volumen 25 das keine konstante Breite
hat und das insofern nicht-gleichmäßig im Vergleich zu dem nominalen
konfokalen Volumen 23 ist. 3c zeigt
ein gescanntes konfokales Volumen 26 das eine verbogene
Form im Vergleich zu dem nominalen konfokalen Volumen 23 hat.
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Hauptursache
der Nicht-Gleichmäßigkeiten der
in den 3a, 3b und 3c dargestellten konfokalen
Volumina sind mechanische. Missjustierung und Imperfektionen optischer
und optomechanischer Komponenten.
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4 zeigt
eine schematische Darstellung eines gescannten Bildes eines DNA-Bindungsarray
31 des
in dem
US-Patent 5,143,854 beschrie benen Typs.
Das Array
31 hat eine schachbrettförmige Anordunung fluoreszierender
Punkte, die dazu ausgebildet sind, Fluoreszenzlicht zu emitieren,
wenn sie mit Anregungslicht bestrahlt werden. Für die Zwecke der nachfolgenden
Erfindung ist es vorteilhaft, zwei Zonen des Arrays
31 zu
unterscheiden: Eine erste Zone
33, die sich von einer Diagonale
34 in
die rechte obere Ecke des Arrays
31 erstreckt und eine
zweite Zone
35, die sich von der Diagonale
34 in
die linke untere Ecke des Arrays
31 erstreckt. Verursacht
entweder durch eine inhomogene Fluorophordichte auf dem gescannten
Objekt oder eine inhomogene Empfindlichkeit des konfokalen Laserscanmikroskops über das
Scan-Bildfeld zeigt das in
4 dargestellte Bild,
dass fluoreszierende Punkte
32, die in der Zone
33 des
Array
31 lokalisiert sind, Fluoreszenzlicht von geringerer
Intensität
als die fluoreszierenden Punkte
32 in der Zone
35 zeigen.
Zweck einer Referenzvorrichtung, eines Verfahrens und eines Systems
gemäß der Erfindung
ist es, quantitativ zu evaluieren, inwieweit derartige Variationen
der Intensität
des detektierten Fluoreszenzlichtes spezifisch auf eine inhomogene
Empfindlichkeit des konfokalen Laserscanmikroskops über das
Abtast-Bildfeld zurückzuführen sind.
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5a zeigt
eine Aufsicht und 5b einen Querschnitt von einer
ersten Ausführungsform
einer erfindungsgemäßen Referenzvorrichtung 41,
die dazu ausgebildet ist, quantitativ die Homogenität und Empfindlichkeit
eines konfokalen Laserscanmikroskops zu charkterisieren, welches
zur zweidimensionalen quantitativen Fluoreszenzmessung dient. In den 5a und 5b sind
Abmessungen in Millimetern angegeben.
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Die
in den 5a und 5b dargestellte Referenzvorrichtung 41 besteht
aus einer oberen Glasplatte 42, die mit einem Glassubstrat 43 verbunden
ist. Das 16 × 16
Quadratmillimeter große
Glassubstrat (Dicke = 1 Millimeter) hat eine geätzte planare Vertiefung 44 (schraffierter
Bereich). Die Glas-Deckplatte 42 (Dicke 0,7 Millimeter)
hat zwei Bohrlöcher 45 beziehungsweise 46,
die als Ein- beziehungsweise Auslass dienen. In einer anderen möglichen
Ausführungsform
kann eine Glas-Deckplatte 42 ohne Bohrlöcher 45 und 46 verwendet
werden, die nicht mit dem Glassubstrat 43 verbunden ist.
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Das
Glassubstrat 43 kann beispielsweise identische Abmessungen
und vorzugsweise die gleichen optischen Eigenschaften haben, wie
das Substrat eines DNA-Bindungsarrays 31, wie es vorstehend unter
Bezugnahme auf 4 beschrieben wurde.
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Die
Vertiefung 44 der Referenzvorrichtung ist mit Fluorophoren
gefüllt,
die in einer vorherbestimmten Konzentration gelöst sind, so dass sich eine
vorherbestimmte räumliche
Verteilung von Fluorophoren auf der abgetasteten Fläche ergibt.
Da die Fluorophore homogen gelöst
sind, wird deren räumliche Verteilung
durch die Struktur der Vertiefung 44, nicht durch die gelösten Fluorophore
selbst, bestimmt. In dem unter Bezugnahme auf die 5a und 5b beschriebenen
Beispiel ist die Vertiefung 44 planar und deshalb ist die
räumliche
Verteilung der Fluorophore gleichmäßig über die gesamte Fläche der
Vertiefung 44.
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Das
Deckglas 42 der in in den 5a und 5b dargestellten
Referenzvorrichtung 41 hat identische Dimensionen und optische
Eigenschaften wie das Glassubstrat eines entsprechenden DNA-Bindungsarrays
des Typs, der oben unter Bezugnahme auf 4 beschrieben
wurde. Deshalb kann die Referenzvorrichtung 41 unter den
gleichen optischen Bedingungen durch das konfokale Laserscanmikroskop
gescannt werden. Wegen der definierten Abmessungen der Vertiefung
und der kontrollierten Konzentration des Fluorophors, der in einer vorbestimmten
räumlichen
Verteilung über
die abgetastete Fläche
vorliegt, ist es möglich,
das Messsignal hinsichtlich, der Empfindlichkeit (Detektionsgrenze)
und hinsichtlich der Homogenität über das Scan-Bildfeld
zu untersuchen. Wie weiter oben erwähnt, wird die räumliche
Verteilung des gelösten Fluorophors
durch die Struktur der Vertiefung 44 bestimmt, nicht durch
die homogen gelösten
Fluorophore selbst.
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Ein
Vorteil der Verwendung von gelösten
Fluorophoren besteht darin, dass die Lösung unmittelbar vor Durchführung der
Fluoreszenzmessung hergestellt werden kann. Deshalb unterliegt die
mit einer flüssigen
Lösung
von Fluorophoren gefüllte
Referenzvorrichtung nicht den Ein schränkungen eines möglichen
Ausbleicheffektes, der anderweitig auftreten könnte, wenn die Referenzvorrichtung
für längere Zeit
gelagert wird. Ein solcher Ausbleicheffekt könnte zu einer nicht-quantitativen
Fluoreszenzfähigkeit
der Referenzvorrichtung über
das Scan-Bildfeld führen. Außerdem können leicht
verschiedene Lösungen
mit unterschiedlichen Konzentrationen an gelöstem Fluorophor hergestellt
werden. Dies ermöglicht
Fluoreszenzmessungen mit unterschiedlichen Intensitätswerten.
Insbesondere kann so der Intensitätswert der Detektionsgrenze
bestimmt werden.
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Die
Höhe der
Vertiefung 44 ist wesentlich kleiner als die Tiefe des
konfokalen Volumens Vc, die durch den Rayleigh Bereich zc bestimmt
wird. Deshalb ermöglicht
die dünne
ebene Schicht von Fluorophoren in der Vertiefung 44 eine
verlässliche
Evaluierung von z. B. möglichen
Verschiebungen des konfokalen Volumens Vc in der Z-Richtung (im
rechten Winkel zu dem Scan-Bildfeld), wenn die Referenzvorrichtung 41 über das
gesamte Scan-Bildfeld abgetastet wird.
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Ein
Beispiel zeigt 6, wobei das Signalprofil der
Reihe 588 aus 1024 des abgetasteten Bildes dargestellt ist, bezogen
auf die in den 5a und 5b dargestellte
Referenzvorrichtung: Die Vertiefung 44 der Vorrichtung
hat eine konstante Dicke über
ihre gesamte Ausdehnung und ist mit einer Lösung von 200 mg/ml Fluorescein-TRIS-Lösung (Fluorescein
in einer wässrigen
Lösung
von 0,1 molarem TRIS-Puffer pH 8,3). Das Bild kann hinsichtlich
der Empfindlichkeit und der Gleichmäßigkeit des konfokalen Laserscanmikroskops
analysiert werden, wie dies in 6 für das Linienprofil
der Reihe 588 aus 1024 dargestellt ist (Bildfeld = 10 × 10 Quadratmillimeter,
Pixelgröße = 10
Mikrometer, Auflösung
des Scans 1024×1024
Pixel, Abtastzeit 126 Sekunden, Detektionsempfindlichkeit des benutzten
Transimpedanz-Verstärkers
10 μamp/Volt,
Grenzfrequenz oder 6 dB-Frequenz des mit dem Transimpedanz-Verstärker verwendeten
Tiefpassfilters 30 kHz, Integrationsintervall [tdwell]-Dauer 40
Mikrosekunden). Aus 6 kann man entnehmen, dass das
resultierende Linienprofil von etwas Rauschsignal überlagert
ist. Die Signalintensität
ist in 6 in willkürlichen
Einheiten dargestellt.
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Die
Abweichung der Signalintensität
jedes Pixels von einem vorherbestimmten Wert, die beispielsweise
als durchschnittliche Signalintensität über das gesamte abgetastete
Bild angegeben werden kann, bildet einen quantitativen Parameter
der Funktionsqualität
eines konfokalen Laserscanmikroskops.
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Eine
weitere Anwendungsmöglichkeit
wird dadurch gebildet, dass der Pegel der Signalintensität kalibriert
werden kann. Die Anzahl der Fluorophore pro Flächeneinheit kann aus der Konzentration
der gelösten
Fluorophore bestimmt werden. Deswegen ist die gemessene Signalintensität und die
gemessene Empfindlichkeit auf quantitative Weise bezogen auf die
Zahl der Fluorophore pro Flächeneinheit.
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Eine
zweite Ausführungsform
einer erfindungsgemäßen Referenzvorrichtung
zur quantitativen Evaluierung der Gleichmäßigkeit und räumlichen Auflösung eines
konfokalen Laserscanmikroskops ist in 7a in
Aufsicht und in 7b im Querschnitt dargestellt.
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In 7a sind
einige Abmessungen in Mikrometern angegeben. In 7b sind
einige Abmessungen in Millimetern angegeben.
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Die
in den 7a und 7b dargestellte Referenzvorrichtung 51 besteht
aus einer Glas-Deckplatte 52 auf einem Glassubstrat 51 und hat
eine Fläche
von 16 × 16
Quadratmillimeter. Die obere Oberfläche des Glassubstrats 53 (Dicke
= 1 Millimeter) hat eine geätzte
mikrostrukturierte Vertiefung von 5 μm, die einen Hohlraum 54 mit
einer unteren inneren Oberfläche
bildet. Der Hohlraum 54 ist gleichmäßig mit einem Fluorophor gefüllt, welcher eine
vorherbestimmte Konzentration hat, sodass eine vorherbestimmte räumliche
Verteilung fluoreszierender Zonen über die Fläche des Hohlraumes 54 resultiert.
Diese räumliche
Verteilung ist nicht von den gelösten
Fluorophoren selbst bestimmt, sondern von der Struktur des Hohlraumes 54.
Der Hohlraum 54 ist von der Glas-Deckplatte 52 abgedeckt,
die eine untere äußere Oberfläche hat.
Der Raum, der von der unteren äußeren Oberfläche der
Platte 52 und der unteren inneren Oberfläche der
Vertiefung 54 gebildet wird, hat eine Dicke D, welche gemäß einer vorherbestimmten
Funktion der Form D = f (x, y) über die
gesamte Fläche
der Depression 54 variiert. Der vorstehend genannte Raum
ist mindestens teilweise mit gelösten
Fluorophoren gefüllt.
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Das
Glassubstrat 53 hat beispielsweise identische Dimensionen
und vorzugsweise die gleichen optischen Eigenschaften wie das Substrat
des oben unter Bezugnahme auf 4 beschriebenen DNA-Bindungsarrays 31.
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Das
Deckglas 52 der Referenzvorrichtung 51 hat identische
optische Eigenschaften wie ein Glassubstrat eines gegebenen DNA-Bindungsarrays 31 derart,
wie sie oben unter Bezugnahme auf 4 beschrieben
wurde. Deshalb kann die Referenzvorrichtung 51 mittels
eines konfokalen Laserabtastmikroskops unter den gleichen optischen
Bedingungen abgetastet werden.
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Der
mikrostrukturierte Hohlraum 54 weist unterschiedliche Muster
von fluoreszierenden Zonen auf. In 7 ist
jede nicht-fluoreszierende Zone als abschattierte Oberfläche dargestellt.
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Ein
erstes Muster fluoreszierender Zonen weist nur zwei nicht-fluoreszierende
Zonen auf, die jeweils in 7 als abgeschattete
Quadrate dargestellt sind. In 7a sind
fluoreszierende Zonen mit diesem ersten Muster in jeder der vier
Eckzonen 55, 56, 57, 58 der
Referenzvorrichtung 51 lokalisiert. Die Messsignale, die
der Intensität
des Fluoreszenzlichts entsprechen, welches aus diesen Eckzonen emitiert wird,
werden ausgewertet, um den Grad der Gleichmäßigkeit über das Scan-Bildfeld des mit
einem konfokalen Laserscanmikroskops durchgeführten Scans zu ermitteln. Die
Zonen 61 und 62, die an mehreren Reihen der Referenzvorrichtung 51 lokalisiert
sind, haben ein zweites Muster räumlicher
Verteilung fluoreszierender Features. Die Messsignale, welche Fluoreszenzlicht
entsprechen, das aus den Zonen 61 und 62 emitiert
wurde, werden ausgewertet, um die Auflösung des mit dem Laserscanmikroskop durchgeführten Scans
zu ermitteln. Darüberhinaus
kann, da die Abmessungen der Zonen 61 und 62 bekannt sind,
die Präzision
der Scanschritte, die mit der Scanmaschine durchgeführt werden,
ermittelt werden. Wie in 7a dargestellt
ist, sind die Zonen 61 und 62 derartig unterteilt,
dass der Hohlraum ein einziges verbundenes Reservoir bildet, das
mit den gelösten Fluorophoren
gefüllt
ist.
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Die
Zonen 63, 64, welche als Gruppen von Balken mit
verschiedenen Neigungswinkeln erscheinen, bilden ein drittes Muster
fluoreszierender Features, das auf der Referenzvorrichtung 51 zur
Verfügung
steht. Die Messsignale, die dem fluoreszierenden Licht entsprechen,
das aus einer Zone, wie der Zone 63, emitiert wird, wird
ausgewertet, um das dynamische Signalverhalten zu ermitteln, das
während eines
mit dem konfokalen Laserscanmikroskop durchgeführten Scans zu beobachten ist.
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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich auf Referenzvorrichtungen, wie
sie vorstehend beschrieben wurden und in den 5a und 5b bzw. 7a und 7b dargestellt
sind. Diese Referenzvorrichtungen werden zur quantitativen Evaluierung eines
konfokalen Laserscanmikroskops verwendet, das für die quantitative Fluoreszenzmessung
bestimmt ist. Typische Charakteristika, die mit einer Referenzvorrichtung
gemäß der Erfindung
beziehungsweise einem entsprechenden Verfahren bestimmt werden,
sind:
- a) die quantitative Signaldetektionsempfindlichkeit,
- b) die quantitative Signaldetektionsgrenze,
- c) die Gleichmäßigkeit
des konfokalen Volumens über
das Scan-Bildfeld,
- d) die räumliche
Auflösung
des Scanprozesses, und
- e) das dynamische Verhalten des gemessenen Signals über das
Scan-Bildfeld, wobei das gemessene Signal dem empfangenen Fluoreszenzlicht
entspricht.
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Die
beschriebene Verwendung der Erfindung zur Evaluierung der Funktion
eines konfokalen Laserscanmikroskops umfasst im Wesentlichen
das
Abtasten einer Referenzvorrichtung gemäß der Erfindung mit einem Mikroskop,
das evaluiert werden soll, um dadurch einen ersten Satz von Messwerten zu
erhalten,
die Verarbeitung des ersten Satzes von Messwerten, um
Korrekturfaktoren zu erhalten,
das Speichern der Korrekturfaktoren
das
Abtasten einer Probe, beispielsweise eines DNA-Bindungsarrays mit
dem evaluierten Mikroskop, um einen zweiten Satz von Messwerten
zu erhalten, und
die Korrektur des zweiten Satzes von Messwerten bezüglich der
Korrekturfaktoren, um einen dritten Satz von Werten zu erhalten,
die frei sind von auf die Funktion des Scanners zurückzuführenden
Abweichungen und die deshalb genauer den Charakteristika der jeweils
untersuchten Probe entsprechen.
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Obwohl
vorausgehend bevorzugte Ausführungsformen
der Erfindung unter Verwendung spezifischer Begriffe beschrieben
wurden, dient diese Beschreibung nur zur Erläuterung und ist dahingehend zu
verstehen, dass Änderungen
und Variationen vorgenommen werden können, ohne den Schutzbereich der
Ansprüche
des Patentes zu verlassen.
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- 11
- Anregungslaserstrahl
- 12
- Dichroischer
Strahlteiler
- 13
- Zweiachsige
Scanmaschine
- 14
- Linse
- 15
- Objektebene
- 16
- Fokusierter
Laserpunkt
- 17
- Fluoreszenzlicht
- 18
- Linse
- 19
- Detektor-Blendenloch
- 21
- Konjugatebene
- 22
- Photodetektor
- 23
- Nominales
konfokales Volumen (Querschnitt in der Ebene z-y)
- 24
- Gescanntes
konfokales Volumen (Querschnitt in der Ebene z-y)
- 25
- Gescanntes
konfokales Volumen (Querschnitt in der Ebene z-y)
- 26
- Gescanntes
konfokales Volumen (Querschnitt in der Ebene z-y)
- 31
- DNA-Bindungsarray
(in der Objektebene lokalisiert)
- 32
- Fluoreszenzpunkt
oder Fluoreszenz-Feature
- 33
- Zone
- 34
- Diagonale
- 35
- Zone
- 41
- erste
Ausführungsform
einer Referenzvorrichtung
- 42
- Deckplatte
- 43
- untere
Platte
- 44
- Hohlraum
- 45
- Loch
- 46
- Loch
- 51
- zweite
Ausführungsform
einer Referenzvorrichtung
- 52
- Deckplatte
- 53
- untere
Platte
- 54
- Hohlraum
- 55
- Zone
mit einem ersten Muster fluoreszierender Features
- 56
- Zone
mit einem ersten Muster fluoreszierender Features
- 57
- Zone
mit einem ersten Muster fluoreszierender Features
- 58
- Zone
mit einem ersten Muster fluoreszierender Features
- 61
- Zone
mit einem zweiten Muster fluoreszierender Features
- 62
- Zone
mit einem zweiten Muster fluoreszierender Features
- 63
- Zone
mit einem dritten Muster fluoreszierender Features
- 64
- Zone
mit einem dritten Muster fluoreszierender Features